Participa en la búsqueda de un fármaco para el Alzhéimer ¡Investiga con péptidos y proteínas!

Taller de experimentación PROTOCOLO

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Las proteínas y los péptidos son moléculas que sintetizan los seres vivos. Son responsables de una gran cantidad de procesos y forman parte de nuestro organismo. Estas moléculas están formadas por varios aminoácidos unidos mediante unos enlaces llamados enlaces peptídicos.

Los avances en las investigaciones en biotecno-logía han incrementado de forma significativa la utilización de péptidos y de proteínas en apli-caciones biomédicas, así como para productos cosméticos.

Una de las tendencias más novedosas en la investigación biomédica se centra en la utiliza-ción de los péptidos como potenciales agentes terapéuticos. Los péptidos están formados por aminoácidos, y éstos están presentes en nues-tro cuerpo, por lo que es lógico pensar que dar medicamentos lo más parecidos posible a nues-tra naturaleza puede ser una buena estrategia para combatir enfermedades. En general, los fármacos peptídicos son más específicos en la

interacción con la diana terapéutica y producen menos efectos secundarios.

Actualmente, ya existe un gran número de péptidos terapéuticos en el mercado, como la insulina, que sirve para tratar la diabetes; la DNasa I, para la fibrosis quística, o el T20, que bloquea el ciclo de replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o sea el virus que causa el sida.

Otra de las enfermedades contra las que se están diseñando péptidos terapéuticos es el Alzhéimer.

Introducción

AmInOáCIdO

Proteína: más de 100 aminoácidos Péptido: menos de 100 aminoácidos

PROTeínA

PéPTIdO

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El Alzhéimer es una enfermedad neurodege-nerativa que afecta al conjunto de capacidades mentales de una persona hasta que queda en estado vegetativo y muere. El enfermo expe-rimenta una pérdida de memoria progresiva y acaba siendo incapaz de llevar a cabo tareas cada vez más básicas, como tener cuidado de su propia higiene personal, vestirse o comer. Final-mente, en el último estadio de la enfermedad, la persona afectada acaba confinada en una cama, totalmente dependiente de su entorno. Hoy en día no hay ningún tratamiento curativo para esta enfermedad.

El número de personas que padecen Alzhéimer aumenta rápidamente a partir de los 65 años, y se calcula que afecta a aproximadamente a la mitad de personas de más de 85 años. El

envejecimiento progresivo de la población mun-dial hace suponer que el número de personas afectadas aumentará de forma exponencial a lo largo de los próximos años.

El cerebro de las personas afectadas por la enfermedad de Alzhéimer presenta agregados de un péptido llamado beta-amiloide (Aß), que está formado por una región hidrófila y una hidrófoba. Las características de estos pépti-dos dan lugar a la formación de los agregados, que reciben el nombre de placas amiloides y se

¿Qué hace que se desarrolle la enfermedad de Alzhéimer?

sitúan fuera de las neuronas. Se cree que la Aß es uno de los agentes causantes de la enfer-medad y que tiene una implicación directa en la neurodegeneración y los déficits cognitivos que se producen a lo largo del desarrollo de la enfermedad de Alzhéimer.

¿Qué es la enfermedad de Alzhéimer?

beta-amiloide Agregados del beta-amiloide

Agregación del beta-amiloide

monómeroBPm

Oligómero Oligómeros Protofibrillas Fibras amiloides Placas amiloides

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Formación de las placas amiloides

Algunos científicos del Instituto de Investigación Biomédica (IRB Barcelona) estudian en profun-didad las alteraciones que sufren las neuronas y los procesos bioquímicos asociados que tienen lugar durante la evolución de la enfermedad.

En concreto, estudian la parte más molecular de la enfermedad: analizan la proteína beta-amiloide. Entre otros aspectos, han estudiado el

efecto in vivo de una molécula que ellos mismos diseñaron y que inhibe la agregación de beta-amiloide. Los resultados que se han obtenido en estudios in vitro han sido muy prometedores. En la actualidad, se sigue esta línea de investiga-ción, ya que se piensa que este inhibidor podría conducir a posibles tratamientos que permiti-rían hacer frente a la enfermedad ralentizándo-la, parándola o, de forma óptima, revirtiéndola.

Investigación sobre el Alzhéimer en el Instituto de Investigación Biomédica (IRB Barcelona)

Inhibición de la agregación del beta-amiloide

monómeroBPm

Oligómero Oligómeros Protofibrillas Fibras amiloides Placas amiloides

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C

B

A

Objetivo

metodología A. Acoplamos un marcador fluorescente al péptido inhibidor del beta-amiloidePartimos de un péptido inhibidor del beta-amiloide que ya se ha sintetizado previamente. En la síntesis se han utilizado unas bolas de resina como soporte. El péptido se hace crecer pegando aminoácidos, uno a uno, encima de esas bolas, hasta obtener la secuencia deseada. Cuando ya se ha sintetizado todo el péptido, se le acopla el marcador fluorescente y se separa de la resina.

Durante la práctica tendremos que unir una molécula fluorescente al extremo N-terminal de un péptido en fase sólida, mientras aún esté pegado a las bolas de resina. Así el péptido será fluorescente. Observaremos en el microscopio óptico la diferencia que existe entre las bolas de resina con y sin péptido marcado.

B. Separamos el péptido marcado de la resina y lo obtenemos en soluciónDespués de la unión de la molécula fluorescen-te, separamos el péptido de la resina a la que está pegado y obtendremos el péptido marcado en solución listo para hacer los ensayos en el laboratorio.

C. Comprobamos que hemos conseguido el péptido marcadoFinalmente hacemos un análisis para compro-bar la presencia de péptidos en la solución que hemos obtenido.

El objetivo de este protocolo consiste en realizar la última etapa de la síntesis de un péptido inhibidor que se está llevando a cabo en el IRB Barcelona. La finalidad es conseguir un péptido fluorescente específico que inhiba la agregación del péptido beta-amiloide, responsable de la enfermedad de Al-zhéimer. Este paso es esencial en el laboratorio para poder hacer otros experimentos con el péptido.

Péptido inhibidor del

beta-amiloidePéptido inhibidor

marcado

Péptidoen solución

marcador fluorescente

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Pie y pinza de mohr

Instrumentos y utensilios de laboratorio

equipamiento y material necesarios

Gradilla Cronómetro

microscopio (objetivo 10X)

Vaso de precipitados Balanza micropipeta de 200 µl

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material fungible

Placa de Petri

Pipetas Pasteur

espátula

Tubos tipo Falcon de 15 ml y 50 ml Puntas de pipeta

Varilla de teflón* Jeringuilla con llave y filtro

Tubos de 1,5 ml

*También se puede utilizar una jeringuilla de 1 ml sin el émbolo.

Filtro

Llave

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Solución tamponadora para neutralizar el ácido

Solución orgánica para hacer la reacción

Contiene un 50% de diclorometano (dCm) y un 50% de dimetilformamida

(dmF)

Reactivos y disolventes (preparación de las soluciones en el Anexo II)

ácido trifluoroacético (TFA) al 2% en dCm

Agua destilada

Reactivo de Bradford

Solución con leche en polvo o leche

Solución de carboxifluo-resceína y otros reactivos

Resina con péptido inhibidor del beta-amiloide

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Partimos de nuestro péptido inhibidor del beta-amiloide, que ya tenemos unido a unas bolas de resina que sirven de soporte. En la superficie de cada bola de resina crecen miles de cadenas peptídicas. Nosotros añadimos un último mar-cador fluorescente que permite a los científicos poder visualizar la presencia del péptido duran-te sus experimentos.

Para unir la molécula fluorescente hacemos un montaje con una jeringuilla equipada con un fil-tro y una llave. La ventaja de utilizar esas bolas es que como son bastante grandes no traspa-san el filtro, lo que facilita la eliminación de los restos de producto y disolventes que tendremos que ir añadiendo.

Procedimientos

A Acoplamos un marcador fluorescente al péptido inhibidor del beta-amiloide

Montamos el material necesario para el experimento tal y como se indica en el dibujo.

1Pesamos la resina con péptido Ponemos la jeringuilla con el filtro den-tro del vaso de precipitados. Pesamos 62,5 mg de bolas de resina con péptido directamente dentro de la jeringuilla, tal y como se indica en el dibujo.

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Péptido inhibidor del beta-amiloide Péptido inhibidor marcado

marcador fluorescente

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Añadimos a la jeringuilla una solución orgánica para que haga la reacción con el marcador fluorescenteCon una pipeta Pasteur de 2 ml, añadimos la solución orgánica de diclorometano (dCm) y dimetilformamida (dmF) para solubilizar los péptidos pegados a la resina. Esta solución también permitirá solubilizar los reactivos y el marcador fluorescente que añadiremos más adelante para que reaccionen.

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Durante 3 minutos, removemos la mezcla de vez en cuando con una varilla de teflón.

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eliminamos la solución orgánica Transcurrido este tiempo, se abre la llave de la jeringuilla y se filtra el diclo-rometano, con lo que la resina queda sin disolvente

Añadimos el marcador fluorescente

Con una pipeta Pasteur y la llave de la jeringuilla cerrada, añadimos 2 ml de una solución preparada que contiene carboxifluoresceína y otros reactivos.

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7Filtramos la carboxifluoresceína en exceso, no acoplada.

• Abrimos la llave para eluir el volumen de carboxifluoresceína.

• Añadimos abundante agua en la jerin-guilla con la llave cerrada. Lo removemos bien y volvemos a abrir la llave. Recoge-mos todo el volumen en un tubo de 50 ml.

Repetimos el proceso cambiando cada vez el tubo, de forma que recogemos tres fracciones en tres tubos distintos. Observamos cómo cada vez el color es menos intenso, mientras que la resina-péptido ahora es naranja: la carboxifluo-resceína se ha acoplado correctamente.

10Visualizamos en el microscopio la resina-péptido con y sin marcador fluorescenteTomamos una pequeña muestra de los dos tipos de resina: la que hemos pesado antes en la jeringuilla y la de la jeringuilla, ya con la carboxifluoresceína acoplada. Las ponemos en la misma placa de Petri y vamos al microscopio para ver su diferencia.

Removemos de vez en cuando durante 5 minutos.

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B Separamos el péptido marcado de la resina y lo obtenemos en solución

Para separar el péptido ya unido a la molécula fluorescente de la bola de re-sina necesitamos un ácido muy fuerte: el ácido trifluoroacético (TFA). Así que, con mucho cuidado, el educador(a) agregará a la jeringuilla 3 ml de la mezcla ya preparada de TFA al 2% con una pipeta Pasteur.

Lo removemos un poco y esperamos 1 minuto.

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3 4Tomamos un tubo de 50 ml que contie-ne solución tamponadora para neu-tralizar el ácido. Lo colocamos debajo de la jeringuilla y eluimos la solución abriendo la llave.

Observamos que la solución que cae en el tubo es de color naranja-amarillo, mientras que la resina ya no está tan teñida. El péptido marcado se ha despegado de la resina y ahora lo tenemos ya en solución dentro del tubo, donde observamos dos fases.

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C Comprobamos que hemos conseguido el péptido marcado

Con la micropipeta, cogemos 200 µl de cada una de las dos fases y los pone-mos en dos tubos de 1,5 ml cada uno.

Una vez tenemos los 4 tubos llenos, añadimos a cada tubo 50 µl del reactivo de Bradford, que se une específicamente a proteínas y experimenta un cambio de color visible a simple vista. Los agitamos bien y observamos los distintos colores.

Paralelamente, hacemos un control positivo y uno negativo. Para el control positivo, cogemos 200 µl de una mues-tra de leche en polvo (sabemos seguro que contiene proteínas) y los añadimos a un tubo. Para el control negativo, cogemos 200 µl de agua desionizada (sabemos seguro que no contiene pro-teínas) y los añadimos a otro tubo.

Finalmente, hacemos un análisis para verificar la presencia de péptidos en la solución obtenida. Utilizaremos un método muy frecuente en los laboratorios: el método de Bradford.

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1. ¿Por qué utilizamos el reactivo de Bradford? A continuación, anota los colores que ves en cada tubo y observa cuáles contenían péptidos.

3. En un experimento, ¿qué entiendes por control positivo y control negativo? ¿Son necesarios?

2. Tras separar el péptido marcado de la resina y recogerlo en una solución neutralizante, has obtenido una solución con dos fases. ¿En cuál de las dos fases se encontraba el péptido?

4. ¿Por qué hacemos lavados tras acoplar el marcador fluorescente al péptido pegado a la resina?

Resultados y conclusiones

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5. ¿Qué diferencias visuales has observado en el microscopio entre las bolitas de resina secas sin marcar y las bolitas después del acoplamiento del marcador fluorescente?

7. ¿Por qué crees que es útil marcar un péptido con una molécula fluorescente?

6. ¿Por qué utilizamos el ácido trifluoroacético (TFA)?

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Anexo I

PReCAUCIOneS eSPeCíFICAS PARA eSTe TALLeR

• Disolventes orgánicos: -Dimetilformamida (DMF) -diclorometano (dCm) -ácido trifluoroacético (TFA) al 2%

Inflamables. Tóxicos por ingestión, inhalación y contacto con la piel.

• Disolución de carboxifluoresceína con N-etildiisopropilamina (DIEA):

Tóxica por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Mancha la piel.

• Solución neutralizante:

Tóxica por ingestión, inhalación y contacto con la piel.

PReCAUCIOneS de SeGURIdAd

InfórmateLocaliza los elementos de seguridad del labo-ratorio o espacio habilitado para experimentar (extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Antes de hacer un experimento, lee sus instrucciones con atención. No olvides leer las etiquetas de seguridad de los reactivos y de los aparatos.

Utiliza la indumentaria adecuadaGuantes, bata y gafas de protección.

normas generales Está prohibido fumar, comer o beber en el labo-ratorio o espacio habilitado para experimentar. Trabaja ordenadamente, con pulcritud y sin prisas. Si se vierte un producto, recógelo inme-diatamente. Deja siempre el material limpio y ordenado. No uses nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente cómo funciona. Lávate las manos antes de salir del laboratorio.

manipulación del vidrio Protégete las manos cuando manipules material de cristal. Tienes que tener en cuenta que a sim-ple vista no hay diferencia entre el cristal caliente y el frío, por lo tanto, asegúrate de su temperatu-ra antes de tocarlo. No uses cristal agrietado.

Productos químicos No uses ningún frasco de reactivos sin etiqueta o que no esté identificado como debe. No huelas, inhales, pruebes o toques los productos químicos. No pipetees nunca con la boca. Ponte guantes y lávate las manos a menudo si usas productos tóxicos o corrosivos. En caso de contacto con los ojos, lávatelos inmediatamente con agua abundante. No acerques envases de reactivos a una llama. No calientes líquidos inflamables. Transporta las botellas cogiéndolas por el fondo, nunca por arriba.

eliminación de residuos Deposita en contenedores especiales y debidamente etiquetados los residuos sólidos y líquidos que lo requieran. Si tienes alguna duda, consúltala con el educador(a). Nunca debes verter residuos sólidos en el fregadero.

Recuerda En caso de accidente, avisa de inmediato al educador(a).

 

 

 

 

 

 

 

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Anexo II

nOmBRe ReFeRenCIA CASA COmeRCIAL

Dimetilformamida (DMF) P0343521 Carlo Erba reagents

Diclorometano (DCM) P02905E58N Carlo Erba reagents

Ácido trifluoroacético (TFA) T6508-25ML Sigma-Aldrich

Carboxifluoresceína 21877-5G-F Sigma-Aldrich

N-etildiisopropilamina (DIEA) 550043-100ML Sigma-Aldrich

Solución tamponadora (PBS) * P4417-50TAB Sigma-Aldrich

Bolas de resina* BR-1065 Iris Biotech GmbH

Reactivo de Bradford B6916-500ML Sigma-Aldrich

Proteína BSA A7906-10G Sigma-Aldrich

Jeringuilla con filtro (fungible) 12131016 Agilent Technologies

Llave para la jeringuilla (reutilizable) 070.110.190 Ryan Herco Flow

Referencias para la compra de los reactivos y algunos materiales necesarios

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Anexo III

1. Solución orgánica para producir la reacción (contiene un 50% de diclorometano [dCm] \ y un 50% de dimetilformamida [dmF])Mezclad 20 ml de cada disolvente dentro de un tubo tipo Falcon que ya viene graduado.

2. Solución de carboxifluoresceína y otros reactivos:

• 23 mg de carboxifluoresceína• 85 µl de N-etildiisopropilamina (DIEA) • 1 ml de solución orgánica de dimetilformamida (DMF) y diclorometano (DCM) (50/50)

3. ácido trifluoroacético (TFA) al 2% en dCm

4. Solución tamponadora para neutralizar el ácido (PBS)

• 30 ml de la solución de PBS que ya viene preparada • 100 mg de proteína BSA

el educador(a) tendrá que hacer una síntesis previa de péptidos encima de esas bolas de resina. También existe la posibilidad de hacer el experimento con las bolas de resina sin péptido; entonces se tendrán que añadir proteínas a la solución neutralizante para garantizar un resultado positivo del método de Bradford. Podéis añadir una cucharada de proteína BSA.

Protocolos para la preparación de las soluciones por parte de los educadores(as):

Investigadores(as) que han contribuido con contenidos: Miguel Moreno Raja, Irene Martín Badajoz, Anna Guimerais, Muriel Arimón Bedós, investigadores(as) del Instituto de Investigación Biomédica (IRB Barcelona).

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