INTRODUCCIN:

La gentica es una parte de las ciencias biolgicas ms modernas, con al menos un siglo de existencia pero con un desarrollo vertiginoso colocndola como una de las ciencias ms destacadas del ltimo siglo. Su objeto de estudio es la herencia y la variacin dentro de ella tenemos a la gentica mdica que es una rama de la medicina que se encarga de estudiar el papel que desempean los factores hereditarios y genticos respecto de una enfermedad, un defecto congnito o la susceptibilidad heredada para ciertos problemas de salud.

El ADN hasta hace poco tiempo era una molcula que presentaba amplias dificultades para su anlisis bioqumico. A partir de los aos 70 se desarrollaron las herramientas de la ingeniera gentica, o lo que se ha denominado tcnicas del ADN recombinante. Hoy en da se pueden separar regiones determinadas del ADN, obtenerlas en grandes cantidades y determinar su secuencia de nucletidos. Durante la ltima dcada las tcnicas moleculares han mostrado una revolucionaria transformacin, que an no termina y que presenta un gran potencial al futuro, siendo conocida como la Medicina del Siglo XXI.

La Gentica desempea un papel de gran importancia en la prctica de la Medicina. Dado que todos los componentes del cuerpo humano estn influidos por los genes, los conocimientos bsicos de gentica conciernen a todas las especialidades mdicas. Sus aplicaciones tanto en la medicina clnica como en la medicina forense son mltiples, y en pocos aos podremos contar con sistemas ms rpidos, ms sensibles y fiables, que mejoren la calidad de pruebas.

As la gentica mdica intenta brindarles una descripcin general de los mecanismos genticos que pueden causar enfermedades. Se han incluido algunas condiciones genticas comunes como ejemplo, sin embargo no describimos todas las condiciones posibles. El objetivo es entender cul es el impacto que tiene la gentica en la salud de nuestros pacientes.

Por otro lado, existen algunos mtodos tradicionales que ya han entrado en desuso, y otros ms nuevos, que se encuentran en fase de experimentacin y transferencia tecnolgica, por lo que an no se los pueden aplicar.

En este trabajo, nos centraremos en cuatro metodologas bsicas, que por su utilidad y su aplicabilidad se estn generalizando en los laboratorios clnicos y forenses e incorporndose en la rutina del diagnstico. Estas metodologas son: tcnicas bsicas y herramientas utilizadas por la gentica molecular humana, ADN recombinante, anlisis de cidos nucleicos, PCR, secuenciacin del ADN, y los microarrays, las mismas que sern tratadas brevemente en este trabajo.

OBJETIVOS Conocer el papel importante que juega la tecnologa para el avance en el desarrollo de la gentica utilizando tcnicas de microarrays de ADN.

Comprender de que manera al tcnica de PCR ( reaccin en cadena de la polimerasa) permite aumentar una zona o regin especfica de ADN y sobre todo en una pequea cantidad de tiempo.

Entender las tcnicas ms importantes de la ingeniera gentica y valorar sus aplicaciones.

TCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE:El ADN recombinante no se refiere a la recombinacin gnica meitica o mittica, sino a procedimientos por los cuales una molcula de ADN es cortada en un lugar determinado y luego pegada (con el mismo fragmento o con otro), mediante el uso de ciertas enzimas de existencia natural en microorganismos (enzimas de restriccin, ligasas), tambin se refiere a los procedimientos que se utilizan para multiplicar una molcula determinada de ADN (o un fragmento de ella) mediante su incorporacin a elementos autorreproducibles en microorganismos.Estas tcnicas se basan en organismos vivos, por lo tanto es conveniente explicar la funcin de biolgica de estos elementos de la llamada Ingeniera Gentica. Las herramientas bsicas que se utilizan son las enzimas de restriccin, cuyo conocimiento es absolutamente necesario para comprender la biotecnologa.1) ADN RECOMBINANTE:A principios de 1970, este trmino nace como respuesta a la necesidad de obtener grandes cantidades de un gen o de un genoma completo para llevar a cabo estudios que permitiesen de un gen concreto: obtener secuencias de nucletidos, estudiar mutaciones y analizar funciones.Desde el primer experimento que mostr la posibilidad de propagar un fragmento de ADN de eucariotas en una bacteria, la tecnologa del ADN recombinante se ha utilizado con xito en muchos campos desde aplicaciones con fines industriales, dando lugar a la Biotecnologa, hasta la deteccin de alteraciones genticas, incluyendo por lo tanto, modificaciones genticas de los organismos y terapias gnicas.La utilizacin del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias especficas de DNA a partir de una poblacin de secuencias mezcladas. Los procedimientos bsicos incluyen una serie de pasos:1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restriccin, que reconocen y cortan lasmolculas de DNA por secuencias nucleotdicas especficas.2. Los fragmentos producidos mediante la digestin con enzimas de restriccin se unen a otras molculas de DNA que sirven de vectores.Los vectores pueden replicarse autnomamente en una clula husped y facilitan la manipulacin de la molcula de DNA recombinanterecin creada.3. La molcula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se transfiere a una clula husped.Dentro de esta clula, la molcula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias idnticas conocidas como clones.4. Al replicarse las clulas husped, las clulas descendientes heredan el DNA recombinante, crendose una poblacin de clulas idnticas,que llevan todas la secuencia clonada.5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las clulas husped, purificarse y analizarse.6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto gnico puede aislarse y examinarse.

2) ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN:

En los aos 1950 se descubri que algunos bacterifagos podan infectar algn tipo concreto de bacterias, debido a que algunas bacterias eran capaces de digerir el ADN del fago y por tanto impedan su crecimiento. Como el fago tiene un rango restringido de huspedes que puede infectar, a dicho sistema se le llam sistema de restriccin. Posteriormente se descubri que dicha restriccin se lleva a cabo gracias a unas enzimas del tipo endonucleasas. estas son enzimas que se encuentran en la naturaleza, en numerosas especies de bacterias, en las cuales desempean un papel defensivo.

Estas enzimas aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones vricas degradando el cido nucleico invasor. Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia especfica de nucletidos (denominada sitio de restriccin) de una molcula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorg a Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por su investigacin sobre las enzimas de restriccin. Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restriccin diferentes.

Por ejemplo, en el caso del bacterifago su mecanismo se basa en cortar las molculas de ADN del bacterifago, y de esa manera eliminarlo. Dado que estas enzimas cortan el ADN solamente cuando encuentran su secuencia de bases especfica a lo largo de la doble hlice y no en sus extremos, es que se denominan endonucleasas de restriccin (cortan por dentro).Entonces podemos concluir que las endonucleasas de restriccin son enzimas que reconocen secuencias de doble cadena especficas en el DNA y las escinden a nivel de los elementos fosfodister de la doble hlice del DNA en el lugar de reconocimiento o cerca de este.

a)Mecanismo de AccinMuchas enzimas de restriccin reconocen una secuencia especfica de bases del ADN que palindrmica, es decir que puede leerse, invertida, en la hlice complementaria. Estas secuencias palindrmicas tienen otras propiedades extraordinarias: Poseen un eje de simetra en cada hlice, lo cual hace que cada hlice tenga auto complementariedad en su secuencia; as, ese segmento palindrmico puede escribirse en forma cruciforme. En general pueden adoptar ms de una forma espacial cuando se encuentran en un mol.A su vez las enzimas que reconocen estos palndromos, como la EcoRI est constituida por dos subunidades simtricas (estructura cuaternaria), cada una de las cuales tiene un sitio (dominio) de reconocimiento (de la secuencia de una hlice) y un sitio activo de corte (catlisis)

b)ClasificacinLas enzimas de restriccin han posibilitado casi todos los dems adelantos logrados en el conocimiento del genoma (humano y de otros organismos) por dos espectaculares propiedades: Son capaces de cortar de manera regular e infalible el ADN en secuencias especficas. Al cortar el ADN, muchas de ellas dejan en cada extremo un segmento pegajoso monocatenario, capaz de unirse exactamente a su segmento complementario. Por lo tanto, estas enzimas no solo cortan especficamente sino que adems dejan un puente especfico y articulado para repegarse cuando se agrega una ligasa.

Para que se produzca el repegado de las dos caras del corte inferido por una enzima de restriccin, se requiere consumo de energa (provista por el ATP) y una enzima ligasa de ADN (p. ej., la ligasa T4) Por consiguiente, es posible cortar y repegar molculas de ADN de diferente origen usando la misma enzima de restriccin.No todas las enzimas de restriccin tienen las propiedades descritas con anterioridad (es decir, cortar el ADN dentro de la secuencia reconocida, dejar "extremos pegajosos", reconocer secuencias palindrmicas). En realidad las enzimas de restriccin pueden clasificarse en tres grupos:Tipo 1: Son complejos multiproteicos que reconocen secuencias especficas de ADN simtricas. Estas endonucleasas adems de cortar el ADN, pueden metilarlo. Su corte se produce a alrededor de 1000 nucletidos de distancia; no existe una secuencia predecible de corte. Requieren la presencia de ATP.

Tipo 2: Son las de mayor inters para la ingeniera gentica. Suelen actuar en forma de dmeros. Su caracterstica principal es que el corte endonucletico tiene lugar dentro de la misma secuencia de reconocimiento por la que se une al ADN (cortan el ADN en secuencia especifica). No requieren ATP y en su mayora dejan extremos de corte pegajoso. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia de una de las cadenas leda en direccin 5' 3' es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leda tambin en direccin 5' 3'. Otras enzimas de restriccin de Tipo II, como SmaI, cortan el DNA formando fragmentos romos. Los fragmentos de DNA con extremos romos tambin pueden unirse y formar molculas recombinantes, pero primero deben modificarse. La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal se utiliza para crear extremos de cadena sencilla mediante la adicin de colas de nucletidos.

Tipo 3: Son complejos multiproteicos que reconocen secuencias especficas de ADN simtricas. Cortan el ADN en las cercanas del lugar reconocido por la enzima pero poseen accin metilante y requieren ATP.