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Optimización del proceso de producción, purificación y
caracterización de una lacasa a partir de un hongo nativo con potencial
aplicación en procesos biotecnológicos
Jesus David Castaño Urueña
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2014
Optimización del proceso de producción, purificación y
caracterización de una lacasa a partir de un hongo nativo con potencial
aplicación en procesos biotecnológicos
Jesus David Castaño Urueña
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias-Bioquímica
Director:
Esperanza Torres Rojas Ph.D.
Profesora Asociada
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2014
III
Lista de Publicaciones y participación en
eventos científicos
• Castaño, J.D., Cruz, C., & Torres-Rojas, E. Optimización de la producción de
lacasas a partir de un hongo ascomiceto nativo mediante la evaluación de
diferentes fuentes de carbono y nitrógeno e inductores y la aplicación de un
diseño ortogonal. XIII Congreso Argentino de Microbiología y II Congreso de
Microbiología Agrícola y Ambiental. Buenos Aires. Argentina. 2013, Sept. 23-26.
Revista Argentina de Microbiología 45(1): 228-229.
• Castaño J.D., Cruz C., Torres E. Optimization of laccase production from Xylaria
sp. grown under distinct sources of carbon, nitrogen, and inducers. Sometido a
publicación a la revista Applied Microbiology and Biotechnology. Octubre 2014
• Castaño J.D., Crespo C.C., Torres E. Degradación de racimos de palma de aceite
(Elaeis guineensis): un reto ambiental. Primer Congreso de Biología Molecular y
Bioquímica. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. 2014, Junio del 4-7.
Mención meritoria al mejor trabajo presentado en el área de Bioquímica y Biología
Molecular Ambiental.
• Castaño JD., Torres E. Purificación y caracterización de una lacasa extracelular
del hongo ascomiceto nativo Xylaria sp. Para presentar en el VIII Congreso
Latinoamericano de Micología (En modalidad de concurso para mejores trabajos
de grado de maestría). A celebrarse en Medellín, Colombia, 2014, Noviembre del
4-7.
Dedico este trabajo a mi familia, a mi amada
madre Esther Jeannet a quien debo tanto, su amor y
apoyo incondicional son pilares que alientan mi vida
a cada instante, a mis hermanos Raphael y
Jonathan, a mi novia Ana Lucia porque su amor es
una razón importante para mí, en cada día y cada
proyecto de mi vida, gracias por tanta paciencia! Y el
color que le das a todos mis días! A mi amado padre
Denizar Castaño (q.e.p.d) de quien aprendí la virtud
de que ser recordado por tu familia, es un valor que
perdura en la memoria, capaz de inspirar vidas
desde la inmensa eternidad, siempre mi mente
extrañará todos los momentos en que no pudiste
estar.
Agradecimientos
A mi directora Esperanza, agradezco haber tenido la oportunidad de desarrollar este
proyecto con una persona de incontables atributos profesionales y también personales, lo
que siempre permitió disfrutar del mejor ambiente de trabajo para llevar a feliz término
este largo proceso.
A los miembros del laboratorio de agrobiotecnología de la Facultad de Ciencias Agrarias
de la Universidad Nacional de Colombia, a Rosa porque su eficiente gestión y
colaboración fueron pieza clave en el desarrollo de muchas etapas del proceso, a
Cristhian de quien aprendí valiosos conocimientos en torno al cultivo de
microorganismos, nuestras discusiones siempre me arrojaron ideas interesantes para el
planteamiento de nuevos experimentos.
A Carlos, quien en su fugaz paso por el laboratorio me dejó aprender de su gran
experiencia, y cuya colaboración fue más que invaluable para sacar este proyecto
adelante, sus valores personales son algo que atesoraré siempre, definitivamente un
gran amigo que he conseguido en este camino.
Al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia, y su directora del
laboratorio de instrumentación, Ana Lucía Castiblanco, por la colaboración con el uso del
cromatógrafo FPLC, a Susana Novoa y el laboratorio de hormonas del departamento de
Química de la Universidad Nacional por su apoyo con los geles bidimensionales, y a
Victoria Hedrick del Centro de Proteómica de la Universidad de Purdue por su gran
colaboración en la corrida y análisis de espectrometría de masas.
A Colciencias, al Centro Colombiano de Genómica y Bioinformática GeBix y a la
Universidad Nacional de Colombia por la financiación de este proyecto, y mi
sostenimiento durante el tiempo de desarrollo de esta investigación, a Botany & Plant
Pathology depto por la financiación del análisis espectrometría de masas.
VI
Resumen La producción de enzimas lignolíticas es una propiedad que exhiben algunos organismos como los hongos. Entre ellas las lacasas se destacan como enzimas oxidasas de cobre (E.C. 1.10.3.2) que catalizan la oxidación por un electrón de compuestos fenólicos, aminas aromáticas, y otros sustratos ricos en electrones con la concomitante reducción de O2 a H2O, con una amplia inespecificidad de sustrato que las hace llamativas para diferentes aplicaciones industriales. Este trabajo buscó potenciar la producción de una lacasa seleccionada entre 7 hongos productores evaluados, con miras a su purificación y caracterización. La cepa seleccionada fue el organismo Xylaria sp. (CH003) el cual fue encontrado sobre madera en descomposición en el Parque Natural Chicaque ubicado entre los municipios de Soacha y San Antonio, Cundinamarca, Colombia. La actividad lacasa fue valorada utilizando azino-bis(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato (ABTS) en cultivos del hongo llevados a cabo en fermentación sumergida, encontrando una alta actividad (1021±114 U/L). El medio de cultivo fue optimizado mediante el método de un factor a la vez para fuentes de carbono y nitrógeno, un arreglo ortogonal de Taguchi, y el uso de inductores. Los resultados mostraron que el salvado de trigo (50g/L), KNO3 (1,4g/L) y el inductor 2,5-xilidina (1mM) son componentes importantes del medio de cultivo para elevar la actividad enzimática a un valor de 20535±1405 U/L. Una vez optimizado el medio para la producción de lacasas, la enzima fue purificada mediante diafiltración, cromatografía de intercambio aniónico DEAE, y de exclusión por tamaño. Se obtuvo un factor de purificación de 7,45 y un rendimiento de 0,51% y una vez purificada presentó una actividad específica de 388 U/mg. De acuerdo al análisis electroforético 2D se sugiere la presencia de una proteína de ~38KDa, con un pI de 4,9. Por espectrometría de masas se detectó la presencia de los péptidos GPASAPYDEDK y LVNTAIDTMFK que han sido reportados para lacasas. La enzima purificada presentó un rango de pH y temperatura óptima de reacción entre 3-4 y 50-60°C, respectivamente. Sin embargo, se observó una mayor estabilidad a 30 °C durante tres horas de incubación, manteniendo el 97,2% de actividad, y también una alta estabilidad a valores de pH de 6,7 y 8 reteniendo más del 80% de la actividad luego de tres horas. Usando ABTS se determinó una Km de 297µM y una Vmax de 581,4 µM/min a un pH y temperatura de reacción de 4,5 y 22°C. La enzima fue inhibida por el ion Fe2+, pero inducida por el ion Cu2+. Adicionalmente la enzima no fue altamente inhibida por EDTA (1 y 10mM) en donde conservó casi el 80% de su actividad, pero sí fuertemente inhibida por azida de sodio (1 y 10mM), DTT (0,1mM) y KCN (5mM), en donde la actividad se redujo a menos del 5%.
Palabras Clave: Oxidasa de cobre, Xylaria sp, fuentes de carbono y nitrógeno, diseño ortogonal, inductor, cromatografía, constantes cinéticas.
VII
Abstract
The production of ligninolytic enzymes is a property exhibited by certain organisms as fungi. Among these enzymes, laccases are known as multicopper oxidases (E.C. 1.10.3.2) that catalyze oxidation by one electron of phenolic compounds, aromatic amines, and other electron-rich substrates with concomitant reduction of O2 to H2O, with broad substrate non-specificity, which make them appealing for different industrial applications. This work enhanced laccase production from one fungi selected among 7 enzyme producing organisms, in order to purify efficiently the enzyme and characterize it. The selected strain was the organism Xylaria sp. (CH003) which was founded on decaying wood in Natural Park Chicaque located between towns Soacha and San Antonio, Cundinamarca, Colombia. Laccase activity was measured using azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonate (ABTS) in cultures carried out through submerged fermentation, finding a high activity value associated with this strain (1021 ±114 U/L). Culture media was optimized through one-factor-at the time method for different carbon and nitrogen sources, a Taguchi orthogonal design, and use of inductors. Results showed that wheat bran and KNO3 at a concentration 50g/L and 1,4g/L, respectively, besides inductor 2,5-xylidine (1mM) are important components to raise laccase activity to 20535±1405 U/L. Laccase from Xylaria sp. produced with this strategy was purified through diafiltration, anion exchange chromatography (DEAE) and gel filtration. It was obtained a purification factor of 7,45 and a yield of 0,51%, and once purified laccase showed a specific activity of 388 U/mg. According electrophoretic analysis in 2D electrophoresis was suggested an enzyme of ~38 KDa, and pI of 4,9. Mass spectrometry analysis found peptides GPASAPYDEDK and LVNTAIDTMFK previously reported for laccases. The purified enzyme had optimal pH and temperature among 3-4 and 50-60°C, respectively. However it was observed major stability at 30° retaining 97,2% of the activity, and pH values of 6,7 and 8, retaining more than 80% of activity after three hours of incubation. Kinetic parameters as Km and Vmax was determined using ABTS as substrate finding values of 297µM and 581,4 µM/min respectively, at a pH of 4,5 and temperature of 22°C. Enzyme was inhibited by Fe2+ ion, but induced by Cu2+ ion. Additionally enzyme was not inhibited strongly by EDTA (1 and 10mM), since it kept almost 80% of activity, but highly inhibited by sodium azide (1 and 10mM), DTT (0,1mM), and KCN (5mM), where activity was decreased at less than 5%.
Keywords: Multicopper oxidase, Xylaria sp., carbon and nitrogen sources, orthogonal design, inducer, chromatography, kinetic constans.
VIII
Contenido
Pág.
Resumen………………………………………………………………………………………….VI
Lista de figuras….….……………………………………………………………………………X
Lista de tablas…….……………………………………………………………………………XIII
Introducción ...................................... .............................................................................. 1
1. Marco conceptual .................................. ................................................................... 3
1.1 Lacasas fúngicas ............................................................................................. 3 1.2 Estructura de las lacasas ................................................................................. 4
1.3 Mecanismo de reacción de la lacasa ............................................................... 6 1.4 Factores que afectan la actividad lacasa ......................................................... 7
1.5 Estructura y organización génica de las lacasas ............................................ 10 1.6 Producción de lacasas ................................................................................... 12
1.6.1 Tipo de cultivo ..................................................................................... 13
1.7 Aplicaciones biotecnológicas ......................................................................... 14
2. Objetivos ......................................... ........................................................................ 15
2.1 Objetivo general............................................................................................. 15
2.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 15
3. Hipótesis ......................................... ........................................................................ 16
4. Metodología ....................................... ..................................................................... 17
4.1 Fermentación líquida sobre salvado de trigo .................................................. 17
4.2 Selección del hongo de interés ...................................................................... 17 4.3 Almacenamiento y conservación del hongo ................................................... 18 4.4 Método de un factor a la vez .......................................................................... 18
4.5 Método de arreglo ortogonal de Taguchi........................................................ 18 4.6 Determinación de interacciones entre los factores evaluados………………...20 4.7 Determinación de la actividad enzimática lacasa ........................................... 20
4.8 Empleo de inductores .................................................................................... 21 4.9 Purificación de la enzima ............................................................................... 21
4.9.1 Diafiltración ......................................................................................... 21 4.9.2 Cromatografía de intercambio aniónico ............................................... 21
4.9.3 Cromatografía de exclusión por tamaño .............................................. 23
4.10 Electroforesis y zimografía ............................................................................ 23 4.11 Separación de proteínas por electroforesis en dos dimensiones- 2D-PAGE .. 24
4.12 Espectrometría de masas .............................................................................. 25
IX
4.13 Caracterización cinética de la enzima ............................................................26
5. Resultados ........................................ ......................................................................28
5.1 Selección del hongo Xylaria sp. como mejor productor de lacasa ..................28
5.2 Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno en el medio de cultivo usando el método de un factor a la vez .....................................................................................29 5.3 Optimización de la composición del medio utilizando el método de matriz ortogonal de Taguchi ................................................................................................32 5.4 Múltiples interacciones ...................................................................................35
5.5 Empleo de inductores .....................................................................................36 5.6 Purificación enzimática ...................................................................................37 5.7 Caracterización cinética de la enzima ............................................................46
5.8 Efecto en el secretoma de Xylaria sp. al ser sometido a condiciones de inducción y baja expresión de lacasa. .......................................................................51
6. Discusión de resultados ........................... ..............................................................53
7. Conclusiones y recomendaciones .................... ....................................................66
7.1 Conclusiones ..................................................................................................66
7.2 Recomendaciones ..........................................................................................68
A. Anexo: Curva de calibración para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford ....................................... .............................................................................69
B. Anexo: Soluciones usadas durante la electroforesis SDS-PAGE .......................70
C. Anexo: Geles trabajados en la electroforesis ...... .................................................72
D. Anexo: Curvas de calibración para determinación del peso molecular relativo de las proteínas .................................. ............................................................................73
E. Anexo: Formulación de tampones usados para la deter minación de pH óptimo…………………………………………………………………………………………….75
F. Anexo: Soluciones usados en estudios de inhibición .........................................76
G. Anexo: Espectros de masas obtenidos en el análisis MS/MS .............................77
H. Anexo: Tablas de resultados de listas de proteínas encontradas por el programa Mascot ................................... ........................................................................79
Bibliografía ...................................... ...............................................................................80
X
Lista de figuras Pág.
Figura 1-1: Estructura de la lacasa con los sitios de cobre activos (Chakratborty y
Barton, 2011)……………………………………………………………………………………....5
Figura 1-2: Detalles estructurales de los centros catalíticos de cobre, en donde el átomo
de cobre T1 está coordinado por una cisteína y dos histidinas. El centro trinuclear se
encuentra coordinado por residuos de histidina. El residuo de cisteína se encuentra
enlazado a dos histidinas del centro trinuclear.(Bento et al., 2010)……………………..…..5
Figura 1-3: Ciclo catalítico de la lacasa. (Wong 2009)……………………………………….6
Figura 1-4: Ciclo catalítico del sistema lacasa mediador………………………………….....9
Figura 1-5: Mecanismo de oxidación del ABTS como mediador en la oxidación de
sustratos no fenólicas (Wong 2009)………………………………………………………….....9
Figura 1-6: Mecanismo de oxidación del HBT como mediador en la oxidación de
sustratos no fenólicos (Wong 2009)…………………………………………………………...10
Figura 5-1: Evaluación de la actividad lacasa para los 7 organismos lignolíticos
encontrados……………………………….………………….……………………………….….29
Figura 5-2: Curva de actividad lacasa inicial en Xylaria sp tras 16 días de
incubación……………………………………………...…………………………………………30
Figura 5-3: Efecto de diferentes fuentes de carbono…………………………….........…...31
Figura 5-4: Efecto de las diferentes fuentes de nitrógeno en la actividad lacasa de Xylaria
sp………..…………………………………………………………………………………………31
Figura 5-5: Efecto sobre la producción de lacasa de los diferentes factores evaluados en
el diseño ortogonal……………………………………………………………………….…...…34
XI
Figura 5-6: Actividad enzimática con medio optimizado………..……………………...…..34
Figura 5-7: Efecto de diferentes inductores evaluados para la producción de
lacasa……………………………………………………………………………………………..36
Figura 5-8: Cromatograma obtenido para el extracto proteico concentrado a través del
casete de Pellicon………………….…………………………………………………………….38
Figura 5-9: Análisis de actividad de las fracciones recolectadas en la zona del pico II de
la cromatografía DEAE……………………………………………………………………….…39
Figura 5-10: Cromatograma obtenido luego de la aplicación de la muestra resultante de
la cromatografía de intercambio aniónico………..……………………………………………40
Figura 5-11: Electroforesis SDS-PAGE para los pasos de purificación enzimática
realizados………..…………………………………………………………………………..……43
Figura 5-12: Espectro de masas que muestra la coincidencia con el péptido
asignado…………………………………………..…………………………….…………..……44
Figura 5-13: Gel en condiciones nativas con la muestra procedente de la etapa de
purificación con cromatografía de exclusión……………………………………….…………45
Figura 5-14: Gel de dos dimensiones de la muestra purificada luego de su paso por
cromatografía de exclusión……….…………………………………..………………………...45
Figura 5-15: Efecto del pH en la actividad y estabilidad de la
lacasa………………………..……………………………………………..……………………..47
Figura 5-16. Efecto de la temperatura en la actividad lacasa……………….………….….48
Figura 5-17 : Estabilidad térmica de la enzima lacasa….…………………………..………48
Figura 5-18: A) Efecto de la concentración ABTS sobre la actividad de la lacasa. B)
Diagrama de Lineweaver-Burk para el ABTS………………………………………………...50
XII
Figura 5-19. Secretomas obtenidos del sobrenadante de cultivo del hongo Xylaria sp. A)
bajo condiciones de baja expresión de lacasa (medio con fructosa) y B) bajo condiciones
de alta expresión de lacasa (medio optimizado)……………………………………………..52
Figura 6-1: Modelo de la agregación de proteínas en SDS-PAGE (Adaptado de Sagné et
al. 1996)…………………………………………………………………………………………..64
XIII
Lista de tablas Pág.
Tabla 4-1: Niveles de concentración evaluados en el arreglo ortogonal de Taguchi para la
salvado de trigo, KNO3, CuSO4.5H2O y KH2PO4……………………………………………..19
Tabla 4-2: Arreglo ortogonal L9(34) empleado para la producción de lacasa del hongo
Xylaria sp……………………………………………………………………………………….…19
Tabla 4-3: Valores medios para cada nivel y cada componente y rango de cada
componente………………………………………………………………………………………20
Tabla 4-4: Programa de corrido de la cromatografía de intercambio aniónico DEAE en
resina sefarosa de flujo rápido, llevada a cabo en el equipo BioRad BioLogic Duo Flow
system. (Tampón A: Acetato de sodio 10 mM pH 5,0; tampón B: acetato de sodio 10 mM
pH 5,0 con NaCl 2M)…………………………………………………………………………….22
Tabla 5-1: Resultados del arreglo ortogonal L9(34) para la producción de lacasa del
hongo Xylaria sp………………………………………………………………………………....32
Tabla 5-2: Análisis de los resultados obtenidos mediante el arreglo ortogonal de
Taguchi………………...………………………………………………………………………….33
Tabla 5-3: Indice de severidad de interacción entre los diferentes factores
evaluados………………………………………………………………………………………....35
Tabla 5-4: Análisis de actividad específica para las fracciones 8-12 provenientes de la
cromatografía de exclusión por tamaño con la resina Sephadex G-100…………………..41
Tabla 5-5: Evaluación de las etapas de purificación de la lacasa extracelular de Xylaria
sp…………………………………………………………………………………………………..42
XIV
Tabla 5-6: Péptidos obtenidos por espectrometría de masas para las bandas observadas
en el gel de electroforesis con la muestra proveniente de cromatografía de exclusión
(figura 5-11 C)…..………………….…………………………………………………………….43
Tabla 5-7: Efecto de iones metálicos en la actividad de la lacasa purificada. Se destacan
el efecto inhibidor del Fe2+ e inductor del Cu2+……………………………………………….49
Tabla 5-8: Efecto de algunos inhibidores quelantes en la actividad de la lacasa
purificada……………….……………………………………………………………………...…50
Introducción
El uso de enzimas en diferentes campos de aplicación industrial se ha incrementado
notablemente en los últimos años logrando el desarrollo de diferentes productos
biotecnológicos. Entre estas, las enzimas lignolíticas han sido objeto de especial atención
en décadas recientes debido a su capacidad de degradar compuestos fenólicos y no
fenólicos tipo lignoides. Tal propiedad ha hecho a estas enzimas potenciales para ser
aplicadas en diferentes áreas de gran importancia como la detoxificación de efluentes
industriales, el pulpado del papel, la industria textil y petroquímica, la síntesis orgánica, la
industria vinícola y de alimentos en general, la biorremediación del suelo y el tratamiento
de residuos agrícolas, entre otras (Faccelo y Cruz, 2008; Rodriguez Couto y Toca
Herrera, 2006; Mougin et al., 2002; Karam y Nicell, 1997). Las lacasas y las peroxidasas,
son enzimas lignolíticas, sin embargo en relación a su aplicabilidad las peroxidasas
presentan limitaciones operacionales en cuanto a su estabilidad, debido a su inactivación
por exceso de peróxido de hidrógeno, el mismo cofactor que necesitan para su actividad
(Timofeevski et al., 1998; Chung y Aust 1995); en tanto, las lacasas trabajan
eficientemente en un amplio rango de sustratos sin cofactores (Baldrian et al., 2006), por
lo que pueden resultar más adecuadas para su utilización en procesos industriales.
Las lacasas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Están presentes en
hongos, plantas superiores, bacterias e insectos, no obstante los hongos han sido más
estudiados (Arakane et al., 2005; Riva 2006). En los hongos estas enzimas son
secretadas principalmente al medio extracelular (Shi et al., 2012; Tavares et al., 2005).
Son producidas constitutivamente en bajas concentraciones (Robene-Soustrede y Lung-
Escarmant 1997), pero mayores cantidades de la enzima pueden ser inducidas al aplicar
diferentes compuestos aromáticos (Xavier et al., 2001), lo que permite la posibilidad de
alcanzar niveles de producción óptimos para las diferentes aplicaciones de interés.
Existe un gran número de estudios reportados sobre la producción de lacasas a partir
del crecimiento de diferentes especies de hongos como Pleurotus Ostreatus, Trametes
2 Introducción
versicolor y otros hongos basidiomicetos y ascomicetos (Bertrand et al., 2013; Wong
2009; Baldrian 2006). No obstante el interés por encontrar nuevas enzimas a partir de
hongos ascomicetos como basidiomicetos ubicados en diferentes hábitats permanece en
continúa exploración. Por lo que la implementación de estudios de bioprospección en
países como Colombia, con excelsos recursos de biodiversidad, aumenta la posibilidad
de encontrar organismos generadores de enzimas con gran potencial de uso
biotecnológico o en procesos de biorremediación.
En estudios previos a este trabajo, realizados por nuestro grupo de investigación, se llevó
a cabo una exploración sistemática de hongos con capacidad lignocelulolítica colectados
a partir de madera en descomposición, en un bosque alto andino ubicado en el Parque
Natural Chicaque (Crespo-Linares y Torres-Rojas, 2013). En total, se aislaron 76 y se
preseleccionaron 7 siete morfotipos con actividad lignolítica usando el guayacol como
indicador en el medio de cultivo (Eugenio et al., 2008; Levin et al., 2004). Este trabajo
comienza con la evaluación de la actividad lacasa a nivel cuantitativo de las cepas
encontradas positivas, con el fin de identificar la cepa con mejores características que
pudiera utilizarse en este estudio y enfocarse en la optimización del proceso de
producción, purificación y caracterización parcial de una lacasa a partir de la cepa
seleccionada.
1. Marco conceptual
1.1 Lacasas fúngicas
Las lacasas (E.C. 1.10.3.2) han sido aisladas de un gran número de hongos
pertenecientes a la división ascomicota y basidiomicota (Bertrand et al., 2013; Wong
2009; Baldrian 2006; Breen y Singleton, 1999) entre los que se encuentran Xylaria
polymorpha (Liers et al., 2007), P. ostreatus (Mazumder et al., 2009) Phlebia radiate
(Mäkela et al., 2006), Physisporinus rivulosus (Hakala et al., 2006), y Ceriporiopsis
subvermispora (Wang y Ng, 2004). Estas enzimas contribuyen a la degradación de la
lignina por lo cual desempeñan un papel esencial en el ciclo del carbono (Leonowicz et
al., 2001). Sin embargo, sus funciones biológicas son más amplias, participan en los
procesos de, esporulación, pigmentación, formación del cuerpo fructífero y patogénesis
vegetal en donde representan importantes factores de virulencia (Yaver et al., 2001;
Thurston 1994). Se ha reportado que en la botritis o formación de moho gris en la vid
causada por la acción del hongo Botrytis cinerea, las lacasas participan en la
detoxificación de los metabolitos de defensa producidos por la planta (Bar-Nun et al.,
1988). Así mimo, las lacasas han sido relacionadas como factores de virulencia en
hongos patógenos humanos como Cryptococcus neoformans (Williamson 1994; Zhu et
al., 2001). En Aspergillus nidulans la deleción de un gen relacionado con la producción
de lacasa ha generado la pérdida de pigmentación en las conidiosporas (Aramayo y
Timberlake 1990; Clutterback, 1972).
Los hongos productores de lacasas pueden secretar diferentes isoformas de la proteína
(Hakala et al., 2006; Leontievsky et al., 1997). El número de isoenzimas depende de
cada especie, y su expresión depende de los componentes del cultivo, la presencia de
inductores específicos y las condiciones de crecimiento. Las características de
estabilidad, pH y temperatura óptima, y afinidad por los diferentes sustratos puede diferir
considerablemente entre las diferentes isoenzimas (Assavanig et al., 1992; Thakker et
al., 1992).
4
Las lacasas fúngicas tienen un potencial redox mayor (hasta 0,8 V) que las lacasas
vegetales y bacterianas (0,4-0,5 V), razón por la cual encuentran mayores aplicaciones
biotecnológicas (Rodgers et al., 2010; Alcalde, 2007) y se han estudiado más en este
sentido.
1.2 Estructura de las lacasas
Las lacasas poseen cuatro motivos de unión al cobre altamente conservados, que
constituyen el sitio activo de la enzima (Yaver et al., 1996; Thurston 1994). Estas
regiones corresponden al lugar donde se ubica el cobre y se caracterizan por la
presencia de 10 histidinas y una cisteína que sirven como ligandos del metal. También se
destaca la presencia de una secuencia pequeña alrededor de las histidinas y cisteínas
que se encuentra altamente conservada (Thurston 1994). Dentro de los átomos de cobre
en la enzima se pueden distinguir tres tipos, T1 y T2, donde se ubica un átomo de cobre
y T3, donde se ubican 2 átomos de cobre. En su estado nativo las enzimas contienen
todos los 4 átomos de cobre en su estado de oxidación 2+. (Dooley et al., 1979; Malkin y
Malmstroom 1970). T1 está localizado en el dominio 3 de la enzima, en donde el átomo
de cobre se ubica en una depresión poco profunda en la superficie de la enzima mientras
que T2 y T3 forman un agrupamiento trinuclear de cobre (T2/T3) en la zona interfacial
entre los dominios 2 y 3. Cada dominio aporta residuos que sirven de ligando para la
coordinación de los átomos de cobre (Figuras 1-1 y 1-2) (Wong 2009).
La mayoría de las lacasas son proteínas que se encuentran como monómeros, dímeros o
tetrámeros con un alto contenido de carbohidratos que varía según el organismo
productor de la lacasa, en los hongos la cantidad de carbohidratos se encuentra entre el
10-25% y en plantas 20-45%. Los carbohidratos presentes son por lo general unidades
de manosa, N-acetilglucosamina y galactosa y su presencia contribuye a la alta
estabilidad de la enzima, lo que le confiriere resistencia a la degradación proteolítica y
termoestabilidad (Kunamneni et al., 2008; Durán et al., 2002; Li et al., 1999). Las enzimas
purificadas han demostrado una notable heterogeneidad en cuanto al contenido y tipo de
glicosilación que puede variar con las condiciones del medio de crecimiento (Pickard y
Hashimoto 1988).
5
Figura 1-1: Estructura de la lacasa con los sitios de cobre activos (Chakratborty y Barton, 2011).
Figura 1-2: Detalles estructurales de los centros catalíticos de cobre, en donde el átomo
de cobre T1 está coordinado por una cisteína y dos histidinas. El centro trinuclear se
encuentra coordinado por residuos de histidina. El residuo de cisteína se encuentra
enlazado a dos histidinas del centro trinuclear (Bento et al., 2010).
6
1.3 Mecanismo de reacción de la lacasa
En el proceso de oxidación catalizado por la lacasa, la enzima reacciona con cuatro
moléculas de sustrato, recibiendo un electrón de cada una, involucrando una
transferencia de 4 electrones al oxígeno molecular para reducirlo a agua.
[4RH+O2→4R+2H2O] (Hammel 1997).
Esta reacción se realiza en varios pasos, en el primero ocurre la reducción de un átomo
de cobre ubicado en el sitio T1, el cual es el aceptor inicial de electrones (Messerschmidt
et al., 1992). Luego los electrones pasan del sitio T1 al T2/T3, a través de un residuo de
cisteína que coordina el átomo de cobre a un par de histidinas ubicadas en el sitio T3 que
están coordinando los átomos de cobre del centro trinuclear (Bento et al., 2010). De esta
forma la enzima pasa a un estado completamente reducido (Figura 1-3). En total son
requeridos 4 electrones para obtener una reducción completa de la enzima. La
transferencia de electrones del sustrato al cobre T1 no constituye un paso limitante en el
ciclo catalítico, al contrario de la transferencia intramolecular del centro T1 al centro
trinuclear T2/T3 (Wong 2009).
Figura 1-3: Ciclo catalítico de la lacasa. (Wong 2009)
Durante la reducción del oxígeno molecular se forman estados intermediarios enlazados
con oxígeno. La molécula de oxígeno se enlaza al centro trinuclear T2/T3, y dos
7
electrones son transferidos rápidamente de los cobres ubicados en T3, permitiendo la
formación del peróxido intermediario (Figura 1-3). La difusión del dioxígeno al centro
trinuclear es limitante de la velocidad, y es sucedido por la rápida transferencia de un
electrón desde T1. El peróxido intermediario decae a un oxi radical y sufre una ruptura
reductiva de 2 electrones del enlace O-O con la consecuente liberación de agua (Lee et
al., 2002; Palmer et al., 2001). Este intermediario decae lentamente por la transferencia
electrónica desde el cobre T2. Después de este último paso los cuatro átomos de cobre
se han oxidado y O2- es liberado como una segunda molécula de agua (Figura 1-3).
1.4 Factores que afectan la actividad lacasa
La actividad de las lacasas depende de varios factores fisicoquímicos como temperatura,
pH, inductores, mediadores de la oxidación, entre otros, los cuales se presentan a
continuación.
Temperatura: La temperatura óptima para la lacasa puede diferir ampliamente entre una
especie y otra. Por ejemplo en el caso de Ganoderma lucidum la temperatura óptima de
las isoformas de lacasa es de 20°C (Ko et al., 2001), y para la lacasa de Trametes hirsuta
es de 85°C (Haibo et al., 2009). En cuanto a la estabilidad se ha encontrado que algunas
lacasas pueden aumentar su actividad luego de una pre incubación de la enzima a 40-
50°C (Farnet et al., 2000).
pH: El pH óptimo para el funcionamiento de las lacasas depende principalmente del
sustrato. De forma general el pH óptimo de las lacasas sigue el comportamiento de una
campana, con un pH óptimo que puede variar considerablemente entre las diferentes
enzimas. Dicha variación se atribuye a cambios generados en el sustrato, al oxígeno o la
enzima misma, los cuales interfieren en la reacción catalítica (Xu 1997). La diferencia en
el potencial redox entre el sustrato fenólico y el sitio T1 del cobre puede incrementar la
oxidación del sustrato a un elevado pH, no obstante la unión de un hidróxido al centro
trinuclear de cobre T2/T3 puede inhibir la actividad de la lacasa, por lo que estos dos
efectos juegan un papel importante al determinar el pH óptimo al cual actúa la enzima
(Xu 1997). La dependencia del pH óptimo de acuerdo al sustrato se ha demostrado al
evaluar una misma enzima con diferentes sustratos como el ABTS, siringaldazina, o 2,6-
8
dimetoxifenol obteniendo diferentes valores de pH óptimo en cada caso (Yang et al.,
2013).
Agentes inhibidores: La inhibición de la enzima puede darse por la presencia de
aniones como azida, haluros, cianuros, tiocianato e hidróxido debido a que se enlazan a
los átomos de cobre del sitio catalítico T2/T3, lo que deriva en la interrupción de la
transferencia interna de electrones y la inhibición del ciclo catalítico (Dwivedi et al., 2011).
Otros inhibidores incluyen iones metálicos (p.ej Hg2+), ácidos grasos, reactivos sulfhidrilo,
hidroxiglicina, ácido kójico, y sales de amonio cuaternarias, el efecto se debe a
reacciones que involucran modificaciones de residuos de aminoácidos, cambios
conformacionales, o quelación del cobre (Dwivedi et al., 2011; Gianfreda et al., 1999; Call
y Mucke, 1997; Bollag y Leonowicz 1984;).
Mediadores de reacción: Las lacasas hacen parte del conjunto de enzimas responsable
de la degradación de la lignina en la madera, sin embargo debido a su peso molecular
que se encuentra cerca a unos ~70 KDa, estas enzimas no pueden penetrar
profundamente al interior de la estructura lignocelulósica de la pared celular vegetal.
Además debido a su bajo potencial redox (~0,5-0,8V) no les es posible degradar
unidades no fenólicas de la lignina, con un alto potencial redox (>1,5V) (Galli y Gentili,
2004). Por lo anterior las lacasas de forma individual solo pueden degradar unidades
fenólicas de la lignina en la superficie del sustrato, lo cual es una limitación importante si
se tiene en cuenta que dichas unidades constituyen menos de un 20% de la lignina
(Rodriguez-Couto y Toca-Herrera, 2006). No obstante las lacasas pueden ser usadas
para la degradación de compuestos de alto potencial redox, siempre y cuando se
encuentren en presencia de mediadores de oxidación, que son moléculas que permiten
extender el efecto degradativo de la enzima a unidades no fenólicas (Figura 1-4).
Además debido al tamaño de los mediadores, su uso tiene como ventaja superar el
problema de accesibilidad de la enzima, así como problemas derivados de impedimentos
estéricos, este fenómeno fue descrito por primera vez por Bourbonnais y Paice (1990).
Se ha publicado que las lacasas de diferentes organismos reaccionan de manera distinta
con diferentes mediadores, y diversos sustratos (Camarero et al., 2005), lo cual plantea
la necesidad de realizar estudios de diferentes enzimas y mediadores.
9
Figura 1-4: Ciclo catalítico del sistema lacasa mediador.
A la fecha se han descrito más de 100 compuestos mediadores de la oxidación para el
sistema Lacasa-mediador, pero los dos más comunes son el ABTS y el 1-
hidroxibenzotriazol (HBT) (Camarero et al., 2005 y Bourbonnais et al., 1997). La lacasa
puede oxidar con facilidad el ABTS, generando el catión radical ABTS+.. Este catión
radical representa un intermediario en la oxidación al catión divalente por la sustracción
de otro electrón, por lo que el ABTS+. es oxidado nuevamente para producir ABTS2+. El
potencial de oxidación para los pares (ABTS/ABTS+.) y (ABTS+./ABTS2+) es de 0,680V y
1,09V respectivamente. El ABTS2+ es el intermediario activo responsable de la oxidación
de sustratos no fenólicos (Scott et al., 1993). El mecanismo por el que el ABTS degrada
los compuestos no fenólicos se observa en la figura 1-5.
Figura 1-5: Mecanismo de oxidación del ABTS como mediador en la oxidación de sustratos no fenólicas (Wong 2009)
10
La oxidación mediada por HBT de sustratos no fenólicos involucra la oxidación inicial del
HBT a HBT+. por la lacasa, seguido de la desprotonación del radical formado. Esta última
especie radical es la encargada de sustraer el hidrógeno bencílico del sustrato, formando
una especie radical del mismo. El potencial de oxidación HBT/HBT+. es de 1,08 V, lo que
hace que este mediador sea más efectivo que el ABTS (Baiocco et al., 2003; Fabbrini et
al., 2002) El mecanismo se observa en la figura 1-6.
Figura 1-6: Mecanismo de oxidación del HBT como mediador en la oxidación de sustratos no fenólicos (Wong 2009)
1.5 Estructura y organización génica de las lacasas Los genes para lacasas codifican proteínas de un tamaño de 520-550 aminoácidos, junto
con un péptido señal N terminal para su secreción de unos 20 residuos de aminoácidos
(Janusz et al., 2012). Un gran número de hongos filamentosos producen varias
isoenzimas que son codificadas en promedio, por entre 4 a 8 genes (Hoegger et al.,
2004; Litvintseva y Henson 2002; Yaver y Golightly 1996; Yaver et al., 1996). En P.
ostreatus la familia de genes consiste en 11 o 12 genes (Castanera et al., 2012; Pezzella
et al., 2013) de los cuales solo algunos han sido caracterizados, con la producción de al
menos 8 isoenzimas. Esta heterogeneidad es debida a la multiplicidad de los genes
correspondientes, no obstante el número de productos sigue siendo alto debido al
complejo proceso de modificaciones postraduccionales que sufren estas proteínas
(procesamiento proteolítico, glicosilación, etc) (Pezzella et al., 2009).
En cuanto al número de intrones presentes, se estima que hay alrededor de 8-13 intrones
por gen, con una longitud de 50 a 90pb (Kiiskinen, 2005), con la excepción notable de
11
P. ostreatus que posee 19 intrones con una longitud de 47-64pb (Giardina et al., 1995). .
Los datos de secuenciación han mostrado que los genes de lacasa en Ascomycetes
tienen un menor número de intrones (1-6) que los basidiomycetes (hasta 19). Aunque
con un mayor número de intrones aumenta la posibilidad de un splicing alternativo de los
transcritos primarios, este fenómeno no ha sido encontrado para lacasas (Janusz et al.,
2012).
La revisión de varias secuencias promotoras de lacasas resalta la existencia de diversos
elementos regulatorios a lo largo del promotor (Piscitelli et al., 2011). Todas las regiones
promotoras de lacasas poseen una secuencia TATA necesaria para el inicio de la
transcripción (Okamoto et al., 2003; Ballance 1986) y al menos una caja CAAT. La
posición de estas dos cajas difiere entre los diferentes genes (Ballance 1986).
La expresión de las lacasas es controlada por diferentes condiciones fisiológicas, por lo
que se espera que las regiones promotoras posean variedad de elementos de respuesta
a diferentes factores. Dentro de estos elementos encontramos secuencias MRE
(Elemento de respuesta a metales), con una secuencia consenso TGCRCNC (Faraco et
al., 2003; Okamoto et al., 2003; Soden y Dobson 2003; Galhaup et al., 2002a; Thiele
1992), secuencias XRE (Elemento de respuesta a xenobióticos) con una secuencia
consenso un poco menos conservada T/GCG/AT/CGC/G, y secuencias repetidas
NGAAN en cualquier orientación para el elemento de respuesta al choque térmico (HSE)
(Galhaup et al., 2002a; Mager y De Kruijff 1995; Cunniff et al., 1991). En Trametes
pubescens se ha observado un incremento en la expresión de lacasa como respuesta a
la presencia de metales pesados (Piscitelli et al., 2011). Dentro de la secuencia MRE en
los promotores también se ha encontrado una secuencia de unión a la proteína ACE1, el
cual activa la transcripción de las lacasas en respuesta a la presencia de cobre, dichas
secuencias se adhieren a la secuencia consenso TACNGCTGA (Canero y Roncero,
2008; Canessa et al., 2008).
Otros elementos presentes en la región promotora de lacasas fúngicas son los elementos
putativos de respuesta al estrés (STRE). Estos se adhieren a la secuencia consenso
CCCCT (Xiao et al., 2006; Galhaup et al., 2002a; Treger et al., 1998). Algunos elementos
de respuesta a cAMP se han encontrado en las regiones del promotor de lacasas en
Trametes spp. Sugiriendo un rol del cAMP en la regulación de la expresión de lacasas
(Xiao et al., 2006; Galhaup et al., 2002a).
12
1.6 Producción de lacasas
Las lacasas son secretadas como parte del metabolismo secundario de muchos hongos
(Shi et al., 2012; Tavares et al., 2005). El prolifero campo de acción en que esta enzima
puede aplicarse, genera una alta demanda y obliga a mejorar los métodos de producción,
ya sea utilizando la ingeniería genética, empleando diferentes métodos de cultivo,
modificando los componentes del mismo y sus concentraciones, o una mezcla de
diferentes estrategias.
La expresión heteróloga de lacasas ha sido una estrategia empleada con el fin de
mejorar la producción de la enzima para así producir grandes cantidades necesarias para
aplicaciones biotecnológicas (Wong et al., 2012). Una ventaja asociada a la expresión
heteróloga ha sido facilitar la caracterización de diferentes isoformas de lacasas en un
determinado organismo (Yaver et al., 1999), así como también el evitar la producción de
otros compuestos tóxicos indeseables. Este tipo de expresión se ha investigado en
hospederos que permitan modificaciones postraduccionales, debido a la glicosilación de
la proteína. Así la expresión heteróloga se ha probado en organismos eucariotas como
Sacharomyces cerevisiae, con resultados insatisfactorios al producirse la expresión de
una proteína con baja actividad (Larsson et al., 2001). En organismos como Pichia
pastoris y Aspergillus sp. La expresión ha mostrado un aumento en el nivel de
producción de la enzima (Liu et al., 2003), así como la producción de enzimas altamente
funcionales para potencial aplicación biotecnológica (Wong et al., 2012).
Con relación a la optimización de los medios de cultivo para maximizar la producción de
la enzima, la fuente de carbono se destaca como un factor importante (Stájic et al.,
2006). En basidiomicetos el empleo de fructosa produce una alta actividad (Mansur et al.,
1997) mientras que en algunas especies de Ganoderma el empleo de almidón produce
los mejores valores de actividad (Revankar y Lele, 2006), al igual que en P. ostreatus
(Elsayed et al., 2012). Adicionalmente, las fuentes orgánicas de nitrógeno como el
extracto de levadura, la peptona, y la urea, así como fuentes inorgánicas como el sulfato
de amonio, y nitrato de potasio han sido usados en la producción de lacasas (Iqbal et al.,
2011; Revankar y Lele, 2006) En cuanto a la relación carbono nitrógeno (C/N) en los
medios de cultivo, algunos reportan que una relación alta favorece la expresión de la
enzima (Heinzkill et al., 1998; Buswell et al., 1995;), y otros que la expresión se favorece
con una relación C/N baja (Monteiro y De Carvalho, 1998). Por otra parte el empleo de
13
residuos lignocelulósicos de origen agroindustrial está siendo ampliamente usado con
resultados satisfactorios (Osma et al., 2007; Stájic et al., 2006). El empleo de estos
sustratos supone también una disminución en los costos de producción de la enzima,
teniendo en cuenta que más del 60% de los costos se relaciona con el medio de cultivo
(Osma et al., 2011).
La producción de lacasas también puede potenciarse mediante la adición de inductores
aromáticos. La utilización en el medio de cultivo de pequeñas cantidades de compuestos
como 2,5-xilidina, ácido ferúlico, ácido gálico, lignina, guayacol, entre otros ha potenciado
la producción enzimática (Revankar y Lele, 2006; Eggert et al., 1996). Así mismo la
adición de pequeñas cantidades de cobre, también ha mostrado ser capaz de inducir la
expresión de lacasa (Palmieri et al., 2000). La respuesta al cobre y a los inductores
aromáticos se ha relacionado con elementos génicos inducibles en las regiones
promotoras (Faraco et al., 2003). La forma en la cual los diferentes hongos responden a
la presencia de un inductor varía considerablemente (Eggert et al., 1996). La adición de
un determinado inductor puede incrementar la concentración de una lacasa en específico
o incluso inducir la expresión de nuevas isoformas de la enzima (Robene-Soustrede y
Lung-Escarmant, 1997).
Otro aspecto a tener en cuenta en el cultivo, es la temperatura a la cual este se lleva
acabo. La temperatura de cultivo óptima para la producción de lacasa se encuentra entre
los 25 y los 30°C (Vasconcelos et al., 2000). Cuando el cultivo se realiza a temperaturas
superiores a 30°C la actividad se ve reducida (Nyanhongo et al., 2002).
1.6.1 Tipo de cultivo
La fermentación sumergida y la fermentación en estado sólido son las dos formas de
cultivo que se usan para la producción de lacasas. El proceso de fermentación sumergida
involucra el crecimiento del organismo inmerso en un medio líquido. Hongos como
Galerina sp. han mostrado una mayor producción de la lacasa bajo condiciones de
fermentación sumergida (Dong et al., 2005). Una ventaja de este tipo de fermentación es
la recuperación sencilla de la enzima a partir del sobrenadante del medio de cultivo. Una
de las desventajas asociadas a este método es el excesivo crecimiento de micelio que
puede afectar la configuración del reactor al aumentar la viscosidad del medio y unirse a
los impulsores y bloquearlos. Esto puede controlarse mediante la inmovilización de
14
células en diferentes soportes, o mediante la producción por lote alimentado, controlando
así el crecimiento fúngico (Galhaup et al., 2002b).
La fermentación en estado sólido se define como una técnica en la cual se realiza el
crecimiento del organismo en condiciones en las que el agua adicional a la de saturación
del sustrato está en cantidades bajas o totalmente ausente. Se han reportado altas
producciones de la enzima empleando este tipo de fermentación (Meza et al., 2006;
Rodriguez-Couto y Toca-Herrera 2006; Stájic et al., 2006), lo que se ha vinculado al
hecho de que un ambiente de fermentación en estado sólido “simularía” las condiciones
naturales de crecimiento del hongo. Las principales desventajas de este tipo de
fermentación se relacionan con la transferencia de oxígeno, nutrientes, porcentaje de
humedad, y la regulación de la temperatura y el pH (Rodriguez-Couto y Toca-Herrera,
2007). Sin embargo estas desventajas también dependen de las características del
sustrato empleado y de la configuración del reactor (Rodriguez-Couto et al., 2003).
1.7 Aplicaciones biotecnológicas
Las lacasas presentan diversos campos de aplicación entre los que se encuentran, la
producción de pulpa de papel en donde se ha mostrado que su utilización acompañada
de otros mediadores redox en la etapa de pretamiento y en posteriores procesos de
pulpado termomecánico reduce de los costos energéticos de producción (Widsten y
Kandelbauer, 2008). Los sistemas lacasa-mediador han permitido la degradación de
compuestos fenólicos desde el bifenol y derivados alquilfenólicos (Saito et al., 2004;
Uematsu et al., 2001), así como abrillantadores fluorescentes, usados en tenería
(Nakatani y Yoshida, 2003). También pueden ser usadas para eliminar olores en lugares
como basureros, sitios de depósito, fincas ganaderas y plantas de pulpado (Xu et al.,
2004; Hiramoto y Abe, 2004). Las lacasas también pueden utilizarse para decolorizar
efluentes de tintorería (Maximo y Costa-Ferreira 2004), aguas residuales de ingenios de
aceite de oliva (D´Annibale et al., 2000) y papeleros (Caballero et al., 2002; Manzanares
et al., 1995) por remoción de compuestos fenólicos derivados.
15
2. Objetivos
2.1 Objetivo general Optimizar el proceso de producción, purificación y caracterización de una lacasa a partir
de un hongo nativo para su posible aplicación en procesos biotecnológicos.
2.2 Objetivos específicos
• Seleccionar un organismo potencial dentro de un tamizaje inicial de hongos con actividad lacasa, basado en los valores de actividad obtenidos bajo condiciones establecidas.
• Potenciar la producción de lacasa en el hongo seleccionado con el fin de mejorar la eficiencia del cultivo, y el rendimiento de la posterior purificación.
• Purificar la lacasa del organismo seleccionado, obteniéndola del cultivo potenciado para la producción de la misma.
• Caracterizar la enzima purificada, y determinar parámetros cinéticos de interés para su estudio y posible aplicación.
16
3. Hipótesis
Desde el descubrimiento de las enzimas lignolíticas estas han sido propuestas para
diversas aplicaciones industriales. Considerando los costos asociados al montaje de tales
aplicaciones, la amplia diversidad de organismos existentes se convierte en una ventaja
que plantea la posibilidad de encontrar un organismo con un sistema lignolítico con
enzimas tipo lacasa con características superiores o potenciales en relación a su
aplicación en determinados procesos de interés industrial.
4. Metodología
4.1 Fermentación líquida sobre salvado de trigo
Los cultivos para la producción de la enzima se llevaron a cabo en 30 ml de medio de
cultivo en erlenmeyers de 100 ml tapados con papel aluminio. Se usó un medio de cultivo
Mandels modificado (Moya y Torres, 2012) bajo la siguiente formulación: salvado de trigo
50 g/L, (NH4)2SO4 1.4g/L; KH2PO4 2g/L; CaCl2.2H2O 0,4 g/L; MgSO4.7H2O 0,3g/L;
FeSO4.7H2O 5mg/L; MnSO4.H2O 1,18mg/L; ZnSO4.7H2O 1,4mg/L; CoCl2.6H2O 2,6mg/L.
Los caldos fueron inoculados con tres discos de medio de 5 mm de diámetro tomados de
la periferia del hongo crecido en placas de agar-salvado de trigo o PDA (Agar dextrosa
papa) de 10 días de incubación (lo cual dependió de la etapa de estudio, ver ítem 5.2). El
pH del medio se ajustó a 5,6 previo a la esterilización. Los frascos de cultivo se
dispusieron en una incubadora a 26± 2°C con agitación orbital de 150rpm por 16 días. Se
tomaron muestras cada dos días, y se evaluó la actividad enzimática lacasa (Ítem 4.6).
4.2 Selección del hongo de interés
A partir de estudios previos realizados en el marco del proyecto “Determinación de la
capacidad celulolítica de consorcios de hongos filamentosos en sustratos
agroindustriales de interés” se aislaron 76 morfotipos de hongos provenientes del
Parque Natural Chicaque y plantaciones de palma de aceite de Unipalma S.A., a los
cuales se les realizó una identificación molecular utilizando secuencias ITS (Internal
Transcribed Spacer) del rDNA ribosomal y una caracterización enzimática lignolítica en
placa de tipo cualitativa y cuantitativa (Crespo-Linares y Torres-Rojas, 2013). De este
estudio se seleccionaron siete hongos positivos para actividad lignolítica que fueron
evaluados para actividad lacasa en medio líquido. Para ello se inocularon 3 discos de
micelio crecido en medio sólido PDA durante una semana en un erlenmeyer de 100mL
con 30mL de medio para fermentación líquida sobre salvado de trigo. Las condiciones de
crecimiento fueron las descritas en el ítem 4.1. Se evaluó la actividad enzimática de los
18
sobrenadantes de cultivo cada 2 días durante 16 días. Cada medida constituyó la media
de tres réplicas experimentales.
4.3 Almacenamiento y conservación del hongo
El hongo ascomiceto seleccionado, identificado como Xylaria sp. (CH003) fue
conservado en cajas de Petri en agar salvado de trigo a 4°C y subcultivado cada 3
meses en el mismo medio. Hace parte actualmente de la colección del laboratorio de
Agrobiotecnología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de
Colombia. Esta cepa también se encuentra depositada en la colección de
microrganismos de la Pontificia Universidad Javeriana (registro 148), la cual está
asociada la WDCM (Word Data Center for Microorganism).
4.4 Método de un factor a la vez
Se utilizó el método de un factor a la vez para optimizar la fuente de carbono y nitrógeno
empleada en el cultivo. Para investigar el efecto de la fuente de carbono sobre la
producción de lacasa del hongo Xylaria sp. se sustituyó el salvado de trigo por cinco
fuentes de carbono diferentes, fructosa (10g/L), almidón (10g/L), cáscaras de mandarina
(40g/L), raquis de palma de aceite con fibras de tamaño de 1mm y 10 mm (50g/L),
dejando los demás componentes del medio tal como se describieron previamente en el
ítem 4.1. Para optimizar la fuente de nitrógeno, se sustituyó el (NH4)2SO4 y se reemplazó
por tres fuentes de nitrógeno diferentes, extracto de levadura, peptona y KNO3, todos a
una concentración de 1,4g/L, los demás componentes del medio se mantuvieron en las
mismas concentraciones, como fuente de carbono se utilizó la mejor fuente de carbono
seleccionada en el paso anterior a la concentración evaluada.
4.5 Método de arreglo ortogonal de Taguchi
Se utilizó un arreglo ortogonal L9 (34) en el cual se evaluaron cuatro componentes del
medio, a saber, la fuente de carbono seleccionada (salvado de trigo), la fuente de
nitrógeno seleccionada (KNO3), CuSO4.5H2O y KH2PO4, todos estos a tres
concentraciones diferentes (tabla 4-1). Los demás componentes se mantuvieron a las
concentraciones descritas anteriormente. El diseño experimental se observa en la tabla
19
4-2. Los experimentos fueron realizados a 26±2°C y 150rpm de agitación orbital. Se
determinó la actividad lacasa al octavo día de crecimiento.
Tabla 4-1: Niveles de concentración evaluados en el arreglo ortogonal de Taguchi para la
salvado de trigo, KNO3, CuSO4.5H2O y KH2PO4.
Nivel Salvado de trigo (g/L) KNO3 (g/L) CuSO4.5H2O (g/L) KH2PO4 (g/L) 1 40 1,4 0,002 0,50 2 50 2,5 0,004 1,0 3 60 5,0 0,006 2,0
Tabla 4-2: Arreglo ortogonal L9(34) empleado para la producción de lacasa del hongo
Xylaria sp.
Experimento Salvado de trigo KNO3 CuSO4 KH2PO4 Valor actividad 1 1 1 1 1 V1 2 1 2 2 2 V2 3 1 3 3 3 V3 4 2 1 2 3 V4 5 2 2 3 1 V5 6 2 3 1 2 V6 7 3 1 3 2 V7
8 3 2 1 3 V8 9 3 3 2 1 V9
Los resultados se evaluaron mediante el programa Qualitek-4 versión 17.1.0, usando la
opción Bigger is better (Revankar y Lele, 2006). Este software se utilizó también para
determinar el valor de actividad lacasa teórico alcanzado, usando las concentraciones
óptimas de cada componente en el medio de cultivo.
Para determinar la influencia de cada parámetro se calculó el valor medio de cada nivel y
componente. Por ejemplo para el componente CuSO4 los niveles evaluados tendrán los
siguientes valores medios:
��� =(�� + �� +��)
3
��� =(�� + �� +� )
3
20
��� =(�� + �� + ��)
3
Una vez calculados estos valores de VN para cada componente y cada nivel evaluado,
se tabularon en una tabla y se calculó el delta o rango R (R=alto VN-bajo VN) Entre mayor
sea el valor de R, mayor será la influencia de dicho componente sobre el experimento.
Además para cada componente el nivel que produzca el más alto valor de VN es el
elegido como óptimo para el experimento (Chou et al., 2010), lo cual estuvo en
concordancia con el análisis realizado en el software Qualitek-4:
Tabla 4-3: Valores medios para cada nivel y cada componente y rango de cada
componente.
Nivel Salvado de trigo
KNO3 CuSO4.5H2O KH2PO4
1 VN1 VN1 VN1 VN1 2 VN2 VN2 VN2 VN2 3 VN3 VN3 VN3 VN3 R RSalvado de trigo RKNO3 RCuSO4 RKH2PO4
4.6 Determinación de interacciones entre los factor es evaluados
Esta determinación se realizó usando el software Qualitek-4 versión 17.1.0 con los
resultados de los experimentos del arreglo ortogonal de Taguchi implementado en el ítem
4.5. Una vez analizados los resultados con la opción Bigger is better se seleccionó la
opción interactions para obtener la tabla de interacciones, la cual contiene el índice de
severidad de interacción entre dos componentes (Indicando un 100% para interacciones
significativas y un 0% para interacciones poco significativas).
4.7 Determinación de la actividad enzimática lacasa
La determinación se realizó de acuerdo a Gomes et al., (2009). Se tomó el contenido
extracelular de un frasco de cultivo y se centrifugó a 14000g por 15 minutos a 4°C. En un
tubo eppendorft se colocaron 0,85mL de tampón acetato de sodio 10mM pH 4.5 y se
adicionaron 50 µL de solución stock de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-
sulfónico) (ABTS) 10mM. A la anterior mezcla se le adicionó 100 µL del extracto
21
enzimático para un volumen final de 1mL y se determinó la absorbancia a 420 nm. A
partir de las medidas de absorbancia y el coeficiente de extinción molar (Ɛ) del catión
radical del ABTS producido en la reacción (36000 M-1cm-1) se calcularon las unidades de
actividad definidas como el número de micromoles del producto de la enzima producidos
por minuto a las condiciones del experimento. La reacción se llevó a cabo a temperatura
ambiente. El resultado de las actividades enzimáticas se expresó como el promedio de
tres réplicas biológicas. (El valor de 100 µL de extracto enzimático pudo cambiar según la
actividad observada, utilizándose también los valores 50, 10 y 1 µL). Para la
determinación de actividad específica, se hizo una relación de la actividad volumétrica
U/L y la concentración de proteínas en mg/L. La concentración de proteínas fue obtenida
por el método Bradford con el kit de SIGMA, la curva de calibración se muestra en el
anexo A.
4.8 Empleo de inductores
A los cultivos optimizados mediante el diseño ortogonal se aplicaron los inductores
aromáticos 2,5 xilidina, guayacol, ácido gálico y ácido ferúlico, los cuales se usaron a una
concentración final de 1mM. Estos inductores se aplicaron en el cuarto día de
crecimiento.
4.9 Purificación de la enzima
4.9.1 Diafiltración
Una vez determinada la mejor estrategia para la producción máxima de la enzima, y el
día de mayor actividad se procedió a la purificación enzimática. El día de mayor
actividad, correspondiente al día seis se filtró el sobrenadante de cultivo a través de
papel Whatman No 3. Posteriormente se pasó el sobrenadante filtrado a través de una
membrana Pellicon ® XL filter de 30 KDa (Millipore), concentrando la muestra 11 veces.
4.9.2 Cromatografía de intercambio aniónico
La muestra procedente de la diafiltración fue precipitada con acetona y redisuelta en
tampón acetato de sodio 10mM pH 5,0 con el fin de concentrarla lo suficiente para
22
obtener mejores rendimientos en las siguientes etapas de cromatografía. La muestra fue
aplicada a una columna de intercambio aniónico DEAE sefarosa de flujo rápido en un
equipo de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) de la casa comercial BioRad,
referencia BioLogic Duo Flow system. La resina fue empacada en una columna de 20cm
x 1cm alcanzando un volumen de 15mL. La resina fue equilibrada pasando tres
volúmenes de tampón A (acetato de sodio 10mM pH 5,0) a una tasa de flujo de 3
mL/min. Luego de la aplicación de la muestra se siguió un programa de gradiente por
pasos para ir de 100% a 0% del tampón A, con un consecuente aumento del tampón B o
tampón de elución (acetato de sodio 10mM pH 5,0 con NaCl 2M) de 0% a 100%. El
programa de corrido de la muestra se presenta en la tabla 4-4. Se recogieron fracciones
de 3ml durante todo el programa de corrida.
Cada una de las fracciones recogidas se dializó y concentró con un dispositivo Amicon ®
Ultra 15 y analizada para actividad lacasa con el sustrato ABTS (SIGMA). Las fracciones
encontradas como positivas se reunieron y se concentraron a través del dispositivo
Amicon ® para detectar la actividad específica utilizando la metodología descrita en el
ítem 4.6 y para ser utilizada en el siguiente paso de purificación.
Tabla 4-4: Programa de corrido de la cromatografía de intercambio aniónico DEAE en
resina sefarosa de flujo rápido, llevada a cabo en el equipo BioRad BioLogic Duo Flow
system. (Tampón A: Acetato de sodio 10mM pH 5,0; tampón B: acetato de sodio 10mM
pH 5,0 con NaCl 2M).
Flujo Tampón Volumen (ml )
Isocrático 100% A 0% B 15
Gradiente lineal 75�73% A 25�27% B 30
Isocrático 73% A 27% B 50
Gradiente lineal 73�71% A 27�29% B 30
Isocrático 71% A 29% B 50
Gradiente lineal 71�69% A 29�31% B 30
Isocrático 69% A 31% B 50
Gradiente lineal 69�67% A 31�33% B 30
Isocrático 67% A 33% B 30
Gradiente lineal 67�55% A 33�45% B 30
23
Isocrático 55% A 45% B 30
Gradiente lineal 55�0% A 45�100% B 30
Isocrático 0% A 100% B 30
4.9.3 Cromatografía de exclusión por tamaño
La muestra proveniente de la etapa de purificación anterior, ítem 4.8.2 se aplicó sobre
una columna de 18 cm x 1,7 cm con resina Sephadex G-100 ocupando un volumen de
33mL y operada a un flujo de 0,33 ml/min. La resina fue empacada y equilibrada con tres
volúmenes de tampón acetato de sodio 10mM pH 5,0 con NaCl 100mM. Posterior a la
aplicación de la muestra se recogieron fracciones de 1,5ml durante el paso de un
volumen de columna.
4.10 Electroforesis y zimografía
Para seguir y verificar la purificación de la proteína en los distintos pasos se realizó un
gel de electroforesis con geles de poliacrilamida en presencia de dodecil-sulfato de sodio
(SDS-PAGE) con un porcentaje del 12% en el gel de separación y de 5% en el gel de
concentración. Se utilizó un sistema discontinúo de acuerdo a lo reportado por Laemmli
(1970). Para la tinción del gel se empleó la tinción con azul brillante de Comassie, y
tinción con plata (Simpson et al., 2009). Para el desarrollo de la electroforesis se utilizó
un sistema modular MiniProtean Bio-Rad® con espaciadores de 0,75mm. Las
condiciones de corrida fueron 100 V durante un tiempo de 100 minutos. La preparación
de los componentes utilizados durante la formulación están descritos en el anexo B, y las
proporciones y el orden de mezcla están enunciados en el anexo C.
Para la estimación del peso molecular relativo de las proteínas se determinó en el gel de
separación la distancia de corrido (cm) de cada marcador de proteínas, y se graficó el
logaritmo de dicho valor contra el logaritmo del peso molecular teórico respectivo (Anexo
D). Una vez obtenida la gráfica, se realizó una conversión de la distancia recorrida por la
proteína de interés, a peso molecular relativo (kDa) mediante el empleo de la ecuación
de la recta, según lo reportado por Janson (2011).
24
Para el zimograma se realizó una tinción con guayacol de acuerdo a lo reportado por
Sharma et al. (2007) con ciertas modificaciones. Se llevó a cabo un gel en condiciones
no denaturantes, ni reductoras (Native-PAGE) de 12% de acrilamida, y se corrió a 100V
durante 100 minutos. La muestra se preparó en un tampón de carga sin SDS, ni β-
mercaptoetanol, y se cargó sin previo calentamiento. Una vez el frente de corrida alcanzó
el borde inferior del gel, este se sumergió en una solución de guayacol 225mM en
tampón acetato 100mM pH 5,0. La presencia de lacasa se detectó por el desarrollo de
una coloración marrón debida a la oxidación del guayacol. Esta coloración se observó
luego de 15 minutos de incubación en oscuridad a temperatura ambiente.
4.11 Separación de proteínas por electroforesis en dos dimensiones- 2D-PAGE
Con el fin de analizar la expresión diferencial de proteínas bajo el efecto de condiciones
inductoras para la producción de lacasa y determinar el punto isoeléctrico (pI) de la
enzima purificada se realizó un gel de electroforesis en 2 dimensiones. Para lo cual el
extracto obtenido se precipitó inicialmente con ácido tricloroacético/acetona para
concentrar la muestra y redisolviendo el precipitado de proteínas en tampón acetato de
sodio 10mM pH 5. Finalmente, se realizó una precipitación con cloroformo/metanol para
eliminar las sales y se redisolvió en buffer IEF de resolubilización (Urea 8M, CHAPS 4%,
ditiotreitol (DTT) 40mM, con anfolitos 0,2% en gradiente Lineal 3-10).
Para la primera dimensión (Isoelectroenfoque), se emplearon ~100 µg de proteína en
buffer de resolubilización; se usó buffer de rehidratación (Urea 8 M, CHAPS 2%, DTT
40mM, anfolitos 0,2% 3-10, y trazas de azul de bromofenol) para completar el volumen
de rehidratación a 125 µl y se usaron tiras secas con anfolitos inmovilizados (7 cm, pH L
3-10 o 4-7 de Bio-Rad®). La tira se rehidrató con el buffer conteniendo la muestra de
forma pasiva por 2 horas, y de forma activa por 11 horas a 50 V en un focalizador Bio-
Rad®. El isoelectroenfoque de las tiras se llevó a cabo a los siguientes gradientes de
voltaje: 200 V por 1h (rampa rápida), 500 V por 1h (rampa rápida), 1.000 V por 1h (rampa
rápida), 2.000 V por 1h (rampa rápida) y a 4.000 V (rampa rápida) hasta un total de 15
kVh.
25
Después del isoelectroenfoque, la tira fue incubada por 20 minutos en el primer tampón
de equilibrio (2 ml, urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 0,375M pH 8.8, glicerol 20%, DTT
130mM) e incubadas en el segundo tampón conteniendo yodoacetamida (135mM) en vez
de DTT. Para la electroforesis en dos dimensiones, las tiras IPG equilibradas fueron
puestas en un gel de poliacrilamida al 10%. La SDS-PAGE fue llevada a cabo a 80 V
mientras el frente de corrida entraba al gel separador, a 100 V en el gel separador por 1
hora y luego 120V hasta el término de la electroforesis, usando una cámara de
electroforesis MiniProtean Bio-Rad®. Después de la separación, las proteínas en el gel
fueron fijadas con etanol al 50% y ácido fosfórico al 5% por 11 horas, lavadas tres veces
con agua por 20 minutos cada uno; finalmente sensibilizadas en ácido fosfórico al 2%,
etanol al 18% y sulfato de amonio al 15%; y teñidas con Coomassie coloidal (G-250) al
1% por 72 horas. Este protocolo fue llevado a cabo por el personal del Laboratorio de
Hormonas del Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia.
4.12 Espectrometría de masas
Para el análisis por espectrometría de masas, la fracción proveniente de la última etapa
de purificación (cromatografía de exclusión, ítem 4.8.3) se corrió en un gel de
electroforesis, SDS-PAGE, siguiendo los parámetros descritos en el ítem 4.9. Luego de la
tinción con plata del gel, las bandas fueron extraídas y fragmentadas en pequeños
pedazos con una cuchilla estéril para luego ser sumergidas en agua desionizada. Estas
bandas fueron desteñidas con por adición de 50 µL K3Fe(CN)6 30mM y 50 µL de Na2SO3
100mM con agitación por 10 minutos. Posteriormente se hicieron lavados con agua
desionizada y uno final con acetonitrilo. Después de desteñir las piezas de gel fueron
secadas en un speed-vacuum por 5 minutos; reducidas con DTT 10mM por 30 minutos
y lavadas con bicarbonato de amonio 25mM. Después fueron alquiladas con
yodoacetamida 55mM por 30 minutos y lavadas con bicarbonato de amonio 25mM, luego
secadas con acetonitrilo y speed-vacuum por 5 minutos. La digestión fue realizada con
tripsina 20 µg/ml en bicarbonato de amonio 25mM a 37°C durante toda la noche. Luego
de la digestión los péptidos fueron extraídos con acetonitrilo, las piezas de gel
deshidratadas se rehidrataron con agua-HPLC y se extrajeron de nuevo con acetonitrilo.
Las soluciones peptídicas extraídas fueron congeladas a -80°C y liofilizadas, para ser
26
reconstituidas en 5 µL de una solución con metanol 50% y ácido fórmico 0.1%. Estos
análisis fueron llevados a cabo por el personal del laboratorio de análisis biofísicos del
Bindley Bioscience Center-Discovery Park Facilities de la Universidad de Purdue, West
Lafayette, Indiana, 47095, con el equipo el equipo Eksigent + Nano LC-425 acoplado a
ABSciex Triple TOF5600. Los espectros MS/MS fueron analizados con el software
Mascot (v.2.4.0) empleando la base de datos no redundante del National Center for
Biotechnology Information (NCBInr).
4.13 Caracterización cinética de la enzima
Para la caracterización enzimática se determinaron los parámetros, pH óptimo,
temperatura óptima, estabilidad al pH, estabilidad térmica, inhibición por iones metálicos
y otros inhibidores, determinación de la constante de Michaelis (Km) y velocidad máxima
(Vmax), utilizando como sustrato ABTS.
Para la determinación del pH óptimo se emplearon los siguientes tampones: tampón
citrato 50mM (pH 3, 4 y 5), tampón fosfato 50mM (pH 6, 7 y 8), y tampón Tris-HCl 50mM
(pH 9). La formulación de los tampones recién enunciados se describe en el anexo E.
Para la determinación de la temperatura óptima se evaluaron las temperaturas: 22, 30,
40, 50, 60 y 70°C. Se utilizó un tampón de reacción citrato 50mM pH 4,0. Las reacciones
fueron incubadas durante 5 minutos a la temperatura correspondiente previa a la
medición de la actividad con ABTS.
Para la determinación de la estabilidad al pH se utilizaron los tampones descritos
anteriormente para la evaluación del pH óptimo que incluía diferentes tampones a valores
de pH de: 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9. Para la determinación se incubó 1 µL del extracto
enzimático purificado con 9 µL del tampón a evaluar durante 3 horas, luego de lo cual se
evaluó la actividad residual con ABTS en tampón acetato 10mM pH 4,5.
Para la determinación de la estabilidad térmica se incubó el extracto enzimático
purificado a las temperaturas: 4, 22, 30, 40, 50, 60 y 70°C durante un tiempo de 1, 2 y 3
horas. Luego de lo cual se evaluó la actividad residual con ABTS en tampón acetato
10mM pH 4,5.
27
Para los estudios de inhibición se estudió el efecto de los iones metálicos Ca2+,
Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+, Cd2+ y Fe2+ los cuales se evaluaron a una concentración de
10mM. Así como el efecto de algunos inhibidores quelantes a diferentes
concentraciones: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 y 10mM; NaN3 1 y 10mM,
tioglicolato de sodio 1mM; KCN 5mM; DTT 0,1mM. Todos los inhibidores se añadieron a
la solución enzimática antes de la determinación de la actividad (More et al., 2011). La
formulación de las soluciones empleadas para las pruebas se enuncia en el anexo F. La
actividad enzimática se valoró con ABTS en tampón acetato 10mM pH 4,5.
Para la determinación de la Km y Vmax se utilizaron las siguientes concentraciones de
ABTS: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 y 500µM. La determinación se realizó
en tampón acetato 10mM pH 4,5.
28
5. Resultados
5.1 Selección del hongo Xylaria sp. como mejor productor de lacasa
Se evaluó la actividad lacasa en cultivos sumergidos con la finalidad de encontrar la
mejor cepa productora de lacasas de los siete morfotipos seleccionados. Los siete
morfotipos evaluados correspondieron a los hongos ascomicetos del género Xylaria sp.
registrados en la colección del laboratorio como CH003, CH20 y CH32; y a los hongos
basidiomicetos del género Psathyrella sp. (CH008b y CH10b), Agrocybe sp. (UP001) y
Psilocybe sp. (UP006). La valoración de la actividad lacasa a partir de los sobrenadantes
obtenidos con cada uno de los aislamientos cultivados mediante fermentación sumergida
con salvado de trigo se presenta en la figura 5-1. Estos resultados muestran que con el
hongo CH32 los valores de actividad lacasa fueron muy bajos durante todos los días de
muestreo, y por lo tanto no se observó el cambio de color provocado por la oxidación del
ABTS, a diferencia de lo encontrado para los demás aislamientos en donde la oxidación
del sustrato sintético fue claramente visible, observándose el color verde característico.
Entre estos hongos, la cepa CH003 (Xylaria sp.) mostró un comportamiento
sobresaliente al ser el organismo con mayor actividad lacasa a los seis días de cultivo
(1021±114 U/L). Esta actividad enzimática fue muy superior a la del aislamiento UP001
que presentó la segunda mejor actividad (279,6± 28,1 U/L) hacia el día 16 de cultivo.
Debido a estos resultados se seleccionó el hongo CH003 para las etapas de
mejoramiento de cultivo y purificación enzimática.
29
Figura 5-1: Evaluación de la actividad lacasa para los 7 organismos lignolíticos
encontrados. Se observó que el hongo CH 003 (guion) presenta un comportamiento
significativamente superior (α=0,05) respecto a los demás organismos estudiados. Cada
punto corresponde a la media de tres réplicas biológicas.
5.2 Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno en e l medio de cultivo usando el método de un factor a la vez
Antes de iniciar el estudio del efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno para
mejorar la producción de la enzima, se evaluó el uso de salvado de trigo-agar, en medios
de cultivo sólidos, como paso previo al inóculo y para conservación y almacenamiento del
hongo. Al realizar este cambio se observó, para el Xylaria sp. seleccionado, una mayor
producción de lacasas al día ocho de crecimiento (1929±44 U/L), lo cual es superior a lo
alcanzado al día seis (1021±114 U/L) en experimentos anteriores (ítem 5.1). (Figura 5-2).
30
Se observó también que la cepa seleccionada perdía actividad gradualmente con los
continuos subcultivos en PDA. Con el fin de contrarrestar este efecto indeseable en la
conservación de la actividad de la cepa en el tiempo, se decidió evaluar el efecto de
utilizar cultivos sólidos de salvado de trigo-agar, como paso previo al inóculo y para
conservación y almacenamiento del hongo. Esta selección obedeció al buen
comportamiento de la actividad detectado en los medios líquidos que contenían salvado
de trigo.
Figura 5-2: Curva de actividad lacasa inicial en Xylaria sp tras 16 días de incubación. Se
destaca el máximo de actividad lacasa hacia el octavo día de crecimiento. Cada punto
corresponde a la media de tres réplicas biológicas.
Los resultados de la evaluación de las diferentes fuentes de carbono y nitrógeno
estudiadas, se presentan en las figuras 5-3 y 5-4, respectivamente. Entre las fuentes de
carbono, el salvado de trigo presentó una actividad enzimática significativamente superior
(α=0,05) sobre las demás fuentes de carbono, por lo que fue seleccionada para
posteriores cultivos. En el caso de la fuente de nitrógeno se observó un patrón similar de
actividad enzimática para tres de los cuatro compuestos utilizados, a saber peptona,
extracto de levadura y KNO3 los cuales presentaron una actividad enzimática
significativamente superior al (NH4)2SO4. La fuente de nitrógeno seleccionada fue KNO3
31
teniendo en cuenta que este reactivo es más económico que la peptona y el extracto de
levadura.
Figura 5-3: Efecto de las diferentes fuentes de carbono sobre la actividad lacasa de
Xylaria sp. Se observa como el salvado de trigo (círculo) arroja un valor de actividad
significativamente superior (1929±44 U/L) sobre las demás fuentes de carbono (α=0,05).
Cada punto corresponde a la media de tres réplicas biológicas.
Figura 5-4: Efecto de las diferentes fuentes de nitrógeno en la actividad lacasa de Xylaria
sp. Las fuentes KNO3 (cuadrado), peptona (triángulo) y extracto de levadura (círculo)
arrojaron valores de actividad significativamente superiores (α=0,05) al obtenido con
(NH4)2SO4 (rombo) en el máximo día de actividad (día ocho). Cada punto corresponde a
la media de tres réplicas biológicas.
32
5.3 Optimización de la composición del medio utiliz ando el método de matriz ortogonal de Taguchi
Luego de la selección de la mejor fuente de carbono y nitrógeno para la producción de la
lacasa, se realizó un diseño ortogonal con un arreglo L9 (34) para evaluar la importancia
de cuatro componentes del medio de cultivo, a saber, salvado de trigo, KNO3, CuSO4, y
KH2PO4 evaluados en tres concentraciones diferentes. En la tabla 5-1 se observan las
concentraciones y los resultados obtenidos para cada arreglo experimental.
Tabla 5-1: Resultados del arreglo ortogonal L9(34) para la producción de lacasa del
hongo Xylaria sp.
Experimento Salvado de trigo KNO3 CuSO4 KH2PO4 Actividad lacasa (U/L) 1 1 1 1 1 1013,6±39 2 1 2 2 2 1201,3±149 3 1 3 3 3 3030,1±120 4 2 1 2 3 14218,1±1512 5 2 2 3 1 11369,7±764 6 2 3 1 2 9665,6±1008 7 3 1 3 2 11250,0±1457 8 3 2 1 3 9125,51±561 9 3 3 2 1 9809,67±726
Nivel Salvado de trigo (g/L)
KNO3
(g/L) CuSO4.5H2O
(g/L) KH2PO4 (g/L)
1 40 1,4 0,002 0,5 2 50 2,5 0,004 1,0 3 60 5 0,006 2,0
El resultado de los análisis para determinar cuáles de los componentes ensayados tenía
mayor efecto en la producción de lacasa indican que en su orden fueron: salvado de trigo
> CuSO4 > KNO3 > KH2PO4 (tabla 5-2). Además, de acuerdo al valor de rango obtenido
(9968,3 U/L), se puede inferir que el salvado de trigo tuvo un impacto más pronunciado
sobre la actividad enzimática que los demás componentes evaluados. Por esta razón,
establecer una óptima concentración de esta fuente de carbono constituye un factor
crítico en la formulación del medio de cultivo para la producción enzimática.
33
Tabla 5-2: Análisis de los resultados obtenidos mediante el arreglo ortogonal de Taguchi.
Factores
Nivel 1
(U/L)
Nivel 2
(U/L)
Nivel 3
(U/L)
Rango
(U/L)
Salvado de
trigo
1748.0 11716.3 10061.2 9968.3
KNO3 8792.4 7231.8 7501.3 1560.6
CuSO4.5H2O 6601.1 8375 8549.4 1948.3
KH2PO4 7397.3 7371.8 8756.4 1359.1
Los resultados del análisis estadístico realizado sobre los datos del arreglo ortogonal
para los cuatro componentes evaluados evidenciaron que uno de los tres niveles de
concentración ensayada resultó más efectivo en potenciar la producción de lacasa. Así
las concentraciones óptimas identificadas en este trabajo para la producción de lacasas
fueron: salvado de trigo 50 g/L, CuSO4.5H2O 0,006 g/L, KNO3 1.4 g/L, y KH2PO4 2.0 g/L
(figura 5-5). Adicionalmente, se realizó una predicción de la actividad enzimática
mediante el programa Qualitek-4 usando estas concentraciones y se encontró un valor
teórico de 14289±968 U/L a un nivel de confianza del 95%, valor que es cercano a la
máxima actividad encontrada de manera experimental usando el medio con la
concentración optimizada de los componentes (13384±680 U/L) (figura 5-6).
34
Figura 5-5: Efecto sobre la producción de lacasa de los diferentes factores evaluados en
el diseño ortogonal. Se observó que los niveles óptimos para cada factor evaluado
fueron: salvado de trigo, nivel 2; KNO3, nivel 1; CuSO4, nivel 3; y KH2PO4, nivel 3.
Figura 5-6: Actividad enzimática con medio optimizado. El valor de máxima actividad en
el octavo día de crecimiento fue de 13384 ±680 U/L. Este valor representa casi 7 veces el
valor de actividad inicial (figura 5-2). Cada punto corresponde a la media de tres réplicas
biológicas.
35
5.4 Múltiples interacciones
La interacción entre los diferentes factores evaluados se presenta en la tabla 5-3 en
donde se indican los pares de componentes con su respectivo índice de severidad (IS).
La columna de niveles indica el nivel óptimo de cada componente para una interacción
favorable a la producción enzimática. El mayor IS observado fue de 80.00% entre los
componentes KNO3 y CuSO4 seguido de KNO3 y KH2PO4 con un IS de 77.26%, y de
CuSO4 y KH2PO4 con un IS de 71.20%.
Tabla 5-3: Índice de severidad de interacción entre los diferentes factores evaluados
N°
Interacción
Factores IS (%) Niveles
1 KNO3 x CuSO4 80.00 [1,2]
2 KNO3 x KH2PO4 77.26 [1,3]
3 CuSO4 x
KH2PO4
71.20 [2,3]
4 Salvado de trigo
x KNO3
11.49 [2,1]
5 Salvado de trigo
x CuSO4
10.68 [2,2]
6 Salvado de trigo
x KH2PO4
1.32 [2,3]
36
5.5 Empleo de inductores
Con la aplicación del método de un factor a la vez para las fuentes de carbono y
nitrógeno y el diseño ortogonal de Taguchi se logró mejorar la actividad enzimática
lacasa del hongo Xylaria sp. de 1929±44 U/L en el medio de cultivo inicial a 13384±680
U/L. Esta actividad se intentó mejorar aún más, evaluando cuatro inductores aromáticos:
2,5-xilidina, guayacol, ácido gálico y ácido ferúlico (figura 5-7). Se destacó el
comportamiento presentado con la adición de la 2,5-xilidina, en donde para el día seis se
manifiesta una actividad 20535±1405 U/L, lo que representa un aumento de la misma de
más de 10 veces respecto al cultivo inicial. Los otros inductores no presentaron
resultados favorables al mejoramiento de la actividad enzimática, manteniendo una
actividad similar a la presente en el cultivo control, o incluso disminuyéndola, como en el
caso del ácido gálico. Debido al comportamiento observado se decidió seleccionar la
2,5- xilidina como inductor para los cultivos empleados en la purificación enzimática.
Figura 5-7: Efecto de diferentes inductores evaluados para la producción de lacasa. Se
observó que la 2,5 xilidina genera un aumento significativo (α=0,05) de la actividad
enzimática respecto al cultivo control para los días 5,6 y 7. Los demás compuestos
mantuvieron la actividad en el mismo rango del control o la disminuyeron.
37
5.6 Purificación enzimática
A partir de los cultivos potenciados para la producción de la enzima lacasa, se procedió a
la purificación enzimática partiendo de un cultivo en el día de mayor actividad, es decir al
día seis. Se desarrollaron tres etapas de purificación a partir de este cultivo, que fueron,
en primer lugar, la diafiltración a través de un casete de Pellicon XL con una membrana
con corte de peso molecular de 30 KDa (MIllipore), en segundo lugar, la aplicación del
extracto concentrado a una columna de intercambio aniónico DEAE de sefarosa de flujo
rápido, y finalmente, la aplicación de las fracciones positivas reunidas y concentradas del
paso anterior a una columna de exclusión por tamaño (SEC) Sephadex G-100.
En la figura 5-8 se observa el cromatograma obtenido en la cromatografía de intercambio
aniónico DEAE para el extracto proteico concentrado a través del casete de Pellicon. Se
observaron cuatro picos diferenciados de proteínas, de los cuales inicialmente se
reunieron las fracciones correspondientes a cada pico y se analizaron, observando que la
actividad se mantenía en el pico II, pero el valor de actividad específica disminuía en
relación al extracto crudo. Por esta razón, se decidió cambiar la estrategia de análisis, así
en lugar de reunir los picos y analizarlos, se evaluó cada una de las fracciones
colectadas.
Esta estrategia de análisis por fracción resultó más efectiva, puesto que se identificó que
la actividad enzimática no se concentraba con el pico II de proteína sino que se hallaba
en las fracciones terminales del mismo pico, de forma que una cantidad importante de
proteínas del pico II no resultaba ser de interés (Figura 5-9). Las fracciones que
resultaron positivas para actividad lacasa se señalan por la doble flecha morada, y
corresponden a las fracciones entre los tiempos 23 y 32 minutos. Estas fracciones fueron
reunidas en una sola muestra, la cual se dializó contra tampón acetato de sodio 10mM
pH 5,0 y se concentró a través de un tubo de Amicon ® 15 de 10 KDa, con el fin de poder
valorar la actividad específica, y proceder con el siguiente paso de purificación.
38
Figura 5-8: Cromatograma obtenido para la cromatografía DEAE realizada al extracto
proteico concentrado a través del casete de Pellicon. (Pico I ) proteínas no retenidas a la
columna, eluidas con el tampón de inicio; (Picos II, III y IV ) proteínas retenidas por la
columna y eluidas mediante el incremento gradual de la fuerza iónica con un gradiente
por pasos de NaCl de 0-1M. En amarillo, el círculo resalta la zona en donde se encontró
actividad lacasa y que se presenta ampliada en la figura 5-9.
39
Figura 5-9: Análisis de actividad de las fracciones recolectadas en la zona del pico II de
la cromatografía DEAE. Cada minuto corresponde a una fracción. Entre las fracciones
correspondientes a los tiempos 23 y 32 minutos se observó actividad evidente por la
oxidación del sustrato ABTS. Estas fracciones se reunieron en una sola para el análisis
de actividad específica y el paso siguiente de purificación por cromatografía de exclusión.
40
Luego de la etapa de purificación con cromatografía DEAE, la muestra resultante se
aplicó a una columna con resina Sephadex G-100. En el cromatograma obtenido se
observa la aparición de un solo pico de proteínas comprendido entre las fracciones 6 y 14
(Figura 5-10). El análisis de actividad lacasa mostró que la enzima se encontraba
localizada en la parte descendente del pico principal de proteínas. Las fracciones
comprendidas entre el tubo 8 y el 12, que corresponden al máximo de actividad y la parte
descendente del pico de proteínas, fueron analizadas individualmente en cuanto al
parámetro de actividad específica, encontrando los resultados visualizados en la tabla 5-
4. Se observó que la fracción 10 obtuvo el mejor valor de actividad específica (388,4
U/mg), el cual fue utilizado como representativo de esta etapa de purificación.
Figura 5-10: Cromatograma obtenido para la cromatografía de exclusión por tamaño
realizada a la muestra resultante de la cromatografía DEAE. Se observa la aparición de
un solo pico ancho. Las fracciones resultantes con actividad lacasa positiva se evaluaron
para determinar la actividad específica, a saber, las fracciones 8-12.
41
Tabla 5-4: Análisis de actividad específica para las fracciones 8-12 provenientes de la
cromatografía de exclusión por tamaño con la resina Sephadex G-100. Se observa que la
fracción 10 presenta la mayor actividad específica. Valor que representa una ganancia en
la actividad respecto al anterior paso de purificación (ver tabla 5-5).
Fracción Actividad específica (U/mg)
8 177,0
9 243,8
10 388,4
11 326,9
12 304,7
El análisis de la actividad enzimática durante cada uno de los pasos de purificación se
muestra en la tabla 5-5. Luego de la última etapa del proceso fue posible alcanzar un
factor de purificación de 7,4 con un rendimiento del 0,51%. La homogeneidad de cada
paso de purificación se analizó por medio de electroforesis SDS-PAGE y se ilustra en la
figura 5-11. En la figura 5-11 A, se observa como el paso de diafiltración conduce a
reducir la cantidad de proteínas de tamaño menor a 21,5 KDa. Si bien se esperaría que
se redujera de forma evidente desde 30 KDa, que es el valor de corte de peso molecular
del casete de Pellicon, se entiende que las proteínas con peso molecular muy cercano al
valor de corte no pasan tan libremente a través de la membrana, de forma que parte de
ellas queda en el retentato. En la figura 5-11 B, se observa que luego del paso por la
cromatografía de intercambio aniónico DEAE se libera el extracto de una gran cantidad
de proteínas, dejando bandas evidentes entre 36,5 y 97,4 KDa, así como algunas bandas
tenues a 21,5 y 14,4 KDa. En la figura 5-11 C se observan dos bandas, una gruesa de 78
y otra muy delgada de 68 KDa correspondientes al producto de purificación luego de la
cromatografía de exclusión.
42
Con el fin de establecer si el doblete de bandas correspondía a 2 proteínas diferentes o a
subunidades de una sola proteína, se realizó una escisión de las bandas y una
secuenciación por espectrometría de masas. El análisis de los péptidos producto de la
digestión tríptica mostró evidencia en ambas bandas de péptidos característicos de
lacasas (tabla 5-6), los cuales han sido descritos en Xylaria polymorpha (Anexo H) (Liers
et al., 2007). La figura 5-12 muestra uno de los espectros de los péptidos teóricos
asignados a los resultados experimentales, resaltando las coincidencias de las señales
m/z encontradas con la escritura de los picos correspondientes a iones tipo y y b en la
parte de superior de cada señal coincidente. La asignación se hace sobre las señales
más intensas, lo que resulta más confiable para la asignación de los picos. En el anexo
G se muestran los espectros de los péptidos coincidentes con la lista de sus respectivos
de picos de masas.
Tabla 5-5: Evaluación de las etapas de purificación de la lacasa extracelular de Xylaria
sp.
Muestra Volumen
(ml)
Actividad
total (U)
Actividad
específica
(U/mg)
% Rendim iento Factor de
purificación
Extracto
crudo
165 2871,8 52,1 100 1
Diafiltración 15,3 1471,2 123,9 51,2 2,4
DEAE 1,3 99,3 340,2 3,46 6,5
SEC 0,9 14,6 388,4 0,51 7,4
43
Figura 5-11: Electroforesis SDS-PAGE para los pasos de purificación enzimática
realizados: A) 1: Marcador de peso; 2: Extracto crudo; 3: Diafiltrado B) 1: Marcador de
peso; 2: Cromatografía DEAE C) 1: Marcador de peso; 2: Cromatografía SEC. Se
observa que los pasos de purificación conducen a la obtención de 2 bandas cercanas de
peso 78 y 68 KDa.
Tabla 5-6: Péptidos obtenidos por espectrometría de masas para las bandas observadas
en el gel de electroforesis con la muestra proveniente de cromatografía de exclusión
(figura 5-11 C). El análisis muestra la presencia de péptidos característicos de lacasas
en las dos bandas de 78 y 68 KDa.
Tamaño
Banda
Péptido % de cobertura
78KDa GPASAPYDEDK
14,4 LVNTAIDTMFK
68KDa LVNTAIDTMFK 7,2
44
Figura 5-12: Espectro de masas que muestra la coincidencia con el péptido asignado.
Se identifica la secuencia LVNTAIDTMFK. Es claro que la asignación se realiza con
picos intensos del espectro lo que da una mayor confianza en el análisis.
Adicionalmente se corrió un gel nativo (PAGE) de zimografía que se tiñó con el sustrato
guayacol y con tinción por Coomassie (figura 5-13 A y B). Los resultados mostraron la
presencia de una sola banda de actividad que se corresponde con una sola banda de
proteína en el gel, de acuerdo a la tinción por Coomassie. Estos resultados sugirieron
que en la metodología SDS-PAGE se observaron dos bandas debido a las condiciones
reductoras que separarían dos subunidades proteicas que aparecen como dos bandas
en el gel de electroforesis. Por tanto en ausencia de dichas condiciones reductoras y
desnaturalizantes la proteína conservaría su integridad y se revelaría como una sola
banda en el gel en condiciones nativas. Sin embargo esta hipótesis fue descartada al
considerar el resultado obtenido en geles de dos dimensiones, los cuales tenían la
intención de determinar el pI de la enzima purificada (Figura 5-14). En este gel se
observó la aparición de spots a una altura de ~38 KDa y un pI entre 4,8 y 5,0, lo que
contrasta con lo obtenido en los geles SDS-PAGE (Figura 5-11), donde la altura de las
banda de proteínas se situaba hacia ~70 KDa. El análisis de los resultados y los
protocolos de trabajo empleados, permitieron determinar que el efecto se debió al
calentamiento necesario (92°C por 5 minutos) en la metodología SDS-PAGE previo al
45
montaje de las muestras en el gel, sugiriendo que el calentamiento es responsable de
generar agregados de alto peso molecular, que no se ven en los geles 2D.
Figura 5-13: Gel en condiciones nativas con la muestra procedente de la etapa de
purificación con cromatografía de exclusión. La tinción inespecífica del gel con azul de
Coomassie muestra la presencia de una sola banda de proteína coincidente con aquella
que presenta actividad. A) Tinción inespecífica con azul de Coomassie R-250; 1: Extracto
diafiltrado; 2: proteína purificada B) Gel teñido con guayacol para la identificación de la
enzima lacasa; 1: proteína purificada.
Figura 5-14: Gel de dos dimensiones de la muestra purificada luego de su paso por
cromatografía de exclusión. Se observan spots a una altura de ~38 KDa y un pI entre 4,8
y 5,0.
46
5.7 Caracterización cinética de la enzima
Con la proteína purificada se procedió a realizar las pruebas de caracterización
enzimática, las cuales incluyeron la determinación del pH y temperatura óptima de
reacción, la estabilidad al pH y la temperatura, el efecto de inhibidores metálicos y
quelantes, y la determinación de constantes cinéticas como la constante de Michaelis
(Km) y la velocidad máxima (Vmax). Todas las pruebas de caracterización se realizaron
con el sustrato ABTS.
Se evaluó la actividad de la enzima en el rango de pH de 3 a 9 (figura 5-15). Se encontró
que la enzima era activa en un rango estrecho de pH hacia el lado ácido, manteniendo su
actividad entre 3 y 6. En este rango los valores de pH 3 y 4 mostraron el mejor
comportamiento (100% y 95%) sin presentar diferencias significativas entre ellos
(α=0,05). Se observa que a valores de pH básicos la enzima pierde completamente su
actividad, por lo que no es recomendable su uso en estas condiciones. También se
valoró la estabilidad de la enzima a diferentes valores de pH (figura 5-15), a partir de lo
cual se pudo observar que la enzima presenta mayor estabilidad a valores de pH
cercanos a la neutralidad (6-8), de la figura se deduce que valores de pH ácido tienen un
efecto negativo en la estabilidad de la enzima, llegando a ser menos estable a pH 3, en
donde su actividad decrece a un 25%.
El efecto de la temperatura en la actividad enzimática se observa en la figura 5-16. La
actividad óptima de la enzima se determinó entre 50 y 60°C (100 y 95%), sin encontrarse
diferencia estadísticamente significativa entre los valores de actividad a estas
temperaturas (α=0,05). Al examinar la estabilidad térmica de la enzima, se encontró que
esta es más estable en temperaturas entre 4 y 30°C, con una mayor estabilidad a 30°C
(α=0,05). Luego de tres horas de incubación a 30°C se mantiene el 97% de la actividad
enzimática. A temperaturas superiores (40-70°C) se observa una disminución notable de
la actividad enzimática, puesto que una hora después de la incubación a 40°C la
actividad ha disminuido a un 54%, tres horas después se halla a un 41%. Una afectación
todavía mayor se observa a 50°C en donde una hora después del inicio de la incubación
la actividad ha disminuido a un 15% llegando a estar por debajo del 10% luego de las
tres horas. El efecto negativo continúa incrementándose a temperaturas más altas, con
60 y 70°C luego de la primera hora de incubación la actividad decrece casi por completo
47
ubicándose a un 7 y 4% respectivamente, luego de las tres horas de incubación, menos
del 2% de actividad se registra en ambos casos. Por lo tanto si bien la temperatura
óptima de reacción se ubicaba entre 50 y 60°C, estas condiciones no resultan aptas en
términos de la estabilidad de la enzima.
Figura 5-15: Efecto del pH en la actividad y estabilidad de la lacasa. Se observa que a
los valores de pH de 3 y 4 se obtiene el máximo de actividad óptima (100 y 95%)
(cuadrado) no encontrándose diferencias significativas a un nivel de confianza de α=0,05.
A valores de pH cercanos a la neutralidad y básicos se aprecia un fuerte descenso de la
actividad enzimática. En cuanto a la estabilidad al pH de la enzima lacasa (rombo). Se
observa una mayor estabilidad a valores de pH cercanos a la neutralidad. Cada valor
constituye la media de tres réplicas experimentales.
48
Figura 5-16. Efecto de la temperatura en la actividad lacasa. Se observa que a las
temperaturas de 50 y 60°C se obtiene el máximo de actividad (100 y 95%) no
encontrándose diferencias significativas a un nivel de confianza de α=0,05. Cada valor
constituye la media de tres réplicas experimentales.
Figura 5-17: Estabilidad térmica de la enzima lacasa. La mayor estabilidad es
encontrada a las temperaturas 4 (rombo), 22 (cuadrado) y 30°C (triángulo), siendo mayor
a 30°C (α=0,05). A temperaturas superiores a 30°C (40-70°C) se observa un rápido
decrecimiento de la actividad. Cada valor constituye la media de tres réplicas
experimentales.
49
Los efectos de algunos iones metálicos e inhibidores quelantes se muestran en las tablas
5-7 y 5-8. Se observa una reducción notable de la actividad enzimática con la presencia
de Fe2+ (10mM), llegando a obtener solo 5,4% de la actividad respecto al control. El Cd2+
y el Mn2+ muestran también efectos inhibitorios sobre la enzima, aunque menores,
llegando a un 90,6 % en el caso del Cd2+ y un 81,8% con el Mn2+. La presencia de los
demás iones no mostró una alteración negativa significativa de la actividad enzimática.
La adición de Cu2+ al sistema de reacción indujo levemente la actividad enzimática dando
un valor de 101,1%.
La enzima purificada no mostró una fuerte inhibición en presencia de EDTA (1 y 10mM),
conservando el 99,3% de la actividad a una concentración de 1mM y 78,8% a una
concentración de 10mM. Los demás inductores evaluados mostraron una fuerte
inhibición de la enzima, siendo casi completa la inhibición con azida (10mM) y KCN
(5mM), en donde la actividad se redujo a menos del 1%.
Tabla 5-7: Efecto de iones metálicos en la actividad de la lacasa purificada. Se destacan
el efecto inhibidor del Fe2+ e inductor del Cu2+.
Inhibidor metálico
% Actividad residual
Control 100,0
Ca2+ 98,4
Mg2+ 99,2
Mn2+ 81,8
Zn2+ 98,2
Ni2+ 95,5
Cu2+ 101,1
Cd2+ 90,6
Fe2+ 5,4
50
Tabla 5-8: Efecto de algunos inhibidores quelantes en la actividad de la lacasa
purificada. Se destaca la alta inhibición de la azida, el DTT y el KCN, en tanto con EDTA
se observa que la enzima conserva gran parte de su actividad característica sin
presencia de inhibidores.
Inhibidor Concentración final (mM) % Actividad r esidual Control -- 100,0
EDTA
1 99,3 10 78,8
Azida
1 6,7 10 0,9
DTT 0,1 3,5
KCN 5 0,7 El valor de los parámetros cinéticos Km y Vmax se obtuvo a partir del estudio de actividad
realizado evaluando el efecto de diferentes concentraciones del sustrato ABTS sobre la
velocidad de reacción (Figura 5-18 A y B). A partir del diagrama de Lineweaver-Burk se
logró determinar una Km de 297µM y una Vmax de 581,4 µM.min-1.
Figura 5-18: A) Efecto de la concentración ABTS sobre la actividad de la lacasa. B)
Diagrama de Lineweaver-Burk para el ABTS.
A
51
B
5.8 Efecto en el secretoma de Xylaria sp. al ser sometido a condiciones de inducción y baja expresión de lacasa.
Para estudiar el efecto del uso del medio de cultivo optimizado e inducido sobre la
producción de proteínas en el sobrenadante del hongo Xylaria sp. se realizaron geles
bidimensionales con muestras de dos condiciones de cultivo diferentes. En una de ellas
con el cultivo optimizado con salvado de trigo, 2,5-xilidina y los demás componentes
descritos (Ítem 4-1 y 5-3) y otro con un medio de cultivo de baja expresión de lacasa
como el evidenciado con fructosa, en el estudio de las diferentes fuentes de carbono
(Ítem 5-2).
Al comparar los secretomas obtenidos (Figura 5-19 A y B), se observa un menor número
de “spots” en el secretoma obtenido bajo condiciones de baja expresión de lacasa,
resulta evidente que la presencia de salvado de trigo, 2,5-xilidina y los demás
componentes optimizados en este medio con respecto al de fructosa, provocan la
expresión de un gran número de proteínas adicionales a la lacasa de interés. En los
círculos verdes se resaltan las correspondencias entre las proteínas encontradas en
ambos secretomas. En el círculo rojo se destaca el spot correspondiente a la lacasa, el
y = 0,5107x + 1,7199R² = 0,9923
0
1
2
3
4
5
6
7
8
-5 0 5 10 15
1/V
1/[S]
52
cual fue identificado al comparar estas imágenes con el gel obtenido con la muestra
purificada (Figura 5-14). En total 7 spots entre los más de 20 encontrados en ambos
casos, resultaron coincidentes.
Figura 5-19. Secretomas obtenidos del sobrenadante de cultivo del hongo Xylaria sp. A)
bajo condiciones de baja expresión de lacasa (medio con fructosa) y B) bajo condiciones
de alta expresión de lacasa (medio optimizado). Los spots de proteínas fueron
visualizados con tinción por Coomassie coloidal. Se aprecia la diferencia de secretomas
obtenidos con las dos condiciones, con la coincidencia de 7 spots en ambos casos,
incluyendo la lacasa purificada (círculo rojo para lacasa, círculos verdes para demás
proteínas coincidentes).
53
6. Discusión de resultados
La selección del hongo de interés se realizó usando salvado de trigo como fuente de
carbono considerando los altos valores de expresión observados para diversos hongos
en este sustrato (Bakkiyaraj et al., 2013; Elshafei et al., 2012; Neifar et al., 2011). Este
sustrato además es una fuente abundante de ácidos hidroxicinámicos, particularmente
ácido p-cumárico y ferúlico, los cuales son conocidos por estimular la producción de
lacasas (Neifar et al., 2009). Efecto que es mayor cuando se utiliza también como medio
de crecimiento sólido, previo a la inoculación líquida, es decir, cuando se reemplaza el
medio de PDA por el medio salvado de trigo-agar.
Es importante mencionar que no todos los hongos presentan la mejor expresión de
lacasa con esta fuente de carbono comparada con otras fuentes (Elsayed et al., 2012;
Kenkebashvili et al., 2012; Chawachart et al., 2004), sin embargo es de resaltar el buen
comportamiento exhibido en este medio con diferentes organismos, razón que motivo su
elección. Una de las ventajas asociadas al uso de salvado de trigo es el bajo costo de
este material, en relación al costo de sustratos definidos como glucosa, fructosa, almidón
y otras fuentes de carbono. Al considerar el número de muestras que se trabajaron, tanto
en la selección inicial como en la optimización posterior, el uso de esta fuente de carbono
resulta rentable económicamente, un aspecto esencial en estudios de bioprospección y
escalamiento de la producción enzimática
Los siete morfotipos evaluados CH20, CH008b, CH32, CH10b, UP001, UP006 y CH003,
fueron considerados potenciales para la producción de lacasa luego del tamizaje
funcional en medios de PDA-guayacol (Crespo-Linares y Torres-Rojas, 2013). El tamizaje
realizado permite identificar enzimas lignolíticas en el organismo capaces de oxidar el
guayacol, propiedad compartida por oxidasas y peroxidasas (Erden et al., 2009; Wong
2009). Debido a esto, es posible encontrar dentro de los hongos evaluados para la
actividad lacasa cuantitativa en medio líquido, organismos con baja producción de la
enzima de interés. Tal es el caso de los hongos CH32, CH008b y CH20 cuya actividad
enzimática máxima fue de 2 U/L (día 10), 29 U/L (día 8) y 40 U/L (día 4),
respectivamente; valores muy lejanos al alcanzado por el Xylaria sp. CH003 (1021 U/L en
el día 8). Una de las variables que puede influir notablemente en la mayor o menor
54
expresión de la enzima y condicionar la actividad obtenida para cada aislamiento es la
composición del medio de cultivo (Iqbal et al., 2011; Stajic et al., 2006; Mansur et al.,
1997), lo que puede ser una explicación al bajo valor de actividad obtenido con los
morfotipos mencionados.
De acuerdo a lo reportado por Fu et al., (2013) estudios con Psathyrella candolleana
sembrado en salvado de trigo, mostraron una elevado valor de actividad de 12000U/L,
muy lejos de lo obtenido con los hongos CH008b y CH010b pertenecientes al mismo
género Psathyrella sp. Al respecto de este comportamiento, así como del observado
entre los diferentes aislamientos de Xylaria sp. evaluados en este trabajo (CH003, CH20
y CH32) es importante resaltar la respuesta diferencial para la producción de lacasas que
se puede dar incluso entre cepas de la misma especie (Stajic et al., 2006). Esto implica
la posibilidad de caer en el uso inadecuado de un sustrato para la cepa que en particular
ha sido aislada, elevando la complejidad de la selección. En este estudio, bajo las
condiciones de crecimiento trabajadas, Xylaria sp. (CH003) fue seleccionado como el
hongo con mayor actividad lacasa, mostrando una evidente superioridad sobre los otros
seis aislamientos evaluados (Figura 5-1).
Luego de la selección del organismo con mayor producción de lacasa y el cambio del
medio de cultivo sólido, se procedió a la optimización del medio de cultivo líquido. Con
este fin se utilizó el método de un Factor-a-la-vez que involucró el cambio de un
componente mientras el resto permanecían constantes a un valor fijo de concentración.
Para ello se empezó con la selección de la fuente de carbono y nitrógeno, pues estas son
cruciales en la formulación del medio de cultivo con el fin de mejorar la producción de la
enzima (Elisashvili y Kachlishvili, 2009; Elisashvili et al., 2001). El estudio de las
diferentes fuentes de carbono incluyó varios residuos lignocelulósicos que han sido
reportados para la producción de lacasas en forma económica, pues más del 60 % de
los costos de producción de la enzima están relacionados con el medio de cultivo
(Osma et al., 2011). Además la utilización de residuos lignocelulósicos supone un valor
productivo a residuos que usualmente son desechados en sitios de depósito
constituyendo una fuente de contaminación ambiental (Chang 2014; Moya y Torres,
2012; Castaño et al., 2014).
55
Las curvas de actividad obtenidas para las diferentes fuentes de carbono (figura 5-3)
muestran que el empleo de cáscaras de mandarina en el medio como fuente de carbono
no generó una buena actividad por parte del hongo, contrario a lo reportado por Osma et
al. (2007) en T. pubescens, y Stajic et al. (2006) en P. ostreatus. Este sustrato reportó la
actividad más baja siendo su máximo de solo 0.072 ±0.029 U/L en el sexto día.
Igualmente la utilización de fructosa como fuente de carbono no indujo altos valores de
actividad como se ha reportado por Mansur et al. (1997) en hongos basidiomicetos. La
fructosa produjo una actividad lacasa máxima de 0.58 ±0.21 U/L hacia el día 14 de
crecimiento, siendo la segunda más baja de las fuentes de carbono evaluadas. El medio
con almidón que ha dado buenos resultados para hongos del género Ganoderma al igual
que en P. ostreatus (Elsayed et al., 2012; Revankar y Lele, 2006) no produjo una buena
actividad en la cepa evaluada. El valor de actividad más alto observado con almidón fue
de 1.50 ±0.50 U/L en el sexto día de crecimiento.
El empleo de raquis de palma de aceite no había sido evaluado en fermentación
sumergida sin el suplemento de una fuente de carbono adicional. Teniendo en cuenta la
alta cantidad de residuos lignocelulósicos generados por la agroindustria de la palma de
aceite, entre 0.20 y 0.25 toneladas de raquis por cada tonelada de frutos procesados
(Saletes et al., 2004; Moya y Torres, 2012), la evaluación de este sustrato constituyó un
intento por dar un valor productivo a este residuo. Es de resaltar que dentro de las
fuentes de carbono evaluadas, el raquis constituyó la segunda mejor fuente, resultando
en un máximo de actividad de 90.5±15 U/L para el raquis de tamaño de 1 mm y de
72.2±16 U/L para el raquis de tamaño de 10 mm, ambos en el sexto día de crecimiento.
Estos resultados sugieren que el tamaño de partícula del sustrato influye en la
producción enzimática, un tamaño de partícula más pequeño puede facilitar el
crecimiento del hongo debido a una mayor área superficial expuesta por el sustrato, esto
significa que hay mayor sustrato lignocelulósico disponible, induciendo la expresión de
enzimas lignolíticas como la lacasa.
El salvado de trigo ha arrojado altos valores de actividad para diferentes cepas de
hongos como Fomes fomentarius, P. ostreatus y Pseudotremella gibosa (Elisashvili et al.,
2009) siendo uno de los sustratos con mejores reportes para la producción de actividad
lacasa. Para este estudio, de todas las fuentes de carbono estudiadas la mayor actividad
56
enzimática se presentó con este sustrato obteniéndose valores considerablemente
superiores al resto de fuentes de carbono utilizadas, siendo este valor de 1929±44 U/L en
el octavo día de crecimiento. El valor de actividad encontrado fue más de 20 veces
superior a lo obtenido con tusa de 1 mm, demostrando una alta favorabilidad de este
sustrato para la producción de la enzima en Xylaria sp.
Se evaluó también el efecto de diferentes fuentes de nitrógeno de tipo orgánico e
inorgánico, manteniendo constantes los demás componentes del medio y utilizando como
fuente de carbono salvado de trigo a una concentración de 50 g/L. Todas las fuentes de
nitrógeno se evaluaron a una concentración de 1,4 g/L. Los valores de actividad
obtenidos se muestran en la figura 5-4. Se observó que en todos los casos la producción
de lacasa comenzó hacia el cuarto día de crecimiento y aumentó significativamente para
el sexto día alcanzando un máximo de actividad en el día ocho. Se obtuvieron los valores
más bajos de actividad (1929±44 U/L) utilizando como fuente de nitrógeno (NH4)2SO4. No
se obtuvo diferencias significativas entre las medias (α=0,05) de los cultivos con extracto
de levadura, peptona y KNO3 en el día de mayor actividad, en donde se registraron
valores de actividad de 8263±687, 8750±436 y 9305±363 U/L, respectivamente. En este
caso se seleccionó como fuente de nitrógeno KNO3 puesto que fue la fuente más
económica. Estos resultados están en desacuerdo con otros reportes en los cuales se ha
observado un mejor comportamiento con fuentes orgánicas de nitrógeno respecto a las
inorgánicas (Revankar y Lele, 2006; Hess et al., 2002).
La interacción entre pares de variables puede estudiarse mediante el índice de severidad
de interacción (IS) entre los diferentes factores bajo estudio (Motallebi et al., 2008), esto
permite conocer la influencia de 2 factores a varios niveles de interacción. El par de
factores cuya combinación tiene mayor impacto muestran un mayor IS de interacción
(100%) por interactuar el uno con el otro en un ángulo de 90°, mientras que los de menor
IS (0%) implican una relación paralela lo que representa una nula interacción entre los
factores seleccionados. Al evaluar el índice de severidad entre pares de componentes del
medio, es interesante notar que los factores con menor impacto individual presentaron
una mayor interacción entre sí (KNO3, CuSO4 y KH2PO4), indicando que la influencia de
cada uno de estos factores depende de la condición de los otros factores. Por el contrario
el IS de interacción entre el factor de mayor impacto (salvado de trigo) y los demás
factores es bajo, lo que implicó que su influencia fue más independiente de las
57
condiciones de los demás factores. Se pudo observar con este análisis que si bien la
producción de la enzima es bastante dependiente de la influencia individual de un factor
de mayor impacto, hubo relaciones entre los componentes del medio que afectaron
también la producción enzimática y no se pueden considerar como factores aislados que
influyen individualmente en el organismo y su metabolismo.
En cuanto al empleo de inductores, hay que resaltar que en la gran mayoría de los
hongos productores de lacasas, estas enzimas son producidas constitutivamente en
bajas cantidades (Galhaup et al., 2002b), sin embargo el empleo de diversos compuestos
aromáticos ha permitido inducir la actividad enzimática (Xavier et al., 2001). Debido a lo
anterior se decidió evaluar el efecto de cuatro inductores aromáticos, adicionados al
cultivo en el cuarto día de crecimiento del hongo. Los inductores utilizados fueron 2,5
xilidina, guayacol, ácido gálico y ácido ferúlico a una concentración de 1mM. Se realizó
la adición en el cuarto día de crecimiento teniendo en cuenta reportes en los cuales se ha
establecido que estos compuestos deben ser agregados al medio de cultivo una vez el
hongo haya tenido un crecimiento con una formación significativa de biomasa (Revankar
y Lele, 2006), de tal forma que en el momento de la adición del inductor los hongos se
encuentren en un crecimiento activo y no se aprecie un efecto tóxico indeseable sobre la
cepa. El efecto de los inductores sobre la actividad lacasa del hongo Xylaria sp. (figura 5-
7) muestra que de los cuatro inductores utilizados solamente la 2,5 xilidina generó un
efecto positivo sobre la actividad respecto al control (sin inductor), dando un máximo de
la misma de 20535±1405 U/L en el sexto día de crecimiento. Los demás compuestos
utilizados mantuvieron una producción similar o la disminuyeron respecto al control,
sugiriendo una toxicidad en la cepa. Con el ácido gálico especialmente se observó una
disminución notable de la actividad enzimática sugiriendo una mayor toxicidad de parte
de este compuesto.
Con el empleo de 2,5 xilidina se logró un incremento de alrededor 1,5 veces en la
actividad lacasa, así como una reducción en el tiempo de incubación. Este compuesto ha
sido reportado habitualmente como el inductor con mejor comportamiento en diversos
organismos fúngicos (Revankar y Lele, 2006; Eggert et al., 1996). De esta manera toda
la estrategia de optimización para la producción de la lacasa en el hongo Xylaria sp. logró
incrementar la actividad de un valor inicial de 1929±44 U/L a 20535±1405 U/L, lo que
58
representó un aumento de más de 10 veces con relación al valor inicial. Así la utilización
de salvado de trigo a una concentración 50 g/L, KNO3 a 1,4 g/L y de 2,5 xilidina (1mM)
como inductor, hacen del hongo Xylaria sp. un buen productor de lacasa, cuya
producción es comparable con muchos hongos basidiomicetos, tradicionalmente usados
para la producción de lacasas. Es de resaltar que la producción enzimática, en
comparación con otros organismos que presentan alta actividad, se da en un tiempo más
corto, lo que representa una característica potencial del organismo estudiado, situándolo
como un candidato probable para la producción masiva de la enzima, sin embargo es
necesario realizar estudios de escalamiento y planta piloto.
Como primer paso en el inicio de la purificación enzimática se plantearon dos posibles
estrategias: la precipitación fraccionada con sulfato de amonio, ampliamente usada (Patel
et al., 2014; Si et al., 2013; Forootanfar et al., 2011; More et al., 2011; Mansur et al.,
2003; Palmieri et al., 1997) y la diafiltración (Liers et al., 2007; Jung et al., 2002; Chefetz
et al., 1998) Al llevar a cabo ambas estrategias se encontró que el factor de purificación
obtenido en ambos casos era de 2,4. No obstante la precipitación fraccionada incluye el
uso de diálisis extensiva y liofilización de volúmenes superiores a 50 mL, incrementando
el tiempo y costo de la purificación, puesto que para la liofilización de dichas cantidades
se requiere un tiempo aproximado de tres días. Esta razón motivó a escoger la
diafiltración como paso inicial de purificación, puesto que su ejecución se presenta en
tiempos muy cortos, y la muestra procedente de este paso puede acoplarse al análisis
por DEAE sin requerimientos adicionales. Además una vez se tiene el casete este puede
usarse repetidas veces, sin incrementar el costo de repeticiones del proceso.
La aplicación de la muestra concentrada por el casete de diafiltración a la columna de
intercambio aniónico DEAE permitió identificar que la proteína se eluía entre los picos
retenidos por la resina, adicionalmente la elución temprana de la enzima permitió
suponer que su carga era baja en las condiciones de trabajo, y por tanto se encontraba
cerca del pI de la enzima. El cual debía ser inferior a 5 de acuerdo al tampón acetato del
mismo pH usado en la elución. Es importante resaltar que el análisis inicial se centró en
analizar los picos separados por la columna, reuniendo las fracciones correspondientes a
cada pico, pero se encontró que era más adecuado el análisis individual de las
fracciones, debido a que el pico de absorbancia puede no coincidir con el pico de
actividad (Figura 5-9). En este sentido la diálisis y concentración de muchas fracciones
59
de elución puede resultar poco práctico, por lo que es altamente recomendable el uso de
membranas de Amicon® que permiten concentrar a la vez que dializar cada fracción,
facilitando el análisis de cada una. Esta estrategia permitió librarse de proteínas que no
son de interés presentes en altas cantidades y que se eluyen dentro del mismo pico con
la enzima.
El último paso de purificación fue la cromatografía de exclusión por tamaño. Luego de
realizar una valoración de la actividad volumétrica (U/L) se encontró un pico de actividad
lacasa que se presentaba con un pequeño corrimiento hacia la derecha con respecto al
pico único de proteínas observado por la determinación de la absorbancia a 280 nm. De
aquí se entiende que las proteínas contaminantes siguen estando en mayor proporción
que la lacasa en la muestra utilizada para esta cromatografía. Inicialmente todas las
fracciones positivas fueron reunidas, dializadas y concentradas para la valoración de la
actividad específica, sin embargo se encontró que al hacer esto se obtenía un valor de
actividad que hacía decrecer el factor de purificación logrado en el paso anterior,
obteniéndose una actividad específica inferior a la obtenida después de la cromatografía
DEAE (340 U/mg). Debido a esto se decidió analizar la actividad específica de cada
fracción positiva para lacasa, en busca de lograr un factor de purificación favorable, que
implicara la obtención de una muestra con mejores características a la obtenida en el
paso anterior de purificación. Los resultados (Tabla 5-4) permitieron concluir que esta
estrategia resultaba más adecuada, obteniendo una fracción con un valor de actividad de
388 U/mg.
A la fecha se han reportado diferentes trabajos sobre purificación de lacasas en hongos
basidiomicetos y ascomicetos. Es importante resaltar que el valor de actividad específica
obtenido para la lacasa de Xylaria sp. resulta superior al valor de diferentes enzimas
purificadas de estos organismos. Tal es el caso con ascomicetos como Paraconiothyrium
variabile (Forootanfar et al., 2011) con una actividad de 18,2 U/mg, y Trychophyton
rubrum (Jung et al., 2002) con una actividad de 300 U/mg, y basidiomicetos como
Coltricia perennis (Kalyani et al., 2012) con actividad de 177,5 U/mg, y Cerrena unicolor
(Kim et al., 2002) con actividad de 140 U/mg.
La lacasa purificada en este trabajo tuvo un pH óptimo de reacción entre 3 y 4, puesto
que a estos dos valores de pH no se presentaron diferencias significativas (α=0,05). Este
60
hallazgo es similar al encontrado para otras lacasas, en donde la zona de pH ácida es la
característica como pH óptimo de reacción al usar ABTS como sustrato (Yang et al.,
2013; More et al., 2011; García et al., 2007). Hacia valores de pH básico se observó un
fuerte descenso de la actividad enzimática, lo que puede estar relacionado con la
ionización de ciertos aminoácidos (ácido aspártico y glutámico), volviendo a la enzima
inactiva (Salony et al., 2006).
Se encontró que la enzima posee un pI de 4,9 y una mayor estabilidad al pH hacia
valores cercanos a la neutralidad, e incluso ligeramente básicos (pH 6-9). Lo que está en
acuerdo con lo observado para muchas lacasas, en donde se ha reportado que estas
enzimas son más estables a valores de pH algunas unidades por encima de su pI
(Rajeeva y Lele, 2010). Por ejemplo Liers et al. (2007) encontraron con X. polymorpha
una mayor estabilidad entre los valores de pH 7-10, teniendo la enzima un pI de 3,1.
Al comparar los valores de pH óptimo y estabilidad al pH se encuentra que la enzima no
es estable a su pH óptimo de reacción. No obstante, es importante remarcar que la
actividad óptima es dependiente del tipo de sustrato que se utilice, encontrándose para
otros sustratos como siringaldazina, guayacol y 2,6-dimetoxifenol, un valor de actividad
óptima que puede situarse en una parte menos ácida (pH 5 o 6) que es coincidente con
una mayor estabilidad de la enzima (Yang et al., 2013). Esto sugiere que para utilizar
esta enzima en un proceso biotecnológico resulta importante determinar el pH óptimo de
reacción para el sustrato que se quiere transformar. En ese sentido, debe buscarse un
balance entre el pH óptimo de reacción, la estabilidad al pH y el tiempo de reacción que
se requiere bajo esas condiciones para implementar el proceso de manera óptima. La
diferencia en el pH de reacción para diferentes sustratos se ha atribuido al hecho de que
el mecanismo involucra la extracción de un electrón o de un hidrógeno en el proceso
catalítico. En este último caso la reacción puede verse afectada en gran medida por los
cambios en el pH. Igualmente al considerar que la reacción depende del potencial redox
del sustrato, el pH puede afectar el estado de ionización del sustrato y por lo tanto su
habilidad para actuar como un sustrato reductor (Majcherczyk et al., 1999).
Se encontró que la lacasa de Xylaria sp. fue activa en todo el rango de temperatura
estudiado (40-70°C), mostrando una temperatura óptima de reacción entre 50 y 60°C
(α=0,05), la cual resulta similar a lo obtenido para otras lacasas fúngicas reportadas
61
(Patel et al., 2014; Das et al., 2001; Forootanfar et al., 2011; Chefetz et al., 1998). En
cuanto a la estabilidad, se encontró que la enzima es bastante estable a -80°C por
meses, lo que es importante en términos de su almacenamiento, sin embargo debe
tenerse en cuenta que debe evitarse el congelamiento y descongelamiento de la enzima,
puesto que puede decrecer la actividad enzimática. La exposición de la lacasa a
temperaturas entre 4-70°C fue estudiada, considerando tiempos de incubación de tres
horas, y evaluando la actividad cada hora. Se encontró que la lacasa fue bastante
estable a temperaturas inferiores a 30°C, pero rápidamente inactivada a temperaturas
sobre 40°C y superiores. En este sentido se encuentra una concordancia con lo obtenido
para la lacasa de X. polymorpha (Liers et al., 2007), en donde la enzima mostró gran
estabilidad a 20°C durante hasta 4 horas, pero mostró una marcada afectación en la
actividad residual a 40°C y temperaturas superiores. La lacasa del hongo ascomiceto P.
variabile purificada por Forootanfar et al., (2011), mostró un comportamiento similar al
exponer la enzima durante una hora a temperaturas entre 4 y 70°C, donde se observó un
punto de inflexión hacia la disminución de la actividad residual por encima de 40°C.
Las interacciones de lacasas con metales son de particular importancia para el
entendimiento de los procesos biotecnológicos involucrados en la degradación de
xenobióticos (Neifar et al., 2009). En la evaluación del efecto de diferentes iones
metálicos sobre la lacasa purificada se observó que en general la actividad de la enzima
no se ve afectada por la presencia de gran parte de los iones evaluados. Se destacó el
efecto inhibitorio del Fe2+, el cual logró una inhibición fuerte de la actividad enzimática en
la lacasa. Resultados similares se han obtenido con otras lacasas como en P. variabile
(Forootanfar et al., 2011) y Fusarium solani (Wu et al., 2010), si bien se han encontrado
lacasas que no sufren este efecto inhibitorio por el Fe2+, como es el caso de T.
pubescens (Si et al., 2013). En presencia del cobre (Cu2+) se observó un leve efecto
estimulante en la actividad enzimática, lo cual ha sido observado también en otros
hongos como P. variabile (Forootanfar et al., 2011), y T. pubescens (Si et al., 2013).
Contrario efecto se ha observado en otros organismos como Odontotermes formosanus,
en donde la presencia de Cu2+ puede cumplir un papel inhibitorio (Zhou et al., 2010).
Estudios realizados con T. pubescens (Si et al., 2013) formularon que un efecto inductivo
en la enzima por parte de iones metálicos podría entenderse por un incremento de la
afinidad de la enzima hacia al sustrato, justificada por el aumento observado de la
62
eficiencia catalítica (kcat/Km). En este sentido se ha propuesto que el Cu2+ o cualquier otro
metal con un efecto estimulante induciría un cambio conformacional de la enzima,
afectando el complejo sustrato-enzima-ion metálico como es evidenciado en el modelo
de inhibición no competitiva (Si et al., 2013).
El efecto inhibitorio observado con los diferentes iones como el Fe2+, y en menor medida
con el Mn2+ y Cd2+ podría ser explicado considerando que se ha propuesto que la
inhibición por iones metálicos puede resultar de un efecto del enlace de estos iones cerca
al sitio T1, donde se enlaza el átomo de cobre tipo I a la enzima nativa. Actuando así
como un inhibidor competitivo de los donantes de electrones y bloqueando el acceso de
los sustratos al sitio T1, inhibiendo de esta forma la transferencia electrónica al átomo de
cobre T1 y llevando a una inhibición de la actividad lacasa (Si et al., 2013; Fang et al.,
2012). Al analizar el comportamiento frente a los iones metálicos se puede decir que la
buena resistencia encontrada en general en esta lacasa, puede hacerla un candidato
probable a aplicaciones industriales como biorremediación, donde esta característica
resulta importante (Kalyani et al., 2012).
La lacasa purificada no presentó una reducción significativa de su actividad en presencia
de EDTA (1 y 10 mM), lo que resulta interesante comparada con otras lacasas, como por
ejemplo la de P. variabile (Forootanfar et al., 2011), Cyanthus bulleri (Salony et al., 2008)
y Melanocarpus albomyces (Kiiskinen et al., 2002). Este comportamiento llama la
atención además si se tiene en cuenta que la enzima presenta como una de sus
principales características la presencia de metal en el sitio activo. Sin embargo este
comportamiento se ha encontrado también en otras lacasas (Patel et al., 2014; De-Souza
y Peralta 2003; Heinzkill et al., 1998). Una causa probable de este comportamiento es
que el efecto inhibitorio del EDTA es influenciado por el sustrato, en este sentido Lorenzo
et al., (2005) encontraron que el EDTA inhibe fuertemente la actividad de la enzima al
usar siringaldazina o 2,6-dimetoxifenol como sustrato, mientras que al usar ABTS, el
EDTA no se encontró como un inhibidor eficiente. La azida de sodio, DTT y KCN fueron
potentes inhibidores de la actividad enzimática, lo cual ha sido encontrado con lacasas
de otros organismos, como T. rubrum (Jung et al., 2002) C. bulleri (Salony et al., 2008) y
T. pubescens (Si et al., 2013). La alta inhibición de estos compuestos indica el papel
esencial que cumplen los grupos tiol y sitios activos de unión a metal en la actividad
lacasa (Lorenzo et al., 2005; Johannes y Majcherczyk 2000). La azida de sodio parece
63
unirse a sitios de unión al metal en lacasas, que afectan la transferencia electrónica, lo
que genera un efecto negativo en todo el proceso de oxidación llevado a cabo por la
enzima, inhibiendo su actividad enzimática (Ryan et al., 2003).
Se determinó un valor de Km de 297 µM y Vmax de 581,4 µM.min-1. El valor de Km es
similar al encontrado en otros hongos con el mismo sustrato, como en P. variabile
(Forootanfar et al., 2011) y Shiraia sp. (Yang et al., 2013) estos resultados están de
acuerdo en general con lo observado para las lacasas con el ABTS, en donde se ha
encontrado una alta afinidad de la enzima por este sustrato.
Al determinar la pureza y el peso molecular relativo de la fracción de proteínas
provenientes de la cromatografía de exclusión por tamaño, positiva para actividad lacasa,
mediante SDS-PAGE y revelado con plata se encontró la aparición de dos bandas de
proteínas a 78 y 68 KDa. El análisis posterior del gel PAGE teñido con Coomassie y
guayacol, y el análisis por espectrometría de masas, permitió suponer la presencia de
una lacasa dimérica. Sin embargo al realizar el análisis en geles bidimensionales se
evidenció la presencia de spots en la zona de 38 KDa. La diferencia entre el
comportamiento en 2D y SDS-PAGE fue atribuida al calentamiento previo al montaje de
la muestra en el gel, mostrando que este genera la formación de agregados de alto peso
molecular, una propiedad descrita en algunas proteínas de membrana (Sagné et al.,
1996), pero no descrita para lacasa previamente. Sagné et al. (1996) propuso que la
causa de la agregación puede darse por la presencia de estructuras secundarias
resistentes al tratamiento con SDS, que en condiciones de calentamiento y ante una
afectación parcial del plegamiento nativo de la proteína puede desencadenar
interacciones complementarias entre las estructuras resistentes al SDS, resultando en la
formación de agregados (Figura 6-1). En ese sentido un tratamiento con ácido
trifluoroacético anhídro de las muestras de lacasa purificada después del calentamiento
previo al montaje en el gel, podría ser capaz de disociar los agregados. El cambio del
tampón de carga de Tris/SDS a Hepes/SDS, y el uso de algunos alcoholes en el tampón
también podrían ayudar a evitar la formación de los agregados, de acuerdo a lo
encontrado en el mismo de reporte de Sagné et al., (1996).
64
Figura 6-1: Modelo de la agregación de proteínas en SDS-PAGE. Mientras la mayoría de
las proteínas pierden completamente su estructura nativa en SDS, algunas proteínas
retienen significativamente cierto nivel de estructura secundaria. Esta estructura residual
se simboliza con las cajas con bordes oscuros. Condiciones como el calor debilitan las
interacciones en esas estructuras, permitiendo interacciones intramoleculares entre otras
cajas complementarias, dando lugar a la formación de agregados. (Adaptado de Sagné
et al. 1996).
Es interesante mencionar que otra diferencia importante entre las dos técnicas se
presenta en la alquilación realizada en la electroforesis 2D y ausente en la SDS-PAGE,
esta característica bloquea los grupos reactivos en la muestra 2D y evita la formación de
agregados o formación de oligómeros en proteínas con estas características. De forma
que una alquilación previa al calentamiento en SDS-PAGE podría ayudar a evitar la
formación de agregados. Adicionalmente es necesario tener en cuenta que estas
proteínas contienen una importante cantidad de carbohidratos. El comportamiento
electroforético de las glicoproteínas ha sido descrito como alterado por su contenido en
carbohidratos (Janson, 2011). Es posible sugerir que se pudieran dar lugar a reacciones
de entrecruzamiento por la presencia de carbohidratos durante el calentamiento, como
aquellas que se presentan en las reacciones de Maillard (Jumel, 2002). En tal sentido
sería interesante deglicosilar la enzima previa a su análisis en SDS-PAGE. Tal vez una
combinación de esta estrategia con la alquilación podría resultar en la obtención de un
perfil electroforético en SDS-PAGE similar al obtenido en electroforesis 2D.
65
La detección de la banda en el peso molecular de 38 KDa, es coincidente en tamaño con
la lacasa codificada por el cDNA de X. polymorpha descrita por Liers et al., (2007).
Aunque las lacasas están típicamente en el rango 60-100 KDa (Bertrand et al., 2013;
Shraddha et al., 2011), se han reportado lacasas de menor tamaño, como la obtenida por
Atalla et al., (2013) de 48KDa en Trematosphaeria mangrovei; por Dhakar y Pandey
(2013) de 45 KDa en T. hirsuta; o por Pezet (1998) de 32KDa en B. cinerea. No obstante
para una mejor interpretación del resultado obtenido sería importante la determinación de
la masa molecular por MALDI-TOF, esta técnica evitaría que la enzima sea sometida a
calentamiento o condiciones reductivas y desnaturalizantes, que pueden afectar la
estimación de la masa.
La aparición de varios spots a la misma altura de peso molecular en el gel 2D se
relaciona en general con diferencias en el pI causadas por heterogeneidad de las
fosforilaciones que pueden recibir las proteínas (Seo y Lee, 2004). De este análisis
también se destaca no solo la diferencia de perfiles proteicos que pueden obtenerse bajo
diferentes condiciones de cultivo, sino el hecho de que componentes que pueden
influenciar la producción de la enzima de interés, también pueden provocar una
sobreexpresión de un número importante de otras proteínas, tal es el caso de los spots
fuertemente marcados a un bajo valor de pI y un peso molecular entre 70-100 KDa.
66
7. Conclusiones y recomendaciones
7.1 Conclusiones
De los 7 morfotipos de hongos evaluados tanto basidiomicetos como ascomicetos, se
encontró que el hongo ascomiceto Xylaria sp. (CH003) evidenció un comportamiento
superior sobre los demás aislamientos evaluados para la producción de lacasas. Aunque
en general se han descrito que los hongos basidiomicetos de la pudrición blanca resultan
ser mejores productores de lacasas, este es un claro ejemplo de que hongos de la
pudrición suave, de tipo ascomiceto pueden llegar a tener una producción superior en
relación a lo convencional. Destacando de esta forma la necesidad de considerar estas
dos divisiones de organismos fúngicos en los análisis de bioprospección.
Este trabajo mostró el desarrollo de una estrategia para la optimización del medio de
cultivo con el fin de potenciar la producción de lacasa. Como factores determinantes en la
producción de la enzima se tuvo en primer lugar a la fuente de carbono. El empleo de
residuos lignocelulósicos representa una buena oportunidad para la producción en masa
de la enzima a bajos costos y con mejores rendimientos respecto a otras fuentes
definidas como fructosa y almidón. La fuente de nitrógeno también mostró ser importante
en la formulación del medio de cultivo. Los resultados obtenidos mostraron que no
siempre las fuentes orgánicas son las mejores fuentes para la producción de lacasas. Al
evaluar el efecto de las diferentes concentraciones de distintos componentes del medio
como salvado de trigo, KNO3, CuSO4 y KH2PO4, se encontró que la fuente de carbono
seleccionada tenía un efecto muy importante sobre la producción de la enzima, siendo la
concentración de este componente la más crítica dentro de la formulación del medio de
cultivo. La variación en la concentración de la fuente de nitrógeno, fósforo y el cobre, un
inductor reconocido de la actividad lacasa, no produjeron un efecto tan marcado como la
fuente de carbono.
Para potenciar la actividad enzimática además de optimizar la concentración de los
componentes del medio, se pueden emplear inductores aromáticos, teniendo en cuenta
que su uso no siempre garantiza un aumento de la actividad lacasa debido a la toxicidad
67
e inhibición en el crecimiento y producción enzimática que pueden causar. Para la cepa
evaluada la utilización de 2,5-xilidina representó un aumento pronunciado de la actividad.
A través del análisis de los secretomas en geles 2D, se evidenció que el uso de salvado
de trigo logró no solo inducir una mayor cantidad de lacasas, sino que en general logró
aumentar la expresión de otra gran diversidad de proteínas, no representando así un
inductor específico de la actividad.
La lacasa purificada mostró un valor de pH óptimo de 3-4 usando ABTS como sustrato y
una estabilidad al pH mayor entre valores de pH de 6-9. Teniendo en cuenta la
variabilidad del pH óptimo de reacción según el sustrato utilizado, es importante controlar
el pH de trabajo con la enzima de forma que se llegue a un equilibrio entre el pH óptimo y
la estabilidad al pH para lograr un mejor efecto del proceso catalítico oxidativo con la
enzima purificada. En esta misma dirección es necesario controlar la temperatura de
trabajo de la enzima, encontrando igualmente un balance entre la temperatura óptima de
la enzima y la estabilidad térmica, puesto que se evidenció que a la temperatura óptima
de reacción de la enzima (50-60°C), la misma presentaba una baja estabilidad,
reduciendo la actividad a menos de un 20% luego de una hora de incubación.
La enzima purificada no reflejó mayor pérdida de actividad en presencia de la mayoría de
los iones metálicos evaluados, a excepción del ion Mn2+ que produjo un pequeño efecto
inhibitorio, reduciendo la actividad a un 81%, y el ion Fe2+ que inhibió la enzima casi por
completo, reduciendo la actividad a un 5%. En todos los demás casos, se mantuvo más
del 90% de la actividad enzimática. Este comportamiento es interesante de cara a
posibles aplicaciones de la enzima, puesto que la presencia de iones metálicos es
característica en los efluentes de muchos procesos industriales contaminantes, en donde
la biorremediación con este tipo de enzimas oxidativas es una excelente alternativa.
Finalmente la masa molecular y los péptidos identificados en la lacasa purificada
coinciden con los reportados para X. polymorpha por Liers et al (2007), confirmando la
identidad enzimática de la fenol-oxidasa purificada.
68
7.2 Recomendaciones
La selección del hongo, o los hongos de interés en un estudio de bioprospección
enzimática es una etapa crítica en el desarrollo del proceso. En este sentido se
recomienda el uso de sustratos lignocelulósicos complejos como salvado de trigo,
cáscaras de mandarina, semillas de uva y otros reportados. Esto debido a la composición
de los mismos sustratos, que han demostrado inducir eficientemente la producción de la
enzima, y de lo cual este trabajo es una evidencia. Además una clara ventaja es la
reducción del costo asociado al proceso. Por otro lado es importante reconocer que el
uso de este tipo de sustratos, da valor agregado a residuos agrícolas evitando que estos
se constituyan en fuente de contaminación.
En relación a la purificación se obtuvo un rendimiento bajo de solo 0,51%. Con el fin de
lograr mejorar el valor obtenido, se recomienda la evaluación de estrategias de
purificación adicionales como la cromatografía de afinidad en un primer paso
cromatográfico.
En cuanto al complejo comportamiento electroforético observado y la persistencia en la
duda sobre la masa molecular de la enzima, fueron propuestas algunas explicaciones
plausibles, no obstante se recomienda la recolección de evidencia experimental que
pudiera confirmar la coincidencia en el comportamiento observado entre la lacasa de
Xylaria sp. y el transportador vesicular de monoaminas, purificado por Sagné et al.,
(1996), o para estimar el posible efecto de los carbohidratos en la agregación.
Se recomienda la evaluación de la capacidad de esta enzima para diferentes procesos
de interés biotecnológico, como lo es la degradación de diferentes compuestos
xenobióticos, como colorantes y otros compuestos orgánicos, la conservación de
alimentos, la síntesis orgánica, etc. De esta forma se podrá determinar el potencial
biotecnológico real de la enzima purificada.
Adicionalmente con el fin de obtener conocimiento sobre las características del gen
relacionado con la expresión de la enzima, se sugieren análisis de expresión a nivel de
RNA y amplificación de cDNA. A partir de estos estudios sería también posible la
evaluación de la expresión heteróloga de la enzima en organismos eucariotas como
Aspergillus sp. o P. pastoris.
69
A. Anexo: Curva de calibración para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford
Se tomaron 150 µL de cada patrón y se le adicionaron 7.5 µL de reactivo de Bradford (SIGMA), se agitó brevemente en vórtex y se dejó a temperatura ambiente por 10 minutos. A continuación se midió la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro Genesys 10S UV/Vis.
y = 1,1124x + 0,0352R² = 0,9976
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Abs
595
nm
mg/ml
70
B. Anexo: Soluciones usadas durante la electroforesis SDS-PAGE
Persulfato de amonio (10 ml)
• Disolver 1 g de persulfato de amonio (PSA) en 8 ml de agua
• Ajustar volumen a 10 ml con agua
• La solución es estable a 4°C por dos semanas
Mezcla acril-bisacrilamida 30% (100ml)
• Disolver 29 g de acrilamida y 1 g de N,N´- metilenbisacrilamida en 60 ml de agua
• Calentar la solución a 37°C para disolver los químicos
• Ajustar volumen a 100 ml con agua
• Guardar a 4°C protegido de la luz
Buffer de carga 2X (100ml)
• Mezclar 10 ml de Buffer Tris 0,5M (pH 6,8), 6 ml de SDS 20%, 30 ml de glicerol,
15 ml de β-mercaptoetanol, y 1,8 mg de azul de bromofenol.
• Ajustar volumen a 100 ml con agua
• Repartir en soluciones stock de 10 ml y guardar a -20°C
• Guardar la solución de trabajo a 4°C
Buffer de corrida 10X (1 L)
• Disolver 10 g de SDS, 30,3 g de Tris y 144,1g de glicina en 800 ml de agua.
• Ajustar volumen a 1000 ml con agua
• Guardar a temperatura ambiente
Solución de tinción de azul de Coomassie (1 L)
• Disolver 2,5 g de azul brillante de Coomassie R-250 en una mezcla de 450 ml de
metanol, 100 ml de ácido acético y 400 ml de agua.
• Ajustar a 1 l con agua
• Guardar a temperatura ambiente
71
Solución de lavado de azul de Coomassie (1L)
• Mezclar 450 (225) ml de metanol, 100 (50) ml de ácido acético y 400 (200) ml de
agua
• Ajustar a 1 L (0,5) con agua
• Guardar a temperatura ambiente
Buffer Tris 0,5M pH 6,8 (500 ml) (Para gel concentr ador)
• 30,25 g de Tris base, llevar a 450 ml con agua, ajustar pH con HCl y completar a
500 ml
SDS 10% (1 L)
• Disolver 10 g de SDS en 900 ml de agua
• Calentar a 68°C para solubilizar los cristales
• Ajustar el pH a 7,2 con HCl
• Ajustar a 1 L con agua
• Repartir en tubos de 15 ml y guardar a temperatura ambiente
• Nota: Los cristales de SDS se dispersan muy fácilmente, usar máscara cuando se
esté pesando este reactivo.
• Cuando los cristales de SDS se precipiten (p.ej. debido a baja temperatura),
redisolver por calentamiento de la solución a 37°C
Buffer Tris 1,5M pH 8,8 (500 ml) (Para gel separado r)
• 90,75 g de Tris base, llevar a 475 ml con agua, ajustar pH con HCl y llevar a 500
ml con agua.
72
C. Anexo: Geles trabajados en la electroforesis
A continuación se muestra la proporción de componentes utilizados en la preparación de
los geles separador y concentrador. Inicialmente se preparó el gel separador en un tubo
Falcon de 15 ml, adicionando los componentes en el orden listado en la tabla, una vez
servido entre las placas de vidrio, se dejó polimerizar por 40 minutos. El gel tuvo una
concentración de 10 o 12 % de acrilamida. Luego se preparó el gel concentrador a una
concentración de 5% de la misma forma que el gel separador, sirviéndolo sobre el gel
separador previamente polimerizado entre las placas de vidrio, y colocando un peine
para marcar los pozos de aplicación de la muestra. Se utilizó el sistema MiniProtean Bio-
Rad®.
Gel separador %
Acrilamida Componentes Volumen de los
componentes por (µl) para 5 ml de gel
10 H2O 30 % acril-bis 1,5 M Tris (pH8,8) 10% SDS 10% PSA TEMED
1900 1700 1300 50 50 2
12 H2O 30 % acril-bis 1,5 M Tris (pH8,8) 10% SDS 10% PSA TEMED
1600 2000 1300 50 50 2
Gel concentrador 5% acrilamida
Componentes Volumen de los componentes
(µL) por 2ml de gel
H2O 1400 30 % acril-bis 330 0,5 M Tris (pH6,8) 250 10% SDS 20 10% PSA 20 TEMED 2
73
D. Anexo: Curvas de calibración para determinación del peso molecular relativo de las proteínas
Se realizaron 2 determinaciones de peso molecular relativo usando patrones en geles de poliacrilamida. Se hizo tanto en geles SDS-PAGE de 12% acrilamida como en geles de dos dimensiones.
• Patrones SDS-PAGE
Peso
molecular
(KDa)
Distancia
(cm)
Log (Peso
molecular)
Log
(distancia)
200 0,4 2,30 -0,40
116,3 0,95 2,06 -0,02
97,4 1,2 1,99 0,08
66,3 1,8 1,82 0,26
55,4 2,5 1,74 0,40
36,5 4 1,56 0,60
31 5,1 1,49 0,71
21,5 7,25 1,33 0,86
Log(peso) = -0,771Log(d) + 2,0275
R² = 0,9949
0
0,5
1
1,5
2
2,5
-0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Los
(Pe
so)
Log (distancia)
74
• Patrones geles 2D
Peso
molecular
(KDa)
Distancia
(cm)
Log (Peso
molecular)
Log
(distancia)
200 0,9 2,30 -0,05
150 1,2 2,18 0,08
120 1,65 2,08 0,22
100 2,15 2,00 0,33
85 2,5 1,93 0,40
70 3,17 1,85 0,50
60 3,8 1,78 0,58
50 4,3 1,70 0,63
40 5,3 1,60 0,72
30 7,4 1,48 0,87
25 8,15 1,40 0,91
Log(peso) = -0,9205(Log(d)) + 2,2792R² = 0,9927
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
-0,20 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
Log
(Pes
o)
Log (distancia)
75
E. Anexo: Formulación de tampones usados para la determinación de pH óptimo
Tampón pH Preparación
Citrato 50mM
3,0 Pesar 0,8983 g de ácido cítrico monohidratado y 0,2132 g de citrato de sodio dihidratado y disolverlos en 100 ml de agua destilada.
4,0 Pesar 0,6558 g de ácido cítrico monohidratado y 0,5525 g de citrato de sodio dihidratado y disolverlos en 100 ml de agua destilada.
5,0 Pesar 0,3847 g de ácido cítrico monohidratado y 0,9320 g de citrato de sodio dihidratado y disolverlos en 100 ml de agua destilada.
Fosfato 50mM
6,0 Pesar 0,6072 g de dihidrogenfosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4.H2O) y 0,2150 g de hidrogenfosfato de sodio dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) y disolverlos en 100 ml de agua destilada.
7,0 Pesar 0,2918 g de dihidrogenfosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4.H2O) y 1,0331 g de hidrogenfosfato de sodio dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) y disolverlos en 100 ml de agua destilada.
8,0 Pesar 0,0471 g de dihidrogenfosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4.H2O) y 1,6680 g de hidrogenfosfato de sodio dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) y disolverlos en 100 ml de agua destilada.
Tris-HCl 50mM 9,0 Pesar 0,6050g y adicionar 90 ml de agua destilada, ajustar el pH con HCl concentrado (36%) y llevar a 100 ml.
76
F. Anexo: Soluciones usados en estudios de inhibición
Todas las soluciones se prepararon a un volumen final de 20 ml.
Ion a evaluar
Sal empleada Peso (g) Concentración solución stock (M)
Volumen usado del stock (µL) para 1 ml de reacción
Ca2+ CaCl2.2H2O 2,9400 1 10 Mg2+ MgSO4.7H2O 4,9295 1 10 Zn2+ ZnSO4.H2O 5,7515 1 10 Mn2+ MnSO4.H2O 3,3803 1 10 Ni2+ NiCl2 2,5920 1 10 Cu2+ CuSO4.5H2O 4,9937 1 10 Cd2+ CdCl2 3,6663 1 10 Fe2+ FeSO4.7H2O 0,5560 0,1 100
Inhibidor Concentración solución stock (mM)
Peso (g)
Concentración del inhibidor a evaluar (mM)
0,1 1 5 10 Volumen usado del stock ( µL) para 1
ml de reacción EDTA 100 0,7445 -------- 10 -------- 100 Azida de sodio 100 0,1300 -------- 10 -------- 100 KCN 100 0,1302 -------- -------- 50 -------- DTT 10 0,0309 10 -------- -------- --------
77
G. Anexo: Espectros de masas obtenidos en el análisis MS/MS
En la gráfica las señales m/z que se identifican con los iones de tipo y o b, señalan los picos coincidentes entre el espectro experimental y el teórico. En la tabla en rojo se muestran las señales observadas de todas las señales teóricas posibles de acuerdo a la secuencia específica.
• Péptido: LVNTAIDTMFK (oxidado)
R.LVNTAIDTMFK.F + Oxidación (M)
# B b++ b* b*++ b0 b0++ Seq. y y++ y* y*++ y0 y0++ #
1 114.0913 57.5493 L 11
2 213.1598 107.0835 V 1155.5714 578.2894 1138.5449 569.7761 1137.5609 569.2841 10
3 327.2027 164.1050 310.1761 155.5917 N 1056.5030 528.7552 1039.4765 520.2419 1038.4925 519.7499 9
4 428.2504 214.6288 411.2238 206.1155 410.2398 205.6235 T 942.4601 471.7337 925.4335 463.2204 924.4495 462.7284 8
5 499.2875 250.1474 482.2609 241.6341 481.2769 241.1421 A 841.4124 421.2098 824.3859 412.6966 823.4019 412.2046 7
6 612.3715 306.6894 595.3450 298.1761 594.3610 297.6841 I 770.3753 385.6913 753.3488 377.1780 752.3647 376.6860 6
7 727.3985 364.2029 710.3719 355.6896 709.3879 355.1976 D 657.2912 329.1493 640.2647 320.6360 639.2807 320.1440 5
8 828.4462 414.7267 811.4196 406.2134 810.4356 405.7214 T 542.2643 271.6358 525.2377 263.1225 524.2537 262.6305 4
9 975.4816 488.2444 958.4550 479.7311 957.4710 479.2391 M 441.2166 221.1119 424.1901 212.5987 3
10 1122.5500 561.7786 1105.5234 553.2654 1104.5394 552.7733 F 294.1812 147.5942 277.1547 139.0810 2
11 K 147.1128 74.0600 130.0863 65.5468 1
78
• Péptido: GPASAPYDEDK
R.GPASAPYDEDK.G
# b b++ b0 b0++ Seq. y y++ y* y*++ y0 y0++ #
1 58.0287 29.5180 G 11
2 155.0815 78.0444 P 1092.4844 546.7458 1075.4578 538.2326 1074.4738 537.7406 10
3 226.1186 113.5629 A 995.4316 498.2195 978.4051 489.7062 977.4211 489.2142 9
4 313.1506 157.0790 295.1401 148.0737 S 924.3945 462.7009 907.3680 454.1876 906.3840 453.6956 8
5 384.1878 192.5975 366.1772 183.5922 A 837.3625 419.1849 820.3359 410.6716 819.3519 410.1796 7
6 481.2405 241.1239 463.2300 232.1186 P 766.3254 383.6663 749.2988 375.1531 748.3148 374.6610 6
7 644.3039 322.6556 626.2933 313.6503 Y 669.2726 335.1399 652.2461 326.6267 651.2620 326.1347 5
8 759.3308 380.1690 741.3202 371.1638 D 506.2093 253.6083 489.1827 245.0950 488.1987 244.6030 4
9 888.3734 444.6903 870.3628 435.6851 E 391.1823 196.0948 374.1558 187.5815 373.1718 187.0895 3
10 1003.4003 502.2038 985.3898 493.1985 D 262.1397 131.5735 245.1132 123.0602 244.1292 122.5682 2
11 K 147.1128 74.0600 130.0863 65.5468 1
79
H. Anexo: Tablas de resultados de listas de proteínas encontradas por el programa Mascot
• Banda 78KDa
La búsqueda fue realizada con el programa Mascot (v.2.4.0) en la base de datos no redundante del NCBI (nrNCBI)
Proteín a Masa (KDa)
Puntaje Número de emparejamientos
Número de emparejamientos signifi cativos
Número de péptidos
Número de péptidos significativo s
Laccase (Xylaria polymorpha)
36,789 410 52 24 3 2
Proteína manosiltransferasa Pmt6 (Candidata ortholopsis Co90-125)
48,381 52 10 4 1 1
Proteína hipotética E5Q_02043 (Mixia osmundae IAM14324)
11,782 48 12 1 1 1
Celobiohidrolasa I, parcial (Hongo no cultivado)
17,704 42 2 1 1 1
Proteína CC1G_00171 (Coprinopsis cinérea okayama7#130)
42 33,443 1 1 1 1
• Banda 68 KDa
Proteína Masa (KDa)
Puntaje Número de emparejamientos
Número de emparejamientos significativos
Número de péptidos
Número de péptidos significativos
Laccase (Xylaria .polymorpha)
36,789 98 14 10 1 1
Proteína manosiltransferasa Pmt6 (Candidata ortholopsis Co90-125)
48,381 56 13 3 1 1
Proteína hipotética AGABI2DRAFT_72723 parcial (Agaricus bisporus var.bisporus H97)
22,415 51 8 1 1 1
Factor de iniciación de la traducción eIF4E3 (Trichophyton rubrum CBS 18892)
39,736 46 10 2 1 1
Péptido sintetasa no ribosomal (Cordyceps militaris CM01)
16,904 40 76 3 1 1
80
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