i

LAPORAN AKHIR PKM-P

DIABETIC WOUND HEALING : EKSTRAK CACING TANAH (Pheretima

aspergillum) SEBAGAI AKSELERATOR PENYEMBUHAN ULKUS

DIABETIK PADA TIKUS MODEL DIABETES MELITUS MELALUI

INDUKSI DENSITAS AKSON SECARA IN VIVO

Oleh :

Fetreo Negeo P. 105070200111004 Angkatan 2010

Ni Putu Jeny M. 105070201111013 Angkatan 2010

Arinda Nur Y. 105070200111010 Angkatan 2010

Dwi Astika Sari 105070201111021 Angkatan 2010

I Wayan Gede S. 115070200111021 Angkatan 2011

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2013

ii

LEMBAR PENGESAHAN

1. Judul Kegiatan : Diabetic Wound Healing : Ekstrak Cacing Tanah

(Pheretima aspergillum) Sebagai Akselerator

Penyembuhan Ulkus Diabetik Pada Tikus Model

Diabetes Melitus Melalui Induksi Densitas Akson

Secara In Vivo

2. Bidang Kegiatan : (√) PKM-P ( ) PKM-M ( ) PKM-KC

( ) PKM-K ( ) PKM-T

3. Ketua Pelaksana Kegiatan

a. Nama Lengkap : Fetreo Negeo Putra

b. NIM : 105070200111004

c. Jurusan : Ilmu Keperawatan

d. Universitas : Universitas Brawijaya

e. Alamat Rumah dan No Telp/HP: RT 20/ RW 03 Ds Buluagung Kec.

Karangan Kab. Trenggalek

085755172513

f. Alamat email : fetreonegeo@gmail.com

4. Anggota Pelaksana Kegiatan : 4 orang

5. Dosen Pendamping

a. Nama Lengkap dan Gelar : Ns.Heri Kristianto,S.Kep.,M.Kep.Sp.KMB

b. NIDN : 0026118201

c. Alamat Rumah dan No Telp/Hp: Pondok Alam Sigura-gura Blok A2/20

Karang Besuki Malang

085234068944

6. Biaya Kegiatan Total

a. Dikti : Rp. 11.200.000,00

b. Sumber lain : -

7. Jangka Waktu Pelaksanaan : 4 bulan

Menyetujui

Pembantu Dekan I FKUB

dr. Sri Andarini, M.Kes

NIP. 195804141987012001

Pembantu Rektor III

Bidang Kemahasiswaan

Ir. H. RB. Ainurrasjid, MS

NIP. 195506181981031002

Malang, 20 Agustus 2013

Ketua Pelaksana Kegiatan

Fetreo Negeo Putra

NIM. 105070200111004

Dosen Pendamping

Ns. Heri Kristianto, S.Kep., M.Kep.Sp.KMB

NIDN. 0026118201

iii

DIABETIC WOUND HEALING : EKSTRAK CACING TANAH

(PHERETIMA ASPERGILLUM) SEBAGAI AKSELERATOR

PENYEMBUHAN ULKUS DIABETIK PADA TIKUS MODEL DIABETES

MELITUS MELALUI INDUKSI DENSITAS AKSON SECARA IN VIVO

Fetreo Negeo Putra1, Ni Putu Jeny Mardiati

1, Arinda Nur Yunitasari

1,

Dwi AstikaSari1, I Wayan Gede Saraswasta

1, Heri Kristianto

2

1. Ilmu Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya

2. Departemen Keperawatan Medikal Bedah FK UB-RSUD dr Saiful Anwar

Abstrak

Latar Belakang: Neuropati merupakan komplikasi serius penyebab ulkus

diabetik pada penderita diabetes melitus (DM). Kondisi ini menyebabkan

kerusakan pada saraf perifer akibat degenerasi akson. Beberapa penelitian

menunjukkan bahwa ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) mampu

meregenerasi saraf perifer. Kemampuan regenerasi ini melibatkan proliferasi dan

diferensiasi sel schwan dalam mendukung regenerasi akson saraf perifer.

Tujuan: Penelitian ini ditujukan untuk membuktikan pengaruh pemberian ekstrak

cacing tanah (Pheretima aspergillum) terhadap akselerasi penyembuhan ulkus

diabetik melalui induksi densitas akson saraf perifer pada tikus Rattus norvegicus

jantan galur wistar yang diiduksi Diabetes Melitus (DM).

Metode: Penelitian ini menggunakan desain true experimental in vivo dengan

metode Randomized Posttest Only Controlled Group Design. Dalam penelitian ini

terdapat 5 kelompok : kontrol (-) yang diinduksi DM dan diberi perawatan ulkus

diabetik dengan normal saline (NaCl 0,9%), kontrol (+) yang diinduksi DM dan

diberi perawatan ulkus diabetik dengan hidrogel (sodiumcarboxymethylcellulose),

kelompok perlakuan yang diinduksi DM dan diberi perawatan ulkus diabetik

secara topikal, oral, dan topikal-oral. Pengambilan jaringan kulit dilakukan pada

hari ke-21 dan dilakukan pengukuran kontraksi luka dan penghitungan densitas

akson.

Hasil: Uji ANOVA menunjukkan bahwa pemberian ekstrak cacing tanah

(Pheretima aspergillum) mampu meningkatkan persentase kontraksi luka dan

jumlah densitas akson saraf perifer secara bermakna dengan nilai p=0,013 (p<0,05)

dan p=0,000 (p<0,05). Uji Post Hoc dilakukan untuk melihat kelompok mana yang

berbeda secara bermakna.

Kesimpulan: Pemberian ekstrak tanah (Pheretima aspergillum) dapat

meningkatkan persentase kontraksi luka dan jumlah densitas akson saraf perifer

pada tikus putih (Rattus novergicus) galur Wistar yang diinduksi Diabetes Melitus.

Kata Kunci: Diabetes Melitus, Ulkus Diabetik, Cacing Tanah (Pheretima

aspergillum), Regenerasi Saraf Perifer.

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur bagi Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberi petunjuk dan

hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini dengan judul

Diabetic Wound Healing : Ekstrak Cacing Tanah (Pheretima aspergillum) Sebagai

Akselerator Penyembuhan Ulkus Diabetik Pada Tikus Model Diabetes Melitus

Melalui Induksi Densitas Akson Secara In Vivo.

Topik penelitian ini diangkat setelah melihat kenyataan tingginya kasus

komplikasi kronik yang terjadi pada pasien dengan Diabetes Melitus (DM). Salah

satu komplikasi kronik tersebut adalah terjadinya proses neuropati atau kerusakan

pada jaringan saraf perifer dengan diikuti timbulnya ulkus diabetik. Kondisi ini

pada akhirnya dapat menimbulkan kematian jaringan dan berujung pada tindakan

amputasi yang sangat berpengaruh pada quality of life pasien. Dalam penelitian ini

kami membuat desain akselerator penyembuhan ulkus diabetik melalui induksi

densitas akson yang kami istilahkan dengan nama “Diabetic Wound Healing”.

Penulis menyadari bahwa baik dalam perjalanan penelitian maupun

penyelesaian penelitian ini banyak memperoleh bimbingan dan motivasi dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa

syukur dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Dr. dr. Karyono Mintaroem, Sp.PA selaku Dekan Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya.

2. Dr. dr. Kusworini, M. Kes, Sp. PK selaku Ketua Jurusan Ilmu

Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

3. Ns.Heri Kristianto,S.Kep.,M.Kep.Sp.KMB sebagai pembimbing yang

selalu memberi masukan, saran serta bimbingan yang sangat berharga

selama proses penelitian ini.

4. Dr. dr. I Ketut Gede Muliartha, Sp. PA dan dr. Indriati Dwi Rahayu

yang telah memberikan masukan dan saran untuk terselesaikannya

penelitian ini.

5. Pak Satuman, Mas Didin, dan Mas Mijan selaku analis Laboratorium

Faal dan Patologi Anatomi FKUB yang telah membantu kami dalam

melakukan penelitian.

6. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penelitian ini

Akhir kata, penulis berharap semoga penelitian ini dapat menambah

khasanah ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi semua pihak. Penulis menyadari

dalam penyelesaian penelitian ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu,

saran dan kritik yang sifatnya membangun sangat diharapkan oleh penulis demi

tersempurnanya penelitian selanjutnya.

Malang, Agustus 2013

Penulis

1

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Diabetes melitus (DM) telah menempatkan Indonesia di urutan ke-4 dunia

setelah negara India, China dan Amerika dengan jumlah Diabetesi sebesar 8,4 juta

orang dan diperkirakan akan terus meningkat sampai 21,3 juta orang di tahun

2030 (King et al., 2003). Komplikasi menahun DM terdiri atas neuropati 60%,

penyakit jantung koroner 20,5%, ulkus diabetik 15%, retinopati 10%, dan

nefropati 7,1% (Waspadji, 2006). Neuropati baik neuropati sensorik maupun

motorik dan autonomik akan mengakibatkan berbagai perubahan pada kulit dan

otot. Hal ini kemudian menyebabkan terjadinya perubahan distribusi tekanan pada

telapak kaki dan selanjutnya akan mempermudah terjadinya ulkus diabetik

(Hastuti, 2008).

Penyembuhan ulkus diabetik berbeda dengan penyembuhan luka akut

normal. Pada ulkus diabetik terjadi penurunan dan gangguan produksi NGF

(Brem & Canic, 2007). Faktor neurotropik NGF memberikan respon mayor dalam

meregulasi proliferasi, diferensiasi, dan remielin sel schwan (Chen et al., 2007).

Sel schwan berdiferensiasi menjadi selubung mielin dan berproliferasi hingga

bagian distal dari area saraf yang mengalami injuri untuk mendukung

pemanjangan akson (Chang et al., 2011a). Penderita DM apabila kadar glukosa

darah tidak terkendali akan menimbulkan kerusakan jaringan saraf akibat adanya

penimbunan sorbitol dan fruktosa sehingga mengakibatkan akson menghilang

(Waspadji, 2006).

Terapi perawatan ulkus diabetik yang ideal seharusnya dapat menghambat

terjadinya neuropati dengan mempercepat proses regenerasi akson pada saraf

perifer melalui peningkatan NGF. Akan tetapi, sampai saat ini belum ditemukan

perawatan ulkus diabetik dengan kriteria demikian. Ulkus diabetik bila tidak

ditangani dengan tepat akan menimbulkan kecacatan bahkan berujung pada

amputasi. Hal ini sangat berpengaruh pada penurunan quality of life (Bradbury &

Price, 2011).

Pheretima aspergillum atau lebih populer dengan sebutan cacing tanah,

merupakan spesies yang memiliki komposisi senyawa kimia tinggi yaitu protein

(43,31%) yang memiliki fungsi mempercepat regenerasi saraf perifer (Sofyan,

2007). Studi in vitro pada ekstrak Pheretima aspergillum memiliki efek terhadap

regenerasi akson saraf perifer. Ekstrak Pheretima aspergillum menyebabkan

peningkatan signifikan terhadap NGF pada sel PC12 yang berhubungan dengan

protein 43 dan sinapsin I (Chen et al., 2010). Ekstrak Pheretima aspergillum

dapat menstimulasi migrasi sel schwan melalui jalur mitogen-activated protein

kinase (MAPK) (Chang et al., 2011a).

Dari pemaparan data empiris di atas muncul hipotesis bahwa ekstrak

cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat mempercepat proses penyembuhan

ulkus diabetik melalui induksi densitas akson pada saraf perifer. Untuk

membuktikannya diperlukan penelitian dalam mengungkap efek ekstrak cacing

tanah terhadap regenerasi akson saraf perifer pada ulkus diabetik melalui

pendekatan biomolekuler secara in vivo.

1.2 Perumusan Masalah

Apakah ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat menginduksi

densitas akson ulkus diabetik secara in vivo pada tikus Rattus norvegicus

galur wistar?

2

1.3 Tujuan Program

Tujuan Umum

Membuktikan pengaruh ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)

terhadap penyembuhan ulkus diabetik pada tikus model diabetes melitus.

Tujuan Khusus

1. Mengukur kontraksi luka pada ulkus diabetik setelah pemberian ekstrak cacing

tanah (Pheretima aspergillum)

2. Menghitung densitas akson pada ulkus diabetik setelah pemberian ekstrak

cacing tanah (Pheretima aspergillum)

1.4 Luaran Yang Diharapkan

Luaran yang diharapkan berupa artikel ilmiah dan paten terkait dengan penerapan

cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam penyembuhan ulkus diabetik pada

penderita diabetes melitus.

1.5 Kegunaan Program

1. Kegunaan Praktis, dapat diketahuinya efek dari kandungan cacing tanah

dalam meningkatkan densitas akson pada ulkus diabetik serta sebagai

referensi dalam mengembangkan penelitian selanjutnya mengenai biota

Indonesia di bidang farmakoonkologi melalui pendekatan biomolekuler.

2. Kegunaan Akademis, dapat dijadikan sebagai dasar teori untuk menambah

wawasan ilmu pengetahuan sekaligus sebagai dasar untuk pengembangan

penelitian selanjutnya dalam bidang kesehatan, khususnya tentang terapi

farmakologi pada ulkus diabetik untuk menghambat proses neuropati.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Diabetes Melitus

Definisi Diabetes Melitus

Diabetes melitus (DM) merupakan suatu penyakit yang melibatkan hormon

endokrin pankreas, antara lain insulin dan glukagon. Manifestasi utamanya

mencakup gangguan metabolisme lipid, karbohidrat, dan protein yang pada

gilirannya merangsang kondisi hiperglikemia (Nugroho, 2006).

Patogenesis Ulkus Diabetik

Ulkus diabetik adalah salah satu bentuk komplikasi kronik DM berupa luka

terbuka pada permukaan kulit yang dapat disertai adanya kematian jaringan

setempat (Frykberb, 2002). Ulkus diabetik disebabkan adanya tiga faktor yang

sering disebut trias yaitu iskemik (vaskular insufisiensi), neuropati, dan infeksi

(Sapico, 2007). Pada penderita DM apabila kadar glukosa darah tidak terkendali

akan terjadi komplikasi kronik yaitu neuropati yang menimbulkan perubahan

jaringan saraf karena adanya penimbunan sorbitol dan fruktosa sehingga

mengakibatkan akson menghilang, penurunan kecepatan induksi, menurunnya

reflek otot, atrofi otot, keringat berlebihan, kulit kering dan hilang rasa, apabila

Diabetisi tidak hati-hati dapat terjadi trauma yang menyebabkan ulkus diabetik

(Waspadji, 2006).

Perawatan Ulkus Diabetik

Perawatan luka modern menekankan metode moist wound healing atau

menjaga agar luka dalam keadaan lembab. Luka akan menjadi cepat sembuh

apabila eksudat dapat dikontrol, menjaga agar luka dalam keadaan lembab, luka

tidak lengket dengan bahan kompres, terhindar dari infeksi dan permeabel

3

terhadap gas. Tindakan dressing merupakan salah satu komponen penting dalam

mempercepat penyembuhan lesi. Ada beberapa jenis dressing yang sering dipakai

dalam perawatan ulkus diabetik, seperti: hydrogel, hydrocolloid, calcium alginate,

foam, dan sebagainya (Hastuti, 2008).

2.2 Cacing Tanah (Pheretima aspergillum) Taksonomi

Cacing tanah (Pheretima aspergillum) atau yang sering disebut dengan

earthworm memiliki taksonomi sebagai berikut: (Santoso, 2002)

Kingdom : Animalia

Sub-kingdom : Metazoa

Filum : Annelida

Kelas : Oligochaeta

Famili : Megascolecidae

Genus : Pheretima

Species : Pheretima aspergilum Gambar 1. Pheretima aspergillum

Morfologi

Ukuran tubuh Pheretima aspergillum dapat mencapai 30cm dengan diameter

mencapai 10mm. Cacing tanah jenis ini segmennya mencapai 95 - 150 segmen.

Klitelumnya terletak pada segmen 14-16. Tubuhnya berbentuk gilik panjang dan

silindris berwarna kemerahan. Cacing ini hidup didalam liang tanah yang lembab,

subur dan suhunya tidak terlalu dingin. Untuk pertumbuhannya yang baik, cacing

ini memerlukan tanah yang sedikit asam sampai netral atau pH 6 - 7,2 (Santoso,

2002).

Kandungan Protein

Kandungan protein pada Pheretima sebesar 43,31%. Protein pada cacing

tanah selain berupa protein struktural juga berupa enzim dan metalloprotein.

Protein tersebut tersusun dari semua asam amino esensial (Sofyan, 2007).

2.3 Densitas Akson

Sistem saraf terbagi menjadi sistem saraf pusat dan sistem saraf perifer,

dimana terdapat perbedaan struktur anatomi dan kemampuan regenerasi.

Regenerasi akson merupakan hasil dari aktivitas sel schwan yang menyediakan

aktivitas penting bagi regenerasi saraf perifer (Chang et al.,2011a). Terdapat tiga

respon mayor yang meregulasi proliferasi, diferensiasi, dan remielin sel schwan

yaitu faktor neurotropik, protein extracellular matrix (ECM), dan hormon. Salah

satu faktor neurotropik tersebut adalah nerve growth factor (NGF) (Chen et al.,

2007). NGF adalah molekul alami dalam tubuh yang merangsang pertumbuhan

dan diferensiasi simpatik dan saraf sensorik (Muangman et al., 2009).

Neurotropic signaling NGF diperantarai oleh dua tipe reseptor yaitu

tropomyosine kinase receptors (Trk) khususnya TrkA yang selektif mengikat

NGF dan p75NTR

. Setelah berikatan dengan reseptornya, NGF akan mengaktivasi

phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) dan selanjutnya mendukung pertumbuhan

akson (Chen et al., 2007). Ekstrak Pheretima aspergillum dapat menginduksi

insulin-like growth factor-1 (IGF-1) dan P13K. IGF-1 merupakan hormon

polipeptide yang disintesa oleh proliferasi sel schwan sebagai respon terhadap

growth hormone untuk menstimulasi pertumbuhan saraf perifer. IGF-1

melindungi neuron pada saraf perifer dari apoptosis dengan mengaktivasi jalur

P13K (Chang et al., 2011b).

4

III. METODE PENDEKATAN

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan desain true experimental in vivo dengan metode

Randomized Post-test Only Controlled Group Design.

3.2 Variabel Penelitian

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah perawatan ulkus diabetik yang

dibagi dalam beberapa kelompok. Kelompok 1: Kontrol Negatif (tikus DM yang

diberi perawatan ulkus dengan normal saline/ NaCl 0,9%). Kelompok 2: Kontrol

Positif (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan hidrogel). Kelompok

Perlakuan 1 (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan ekstrak cacing tanah

secara oral pada konsentrasi 100 mg/ml). Kelompok Perlakuan 2 (tikus DM yang

diberi perawatan ulkus dengan ekstrak cacing tanah secara topikal pada dosis 100

mg/kgBB). Kelompok Perlakuan 3 (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan

ekstrak cacing tanah secara oral dan topikal pada konsentrasi 100mg/m dan dosis

100mg/kgBB).

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah: (a) persentase kontraksi luka dan

(b) densitas (kepadatan) akson saraf perifer

3.2 Subyek dan Sample

Sampel penelitian adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar jantan,

berusia 10-12 minggu, berat badan 150-200 gram. Perhitungan besarnya

pengulangan pada sampel adalah sebagai berikut (Hidayat, 2009):

(np-1) – (p-1) ≥ 16 (p: jumlah perlakuan, n: jumlah ulangan), p=5 sehingga

(5n-1) – (5-1) ≥ 16

n ≥ 4,2 Dibulatkan ke atas menjadi 5 pengulangan

3.3 Metode Penelitian

Ekstraksi Pheretima aspergillum

Cacing tanah 500 gram dikeringkan dengan suhu 50o

C kemudian

dihancurkan dengan cara ditumbuk atau dihaluskan dengan blender dan disaring

untuk memisahkan partikel yang relative besar dan tepung bahan. Tepung bahan

yang diperoleh selanjutnya diekstrak dengan metode maserasi (Chang et al.,

2011a). Timbang tepung bahan yang akan diekstrak. Masukkan kedalam baker

glas dan tuangkan pelarut dengan perbandingan (1:3) 1 kg bahan dalam 3 liter

pelarut etanol 70%. Rendam bahan dan diamkan pada suhu kamar selama minimal

2x24 jam kemudian saring bahan menggunakan kertas saring whatman no 40.

Evaporasi untuk menghilangkan sisa pelarut. Oven sisa pelarut yang masih tersisa

pada suhu 40oC hingga benar-benar tidak mengandung pelarut. Hasil ekstraksi

berbentuk pasta sebanyak 36 gram.

Induksi Diabetes Melitus

Tikus diinduksi DM dengan injeksi Streptozotocin (STZ) intraperitonial

single dose 40mg/kgBB dalam pelarut buffer sitrat 0,1 M pH 4.5 setelah

sebelumnya dipuasakan selama 12 jam. Tiga hari setelah injeksi STZ, glukosa

darah diukur melalui vena ekor dengan menggunakan glukometer (Multi-check,

NESCO, Taiwan) dan tikus dengan glukosa darah diatas 200 mg/dL dinyatakan

sebagai diabetik (Zangiabadi et al., 2011). Tikus di tunggu selama 4 minggu

setelah induksi DM untuk proses neuropati (Kappelle et al., 1993)

Pembuatan Ulkus Diabetik

Tikus dianastesi ketamine intraperitoneal dengan dosis 25 mg/kgBB,

kemudian difiksasi dalam posisi pronasi. Bulu daerah punggung dicukur, lalu

5

dilakukan desinfeksi dengan alkohol 70%. Pembuatan ulkus diabetik melalui luka

eksisi berukuran 1,5x1,5 cm pada kulit dengan menggunakan pisau bedah pada

epidermis hingga hipodermis/lapisan subkutan (ulkus derajat 2) (Li et al., 2011).

Perawatan Ulkus Diabetik

Perawatan ulkus diabetik dilakukan 1 kali sehari selama 21 hari (Juranek et

al., 2013). Teknik perawatan secara topikal menggunakan teknik steril dengan

perawatan luka tertutup kasa untuk mencegah terjadinya infeksi. Teknik

perawatan secara oral menggunakan sonde. Pemberian ekstrak topikal

menggunakan konsentrasi 100 mg/ml sedangkan pemberian ekstrak oral

menggunakan dosis 100 mg/kgBB (Chang et al., 2011a; Liu et al., 2013).

Pembuatan Preparat Jaringan Kulit

Tikus dieutanasia dengan inhalasi ether pada hari ke-21. Kulit pada daerah

ulkus dan sekitarnya dieksisi menggunakan pisau bedah mencapai batas lapisan

otot. Jaringan direndam dalam larutan fiksatif formalin 10% selama 24 jam,

selanjutnya dilakukan pembuatan preparat jaringan kulit. Pengeringan dilakukan

untuk menghilangkan air dari potongan jaringan dengan cara merendam berturut-

turut secara bertahap dalam larutan etanol (70% sampai 100%). Larutan kemudian

diganti dengan larutan xylene. Setelah jaringan dipenuhi dengan larutan, jaringan

dimasukkan dalam parafin cair di dalam oven pada suhu 58-600

C. Blok keras

yang berisi jaringan kemudian diiris longitudinal dengan pisau baja atau pisau

kaca mikrotom setebal 10 µm (Junqueira & Carneiro, 2004).

Pengukuran Kontraksi Luka

Ulkus diabetik didokumentasikan menggunakan digital camera 16 Mpixel.

Luas luka yang tidak sembuh setelah perawatan luka selama 21 hari diukur

menggunakan program AutoCAD 2009. Kontraksi luka dihitung dengan

menggunakan rumus: persentase kontraksi luka = [(luas luka awal – luas luka

yang tidak sembuh) / luas luka awal] x 100% (Li et al., 2011).

Penghitungan Densitas Akson

Preparat jaringan kulit dipulas dengan menggunakan impregnasi perak (silver

impregnation) (Switzer, 2000 ; Grant, Hollander, & Aldskogius, 2004). Jaringan

terlebih dahulu dibasahi dengan aquades, kemudian homogenasi 5 tetes reagen

potassium permanganate dengan 5 tetes reagen acid activation buffer dan teteskan

selama 5 menit kemudian bilas dengan aquades. Untuk seterusnya teteskan reagen

sesuai urutan kemudian bilas dengan aquades. Reagen tersebut adalah oxalic acid

selama 3 menit, iron ammonium sulphate selama 2 menit, ammoniacal buffer

selama 2 menit, formic aldehyde buffer selama 2 menit, sodium thiosulphate

selama 4 menit, kemudian bilas dengan air mengalir selama 5 menit. Dehidrasi

dengan segera, bersihkan dengan xylol, dan rekatkan (mounting) dengan balsam

serta tutup dengan coverslip. Hasil pemulasan impregnasi perak adalah berwarna

hitam untuk serabut saraf (nervous fibers) (Diapath, 2013). Migrasi serabut saraf

diamati disekitar folikel rambut (Gagnon et al., 2011). Slide kulit hasil

pemeriksaan Silver diamati menggunakan program Scan Dot Slide OlyVIA.

Kemudian jumlah akson dihitung dengan pembesaran 20x obyektif pada tiap slide

dari masing-masing tikus sebanyak 10 lapang pandang kemudian dirata-rata.

Prosedur Pengumpulan dan Analisa Data

Hasil pengukuran tikus kontrol dan perlakuan dianalisa secara statistik dengan

menggunakan program SPSS 18.0 for Windows XP dengan tingkat kebermaknaan

0,05 (p=0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05). Langkah-langkah uji

6

hipotesis adalah uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-way ANOVA

dan Post hoc test (Dahlan, 2004).

IV. PELAKSANAAN PROGRAM

4.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fisiologi dan Patologi

Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Laboratorium Ekologi

Fakultas MIPA Universitas Brawijaya, serta Laboratorium Teknik Kimia

Politeknik Malang, dengan lama penelitian selama 4 bulan.

4.2 Tahapan Pelaksanaan/Jadwal Faktual Pelaksanaan

Kegiatan Waktu

Bulan 1 Bulan 2 Bulan 3 Bulan 4

Mengurus ethical clearance

Mengurus perijinan laboratorium

Belanja alat dan bahan penelitian

Perawatan dan adaptasi tikus

Proses ekstraksi cacing tanah

Induksi Diabetes Melitus

Pembuatan ulkus diabetik

Perawatan ulkus diabetik

Histo PA jaringan kulit

Pengukuran variabel

Analisa data

Penyusunan laporan akhir

4.3 Instrumen Pelaksanaan

Ekstraksi Pheretima aspergillum

Alat: baker glas, timbangan analitik, kertas saring whatman no.40, oven,

blender. Bahan: cacing tanah (Pheretima aspergillum), etanol 70%.

Induksi Diabetes Melitus

Alat: spuit 1 cc, handscoon, blood lancet, glukometer, timbangan berat badan.

Bahan: Streptozotocin (STZ), pelarut buffer sitrat 0,1 M pH 4.5.

Pembuatan Ulkus Diabetik

Alat: meja operasi kecil, set bedah minor, alat cukur, duk steril, penggaris,

timbangan berat badan. Bahan: anastesi ketamine, alkohol 70%.

Perawatan Ulkus Diabetik

Alat: spuit 3 cc, set rawat luka steril (handscoon, kasa, kom, pinset anatomis

dan sirugis, lidi kapas, gunting anatomis), masker, bengkok, underpad, sonde.

Bahan: normal salin (NaCl 0,9%), hidrogel, ekstrak Pheretima aspergillum

Pembuatan Preparat Jaringan

Alat: meja operasi kecil, peralatan bedah minor, botol kecil tertutup,

mikrotom, obyek glas. Bahan: anastesi ether, jaringan kulit, formalin 10%,

alkohol 70%, 90%, 100%, xylene, parafin cair.

Pengukuran Kontraksi Luka

Alat: digital camera 16 Mpixel, penggaris, program AutoCAD 2009.

Penghitungan Densitas Akson

Alat: program Scan Dot Slide OlyVia, coverslip. Bahan: silver staining kit,

xylol, balsam

7

4.4 Rekapitulasi Rancangan dan Realisasi Biaya

No Uraian Kegiatan Total Anggaran

(Rp)

Total Realisasi

(Rp)

1 Proses ekstraksi 300.000 440.000

2 Penyediaan sample dan perawatan 2.250.000 2.227.200

3 Induksi Diabetes Melitus 2.250.000 2.630.227

4 Perawatan ulkus diabetes 1.500.000 1.360.350

5 Pembuatan preparat 1.500.000 1.341.000

6 Pengukuran densitas akson 3.200.000 3.003.933

7 Lain – lain 200.000 195.000

Total (Pemasukan dan Pengeluaran) 11.200.000 11.197.710

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Hasil Penelitian

Hasil Pengukuran Persentase Kontraksi Luka

Tabel 1. Persentase Kontraksi Luka

Kelompok Mean + SD

1 Kontrol (-) 81,30 + 8,02

2 Kontrol (+) 90,80 + 4,09

3 Ekstrak Topikal

100 mg/ml

91,66 + 5,25

4 Ekstrak Oral 100

mg/kgBB

91,10 + 2,68

5 Ekstrak Topikal-

Oral 100 mg/ml

dan 100 mg/kgBB

93,52 + 4,71

Grafik 1. Menunjukkan rata-rata persentase kontraksi luka pada tikus dengan

ulkus diabetik. Uji ANOVA didapatkan nilai p=0,013 (p<0,05) yang

menunjukkan ada beda antar kelompok. Uji Post Hoc Bonferroni menunjukkan

perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol (-) dengan kelompok

perlakuan yang diberikan ekstrak topikal-oral (p=0,015).

Hasil Penghitungan Densitas Akson

Tabel 2. Jumlah Densitas Akson

Kelompok Mean + SD

1 Kontrol (-) 0 + 0

2 Kontrol (+) 0,2 + 0,45

3 Ekstrak Topikal

100 mg/ml

15,6 + 4,78

4 Ekstrak Oral 100

mg/kgBB

4,8 + 1,92

5 Ekstrak Topikal-

Oral 100 mg/ml

dan 100 mg/kgBB

6,8 + 3,63

Grafik 2. Jumlah Densitas Akson

Grafik 1. Persentase Kontraksi Luka

8

Pada pemulasan impregnasi perak (silver impregnation) dan pengamatan

dengan program Scan Dot Slide OlyVIA pada perbesaran 20x obyektif dapat

dihitung jumlah densitas (kepadatan) akson pada jaringan kulit (Gambar 2).

Grafik 2. Menunjukkan rata-rata jumlah densitas akson. Uji ANOVA didapatkan

nilai p=0,000 (p<0,05) yang menunjukkan ada beda antar kelompok. Uji Post Hoc

Games-Howell menunjukkan perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol

(kontrol negatif dan kontrol positif) dengan kelompok perlakuan yang diberikan

ekstrak topikal dan ekstrak oral.

5.2 Pembahasan

Efektifitas Pemberian Ekstrak Cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam

Mempercepat Penyembuhan Ulkus Diabetik

Pada penelitian ini, pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)

dapat meningkatkan persentase kontraksi luka secara bermakna (p=0,013). Hasil

penelitian ini membuktikan bahwa terjadi proses penyembuhan pada ulkus

diabetik. Penyembuhan luka secara makroskopis ditandai dengan peningkatan

kontraksi luka (Li et al., 2011). Pada penelitian ini perbedaan secara bermakna

terjadi antara kelompok kontrol (-) dengan kelompok perlakuan topikal-oral. Hal

ini menunjukkan pemberian ekstrak secara oral memiliki efek sistemik yang

mendukung pemberian ekstrak secara topikal terhadap proses akselerasi

penyembuhan ulkus diabetik. Efektifitas Pemberian Ekstrak Cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam

Menginduksi Densitas Akson Saraf Perifer

Pada penelitian ini, pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)

dapat meningkatkan densitas akson saraf perifer secara bermakna (p=0,000). Hasil

penelitian ini membuktikan bahwa terjadi proses proliferasi dan migrasi sel

schwann pada daerah ulkus diabetik. Proliferasi dan migrasi sel schwan

merupakan proses penting yang mendukung regenerasi akson saraf perifer.

Ekstrak Pheretima aspergillum menstimulasi migrasi sel schwan melalui jalur

mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Chang et al., 2011a). Ekstrak

Pheretima aspergillum mampu menginduksi insulin-like growth factor-1 (IGF-1)

yang merupakan hormon polipeptide yang disintesa oleh proliferasi sel schwan

sebagai respon terhadap growth hormone untuk menstimulasi pertumbuhan saraf

perifer (Chang et al., 2011b).

Gambar 2. Densitas akson

saraf perifer pada jaringan

kulit dengan pemulasan

perak. Kontrol negatif (1),

Kontrol Positif (2),

Perlakuan topikal 100 mg/ml

(3), Perlakuan oral 100

mg/kgBB (4), Perlakuan

topikal-oral 100 mg/ml dan

100 mg/kgBB (5). Scale

bars=20µm

9

V. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah:

Pemberian ekstrak tanah (Pheretima aspergillum) dapat meningkatkan

persentase kontraksi luka dan densitas akson saraf perifer pada tikus putih

jantan (Rattus novergicus) galur Wistar yang diinduksi Diabetes Melitus.

6.2 Saran

Saran dari penelitian ini adalah:

1. Diperlukan penelitian lebih lanjut terkait keadaan densitas akson saraf perifer

hingga fase remodelling untuk memperkuat hasil penelitian ini.

2. Perlu dilakukan eksplorasi dosis dan penelitian lebih lanjut terkait formulasi

ekstrak cacing (Pheretima aspergillum) secara topikal, oral, dan topikal-oral

untuk mengetahui terapeutic window terutama pada pemberian oral.

3. Penelitian pengembangan diperlukan terkait perawatan ekstrak cacing tanah

(Pheretima aspergillum) pada jenis ulkus diabetik dengan komplikasi infeksi

atau gangrene yaitu pada ulkus derajat 3 atau derajat 4.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Bradbury, Sarah & Patricia Price. 2011. The Impact of Diabetic Foot Ulcer Pain

on Patient Quality of Life. Wound UK Vol 7 No.4

Brem, Harold & Marjana Tomic-Canic. 2007. Cellular and Molecular Basis of

Wound Healing in Diabetes. The American Society for Clinical Investigation

Vol. 177 (5):1219-1222

Chang, Yung-Ming et al. 2011a. RSC96 Schwann Cell Proliferation and Survival

Induced by Dilong through P13K/Akt Signaling Mediated by IGF-1. Evidence-

Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 216148. Hindawi

Publishing Corporation

Chang, Yung-Ming et al. 2011b. Schwann Cell Migration Induced by Earthworm

Extract via Activation of PAs and MMP2/9 Mediated through ERK1/2 and p38.

Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 395458.

Hindawi Publishing Corporation

Chen, Chao-Tsung et al. 2010. Earthworm Extracts Facilitate PC12 Cell

Differentiation and Promote Axonal Sprouting in Peripheral Nerve Injury. Am.

J. Chin. Med. 38, 547. DOI: 10.1142/S0192415X10008044

Chen, Zu-Lin,Wei-Ming Yu, & Sidney Strickland. 2007. Peripheral Regeneration.

The Annual Review of Neuroscience 30:209-33. Rockefeller University

Dahlan, S. M. 2004. Seri Statistik: Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan; Uji

Hipotesis dengan Menggunakan SPSS Program 12 Jam. Jakarta: Arkans

Diapath S.p.A. 2013. Diapath Special Stains Handbook.

http://www.diapath.com/diapath-special-stains.aspx diakses pada tanggal 10

Mei 2013.

Frykberb Robert G. 2002. Risk Factor, Pathogenesis and Management of

Diabetic Foot Ulcers. Lowa: Des Moines University

Gagnon, Vicky et al. 2011. Hair Follicles Guide Nerve Migration In Vitro and In

Vivo in Tissue-Engineered Skin. Journal of Investigative Dermatology 131,

1375–1378; doi:10.1038/jid.2011.34

10

Grant G, Hollander H, & Aldskogius H. 2004. Suppressive Silver Methods : A

Tool For Identifying Axotomy-Induced Neuron Degeneration. Brain Res Bull.

Jan 15;62(4):261-9

Hastuti. 2008. Faktor-Faktor Risiko Ulkus Diabetika Pada Penderita Diabetes

Melitus. Semarang :Universitas Diponegoro. http://eprints.undip.ac.id/18866/

diakses 7 Oktober 2012

Hidayat AAA. 2009. Metode Penelitian Keperawatan dan Teknik Analisis Data.

Jakarta: Salemba Medika

Junqueira, Luiz Carlos & Jose Carneiro. 2004. Histologi Dasar: Teks dan Atlas.

Jakarta: EGC

Juranek, Judyta K et al. 2013. RAGE Deficiency Improves Postinjury Sciatic

Nerve Regeneration in Type 1 Diabetic Mice. American Diabetes Association,

Vol 62 : 931-934

Kappelle et al. 1993. Amelioration by The Ca2+

Antagonist, Nimodipine of An

Existing Neuropathy in The Streptozotocin-Induced, Diabetic Rats. J

Pharmacol 108: 780-785

King, H., Aubert, R.E., & Herman, W.H. 2003. Diabetes Care. 21:1414

Li, Kun et al. 2011. Tannin Extract From Immature Fruits of Terminalia Chebula

Fructuz Retz. Promote Cutaneous Wound Healing In Rats. BMC

Complementary and Alternative Medicine. 11:86

Liu, Chung Hsiang et al. 2013. Effect of Oral Administration of Pheretima

Aspergillum (Earthworm) In Rats With Cerebral Infarction Induced By

Middle-Cerebral Artery Occlusion. African Journal of Traditional,

Complementary & Alternative Medi Vol. 10 Issue 1, p66

Muangman, P et al. 2009. Nerve growth factor accelerates wound healing in

diabetic mice. Wound Repair and Regeneration,12:44–52

Nugrogo, Agung E. 2006. Hewan Percobaan Diabetes Melitus : Patologi Dan

Mekanisme Aksi Diabetogenik. Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi,

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada

Prihatman, Kemal. 2000. Budidaya Cacing Tanah. Proyek Pengembangan

Ekonomi Masyarakat Pedesaan, Bappenas. http://www.ristek.go.id diakses 27

Agustus 2012

Santoso, Marcus Adrian. 2002. Identifikasi Ekstrak Cacing Tanah Lumbricus

rubellus dan Pheretima aspergillum yang Memiliki Efek Antipiretik pada Tikus

Putih. FMIPA-IPB. Pdf

Sapico, F. L. 2007. Food Ulcer in Patients with Diabetes Mellitus. Journal of

American Podiatric Medical Association Vol 79, Issue 482-485

Sofyan, Sashadi. 2007. Karakteristik Dan Pertumbuhan Cacing Tanah Lokal

Pada Media Mengandung Limbah Tanaman Pisang Serta Jerami Padi.

Universitas Brawijaya Malang

Switzer R.C. 2000. Application of Silver Degeneration Stains For Neurotoxicity

Testing. Toxicol Pathol. Jan-Feb;28(1):70-83.

Waspadji S. 2006. Komplikasi Kronik Diabetes : Mekanisme Terjadinya,

Diagnosis dan Strategi pengelolaan. Ilmu Penyakit Dalam, Jilid III, Edisi

keempat, Jakarta: Penerbit FK UI

Zangiabadi, Nasser et al. 2011. Effects of Melatonin in Prevention of Neuropathy

in STZ-Induced Diabetic Rats. American Journal of Pharmacology and

Toxicology 6 (2): 59-67, ISSN 1557-4962