organización de los genes en organismos procariotas y ... la subunidad mayor posee un dominio...
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Organización de los genes en organismos procariotas y eucariotas
Transcripción
Gen: unidad de ADN que contiene la información para especificar la síntesis de un polipéptido
o de un ARN funcional (ARNt, ARNr)
Transcripción es la síntesis de una cadena de ARN que representa una hebra igual en
secuencia al ADN doble cadena (hebra codificante 5´- 3´). La hebra complementaria sirve de
templado o molde (3´- 5´). Es catalizada por la ARN polimerasa
Durante la transcripción, la
polimerización de rNTPs por la ARN
polimerasa se realiza en dirección
5’- 3 usando como molde la hebra
complementaria (3´- 5´)
Unidad de transcripción
Etapas de la
transcripción
Una sola ARN polimerasa sintetiza los 3 tipos de ARNs (ARNm, ARNr y ARNt)
Holoenzima (~500 kDa)= α2 β β’(core) + factor σ
Es inhibida por antibióticos de la familia de las rifamicinas (ej. Rifampicina)
ARN polimerasa bacteriana
El factor σ facilita la unión de la ARN
polimerasa al promotor, se libera durante la
elongación de la cadena.
Existen varios factores σ en E. coli (σ
alternativos) que reconocen diferentes
promotores (regulación de la expresión génica).
Promotores
Elemento reconocido por la ARN polimerasa para localizar el sitio de iniciación de la
transcripción de un gen
Presentan secuencias particulares cortas de localización específica
5´- - 3´
En bacterias:
- Sitio de inicio de transcripción (start point), purina (CAT)
- Secuencia o caja -10 ( 5´-TATAAT 3´)
- Secuencia o caja -35 (5´-TTGACA 3´)
- Elemento UP («upstream») (rico en AT) en algunos genes de alta expresión (rARNs).
Los promotores y terminadores bacterianos tienen secuencias
nucleotídicas específicas que son reconocidas por la ARN polimerasa
Terminadores intrínsecos:
Se forma una estructura de
horquilla en el ARN rica en GC
seguida de una región rica en U.
La ARN pol se detiene en la
horquilla y luego se desprende del
templado, liberando el transcripto.
Señales de terminación de la transcripción en bacterias
Necesitan la participación de la proteína Rho.
Rho es miembro de la familia de helicasas
hexaméricas ATP-dependientes.
Rho se une al ARN naciente. Mientras la ARN pol se
detiene en el terminador (ADN), la actividad helicasa
de Rho desenrolla el transcripto del híbrido ADN-
ARN.
~ la mitad de los terminadores transcripcionales de E.
coli son Rho-dep.
Se descubrieron en los genomas de fagos.
Terminadores Rho-dependientes
Transcripción en eucariontes
Las ARN polimerasas de procariotas y
eucariotas son similares en estructura y
función
Composición polipeptídica de las
ARN polimerasas bacteriana (E. coli)
y eucariotas (levaduras)
La subunidad mayor posee un dominio C-
Terminal (carboxyl terminal domain, CTD)
único de la ARN pol II que se fosforila
durante el inicio de la transcripción
Las ARN polimerasas se unen al promotor a través del contacto con los factores
de transcripción generales (FTs).
ARN pol. lI + FTII grales = Aparato de transcripción basal de la ARN pol II
ARN Polimerasa II
Promotores en ADN eucariota
Tipos :
1. TATA box. Secuencia conservada. Genes de alta transcripción.
2. Iniciadores (Inr). Secuencia poco conservada, reemplaza a TATA box en algunos genes.
BRE y DPE son secuencias accesorias que colaboran (se unen a los factores TFIIB y TAFs,
respectivamente).
3. Islas CpG. Regiones 100-1000 pb ricas en CG (vertebrados). La transcripción se inicia en
sitios alternativos, menos definidos. Genes de baja transcripción. Zonas desprovistas de
nucleosomas.
Y= C/T
N= C/T/G/A
Elementos proximales/próximos al promotor mínimo
Secuencias cortas (6-10 pb) localizadas entre 100-200 pb río arriba del sitio de inicio de la
transcripción
Estos módulos y los factores que los reconocen son comunes en una variedad de promotores.
La expresión de los genes eucariotas requiere múltiples interacciones de proteínas
con secuencias en el ADN: región de control de la transcripción
Secuencias amplificadoras (Enhancers)
Secuencias que estimulan el inicio de la transcripción, están localizados a distancia del
sitio de inicio de la transcripción (hasta ~50 kpb), río arriba (5’) o río abajo (3’) del promotor.
Tienen ~200 pb de largo, formados por varios módulos de 6-10 pb. Participan en la
regulación temporal/espacial de genes.
UAS (upstream activator sequences) de levaduras. Similar a enhancers, se localizan río
arriba del promotor mínimo.
Elementos de control que regulan la expresión génica en
eucariotas multicelulares y levaduras
Los promotores contienen diferentes combinaciones de módulos en la región río
arriba (5’) del promotor mínimo a los que se asocian diferentes factores que
aumentan el nivel de la transcripción
Ensamblado in vitro
de los FTs II en el
promotor mínimo de la
ARN pol II e inicio de
la transcripción en
eucariontes
TBP: proteína de unión a la caja TATA. TAFs: factores asociados a la TBP (in vivo).
TFIID=TBP+TAFs
TFIIH posee actividad helicasa (desenrolla ADN doble cadena en el promotor) y kinasa,
fosforila al CTD de la ARN pol II durante el inicio de la transcripción.
Iniciación de la transcripción en los eucariotas
El CTD de la ARN Pol II coordina el procesamiento del ARNm con la transcripción.
Es importante para reclutar los factores involucrados en las modificaciones
postranscripcionales del pre-ARNm.
ARNm bacteriano
Los ARNm contienen regiones codificantes (codones que especifican la proteína) y
regiones no codificantes (no codifican proteínas) en ambos extremos: 5’ y 3’ UTRs
(untranslated regions).
Las UTRs son más cortas en los ARNm bacterianos (pocos nt) que en los ARNm eucariontes
(cientos de nt).
Los ARNm bacterianos son generalmente policistrónicos (codifican varios polipéptidos)
Los ARNms policistrónicos poseen regiones intergénicas de 1-30 pb.
ARN mensajeros
Se transcriben y traducen simultáneamente
(2 min para ARNm 5 kpb equivalente a una proteína
de 180 kDa) en el mismo compartimento celular
Son inestables (t1/2 ~2 min) y se traducen unos
pocos min.
ARNm bacteriano
- Síntesis y maduración en el núcleo, luego son exportados al citoplasma y
traducidos.
- Se sintetizan como precursores (pre-ARNm) y sufren modificaciones en
los extremos que identifican a los ARNms :
Agregado de la cápsula/capucha (CAP) en extremo 5’
Adición de cola de poli-A en extremo 3’.
- Son generalmente monocistrónicos (codifican una única proteína).
- Son relativamente estables y se traducen por varias hs. T1/2 de ARNm de células
animales ~1-24 hs.
ARNm eucarionte
Procesamiento del ARNm para producir un ARNm funcional en eucariontes
Los ARNm se asocian en el núcleo con proteínas que contienen dominios
de unión al ARN
Pre-ARNm: transcriptos nacientes del ARNm e intermediarios del procesamiento.
ARN heterogéneo nuclear (hnRNA): pre-ARNm y otros ARNs nucleares (ej. ARN pequeňos
nucleares o snRNAs).
Los hnRNA se asocian con proteínas nucleares formando partículas ribonucleoproteicas
heterogéneas nucleares (hnRNP).
Proteínas hnRNP
~34-120 kDa
Funciones:
- Evitan formación de estructuras secundarias en los pre-ARNm facilitando su interacción
con proteínas y ARNs involucrados en su procesamiento.
- Facilitan el transporte de los ARNm maduros al citoplasma.
Modificación en extremo 5 ‘ del ARNm naciente por adición de
un nt atípico, 7-metilguanilato (cap) mediante unión inusual
5’- 5’-trifosfato.
Enzima formadora del CAP interacciona con el dominio CTD
fosforilado de la ARN pol II durante la transcripción, por lo que
el capping es específico de los ARNms.
El capping ocurre cuando el pre-ARNm tiene ~25 nt.
Funciones del CAP:
- Protege al ARNm de la degradación enzimática
- Contribuye a su desplazamiento hacia el citoplasma
- Se une a un factor proteico para comenzar la traducción del
ARNm en el citoplasma.
Procesamiento en extremo 5’ del ARNm: Encapuchamiento del ARNm (capping)
Procesamiento en extremo 3’ del ARNm: Poliadenilación
Los ARNms de células eucariontes, excepto los de histonas, tienen poli(A).
Mecanismo: Escisión del extremo 3’del ARNm por endonucleasa para generar OH- libre sobre el cual la
enzima poli(A) polimerasa (PAP) agrega residuos de ácido adenílico, 100-250 b (cola poli-A).
Proporciona estabilidad al ARNm
Corte y empalme del ARNm (splicing)
Existen secuencias consenso cortas en los sitios de corte y empalme en los extremos
de los intrones de los pre-ARNms que actúan como señales para su eliminación.
Escisión interna del pre ARNm, remoción de intrones (porciones no codificantes) y ligación de
exones (porciones codificantes).
Los genes de eucariontes multicelulares contienen múltiples intrones, a diferencia de los genes
de bacterias y arqueas.
Cómo se reconocen las secuencias que deben eliminarse?
Los snRNAs se aparean con el pre-ARNm y entre sí durante el corte y empalme
snRNA: ARNs nucleares pequeños, ricos en U (U1-U2-U4-U5-U6) de 100-200 nt.
snRNA + proteínas: Partículas ribonucleoproteicas nucleares pequeñas (snRNP)
snRNPs + pre-ARNm = Empalmosoma
El corte y empalme es llevado a cabo principalmente por los snRNAs que reconocen los
límites exón-intrón a través del apareamiento de bases complementarias. Participan en los
procesos químicos de corte y empalme.
El empalme de exones se lleva a cabo
mediante dos reacciones de trans-
esterificación.
Los intrones son eliminados como una
estructura con forma de lazo en la que la G
5’del intrón forma un enlace fosfodiéster
inusual 2’-5’ con A (punto de ramificación) del
3’ del intrón.
Un enlace fosfodiéster se intercambia por otro.
Exosoma: Exonucleasas nucleares que degradan en
sentido 3’-5’ los ARNs resultantes del
procesamiento
Los pre-mARNs y ARNs maduros con
protección en extremos 5’y 3’ no son
degradados
El splicing alternativo del mRNA incrementa el número de proteínas expresadas a partir
de un gen eucariótico único
Produce diferentes formas de una proteína (isoformas) en distintos tipos celulares
Eliminación específica de exones del pre-mRNA de fibronectina en fibroblastos y
hepatocitos. Intrones (línea negra), exones (cajas de colores).
Fibronectina proteína multidominio de la matriz extracelular de los mamíferos.
Fibroblastos producen mRNA con exones (verde) que codifican dominios de unión a proteínas de membrana
del fibroblasto. Esta fibronectina adhiere los fibroblastos a la matriz extracelular.
Hepatocitos, mRNA carece de estos exones, esta isoforma no se adhiere al fibroblasto y circula en sangre
participando en la formación de coágulos.
Altera la secuencia del pre-mRNA, la secuencia del ARN maduro difiere de los exones que lo
codifican en el ADN genómico.
Se descubrió a mediados de 1980. Muy difundida en mitocondrias de protozoos, plantas y
cloroplastos.
Edición del pre-mRNA de apolipoproteína B (apoB). Transportan lípidos en el suero
Edición del mARN
Geles de retardo (gel shift assay o EMSA, Electrophoretic mobility shift assay)
Técnicas para el estudio de la Interacción entre ADN y proteínas
La aparición de bandas con movilidad
retrasada respecto al control (ADN
solo) indican la formación de un
complejo ADN-proteína
Se incuba un fragmento de ADN marcado con una secuencia de interés (ej CAAT box) en ausencia y
presencia de una proteína especifica o un extracto proteico. Se siembra en gel nativo y se identifican las
bandas por autorradiografía.
1. ADN solo; 2. ADN + proteína; 3. ADN + 2 proteínas
Huellas de ADN (ADN footprinting)
Pasos:
1. Marcación del fragmento de ADN
2. Incubación del ADN marcado con/sin
proteína.
3. Incubación con DNAasa I
4. Separación de los fragmentos por
electroforesis en geles desnaturalizantes y
autorradiografia
La región protegida por la proteína se
visualiza como una huella en el patrón de
bandas resultante de la digestión con DNAsa I
en comparación con la muestra sin digerir.
NE, sin extracto. O, extracto
proteico total.
1-22, diferentes fracciones proteicas
eluídas de una columna
Permite identificar la secuencia de ADN
específica a la cual se une un FT.
Genes reporteros: Codifican proteínas
fácilmente medibles (B-gal, luciferasa, GFP)
Permiten Identificar/caracterizar elementos de
control de la transcripción en el ADN.
Fragmentos de ADN de longitudes variables en
extr.5’ se clonaron en un plásmido río arriba de un
gen reportero carente de su propio promotor.
Se trasformaron células y se midió la actividad del
gen reportero.
Ensayos con genes reporteros