Bol. San. Veg. Plagas, 24: 629-636, 1998

Actividad de extractos de semillas de Trichilia havanensis Jacq,sobre larvas de Helicoverpa armigera (Hbner)J. F. LPEZ-OLGUN, M. C. DE LA TORRE, E. VIUELA y P. CASTAERA

Se ha evaluado, mediante ensayos de alimentacin de preferencia y no- preferencia,la actividad de extractos acetnicos, etanlicos e hidro-etanlicos (a 5000 ppm) de pe-ricarpio y semillas de Trichilia havanensis Jacq. (Meliaceae), frente a larvas del quintoestadio de Helicoverpa armgera (Hbner) (Lepidoptera: Noctuidae). El extracto acet-nico de semillas, que mostr la mxima actividad antialimentaria, se cromatografi encolumna de gei de slice. Cinco de las siete fracciones obtenidas fueron identificadascomo los limonoides: azadirona, 0-acetiltrichilenona, 3,7-di-0-acetil-14,15-desoxiha-vanensina, l,7-di-0-acetil-14,15-desoxihavanensina, y una mezcla de 1,7-di-O-acetil-havanensina y 3,7-di-O-acetilhavanensina (4:1).

La actividad de cada fraccin se determin a 1000 ppm, mediante ensayos de pre-ferencia y no preferencia. La mezcla de 1,7-di-

mayoritarios extrado de sus frutos, la azadi-ractina, ha mostrado una alta actividad an-tialimentaria y como regulador del creci-miento contra muchas plagas (MORDUE yBLACKWELL, 1993). De los limonoides ais-lados del fruto de T. havanensis (CHAN etal, 1973; ARENAS y RODRGUEZ, 1990),nicamente la azadirona obtenida original-mente de A. indica (LAVIE et al, 1971), seha citado con actividad antialimentaria con-tra Epilachna varivestis Mulsant (CHAM-PAGNE et al, 1992). No hemos encontradoreferencias en la literatura cientfica de quese haya investigado la actividad biolgicacontra insectos, de los dems limonoidesobtenidos de esta planta.

Por otra parte, se han realizado diversosestudios que han demostrado la efectividadde extractos acuosos de T. havanensis con-tra plagas agrcolas (LAGUNES, 1993). Re-cientemente, se ha observado que el frutoseco pulverizado de esta planta, incorporadoa la dieta, ocasiona alta mortalidad, reduc-cin significativa del peso y un marcado re-traso del desarrollo larvario de S. littoralis(LPEZ-OLGUN et al, 1997); Sin embargo,los compuestos responsables de esta activi-dad no han sido identificados.

Es evidente, por tanto, el gran inters quetienen los compuestos aislados de meliceaspara el desarrollo potencial de productosambientalmente seguros y efectivos quepuedan contribuir al control de plagas. Elpresente trabajo tiene por objeto aislar eidentificar estructuralmente compuestos delfruto de T. havanensis, que muestren activi-dad antialimentaria frente a larvas de H. ar-mgera, plaga de la mayor importancia agr-cola mundial.

MATERIAL Y MTODOSInsectos

Los ensayos se realizaron con larvas de H.armgera, procedentes de una poblacin decampo mantenida en el laboratorio duranteuna generacin. Las larvas se alimentaron

con la dieta semisinttica desarrollada porPOITOUT & BUES (1970), modificada con laadicin de 0,63% (p/p) de la mezcla de salesminerales de Wesson. Los adultos se ali-mentaron con una solucin al 10% de miel.Las larvas y adultos se mantuvieron en uninsectario a una temperatura de 24 2 C,>70% de Humedad Relativa y un fotoperio-do de 16:8 horas (luz:oscuridad).

Material vegetal, extracciny fraccionamiento

Se recolectaron frutos en estado de madu-rez de T. havanensis y se dejaron secar a lasombra durante 15 das. El pericarpio fueseparado de la semilla y ambas partes sepulverizaron en un molino (Culatti) usandoun tamiz de 1,5 mm. El pericarpio y la semi-lla se sometieron de manera independiente aextraccin continua durante 12 horas en unaparato Soxhlet, utilizando secuencialmente,acetona, etanol 96% y etanol-agua (80-20).Las seis soluciones resultantes fueron eva-poradas en un rotavapor de vaco, obtenin-dose los extractos correspondientes.

El extracto acetnico, que mostr la mxi-ma actividad antialimentaria, se cromatogra-fi en columna de gei de slice (Merck 60mesh, desactivada con un 10% de agua), uti-lizando como eluyentes n-hexano, mezclasde n-hexano:acetato de etilo y acetato deetilo puro. Las estructuras de los compues-tos aislados de las diferentes fracciones cro-matogrficas se determinaron por compara-cin de sus espectros de 'H-RMN con losdatos bibliogrficos.

Bioensayos

General

Los seis extractos y las siete fraccionesobtenidos del extracto acetnico de las se-millas de T. Havanensis, se aplicaron di-sueltos en su respectivo solvente a discosfoliares de lechuga, a concentraciones (peso

del producto/peso fresco del disco foliar), de5000 ppm en el caso de los extractos y a1000 ppm para las fracciones (mezclas ycompuestos puros). En todos los ensayosse incluy el tratamiento testigo, consisten-te en aplicar a los discos foliares solamenteel solvente utilizado para los productos deensayo.

La unidad experimental para los ensayosde alimentacin consisti en una placa Petride plstico (15 x 90 mm), con el fondo cu-bierto por una capa de aproximadamente 20mi de una solucin de agar al 2,5% (ESCOU-BAS et al, 1993). Sobre la capa de agar sehicieron seis crculos usando un sacaboca-dos N. 17 (17 mm de dimetro), donde secolocaron seis discos foliares de lechuga (15mm de dimetro), cada uno con su extractoo fraccin. Una vez evaporado el solvente,dentro de cada placa se coloc una larva dequinto estadio de H. armgera de menos de24 horas de edad, que se mantuvo en ayunolas 6 horas previas, y con un peso entre 250y 300 mg. Cada placa Petri se consider unarepeticin. En todos los ensayos se realiza-ron 10 repeticiones por tratamiento. Todaslas placas del ensayo se colocaron comple-tamente al azar dentro de una cmara decrecimiento a una temperatura de 26 1 C,>70% de humedad relativa y un fotoperodode 16:8 horas (luz:oscuridad).

Todos los datos de ingestin se determi-naron en miligramos de disco(s) foliar(es)consumido(s), en peso seco, por cada larva.El peso seco inicial de los discos foliares seestim, en cada ensayo, a partir de 10 gru-pos de 6 discos foliares con los que se obtu-vo el factor de conversin de peso fresco apeso seco. Al final del ensayo, los discos fo-liares no consumidos se colocaron en unaestufa a 60 C durante 48 horas y se pesaronpara obtener el peso seco final.

Evaluacin de la actividadde las fracciones y compuestos puros

El efecto de las distintas sustancias sobreel comportamiento de alimentacin de las

larvas de H. armgera se evalu medianteensayos de alimentacin de corta duracin yel clculo del los ndices de actividad co-rrespondientes.

La posible actividad antialimentaria, queincluye tanto el modo de accin de no pre-ferencia (antixenosis) como txico (antibio-sis), de los extractos y de los productos puri-ficados se evalu mediante los bioensayossiguientes:

a) Ensayos de preferencia (puede elegirentre discos tratados y no tratados) para eva-luar el el grado de percepcin de un com-puesto por las larvas y su efecto disuasorio(deterrent) para la alimentacin. Se colo-caron alternadamente, dentro de cada placaPetri, seis discos foliares de lechuga. A tresde los discos se les aplic, de forma homo-gnea, 12 ul de una solucin conteniendo elproducto de ensayo (discos tratados: Dt) y alos otros tres discos, se les aplic nicamen-te 12 |il del solvente (discos control: Dc). Almismo tiempo se prepararon las placas tes-tigo, en las cuales se colocaron seis discosfoliares a los que se aplic nicamente elsolvente. Este testigo adicional se utilizpara detener el ensayo cuando la ingestinmedia de las larvas era alrededor del 50% ypara el clculo del ndice de supresin. Elndice de disuasin (ID) se calcul median-te la ecuacin:

ID = [(Dc - Dt)/(Dc + Dt)] x 100

(SIMMONDS et al, 1989). Donde: Dc = in-gestin en discos testigo, Dt = ingestin endiscos tratados.

b) Ensayos de no-preferencia para deter-minar el potencial de los compuesto para su-primir la actividad alimenticia (actividadantifeedant) de un insecto en situacionesde no eleccin. Los ensayos de no-preferen-cia se realizaron tratando los seis discos fo-liares de cada placa con el producto de prue-ba (tratamiento) o con nicamente el sol-vente (placas testigo). El ensayo se dio porfinalizado cuando las larvas haban ingeridoel 75% de los discos foliares en las placas

testigo. El ndice antiapetitivo (IA), se obtu-vo de acuerdo con BENTLEY et al (1984)mediante la ecuacin:

IA = [(Dc-Dt)/Dc]xlOO.

Donde: Dc = ingestin en discos testigo,Dt = ingestin en discos tratados.

c) Paralelamente, mediante un anlisiscombinado de los datos de ingestin en losensayos de preferencia y no-preferencia, seha estimado el ndice de supresin (IS) dela alimentacin. Este ndice permite valo-rar el efecto de inhibicin de la alimenta-cin que puede producirse en discos folia-res no tratados como consecuencia dehaber ingerido discos tratados (toxicidadaguda potencial) en placas con discos trata-dos y no tratados (ensayos de preferencia)cuando se compara con el consumo en lasplacas testigo de los ensayos de preferenciay no preferencia. Se calcul mediante laecuacin:

IS = [(IngTest.-IngTrat.)/IngTest.]*100

(RAFFA y FRAZIER, 1988). Donde: IngTrat.= ingestin en placas con discos tratados yno tratados (preferencia), IngTest. = Inges-tin en las placas del testigo (preferencia/no-preferencia).

Anlisis estadstico

En los ensayos de preferencia (ID), las di-ferencias entre el consumo de discos folia-res de lechuga testigo y tratados se compro-baron mediante la prueba de Wilcoxon. Enlos bioensayos de no preferencia (IA) y pre-ferencia/no preferencia (IS) las diferenciasentre el consumo de discos foliares en lasplacas testigo y las tratadas se estimaronmediante la prueba de Dunnett.

RESULTADOS Y DISCUSINLa extraccin de las semillas y del peri-

carpio de los frutos de T. havanensis diolugar a los seis extractos crudos y a los ren-dimientos que se muestran en el Cuadro 1.Los ndices de actividad antialimentaria dedichos extractos ponen de manifiesto laexistencia de compuestos en el fruto de T.havanensis que afectan significativamenteel comportamiento de alimentacin de laslarvas de H. armgera (Cuadro 2). Se obser-va una mayor variedad y concentracin decompuestos activos en la semilla, puestoque los tres extractos ocasionaron una altaactividad antialimentaria, particularmentepara los ndices antiapetitivo y de supre-sin de la alimentacin. Con respecto al pe-ricarpio, nicamente el extracto acetnico

Cuadro 1 .-Extractos crudos procedentes del fruto de T. havanensis y rendimientode los mismos

* Obtenido a partir de 156,86 gramos de pericarpio y 82,8 gramos de semillas.

Extracto (5000 ppm)PERICARPIO

AcetonaEtanolEtanol-Agua

SEMILLAAcetonaEtanolEtanol-Agua

(1) ndice antiapetitivo [(Dc-Dt)/Dc] x 100% error estndar (n = 10). * Indica diferencias significativas entre elconsumo foliar en el control (Dc) y en los discos tratados (Dt) (test de Dunnett p < 0,05).

(2) ndice de disuasin de la alimentacin [(Dc-Dt)/(Dc+Dt)] x 100% error estndar (n = 10). * Indica diferenciassignificativas entre el consumo foliar en el control (Dc) y en los discos tratados (Dt) dentro de cada placa (test de Wil-coxon p < 0,05).

(3) ndice de supresin de la alimentacin [(IngTest.-IngTrat.)/IngTest.]*100 error estndar (n = 10). * Indica di-ferencias significativas entre el consumo foliar de discos tratados y no tratados en las placas tratadas (IngTrat) y en loscontroles (IngTest.) que contienen slo discos no tratados (test de Dunnett p < 0,05).

ocasion alta actividad antialimentaria, con ID = 25,5%), procedimos a su fracciona-un ndice antiapetitivo que no difiere del ob- miento, obtenindose las siete fracciones yservado con los tres extractos de semillas de los rendimientos que se recogen en el Cua-T. havanensis. dro 3. De las diferentes fracciones croma-

En base a que el extracto acetnico de togrficas se aislaron en orden creciente desemillas mostraba la mxima actividad an- polaridad, los limonoides: azadirona (I);tialimentaria (IA = 79,0%, IS = 42,8% e O-acetiltrichilenona (II); 3,7-di-O-acetil-

Cuadro 3.-Fraccionamiento del extracto acetnico de semillas de T. havanensis y rendimientoobtenido para cada fraccin

SolventeHexano-EtOAc (80:20)Hexano-EtOAc (80:20)Hexano-EtOAc (80:20)Hexano-EtOAc (80:20)

Hexano-EtOAc (80:20)Hexano-EtOAc (1:1)

Hexano-EtOAc (1:1)

Compuesto (pureza)Mezcla no determinada

Azadirona (98%)O-acetiltrichilenona (90%)

3,7-di-0-acetil-14,15-desoxihavanensina (95%)Mezcla no determinadal,7-di-0-acetil-14,15-

desoxihavanensina (95%)l,7-di-(9-acetilhavanensina + 3,7-

di-O-acetilhavanensina (prop. 4:1) (95 %)* Obtenido de 18 g de extracto.

Cuadro 2-ndices de actividad antialimentaria de seis extractos crudos del frutode T. havanensis sobre larvas de H. armgera

Fig. 1.-Estructuras de los limonoides: azadirona (I); O-acetiltrichilenona (II); 3,7-di-Oacetil-14,15-desoxihavanensina (III);l,7-di-0-acetil-14,15-desoxihavanensina (IV); 1,7-di-O-acetilhavanensina (V) y 3,7-di-O-acetilhavanensina (VI)

aislados del extracto acetnico de semillas de Trichilia havanensis.

Cuadro 4.-Actividad de siete fracciones de un extracto acetnico de semillas de T. havanensissobre larvas de H. armgera

Fraccin* (1000 ppm)Mezcla no determinadaAzadironaO-acetiltrichilenona3,7-di-O-acetil-14,15-desoxihavanensinaMezcla no determinada1,7-di-O-acetil-14,15-desoxihavanensina1,7-di-O-acetilhavanensina 3,7-di-O-acetilhavanensina (4:1)

(1) ndice antiapetitivo (Id. Cuadro 2).(2) ndice de disuasin (Id. Cuadro 2).(3) ndice de supresin (Id. Cuadro 2).

14,15-desoxihavanensina (III) y 1,7-di-O-acetil-14,15-desoxihavanensina (IV), cuyasestructuras se representan en la Figura 1.Estos limonoides coinciden con los aisla-dos anteriormente del fruto de T. havanen-sis (CHAN et al., 1973; Arenas y Rodr-guez-Hann, 1990). Aunque, nicamente laazadirona, obtenida originalmente de A. in-dica (LAVIE et al, 1971), se ha informadoque muestre actividad antialimentaria con-

tra Epilachna varivestis (CHAMPAGNE etai, 1992). Las otras tres fracciones resulta-ron mezclas, de las cuales nicamente la demayor polaridad (fraccin 7), fue de interspor sus resultados en los ensayos de activi-dad antialimentaria. El estudio de la com-posicin de esta mezcla revel la presenciade los limonoides 1,7-di-O-acetilhavanen-sina y 3,7-di-O-acetilhavanensina (V y VIrespectivamente, en proporcin 4 : 1 ) ,

identificados originalmente por CHAN etai (1973).

La actividad de las siete fracciones del ex-tracto acetnico frente a larvas de H. arm-gera se determino a 1000 ppm, medianteensayos de preferencia y no preferencia(Cuadro 4). La mezcla de 1,7-di-Oacetilha-vanensina y 3,7-di-O-acetilhavanensina,mostro Ia mxima actividad antiapetitiva, yfue la nica que mostr un ndice de disua-sin de la alimentacin significativamentedistinto de los testigos. As mismo, los li-monoides azadirona y 0-acetiltrichilenonaacetato mostraton diferencias significativascon sus testigos en sus ndices antiapetitivosy de supresin de la alimentacin, pero noen el ndice de disuasin. Los altos ndicesde actividad antiapetitiva en condiciones deno-preferencia (IA) y de preferencia/no-pre-ferencia (IS), combinados con un bajo ndi-ce de disuasin para alimentarse de discostratados en condiciones de preferencia (bajacapacidad de discriminacin entre discostratados y discos control dentro de la misma

placa), sugiere un modo de accin probable-mente txico de estos limonoides sobre lar-vas de H. armgera. No obstante, sera nece-sario realizar ensayos de alimentacin delarga duracin con dichos limonoides paradeterminar el consumo y crecimiento relati-vo de las larvas, as como el efecto crnicopotencial de cada compuesto para dilucidarde forma precisa su modo de accin.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Comunidad Autnomade Madrid (Proyecto CCAM 06G-001-96)la financiacin de este trabajo. A la Dra.Rosa Gabarra (IRTA, Cabrils) el suministrode la poblacin inicial de H. armgera. A laUniversidad Autnoma de Puebla, Progra-ma SUPERA-ANUIES, Mxico y al ICI Es-paa, por haber otorgado un permiso de su-peracin acadmica y beca pre-doctoral alprimer autor.

ABSTRACT

LPEZ-OLGUN, J. F. DELA TORRE, M. C ; VIUELA, E. y CASTAERA, P., 1998: Ac-tivity of seed extracts of Trichilia havanensis Jacq. (Meliaceae) on larvae of Helicover-pa armgera (Hbner). Bol. San. Veg. Plagas, 24(3): 629-636.

Short-term choice and no-choice feeding assays were used to assess the antifeedantactivity of fruit extracts (at 5000 ppm) from Trichilia havanensis Jacq. (Meliaceae)against fifth instar larvae of Helicoverpa armgera Hbner (Lepidoptera: Noctuidae).The acetonic extract, which presented the highest activity, was further fractionated bysilica gei colum chromatography. Five of the seven fractions isolated were identified asthe limonoids: azadirone, trichilinone acetate, 14,15-deoxyhavanensin-l,7-diacetate,14,15-deoxyhavanensine-3,7-diacetate, and a mixture of havanensin-l,7-diacetate y ha-vanensin-3,7-diacetate.

Choice and no-choice feeding assays of each fraction (at 1000 ppm) showed thehighest antifeedant activity against fifth instar larvae of H. armgera in the mixture ofhavanensin-l,7-diacetate and havanensin-3,7-diacetate. Moreover, azadirone and tri-chilinone acetate were also antifeedants, though no differences between them werefound. No antifeedant activity was found in any of the other fractions. The antifeedantactivity data suggest a similar mode of action, probably toxic, for all these limonoids.

Key words: Meliaceae, Trichilia havanensis, Helicoverpa armgera, antifeedants,limonoids, azadirone, trichilenone, havanensin.

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(Recepcin: 13 abril 1998)(Aceptacin: 14 julio 1998)