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AllplexTM

Panel Respiratorio 1

(Flu / VSR / Subtipificación Flu A)

(Cat. No. RP9801X)

Sistema de PCR en tiempo real múltiplex con RT (Transcripción Inversa) en un solo

paso para la detección de virus de la Influenza A, virus de la Influenza B, virus sincitial

respiratorio humano A, virus sincitial respiratorio humano B, y la subtipificación del

virus de Influenza A (Virus de la Influenza Humana A subtipos H1, H3, y H1pdm09) en

aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares.

Para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet

Para su uso con el

1. Sistema de PCR en Tiempo Real CFX96TM (Bio-Rad)

(Uso para Diagnóstico In Vitro)

Éste producto puede ser usado con propósitos IVD en países autorizados.

(Únicamente para uso en investigación)

Este producto debe usarse para propósitos RUO en otros países.

No disponible en los Estados Unidos

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Panel Respiratorio AllplexTM 1

TABLA DE CONTENIDOS

NOTIFICACIONES------------------------------------------------------------------------------------------------------ 3

USO PREVISTO --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4

PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO --------------------------------------------- 5

ANTECEDENTES ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

REACTIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9

MANEJO Y ALMACENAMIENTO ----------------------------------------------------------------------------------- 9

MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO ------------------------------------------------------------------------- 10

PROTOCOLO --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11

CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ------- 16

RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS -------------------------------------------------------------------------------------- 28

RENDIMIENTO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 30

REFERENCIAS -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34

SIMBOLOGÍA --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36

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NOTIFICACIONES

Este producto se puede utilizar con propósitos IVD (Diagnóstico In Vitro) en la UE dado que

la Marca IVD CE está aprobada por la Directiva de la UE (98/79/EC) y países autorizados,

pero debe utilizarse para propósitos RUO (Uso Exclusivo en Investigación) en otros países.

La confiabilidad de los resultados depende de la toma adecuada de la muestra, el

almacenamiento, el transporte y la ejecución de procesamiento.

Es posible usar el mismo ácido nucleico aislado para los Paneles Respiratorios

AllplexTM 1, 2, y 3.

Si la misma muestra será evaluada también con el kit del Panel Respiratorio AllplexTM

4 adicionar ambos RP-V IC y RP-B IC al ácido nucleico aislado (Véase página 12).

Este producto es para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB

STARlet, máximo 5 ensayos separados.

Ésta prueba ha sido validada para los siguientes tipos de muestras: aspirados

nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares. Ésta prueba no

ha sido validada para otros tipos de muestras.

Almacene las muestras de ADN/ARN a ≤ -20℃ hasta su uso y manténgalas en hielo

durante su uso.

La sensibilidad del ensayo puede disminuir en las muestras que son congeladas y

descongeladas repetidamente o almacenadas por largos periodos de tiempo.

El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder de manera unidireccional.

Use siempre guantes desechables en cada área y cámbielos antes de ingresar a áreas

diferentes. Cambie los guantes inmediatamente si se contaminan o trátelos con un reactivo

descontaminante de ADN.

Asigne suministros y equipos a las áreas de trabajo separadas y no los mueva de un área

a la otra.

No pipetee con la boca.

No coma, beba o fume en las áreas de trabajo del laboratorio. Use guantes desechables

libres de talco, batas de laboratorio y gafas protectoras cuando manipule muestras y

reactivos. Lávese bien las manos después de manipular muestras y los reactivos de la

prueba.

Evite contaminar los reactivos al extraer las alícuotas de los tubos de reactivos. Se

recomienda el uso de puntas para pipetas estériles, desechables y con filtro resistente a

aerosoles

No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de tubos diferentes del mismo lote.

No use este producto después de la fecha de vencimiento.

Todos los elementos desechables se pueden usar una sola vez. No los reutilice.

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Use tubos de tapa rosca y evite las posibles salpicaduras o contaminación cruzada de

muestras durante la preparación.

Sea cuidadoso de no contaminar los reactivos con ácidos nucleicos aislados, productos de

la PCR, y control positivo. Para prevenir la contaminación de los reactivos, se recomienda

usar puntas con filtro.

Use áreas separadas para cada experimento.

Prepare y use un set diferente de pipetas para cada una de las siguientes áreas:

aislamiento de ácido nucleico, mezcla de reactivos, la adición del ácido nucleico molde y la

adición de productos de PCR.

Solo en un espacio designado, abra los tubos de reacción o tiras de PCR después de la

amplificación, para evitar la contaminación con amplicones.

Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit.

Los procedimientos de seguridad en el laboratorio (remitirse a Bioseguridad en laboratorios

microbiológicos y biomédicos y Documentos del CLSI) se deben tener en cuenta para

manipular las muestras. Limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con

hipoclorito de sodio al 0.5% (en agua desionizada o destilada). Los componentes del

producto (residuos del producto, empaque) se pueden considerar residuos de laboratorio.

Deseche los reactivos no usados y los residuos de conformidad con los reglamentos

federales, estatales y locales aplicables.

USO PREVISTO

El Panel Respiratorio AllplexTM 1 es un ensayo cualitativo in vitro para la detección simple o

múltiple de virus de Influenza A (Flu A), virus de Influenza B (Flu B), virus sincitial respiratorio

humano A (VSR A), virus sincitial respiratorio humano B (VSR B), virus de Influenza humana A

subtipo H1 (Flu A-H1), virus de Influenza humana A subtipo H3 (Flu A-H3) y virus de Influenza

humana A subtipo H1pdm09 (Flu A-H1pdm09) en muestras de aspirados nasofaríngeos,

hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares.

Flu A: Los primers están diseñados en regiones conservadas en el gen matriz (M1) para

detectar distintos subtipos del virus de influenza A. Con base en el análisis in silico, pueden

detectar secuencias del subtipo H5N1 que causa la gripe aviar altamente patogénica, y el

nuevo virus de influenza A (subtipo H7N9) de origen aviar que se detectó por primera vez en

China en marzo de 2013.

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Subtipos de Flu A: Los primers están diseñados en regiones conservadas del gen de la

hemaglutinina (HA). Detectan casi todos y cada uno de los subtipos (H1, H3, y H1pdm09) del

virus de influenza humana A.

PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO

1. Principios

El Panel Respiratorio AllplexTM 1 es representativo de la tecnología patentada de Seegene

MuDT™, la cual proporciona valores multi-Ct (ciclo umbral) en un solo canal de fluorescencia

sin análisis de curvas de melting en los instrumentos para PCR en tiempo real.

El Panel Respiratorio AllplexTM 1 es un ensayo de RT-PCR en tiempo real multiplex en un solo

paso que permite la amplificación simultánea y la detección de ácidos nucleicos objetivo de Flu

A, Flu B, VSR A, VSR B, Flu A-H1, Flu A-H3, Flu A-H1pdm09 y el Control Interno (IC).

En la PCR, la eficiencia de amplificación puede reducirse usualmente por inhibidores que se

pueden presentar en las muestras clínicas. Por ende, el control interno (IC) es incorporado

dentro del producto como un control exógeno de todo el proceso para monitorear el aislamiento

de ácidos nucleicos y verificar una posible inhibición de la RT-PCR. El IC es co-amplificado con

los ácidos nucleicos objetivos en las muestras clínicas.

2. Descripción General del Procedimiento

< Descripción general del procedimiento del Panel Respiratorio AllplexTM 1 >

Muestras

(Aspirados nasofaríngeos, hisopados

nasofaríngeos y lavados broncoalveolares)

Aislamiento de ácidos

nucleicos

ADN/ARN Viral

RT-PCR en tiempo real

en un solo paso

utilizando el sistema

AllplexTM

Análisis de resultados

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ANTECEDENTES

1. Infección por Virus Respiratorios

La Infección Respiratoria tiene dos categorías: la infección del tracto respiratorio superior y la

infección del tracto respiratorio inferior. La infección del tracto respiratorio superior es causada

por patógenos que invaden por vía nasal, faríngea, auris media, espenculus, etc. Cualquier

infección detectada en el tracto respiratorio que se encuentre por debajo de la laringe es

categorizada como una infección del tracto respiratorio inferior. Entre las infecciones del tracto

respiratorio inferior, las infecciones virales pueden dividirse en cuatro grupos principales

denominados, neumonía, bronquiolitis, laringotraqueobronquitis y traqueobronquitis. Las

diferencias de edad para cada virus se presentan en las víctimas que se infectan. Además, los

síntomas pueden diferir en pacientes que incluso tengan el mismo tipo de virus. Aunque cada

virus puede causar síntomas para todos los cuatro tipos de infecciones del tracto respiratorio

inferior, algunos síntomas aparecen con frecuencia en una infección específica que en otras.

Por ejemplo, el VSR puede aparecer en todas las edades desde infantes a adultos, pero este

causa una infección del tracto respiratorio superior en adultos y bronquiolitis en bebés.

Usualmente, el VSR causa neumonía en infantes, y la mayoría de pacientes que son

diagnosticados con infecciones del tracto respiratorio inferior son niños con menos de dos

años, en su mayoría niños con menos de seis meses de edad.

Aunque los adultos tienen buenos niveles de inmunidad por las repetidas infecciones por virus

respiratorios desde su infancia, el sistema inmune es limitado, imperfecto y vulnerable a los

virus respiratorios, usualmente infecciones del tracto respiratorio superior. Sin embargo, los

pacientes con un sistema inmune decaído pueden desarrollar infecciones del tracto respiratorio

inferior tales como neumonía. En casos de influenza, debido a que es una variación antigénica

del virus, los pacientes con enfermedades subyacentes y personas mayores se infectan

frecuentemente y desarrollan neumonía. Además, puede deteriorar las enfermedades

subyacentes que pueden causar la muerte del paciente. Investigaciones recientes afirman que

el VSR produce los mismos síntomas que la influenza.

2. Virus de la influenza

El virus de la influenza (de la familia Orthomyxoviridae) presenta un genoma de ARN de

cadena sencilla de sentido negativo que está presente en 8 segmentos separados de

ribonucleoproteína. Esta segmentación del genoma es poco común entre los virus y muy

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probablemente contribuye al rápido desarrollo de nuevas variedades de influenza, a través del

intercambio de segmentos génicos entre virus diferentes que infectan la misma célula. Existen

3 tipos de virus de influenza: A, B y C. Los virus A y B son los más comunes de los tres. Sobre

todo, el virus tipo A es conocido como el más común por infectar no solo seres humanos, sino

también aves y varios tipos de mamíferos. Entre los virus de influenza que invaden seres

humanos, el H1N1 y H3N2 se están convirtiendo en un problema por infectar niños y personas

mayores.

Los tipos B y C se limitan a afectar solamente a seres humanos. Los primeros síntomas por

influenza son descarga nasal, congestión nasal, dolor de garganta, tos, fiebre, nasofaringitis o

síntomas similares por rinitis aguda, escalofríos, y dolor muscular, los cuales son más graves

que el resfriado común. Específicamente, los síntomas de influenza causan alta fiebre y

desarrollan complicaciones debido a infecciones bacterianas.

3. Virus Sincitial Respiratorio (VSR)

El virus sincitial respiratorio (de la familia Paramyxoviridae) es un virus envuelto de un genoma

de ARN de cadena sencilla de sentido negativo. El VSR tiene una alta frecuencia de ocurrencia

entre otras enfermedades respiratorias. Está caracterizado como clínicamente significativo por

causar muertes en bebés con malformaciones cardíacas congénitas, infantes prematuros, y

bebés con cirugía de corazón abierto reciente. La bronquiolitis es el tipo más común de

infección de VSR en infantes, pero no aparece tan a menudo después de un año de edad. Por

otro lado, la neumonía es un problema para todos los infantes. El VSR es el responsable de

desarrollar el 45~75% de bronquiolitis, el 15~25% de neumonía en infantes, y 6~8% de

laringotraqueobronquitis. El VSR era originalmente conocido como patógenos que

desarrollaban enfermedades en bebés, pero estudios recientes demuestran que el VSR que se

presenta en adultos puede producir resultados tan graves como la influenza, tales como la

transferencia y muerte. Además, si los pacientes que tienen el sistema inmune decaído (que se

hayan sometido a trasplante de médula ósea o trasplante de órganos sólidos) son infectados

por el VSR que causa neumonía, la probabilidad de que se produzca la muerte es de un 50%.

4. Influenza Estacional

La influenza estacional es una infección viral aguda causada por un virus de influenza. Los

virus de influenza tipo A se dividen además en subtipos de acuerdo a las clases y

combinaciones de proteínas superficiales virales. Entre muchos subtipos de virus de influenza

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A, los subtipos H1N1 y H3N2 son los más recientes que están circulando entre los seres

humanos. Los virus de influenza circulan en todo el mundo. Los casos de virus de influenza

tipo C ocurren con mucha menor frecuencia que los de tipo A y B. Esa es la razón por la cual

solamente los virus de influencia A y B están incluidos en las vacunas de influenza estacional.

Las epidemias de influenza ocurren cada año en otoño y en invierno en las regiones

templadas. Las enfermedades causan hospitalizaciones y muertes, principalmente entre

grupos de alto riesgo (infantes, personas mayores o enfermos crónicos). En todo el mundo,

estas epidemias anuales causan cerca de tres a cinco millones de casos de enfermedades

graves, y aproximadamente de 250.000 a 500.000 muertes. La mayoría de muertes asociadas

a la influenza en países industrializados se presentan en las personas de 65 años o más.

5. Subtipo H1N1 del virus de Influenza A de origen porcino (H1pdm09)

El H1N1, un subtipo del virus de influenza A, es la causa más común de influenza (gripe) en los

seres humanos. Algunas cepas de H1N1 son endémicas y también son responsables de una

pequeña parte de todas las enfermedades similares a la influenza y de una gran parte de toda

la influenza estacional. Por ejemplo, en 2006, las cepas H1N1 causaron aproximadamente la

mitad de todas las infecciones humanas de gripe. Otras cepas de H1N1 son endémicas en

cerdos (influenza porcina) y en aves (influenza aviar). En junio de 2009, la Organización

Mundial de la Salud (OMS) declaró que una nueva cepa de origen porcino H1N1 era la

responsable de la pandemia de gripe de 2009 y elevó el nivel de alerta a la fase 6; esta era la

primera pandemia global desde la gripe de Hong Kong de 1968. Esta cepa es denominada

comúnmente como “gripe porcina” por los medios públicos de comunicación. Se descubrió que

el origen porcino H1pdm09 aislado de los pacientes en Estados Unidos estaba compuesto de

elementos genéticos de cuatro virus de gripe distintos - influenza en Norteamérica y México,

influenza aviar de Norteamérica, influenza humana y el virus de la influenza porcina encontrado

por lo general en Asia y en Europa: “una mezcla inusualmente mestiza de secuencias

genéticas”. Esta nueva cepa parece ser el resultado de un intercambio de virus de influenza

humana y porcina, en todas las cuatro diferentes cepas del subtipo H1N1.

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REACTIVOS

Los reactivos contenidos en un kit son suficientes para 50 reacciones.

Información de pedido ( RP9801Y)


Símbolo Contenido Volumen Descripción

5X RP1 MOM 500 μL

Mezcla de Oligos MuDT (MOM):

- Reactivo para la amplificación y detección

Enzima para tiempo real en un

solo paso 200 μL

Mezcla de enzimas para la RT-PCR en un solo paso.

Buffer 5X para tiempo real en un

solo paso 500 μL

Buffer para RT-PCR en un paso – Buffer que contiene dNTPs.

RP1 PC 80 μL Control Positivo (PC):

- Mezcla de patógenos y clones de IC

RP-V IC 1000 μL Control Interno Exógeno (IC) para el Panel Respiratorio Allplex 1, 2, y 3

Agua libre de RNasas

1.000 μL

Control Negativo (NC) grado PCR de

calidad ultrapura:

- Agua esterilizada como control negativo

Manual de usuario

AllplexTM es una marca registrada de Seegene Inc.

MANEJO Y ALMACENAMIENTO

Todos los componentes del Panel Respiratorio 1 AllplexTM deben almacenarse a -20° C.

Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta. El

congelamiento y descongelamiento repetido debe evitarse ya que podría disminuir la

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sensibilidad. Si los reactivos serán usados de manera intermitente, deberán almacenarse en

alícuotas.

MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO

Guantes desechables libres de polvo (látex o nitrilo).

Pipetas (ajustables) y puntas estériles.

Microcentrífuga para tubos de 1.5 ml.

Kit para aislamiento de ácidos nucleicos.

Máquina de hielo.

Centrífuga de mesa.

Agitador vórtex.

Equipo para PCR en tiempo real CFX-96TM (Bio-Rad).

Tiras de 8 tubos de bajo perfil de 0.2 ml sin tapas (color blanco, No. Cat. TLS0851, Bio-Rad)

Tiras de 8 tapas planas de grado óptico (No. Cat. TCS0803, Bio-Rad)

Plato de 96 pozos, pozo blanco. (cat. No. HSP-9655, Bio-Rad)

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PROTOCOLO

1. Toma de muestra, almacenamiento y transporte

Nota: Todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos.

Sólo las muestras que sean recogidas, transportadas y almacenadas y atiendan estrictamente

las siguientes normas e instrucciones, serán permitidas:

Nota: Para garantizar una alta calidad de las muestras, se deben transportarse lo más

rápidamente posible. Las muestras tienen que ser transportadas en las condiciones de

temperatura indicadas.

A. Toma de muestra

Aspirado nasofaríngeo, hisopado nasofaríngeo, lavado broncoalveolar

Las muestras de aspirado nasofaríngeo, hisopado nasofaríngeo, y el lavado broncoalveolar

son examinadas rutinariamente para patógenos respiratorios comunes.

La obtención de las muestras puede ser difícil en algunos pacientes. En tales casos, el

hisopado nasofaríngeo puede recolectarse simple y eficientemente con el hisopo de nylon

(COPAN, Italia) y en el medio universal de transporte (UTM).

Manufacturer Specimen collection device Cat. No.

COPAN ESwab 482CE

COPAN ENAT PM 2ML PERNASAL APPLICATOR 606CS01P

COPAN UTM con hisopos flocados 360C / 305C

DIAGNOSTIC HYBRIDS UTM con hisopo flocado de minipunta flexible

403C / 406C

Nota: Recomendaciones del kit de ácidos nucleicos para el MICROLAB NIMBUS IVD o MICROLAB STARlet. SE RECOMIENDA ESPECIALMENTE SEGUIR LAS SIGUIENTES INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE. 1. Utilice el kit STARMag 96 para tejidos o para virus para muestras clínicas tomadas en UTM. 2. Utilice el kit STARMag 96 para tejidos para muestras clínicas tomadas en ESwab. 3. Utilice el kit STARMag 96 para virus para muestras clínicas tomadas con ENAT.

B. Almacenamiento y transporte de muestras

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Muestra

Almacenamiento y Transporte

Nota Temperatura Duración*

Aspirado Nasofaríngeo

2~8°C. 3 días.

- El desempeño podrá afectarse

por el almacenamiento

prolongado de las muestras.

- Las muestras deben ceñirse a

las instrucciones locales y

nacionales para el transporte de

material patogénico.

Hisopado Nasofaríngeo

Lavado broncoalveolar

* Duración: Muestras tomadas de la prueba antes del periodo.

2. Aislamiento de ácidos nucleicos

Diversos fabricantes ofrecen kits para aislamiento de ácidos nucleicos. Use el protocolo

correcto de acuerdo al protocolo del fabricante. Los siguientes kits han sido validados para uso

con este kit.

A. Control Interno

Nota: IC está incluido en el kit para permitir a los usuarios confirmar no solamente el

procedimiento de extracción de ácidos nucleicos sino también identificar cualquier inhibición de la

RT-PCR.

Se deben añadir 10 μL de RP-V IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos nucleicos.

Cuando use este producto con el kit del Panel Respiratorio AllplexTM 4, debe agregar 10 μL

de RP-V IC y 10 μL de RP-B IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos nucleicos.

B. Sistema automatizado para el aislamiento de ácidos nucleicos

B-1. MICROLAB NIMBUS IVD

Nota: Por favor use las muestras y los volúmenes de elución como se indica abajo. Para todos

los demás, refiérase al protocolo del fabricante.

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Sistema automatizado para el aislamiento

Fabricante Cat. No. Vol. recomendado

MICROLAB NIMBUS IVD Hamilton 65415-02* -

STARMag96 Virus Seegene 744800.4.205875 Muestra: 600 µL

Elución: 100 µL

Cartucho para virus STARMag 48 X 8

Seegene 744800.4.VC384 Muestra: 600 µL

Elución: 100 µL

STARMag 96 Tejido Seegene 744300.4.205875 Muestra: 450 µL

Elución: 100 µL

Cartucho para tejidos STARMag 48 X 8

Seegene 744300.4.TC384 Muestra: 450 µL

Elución: 100 µL

* Si desea comprar este producto a Seegene Inc., por favor utilice este número de Cat.

B-1. MICROLAB STARlet

Nota: Por favor use las muestras y volúmenes de elución recomendados como se indica abajo.

Para todos los demás refiérase al protocolo del fabricante.

Sistema de aislamiento automatizado

Fabricante Cat No. Vol. recomendado

MICROLAB STARlet Hamilton 173000-075* -

STARMag 96 Virus Seegene 744800.4.205875 Muestra: 600 µL

Elución: 100 µL

STARMag 96 Tejido Seegene 744300.4.205875 Muestra: 450 µL

Elución: 100 µL

* Si desea comprar este producto a Seegene Inc., por favor utilice este número de Cat.

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3. Preparación de la RT-PCR en tiempo real en un solo paso.

Nota: Se deben usar los tubos y tapas correctas (véase MATERIAL REQUERIDO NO

INCLUIDO).

Nota: Se deben usar puntas con filtro resistente a aerosoles y guantes ajustados durante la

preparación de las reacciones RT-PCR de un solo paso. Preste cuidado especial para prevenir la

contaminación cruzada.

Nota: Descongele completamente los reactivos sobre hielo.

Nota: Prepare todas las reacciones sobre hielo para minimizar el riesgo de degradación del ARN.

Nota: Centrifugue brevemente los tubos de reactivos para remover gotas del interior de la tapa.

Nota: Los pasos A – D se procesan se procesan automáticamente en el MICROLAB

NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet. Remítase a cada manual de operación.

A. Prepare la Mastermix de la RT-PCR en un solo paso

5 µL 5X RP1 MOM

5 µL Agua libre de RNasa

5 µL Buffer 5X para tiempo real en un solo paso

2 µL Enzima para tiempo real en un solo paso

17 µL Volumen total de Mastermix de RT-PCR en un solo paso

Nota: Calcule la cantidad necesaria de cada reactivo requerida según el número de reacciones

(muestras + controles).

B. Mezcle por inversión el tubo 5 veces o haga un vórtex rápido, y centrifugue brevemente.

C. Alicuote 17μL de Mastermix de RT-PCR en un solo paso en los tubos de PCR.

D. Adicione 8μL de cada ácido nucleico en el tubo que contiene la alícuota de Mastermix de RT-

PCR en un solo paso.

17 μL Mastermix de RT-PCR en un solo paso

8 μL Ácido nucleico de la muestra.

25 μL Volumen total de la reacción.

E. Cierre la tapa y centrifugue brevemente los tubos de PCR.

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F. Verifique que el líquido que contiene todos los componentes de la PCR este en el fondo de

cada tubo de PCR. Si no es así, centrifugue nuevamente a un rpm más alto por un mayor

tiempo.

Nota: Los tubos de PCR deben ser centrifugados antes de iniciar la reacción de PCR. Esto

fuerza a que el líquido vaya al fondo y a eliminar burbujas de aire.

Correcto Incorrecto

Nota: Use una punta nueva estéril para cada muestra.

Nota: Para el Control Negativo (NC), use 8µL de agua libre de RNasa en lugar de ácido

nucleico de muestra.

Nota: Para el Control Positivo (PC), use 8μL de RP1 PC.

Nota: Por favor ser cuidadoso de no contaminar la Mastermix de RT-PCR en un solo paso ni las

muestras con el Control Positivo.

Nota: Los tubos de PCR deben mezclarse y centrifugarse antes de iniciar la reacción de PCR.

Asegúrese que el líquido que contiene todos los componentes de la reacción de la PCR este en

el fondo de cada tubo de PCR.

Nota: No marque la tapa de los tubos de reacción dado que la fluorescencia es detectada a

través de la tapa del tubo.

Burbuja

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CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANÁLISIS DE

RESULTADOS

1. Sistema para PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-Rad)

1.1. Configuración del Equipo para PCR en tiempo real

Nota: La configuración del experimento en el Sistema para PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-

Rad) puede dividirse en tres pasos: Configuración del Protocolo, Configuración de la Placa, Inicio

del Ensayo.

A. Configuración del Protocolo

1) En menú principal, seleccione File New Protocol para abrir la ventana de Protocol

Editor.

Fig. 1. Configuración del Protocolo. Cree un Nuevo protocolo o cargue un protocolo existente

para el experimento

2) En Protocol Editor, defina el perfil térmico como se menciona a continuación:

Nota*: Lectura de placa en el segmento 4 y 5. Fluorescencia detectada a 60°C y 72°C.

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Fig. 2. Editor del Protocolo

3) Haga clic sobre Sample Volume para modificar directamente el valor a 25 μL.

4) Haga clic en OK y guarde el protocolo para abrir la ventana de Experiment Setup.

Fig. 3. Configuración del Experimento: Protocolo

B. Configuración de la Placa

1) En la pestaña Plate en Experiment Setup, haga clic en Create New para abrir la ventana de

Plate Editor para crear una nueva placa.

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Fig. 4. Editor de Placa. Cree una nueva placa

2) Haga clic en Select Fluorophores para indicar los fluoróforos (FAM, HEX, Cal Red 610, y

Quasar 670) que serán utilizados en el experimento y haga clic en OK.

Fig. 5. Seleccionar Fluróforos (FAM, HEX, Cal Red 610 y Quasar 670)

3) Seleccione los pozos deseados y luego su tipo de muestra del menú desplegable Sample

Type.

- Unknown: Muestras clínicas

- Control Negativo

- Control Positivo

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4) Haga clic en las casillas de verificación apropiadas (FAM, HEX, Cal Red 610 y Quasar 670)

para especificar los fluoróforos que se detectarán en los pozos seleccionados.

5) Digite el nombre de la muestra en Sample Name y presione la tecla enter.

6) En Settings del menú principal del Plate Editor, elija el tamaño de la placa en Plate Size (96

wells) y el tipo de placa en Plate Type (BR White).

Fig. 6. Plate Setup

7) Haga clic en OK para guardar la nueva placa.

8) Se devolverá a la ventana de Experiment Setup.

Fig. 7. Configuración del Experimento: Placa

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C. Inicio del ensayo

1) De la pestaña Start Run en Experiment Setup, haga clic en Close Lid para cerrar la tapa del

equipo.

Fig. 8. Cierre de Tapa

2) Haga clic en Start Run.

3) Guarde el archivo del ensayo en Mis Documentos o en la carpeta que usted designe. Ingrese

el nombre del archivo, haga clic en SAVE, y el ensayo iniciará.

1.2. Análisis de datos

A. Cree carpetas para la exportación de datos

1) Cree una carpeta para guardar los resultados de la curva de amplificación.

2) El nombre de la carpeta podrá ser designado por el usuario (Para la función ‘Seegene

Export’, las Carpetas “QuantStep4” y “QuantStep5” se crean automáticamente para guardar

los datos de cada curva de amplificación en la carpeta creada por el usuario).

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B. Pre-ajustes para el Análisis de Datos en el CFX96TM

1) Después de la prueba, haga clic en la pestaña de Cuantificación para confirmar los resultados

de curva de amplificación.

Fig. 9. Resultados de la curva de amplificación

2) Seleccione No Baseline Subtraction del Modo de Análisis del menú Settings.

Fig. 10. Sin sustracción de línea de referencia

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3) Seleccione Seegene Export del menú Tools.

Fig. 11. Exportación Seegene

4) Elija una ubicación para guardar los datos y haga clic en OK.

Fig. 12. Exportación Seegene a la carpeta designada

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C. Ajustes para el análisis de datos en el Seegene Viewer

1) Abra el programa Seegene Viewer, y haga clic en Open para encontrar el archivo guardado en

la carpeta “QuantStep4”.

Fig. 13. Seegene Viewer

2) Después de abrir la carpeta de resultados, seleccione el kit de prueba del menú PRODUCT.

Fig. 14. Ajustes para el análisis de datos en Seegene Viewer

Nota: Por favor verifique el tipo de tubo al seleccionar el kit de prueba (banda de 8 o

placa de 96).

24 10/2015 V1.03


3) Verifique el resultado de cada pozo.

Fig. 15. Resultados de la prueba en el CFX96TM mediante el Seegene Viewer

4) Abreviaciones en el informe.

Analito Seegene Viewer

Flu A-H1pdm09 pdm09

Flu A-H1 H1

Flu A-H3 H3

25 10/2015 V1.03


RESULTADOS

1. Interpretación de Resultados

Fluoróforo

Analito

Gráfica 1 Gráfica 2

FAM VSR A Flu A

HEX VSR B Flu B

Cal Red 610 Flu A-H1pdm09 Flu A-H1

Quasar 670 IC Flu A-H3

Valor Ct Resultado

≤ 42 Detectado (+)

> 42 or N/A No detectado (-)

Resultado Objetivo* Resultado

IC Interpretación

Gráfica 1 Gráfica 2

+ -

+

Ácido nucleico objetivo, Detectado

- +

+ +

+ -

-

Ácido nucleico objetivo, Detectado **

- Virus respiratorios adicionales que no fueron detectados pueden estar presentes.

- +

+ +

- - + Ácido nucleico objetivo, No detectado

26 10/2015 V1.03


- - -

Inválido***

- Señal débil o negativa del control interno es

indicativa de una toma de muestra inadecuada, o

errores en el procedimiento o presencia de

inhibidores.

- Repita la prueba de aislamiento de ácido nucleico

utilizando otra alícuota de la muestra original.

- Si el mismo resultado se muestra en el ácido

nucleico re-aislado, por favor diluya la muestra

(1/3~1/10) en solución salina y repita el aislamiento

(después de añadir RP-V IC) y RTPCR.

* Si se detecta solamente el virus de Influenza A, pero no el subtipo de virus de Influenza A, es

debido a que el subtipo no puede ser identificado por este producto o a que la carga viral de la

muestra es muy bajo. El subtipo del virus de Influenza A podrá ser identificado por medio de la

secuenciación. Si solo se detecta el subtipo de virus de Influenza A, la muestra contiene una

carga viral muy baja, por ende se deberá concluir que el resultado ha detectado el subtipo de

virus de Influenza A.

** La detección del Control Interno en el canal de detección del Quasar 670 no es requerida para

resultados positivos de patógenos objetivo. Una carga elevada de otro analito puede conducir a

una reducción o ausencia de la señal del Control Interno.

*** Si no se observa ninguna de las señales incluyendo el Control Interno, véase Solución de

Problemas TROUBLESHOOTING.

27 10/2015 V1.03


2. Aplicación a Muestras Clínicas

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra

FAM (Ct) HEX (Ct) Cal Red 610 (Ct) Quasar 670 (Ct) Auto

interpretación VSR A Flu A VSR B Flu B Flu A-

H1pdm09

Flu A-

H1

Flu A-

H3 IC

1 N/A 33.82 N/A N/A N/A 33.65 N/A 31.21 Flu A, Flu A-H1

2 N/A N/A N/A 21.42 N/A N/A N/A 33.89 Flu B

3 N/A 28.90 N/A N/A N/A N/A 26.23 36.91 Flu A, Flu A-H3

28 10/2015 V1.03


SOLUCIÓN DE PROBLEMAS


OBSERVACIONES CAUSAS PROBABLES SOLUCIÓN

No se observa señal Los fluoróforos para análisis

de datos no cumplen con el

protocolo.

Seleccione los fluoróforos correctos para el

análisis de datos y exporte los datos de nuevo. No

hay necesidad de repetir la prueba en este caso.

Ajustes incorrectos del

termociclador en tiempo real

Verifique las condiciones del ciclo térmico y repita

la prueba bajo los ajustes correctos.

Almacenamiento incorrecto o

posterior a la fecha de

vencimiento del kit de la

prueba.

Verifique las condiciones de almacenamiento

(Véase página 10) y la fecha de vencimiento

(remítase a la etiqueta) del kit de la prueba y

utilice un nuevo kit, si es necesario.

Fallo en el aislamiento de

ácidos nucleicos

Una ausencia de señal de IC puede indicar la

pérdida de ácidos nucleicos durante su

aislamiento. Asegúrese de utilizar el método de

aislamiento recomendado.

Si es debido a los inhibidores, re-aísle la muestra

original o diluya la muestra (1/3~1/10) en solución

salina y repita la prueba desde el paso de

aislamiento.

No se observa señal

de Control Interno

Alta carga del ácido nucleico

del patógeno

Si se observa la señal del patógeno objetivo pero

no la del IC, entonces la amplificación del IC

podrá haberse inhibido por la alta carga del

patógeno objetivo. Con el fin de confirmar la señal

de IC, diluya la muestra (1/3~1/10) en solución

salina y repita la prueba desde el paso de

aislamiento.

Presencia de inhibidores de

RT-PCR

Diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y

repita la prueba desde el paso de aislamiento.

Se observan señales

objetivo o falsos

positivos putativos

en el Control

Negativo

Contaminación Descontamine todas las superficies y los equipos

con hipoclorito de sodio y etanol. Utilice

solamente puntas con filtro durante el

procedimiento y cambie las puntas entre cada

tubo. Repita todo el procedimiento del aislamiento

de ácidos nucleicos con un nuevo set de

29 10/2015 V1.03



OBSERVACIONES CAUSAS PROBABLES SOLUCIÓN

reactivos.

No se observan

señales o falsos

negativos putativos

en el Control

Positivo

Error en la toma de muestras Verifique el método de toma de muestras y tome

de nuevo la muestra.

Almacenamiento incorrecto

de la muestra

Tome de nuevo la muestra y repita todo el

procedimiento. Asegúrese de que la muestra sea

almacenada, según las recomendaciones.

Error en el aislamiento de

ácido nucleico

Verifique el procedimiento de aislamiento de

ácidos nucleicos así como la concentración de

ácidos nucleicos, y re-aísle el ácido nucleico.

Error en la adición de ácido

nucleico a los tubos de PCR

correspondientes

Verifique los números de muestra de los tubos

que contienen ácido nucleico y asegúrese de

adicionar ácido nucleico en el tubo correcto de

PCR y repita cuidadosamente la prueba, si es

necesario.

Presencia de inhibidores Diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y

repita la prueba desde el paso de aislamiento.

Mezclado de la PCR

incorrecto

Confirme que todos los componentes sean

adicionados al mezclado de la RTPCR (La

sensibilidad está comprometida con el pre-mix

compuesto). Todos los reactivos deben ser

homogeneizados y girados hacia abajo antes de

ser utilizados.

Solo se detecta

el subtipo del

virus de

Influenza A pero

no el virus de

Influenza A

Carga baja del ácido

nucleico del patógeno

Los resultados se deberían interpretar de acuerdo

con la tabla de interpretación proporcionada, pero

se puede realizar una nueva prueba con un

volumen disminuido de agua libre de RNasa y un

mayor volumen de ácido nucleico.

Picos en los ciclos

de la curva de

amplificación

Burbuja en el tubo de PCR Centrifugue el tubo de PCR antes de iniciar.

30 10/2015 V1.03


RENDIMIENTO

1. Especificidad

La alta especificidad del Panel Respiratorio AllplexTM 1 está asegurada por los oligos

diseñados específicamente para los blancos de interés bajo las condiciones definidas de

reacción. Se evaluó reactividad cruzada del Panel respiratorio AllplexTM 1 con 84 patógenos

diferentes, y en la amplificación RT-PCR y detección se identificaron únicamente los blancos

específicos.

No. Organismo Número de Cepa

Resultado

1 Virus de la influenza humana A (H3N2) ATCC VR-544 Flu A, Flu A-H3 Detectado










11 Virus de la influenza humana A (H1pdm09)

ATCC VR-1736 Flu A, Flu A-H1pdm09 Detectado

12 Virus de la influenza humana B ATCC VR-101 Flu B Detectado








31 10/2015 V1.03



Resultado

20 Virus sincitial respiratorio humano A ATCC VR-26 VSR A Detectado

21 Virus sincitial respiratorio humano B ATCC VR-955 VSR B Detectado

22 Metapneumovirus humano Korean isolate No Detectado

23 Adenovirus humano C tipo 1 ATCC VR-1 No Detectado

24 Adenovirus humano C tipo 2 KBPV VR-58 No Detectado

25 Adenovirus humano B tipo 3 ATCC VR-3 No Detectado

26 Adenovirus humano E tipo 4 ATCC VR-1572 No Detectado

27 Adenovirus humano C tipo 5 KBPV VR-61 No Detectado

28 Adenovirus humano D tipo 8 ATCC VR-1368 No Detectado

29 Adenovirus humano A tipo 18 ATCC VR-1095 No Detectado

30 Adenovirus humano D tipo 23 ATCC VR-1101 No Detectado

31 Coronavirus humano 229E ATCC VR-740 No Detectado

32 Coronavirus humano NL63 Korean isolate No Detectado

33 Coronavirus humano OC43 ATCC VR-1558 No Detectado

34 Rinovirus humano A8 ATCC VR-488 No Detectado



37 Rinovirus humano B42 ATCC VR-338 No Detectado

38 Rinovirus humano B14 ATCC VR-284 No Detectado

39 Rinovirus humano C Korean isolate No Detectado

40 Bocavirus humano Korean isolate No Detectado

41 Virus Parainfluenza humana 1 ATCC VR-1380 No Detectado



44 Virus Parainfluenza humana 4A ATCC VR-1378 No Detectado

45 Virus Parainfluenza humana 4B ATCC VR-1377 No Detectado

46 Coxsackievirus humano A9 KBPV VR-11 No Detectado

47 Coxsackievirus humano B1 KBPV VR-13 No Detectado

32 10/2015 V1.03



Resultado






53 Echovirus humano 6 KBPV VR-19 No Detectado


55 Echovirus humano 9 ATCC VR-39 No Detectado


57 Echovirus humano 22 (Parechovirus) KBPV VR-23 No Detectado



60 Echovirus humano 34 (Cox A24 C) ATCC VR-583 No Detectado

61 Enterovirus humano 70 (D) ATCC VR-836 No Detectado

62 Enterovirus humano 71 (A) ATCC VR-784 No Detectado

63 Poliovirus KBPV VR-74 No Detectado

64 Legionella pneumophila ATCC 41782 No Detectado

65 Streptococcus pneumoniae ATCC BAA-255D No Detectado

66 Bordetella pertussis ATCC BAA-589D No Detectado

67 Haemophilus influenzae ATCC 51907D No Detectado

68 Mycoplasma pneumoniae ATCC 29342 No Detectado

69 Chlamydophila pneumoniae Korean isolate No Detectado

70 Klebsiella pneumoniae ATCC 700721D-5 No Detectado

71 Klebsiella oxytoca ATCC 700324D No Detectado

72 Serratia macrescens ATCC 27137D-5 No Detectado

73 Enterobacter cloacae KCTC 13047 No Detectado

74 Enterobacter aerogenes ATCC 15038D No Detectado

33 10/2015 V1.03



Resultado

75 Proteus mirabilis ATCC 12453D No Detectado

76 Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085D No Detectado

77 Pseudomonas fluorescens KCTC 49642 No Detectado

78 Candida albicans ATCC 14053 No Detectado

79 Staphylococcus aureus ATCC 700699D-5 No Detectado

80 Streptococcus mitis ATCC 3556 No Detectado

81 Streptococcus agalactiae ATCC BAA-611D No Detectado

82 Fusobacterium nucleatum ATCC 25586D-5 No Detectado

83 Herpesvirus humano 1 ATCC VR-260 No Detectado

84 Herpesvirus humano 2 ATCC VR-734 No Detectado

† Para evaluar la reproducibilidad de los resultados, el experimento se repitió tres veces.

2. Sensibilidad

Con el fin de determinar la sensibilidad del Panel Respiratorio AllplexTM 1, se realizó una

dilución seriada estándar de ADN blanco clonado desde 105 a 100 copias/reacción y se

analizó con el Panel Respiratorio AllplexTM 1. El límite de detección del Panel Respiratorio

AllplexTM 1 fue 100 copias/reacción.

3. Reproducibilidad

Se realizaron pruebas de reproducibilidad en 5 momentos diferentes en el transcurso de 5

días, por 3 experimentadores diferentes, y con 3 lotes de producto distintos. Se obtuvieron los

mismos resultados en todas las pruebas, confirmando la reproducibilidad del Panel

Respiratorio AllplexTM 1.

34 10/2015 V1.03


REFERENCIAS

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36 10/2015 V1.03


SIMBOLOGÍA

Explicación de los símbolos utilizados en el manual y en las etiquetas.

Símbolo Explicación

Dispositivo médico de diagnóstico In vitro

Uso exclusivo en investigación

Número de lote

Número de catálogo

Fecha de vencimiento

Límite de temperatura de almacenamiento

Mezcla de oligonucleotidos para amplificación y detección

Mezcla de enzimas

Buffer

Agua libre de RNasa

Control Positivo (PC)

Control Interno (IC)

Consulte instrucciones de uso

Fabricante

Fecha de fabricación

37 10/2015 V1.03


Representante autorizado en la Comunidad Europea

Precaución

38 10/2015 V1.03


INFORMACIÓN DE PEDIDO

Cat. No. Producto Tamaño

Serie AllplexTM

RP9801Y Panel Respiratorio AllplexTM 1 50 rxns

RP9801X Panel Respiratorio AllplexTM 1 100 rxns*







* Para su uso exclusivo con MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet

Serie AnyplexTM

RV7G01Y Detección AnyplexTM II RV16 (V1.1) 50 rxns

RV7G01X Detección AnyplexTM II RV16 (V1.1) 100 rxns*

RB7500Y Detección AnyplexTM II RB5 50 rxns

RB7500X Detección AnyplexTM II RB5 100 rxns*

RV7310X Detección en tiempo real de digitación AnyplexTM FluA/B (V1.1)

100 rxns

* Para su uso exclusivo con MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet

Serie Seeplex®

RV3210 Detección Seeplex® RV7 50 rxns

RV6C00Y Detección Seeplex® RV12 ACE 50 rxns

RV6F00Y Detección Seeplex® RV15 ACE 50 rxns

RV6F01Y Detección Seeplex® RV15 OneStep ACE (V1.1) 50 rxns

RV6520X Seeplex® Influenza A/B OneStep Typing (V2.1) 100 rxns

PB1610Y Detección Seeplex® PneumoBacter ACE (V3.0) 50 rxns

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Productos accesorios

SG1701 Ribo_spin vRD (Kit de aislamiento de ARN/AND Viral) 50 preps

Sistemas automáticos de aislamiento

65415-02 MICROLAB NIMBUS IVD EA

173000-075 MICROLAB STARlet EA

744800.4.205875 STARMag 96 Virus 384T / 1 caja

744800.4.VC384 STARMag 48 X 8 Virus Cartridge kit 384T / 1 caja

744300.4.205875 STARMag 96 Tissue 384T / 1 caja

744300.4.TC384 STARMag 48 X 8 Tissue Cartridge kit 384T / 1 caja

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