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OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN DE UN PREPARADO LÍQUIDO COMO
PROMOTOR DE CRECIMIENTO DE CULTIVO DE TOMATE (Solanum
lycopersicum L.) EMPLEANDO LA BACTERIA Gluconacetobacter diazotrophicus
Propuesta Tesis Doctoral
Estudiante
GLORIA MARIA RESTREPO FRANCO
Director
ÓSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO, Ph.D.
Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria
Grupo de Investigaciones Biológicas (GIBI)
Universidad de Caldas
Instituto de Biotecnología Agropecuaria
Doctorado en Ciencias Agrarias
Manizales, 2010
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RESUMEN
En los últimos 50 años, la producción agropecuaria aumentó aproximadamente 10 veces,
incrementándose el consumo de fertilizantes químicos nitrogenados, los cuales son responsables del
80% del nitrógeno que se vuelca en el ambiente por actividades humanas. Por lo tanto se ha
generado la necesidad de fomentar el uso de productos agrícolas más seguros y eficientes. En este
campo se ha reconocido el potencial de microorganismos endófitos que promueven el crecimiento
de las plantas mediante mecanismos de liberación de hormonas y fijación biológica de nitrógeno,
convirtiéndose en la base de biofertilizantes que permitirán disminuir el empleo de fertilizantes
químicos. El proyecto propuesto contempla obtener un producto promotor del crecimiento de
diferentes cultivos de hortalizas colombianas de importancia biológica a base de la bacteria
Gluconacetobacter diazotrophicus. Para ello se realizarán aislamientos nativos de esta bacteria, se
definirán las mejores condiciones de cultivo líquido, se optimizará el medio de cultivo para
maximizar la producción de biomasa celular, nitrogenasa y ácido indolacético a partir de la bacteria
mencionada, se estudiará la cinética de la fermentación líquida y se llevarán a cabo ensayos en
campo. Por lo tanto con esta propuesta se pretende generar conocimiento para en el futuro
desarrollar un paquete tecnológico que permita consolidar el mercado de los inoculantes
microbianos y ofrecer a los agricultores una opción más segura y eficiente. La promoción de los
bioinsumos no sólo contribuirá a incrementar el ingreso de sus productores y su calidad de vida,
sino que con ello también se dará cabida a la consecución de una mayor competitividad de todo el
sector agropecuario en el mercado internacional, al implementar sistemas productivos limpios. El
proyecto tendrá un impacto social importante al contribuir al desarrollo de una solución ambiental y
tecnológica para el uso de un inoculante microbiano a base de Gluconacetobacter diazotrophicus en
cultivos de hortalizas de importancia económica. El desarrollo de este proyecto posibitará la
formación de talento humano, un investigador a nivel de doctorado y dos estudiantes de
especialización, y un estudiante de maestría con las competencias en Investigación y Desarrollo,
obtención y apropiación de información sobre metodologías, procesos microbianos, aplicación de
bioproductos en el campo.
Palabras clave: Gluconacetobacter diazotrophicus, bacterias endófitas, promotor de crecimiento,
fijación biológica de nitrógeno, hortalizas.
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Tabla de contenido
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 5
2. JUSTIFICACIÓN........................................................................................................................ 7
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 9
3.1. OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 9
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 9
4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 10
4.1. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA BACTERIA Gluconacetobacter
diazotrophicus ............................................................................................................................... 10
4.1.1. Muestreo .................................................................................................................... 10
4.1.2. Aislamiento de la bacteria G. diazotrophicus ........................................................... 10
4.1.3. Caracterización bioquímica de aislamientos ............................................................. 11
4.1.4. Caracterización molecular ......................................................................................... 11
4.1.5. Selección de aislamientos de G. diazotrophicus ....................................................... 12
4.1.6. Preservación de aislamientos seleccionados ............................................................. 13
4.2. OPTIMIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE
BIOMASA CELULAR, NITROGENASA Y ÁCIDO INDOLACÉTICO OBTENIDOS A
PARTIR DE LA BACTERIA Gluconacetobacter diazotrophicus ............................................... 13
4.2.1. Activación y producción del inóculo de la bacteria G. diazotrophicus ..................... 13
4.2.2. Condiciones del medio de cultivo ............................................................................. 13
4.2.3. Identificación de los componentes más relevantes del medio de cultivo .................. 14
4.2.4. Determinación de las concentraciones óptimas de los componentes del medio de
cultivo 14
4.3. ESTUDIO CINÉTICO DEL CULTIVO SUMERGIDO DE LA BACTERIA
Gluconacetobacter diazotrophicus PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA CELULAR,
NITROGENASA Y ÁCIDO INDOLACÉTICO .......................................................................... 15
4.3.1. Condiciones de fermentación .................................................................................... 15
4.3.2. Procedimientos analíticos y determinación de la producción de biomasa y ácido
indolacético, de la actividad nitrogenasa y del consumo de sustrato ........................................ 16
4.4. EVALUACIÓN DE LA actividad DE LA BACTERIA Gluconacetobacter diazotrophicus
COMO PROMOTORA DEL CRECIMIENTO DEL CULTIVO DE TOMATE (Solanum
lycopersicum L.) ............................................................................................................................ 16
5. RESULTADOS ESPERADOS ................................................................................................. 18
5.1. GENERACIÓN DE NUEVO CONOCIMIENTO ............................................................ 18
5.2. FORTALECIMIENTO DE LA COMUNIDAD CIENTÍFICA COLOMBIANA ............ 18
5.3. APROPIACIÓN SOCIAL/PÚBLICA DEL CONOCIMIENTO ...................................... 18
5.4. IMPACTOS ESPERADOS A PARTIR DEL USO DE LOS RESULTADOS ................ 18
6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES .................................................................................... 20
7. PRESUPUESTO ....................................................................................................................... 21
4
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 22
ANEXO A ......................................................................................................................................... 24
ANEXO B ......................................................................................................................................... 25
ANEXO C ......................................................................................................................................... 27
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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La gran demanda de alimentos a nivel mundial requiere un aumento significativo de la
productividad de los cultivos, lo que ha conllevado a un incremento de 10 veces en la producción
agropecuaria en los últimos 50 años; trayendo como consecuencia el aumento en el consumo de
fertilizantes químicos (Solari, 2002). La utilización de fertilizantes químicos presenta varias
desventajas. En primer lugar, para su síntesis se emplean combustibles fósiles (Allen, 2003;
Sánchez et al., 2009); éstos son recursos no renovables, responsables de grandes problemas
medioambientales como el cambio climático. Los fertilizantes nitrogenados generan nitratos
contaminantes de aguas superficiales y profundas (eutrofización) para uso humano y animal, y
óxido nitroso que contamina el aire, contribuyendo al calentamiento global y la destrucción de la
capa de ozono (Solari, 2002). La liberación de nitrógeno en el ambiente puede alterar el crecimiento
de las especies y reducir su diversidad desencadenando el aumento de plagas al provocar
desequilibrios metabólicos en los cultivos de origen nutricional. Finalmente, el proceso de
producción de fertilizantes químicos es muy costoso; por ejemplo, se necesita una tonelada de
petróleo para producir una tonelada de un fertilizante nitrogenado sintético como la urea. Estas
desventajas han suscitado preocupación en círculos académicos, entidades gubernamentales, ONG’s
e instituciones internacionales.
En los últimos años ha surgido la necesidad de producir alimentos orgánicos que tienen como
prioridad ser saludables; además, en su producción se emplean tecnologías que protegen el medio
ambiente debido al menor uso de energía y sustancias de origen fósil (Sánchez et al., 1996 ). Por
ello, en Colombia y en el mundo se han implementado regulaciones para certificar los productos
orgánicos, incentivar su producción y determinar los requisitos que deben cumplir estos alimentos
(CEE, 1991) (Minagricultura, 2006). El tomate es uno de los cultivos de hortalizas que debido a su
susceptibilidad al ataque de diferentes patógenos y plagas requiere del uso frecuente de plaguicidas
y fertilizantes, trayendo como consecuencia riesgos serios de salud por la exposición permanente a
los químicos, ocasionando además deterioro del medio ambiente; por lo tanto es uno de los cultivos
que demanda el uso de insumos biológicos con el fin de mejorar su estado fitosanitario mediante la
implementación de Buenas Prácticas Agrícolas, y la búsqueda del aumento de mayores estándares
de productividad y rentabilidad del cultivo. Para dicho aumento de la productividad, el uso eficiente
de inoculantes microbianos se constituye en una importante alternativa (Zambrano y Riaño, 2008).
Uno de los principales retos que enfrenta el sector rural colombiano es la búsqueda del aumento de
mayores estándares de productividad y rentabilidad de los cultivos a nivel nacional que permitan
tasas de significativas y sostenidas de crecimiento anual del PIB. Para dicho aumento de la
productividad, el uso eficiente de inoculantes microbianos se constituye en una importante
alternativa (Zambrano y Riaño, 2008). De hecho, la producción de bioinsumos y extractos vegetales
en Colombia (según la clasificación de productos agropecuarios del ICA) ha venido abarcando un
mayor mercado dentro del sector agropecuario nacional, tanto así que actualmente existen 71
empresas registradas y avaladas por el ICA para desempeñar esta labor. A nivel nacional la
producción de estos bioinsumos se concentra en inoculantes biológicos con un 27,59% y en agentes
biológicos de control de plagas e inóculos microbiológicos para compostaje con un 20,59%,
mientras que la menor producción se presenta en los productos bioquímicos de control de plagas
con un 6,9%.
Al analizar los costos en los que incurren las empresas para producir sus bioinsumos y mantenerlos
en óptimas condiciones, se evidencian que sus puntos críticos se encuentran en la metodología de
producción y en el almacenamiento de los productos; es decir, que gran parte de los costos
operativos de la empresa se concentran en estos dos rubros, mientras que el empacado no es un
factor tan influyente dentro de la matriz de costos. Al respecto, el 70% de las empresas evidencia
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que la tendencia de sus costos operativos es creciente, y un 54% percibe que sus ciclos de
producción son muy prolongados. Lo anterior en razón a que estas empresas son familiares con
procesos de producción mayoritariamente manuales y con bajo nivel de desarrollo tecnológico e
innovación (Zambrano y Riaño, 2008). Ha surgido, por tanto, la necesidad de vincular estas
empresas nacientes con universidades y centros de investigación a fin de mejorar estos procesos de
producción para que cumplan con las buenas prácticas de manufactura, asegurar la calidad de los
inoculantes, aumentar su estabilidad y vida útil, incrementar la efectividad de los productos en el
campo, desarrollar nuevos productos microbianos, entre otros aspectos tecnológicos.
En el mercado colombiano existen bioinsumos nacionales o importados, formulados a base de
microorganismos procedentes de ceparios o de aislamientos foráneos no adaptados al trópico; una
proporción menor de estas empresas sí han desarrollado productos a base de cepas nativas, pero
éstas corresponden a microorganismos convencionales que generalmente crecen en la rizosfera y en
las raíces como Rhizobium, Azospirillum, Azotobacter y micorrizas vesículo arbusculares
complementadas con bacterias lácticas y levaduras. Sin embargo, se requiere una mayor utilización
de aislamientos nativos de microorganismos alternativos para la producción de inoculantes
microbianos que tengan un modo de acción más efectivo y que sean más eficientes debido a su
adaptación a las condiciones de nuestros ecosistemas.
Finalmente, se requiere asegurar la calidad de este tipo de bioinsumos para incrementar la
competitividad de esta industria en nuestro país. Por tanto, se hace necesario aislar y seleccionar
microorganismos autóctonos que sean eficientes in vitro e in vivo, y contribuir así a definir
parámetros de producción que cumplan con las buenas prácticas de manufactura y con unos
controles de calidad muy rigurosos que aseguren la efectividad de los productos en campo.
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2. JUSTIFICACIÓN
Considerando la necesidad de contar con insumos agrícolas menos contaminantes, más eficientes en
el campo, más económicos y que no tengan origen fósil, se requiere el avance de investigación y
desarrollo en inoculantes microbianos obtenidos a partir de microorganismos nativos. La presente
propuesta se orienta a desarrollar un preparado microbiano orientado a cultivos de hortalizas de
importancia económica en Colombia, que permita promover el crecimiento de plantas de tomate
mediante la fijación de nitrógeno y producción de ácido indolacético. La bacteria
Gluconacetobacter diazotrophicus despliega las características antes mencionadas, por lo que se
plantea su empleo como base de un preparado microbiano para promover el aumento de la
productividad de las hortalizas en nuestro país. Esta bacteria se encontró en cultivos de caña de
azúcar en Brasil (Cavalcante y Döbereiner, 1988), y ha servido como modelo pionero de bacteria
endófita fijadora de nitrógeno y productora de fitohormonas; estas características han permitido
abrir un nuevo capítulo en la investigación sobre fijación de nitrógeno en plantas no leguminosas.
De hecho, la aplastante mayoría de productos comerciales para la fertilización de cultivos en
Colombia se basan en microorganismos no endofíticos (ICA, 2008; 2010). Adicionalmente, la
mayoría de investigaciones en microorganismos eficientes se ha dirigido al estudio de
microorganismos fijadores de nitrógeno en leguminosas. Por esta razón, es relevante llevar a cabo
investigación y desarrollo con inoculantes microbianos endófitos en cultivos diferentes a las
leguminosas, a fin de ampliar el espectro de aplicaciones y aumentar la efectividad de los mismos.
Desde hace más de 10 años, se ha reportado a G. diazotrophicus como la bacteria responsable, o al
menos una de las más importantes, de la fijación biológica de nitrógeno en la caña de azúcar. Sin
embargo, desde el descubrimiento de esta bacteria, y a pesar de que ha sido encontrada en
asociación endófita con diferentes plantas, son escasos los estudios desarrollados para conocer su
efecto sobre el crecimiento vegetal en hospederos diferentes a la caña de azúcar. En este punto, se
han realizado varias investigaciones enfocadas al aislamiento de cepas de G. diazotrophicus a partir
de cultivos como café, arroz, papa dulce, entre otros, así como a su posterior caracterización
(Madhaiyan et al., 2004a). Se postula que esta bacteria puede ser potencialmente responsable de la
fijación de nitrógeno en estos cultivos, por lo que se evidencia la necesidad de desarrollar
preparados microbianos basados en G. diazotrophicus y evaluar su efecto en campo.
Adicionalmente, se requiere evaluar la capacidad de este microorganismo para producir auxinas.
Finalmente, es necesario realizar estudios para obtener un producto biológico como el mencionado
a partir de un microorganismo nativo adaptado a las condiciones ambientales de la región, asociado
a la ecología microbiana del cultivo y que incremente el crecimiento, desarrollo y rendimiento de
cultivos de importancia económica. De esta manera, se contribuye a disminuir la dependencia de
productos importados que no siempre se han desarrollado para las condiciones específicas de
nuestro país.
Esta propuesta pretende utilizar herramientas modernas de la microbiología industrial para
optimizar las condiciones de la fermentación líquida requerida para la obtención de la bacteria
objeto de estudio. Lo anterior permitirá explorar vías para una utilización más eficiente de los
nutrientes del medio de cultivo y la definición de las condiciones de fermentación. Así, se generará
el conocimiento necesario para la futura implementación de la producción industrial de un
inoculante microbiano basado en G. diazotrophicus.
Desde el punto socio-económico, la ejecución del presente proyecto contribuirá a la consolidación
del mercado de los inoculantes microbianos en Colombia ofreciendo a los agricultores y
empresarios del campo una opción más eficiente y amigable con el medio ambiente. La promoción
de los bioinsumos no sólo permitirá incrementar el ingreso de sus productores, sino que también
hará posible alcanzar una mayor competitividad de todo el sector agropecuario en el mercado
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internacional al implementar sistemas productivos limpios. El proyecto tendrá un impacto social
importante al posibilitar, mediante nuevos productos biológicos con mejor desempeño, el
mejoramiento de la calidad de vida de los cultivadores de hortalizas así como de las comunidades
rurales asociadas a ellos, igualmente, permitirá el mejoramiento de la seguridad alimentaria de la
población al contar con alimentos de menor precio y seguros. Además, el desarrollo de la
agroindustria de los inoculantes microbianos mejorará la situación de empleo de los sectores
económicos relacionados.
A través de este proyecto se formará una investigadora a nivel de doctorado, la cual contribuirá
posteriormente a la consolidación del Grupo de Investigaciones Biológicas (GIBI) de la
Universidad Católica de Manizales. Adicionalmente, se favorecerá la participación de estudiantes
del programa de Especialización en Microbiología Industrial vinculándolos a la ejecución de
actividades puntuales del proyecto. Con el talento humano formado, se favorecerá la consolidación
de una masa crítica de investigadores que impulsen el desarrollo de la investigación en
biotecnología y la creación de nuevos programas como la Maestría en Microbiología
Agroindustrial. Adicionalmente, se promoverá el trabajo interinstitucional con otras entidades del
Sistema Nacional de Ciencia y Tecnología como la Universidad de Caldas a través de su Instituto
de Biotecnología Agropecuaria.
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3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Obtener y evaluar un preparado líquido como promotor de crecimiento para cultivos de tomate
(Solanum lycopersicum L.) empleando la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Llevar a cabo el aislamiento y caracterización de la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus
a partir de cultivos de la región.
Realizar la optimización del medio de cultivo para la producción de biomasa celular de la
bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus con actividad nitrogenasa y capacidad de producir
ácido indolacético.
Llevar a cabo el estudio cinético del cultivo sumergido de la bacteria Gluconacetobacter
diazotrophicus con actividad nitrogenasa y capacidad de producir ácido indolacético.
Evaluar la capacidad de la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus como promotora del
crecimiento de cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.).
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se desarrollará en cuatro etapas: inicialmente se realizará aislamiento,
caracterización morfológica, bioquímica y molecular de colonias de Gluconacetobacter
diazotrophicus procedentes de cultivos de caña panelera y tomate. Posteriormente se llevará a cabo
la optimización de los medios de cultivo para la producción de biomasa celular, nitrogenasa y ácido
indolacético obtenidos a partir de la bacteria G. diazotrophicus, seguido del estudio cinético del
cultivo sumergido de este microorganismo para la producción de biomasa celular, nitrogenasa y
ácido indolacético; finalmente se evaluará la capacidad de G. diazotrophicus como promotora de
crecimiento del cultivo de tomate.
4.1. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA BACTERIA Gluconacetobacter
diazotrophicus
4.1.1. Muestreo
Durante el periodo de julio a octubre de 2010, se realizarán dos muestreos a partir de plantas de
caña panelera. Los muestreos se realizarán en dos fincas de Supía ubicadas en la zona central, con
una altura sobre el nivel del mar 1183 metros y temperatura promedio 26°C (Alcaldía del Municipio
de Supía, 2010). Además se tomarán muestras de la granja Tesorito de la Universidad de Caldas a
partir de un cultivo de tomate (Lycopersicum sculentum). Paralelamente se realizará análisis físico-
químico de los suelos donde se realicen los muestreos; éstos serán procesados en el Laboratorio de
Suelos de la Universidad de Caldas.
El muestreo en caña se realizará en cultivos donde no se hayan aplicado agroquímicos. Para el
efecto, se reunirá información de la fuente primaria mediante encuesta sobre la variedad del cultivo,
edad, manejo de plagas y arvenses, entre otros aspectos (ANEXO A). La toma de las muestras se
realizará al azar, en zig-zag con una distancia de 10-20 m entre plantas para un total de 10 plantas
por finca; el muestreo consistirá en la recolección de trozos de tallos y raíces de aproximadamente 3
a 4 cm de longitud y de suelo de la rizosfera. Se procederá de igual manera para el tomate, tomando
las muestras de tres parcelas de la Granja Tesorito de la Universidad de Caldas.
Las muestras se empacarán en bolsas plásticas y serán transportadas en neveras de icopor con hielo
al Laboratorio de Microbiología Agroindustrial del Instituto de Investigación en Microbiología y
Biotecnología Agroindustrial (IMBA) de la Universidad Católica de Manizales.
4.1.2. Aislamiento de la bacteria G. diazotrophicus
Inicialmente se realizará un ensayo con el fin de definir la metodología de procesamiento de las
muestras, en el cual se evaluarán tres métodos de desinfestación de las muestras de raíces y tallos;
se seleccionará el método que permita el aislamiento del microorganismo de interés (Tabla 1).
Las muestras de raíces y tallos desinfestados se pesarán y homogenizarán en una solución estéril de
sacarosa al 1%, empleando un mortero estéril para las raíces y una licuadora para los tallos. Se
empleará un volumen de diluyente suficiente para obtener una dilución 1/10, y se continuarán
realizando diluciones seriadas hasta 10-7
. En el caso del suelo, se diluirá 10 g del material en 90 mL
de solución salina estéril para dilución (ANEXO B) y se llevará a agitación orbital durante una
hora. A continuación se continuarán realizando diluciones seriadas hasta 10-7
.
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Tabla 1. Métodos de desinfestación de muestras de raíz y tallo.
El procedimiento para la obtención de aislamientos de G. diazotrophicus se basará en el reportado
por Cavalcante y Dobereiner (1988), con modificaciones tendientes a mejorar la recuperación de la
bacteria. Se inocularán alícuotas de 500 µL de cada dilución por duplicado en cajas de Petri que
contengan el agar LGI que se llevarán a incubación a 30°C por 4 a 6 días. Después del periodo de
incubación, el crecimiento bacteriano de color amarillo obtenido se traspasará a cajas con agar LGI,
agar papa y agar LGI ácido acético suplementado con extracto de levadura y ciclohexamida, estos
cultivos en caja de Petri serán incubados a 30 °C de 6 a 7 días. La morfología de las colonias
recuperadas será comparada con la cepa de referencia G. diazotrophicus PAL-5 (ATCC 49037), la
cual será adquirida en el banco de cepas de la ATCC (American Type Culture Collection, Virginia,
USA).
Las colonias que crezcan en estos medios serán seleccionadas morfológicamente según su color,
tamaño, margen, elevación y brillo. Las colonias se purificaran transfiriéndolas tres veces
consecutivas en los medios correspondientes de donde se aislaron y se les asignará un número
consecutivo dado en el laboratorio.
4.1.3. Caracterización bioquímica de aislamientos
Los aislamientos presuntivamente identificados como G. diazotrophicus mediante el medio LGI
serán caracterizados empleando una serie de pruebas bioquímicas como coloración de Gram,
movilidad, flagelación, reducción de nitratos, catalasa, oxidasa, hidrólisis de gelatina, oxidación de
etanol, producción de pigmento café en agar GYC (glucosa, extracto de levadura, carbonato
cálcico), crecimiento en diferentes fuentes de carbono, crecimiento en aminoácidos y crecimiento
en ácidos orgánicos (ANEXO C). En esta identificación se tendrá como patrón la cepa de referencia
G. diazotrophicus PAL-5 (ATCC 49037).
4.1.4. Caracterización molecular
Para la identificación de diferentes cepas de G. diazotrophicus se desarrollarán ensayos de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) basados en la amplificación de un
fragmento específico de gen de la subunidad 16S del ARNr de acuerdo con la metodología
empleada por Madhaiyan et al.,(2004b). Se emplearán los primers AC (5’-CTG TTT CCC GCA
Método 1 Método 2 Método 3
(Cavalcante y Dobereiner,
1988)(Moutia et al ., 2003) (Madhyaian et al ., 2004)
Lavar con agua de la llave Lavar con jabón y agua de la llave Lavar con agua de la llave
Macerar empleando licuadoraCortar el material en trozos de 10
cm de largo
Sumergir en hipoclorito de calcio
al 5% durante 5 minutos
Sumergir por 15 minutos en
solución de cloramina T al 1%
Realizar cinco lavados con agua
de la llave
Agitar espontáneamente
Transferir a frascos limpios
Realizar tres lavados con solución
de cloramina T al 1% (10 minutos
cada uno)
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AGG GAC – 3’) y DI (5’- GCG CCC CAT TGC TGG GTT – 3’) derivados de la secuencia 16S del
ADNr de la bacteria G. diazotrophicus así como los cebadores RB (5’- AGA GTT TGA TYM TGG
CTC AG-3’) y RM (5’- GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’), en calidad de primers no
específicos para G. diazotrophicus, bajo las mismas condiciones de reacción para amplificar un
fragmento de aproximadamente 800 pb. Las condiciones de reacción para una PCR de 100 µL
serán: 0,02 µg de ADN cromosómico purificado, los primers AC, DI, RB y RM (1 µM de cada
uno), desoxinucleótidos trifosfato (dNTP, 300 µM c/u), buffer de PCR (10 µL), y Taq polimerasa (2
U). La amplificación se realizará en un termociclador minicycler (BIO-RAD, EU) con un paso
inicial de desnaturalización a 95°C por 10 minutos seguido de 35 ciclos con desnaturalización a
92°C por 1 minuto, alineamiento de 52°C por 2 minutos, y una extensión a 72°C por 2 minutos con
un paso final de alineamiento de 52°C por 2 minutos seguido de una extensión final a 72°C por 8
minutos.
Las muestras de ADN serán amplificadas directamente de cultivos de laboratorio obtenidos en
medio DYGS (ANEXO A). Las colonias de un día de incubación serán transferidas con un palillo a
un microtubo de PCR, el cual contendrá todos los componentes de la reacción. Las células serán
lisadas a 90°C durante 10 minutos. Luego se adicionará la Taq- polimerasa (1,5 U) y se llevará a
cabo la PCR por 30 ciclos usando las condiciones descritas anteriormente. Los productos de la
amplificación serán analizados por electroforesis en geles de agarosa al 1,2%. Luego de la
separación de los productos de la PCR con gel de agarosa, éstos serán fotografiados y analizados.
Los productos de la PCR serán enviados a la empresa Macrogen (Corea del Sur) para su
secuenciación. Las secuencias se analizarán con el software STADEN (Staden et al., 2003). Las
secuencias de alta calidad serán analizadas mediante el programa BLAST (Altschul et al., 1997)
para realizar la comparación de las secuencias del conjunto de primer AC, DI a fin de verificar que
éstas correspondan a la bacteria G. diazotrophicus. Como último paso, se propone realizar los
alineamientos con secuencias de referencia usando el software ClustalW (Higgins y Sharpa, 1988),
y el análisis filogenético usando el programa MEGA 4 (Tamura et al., 2007), para observar si los
aislamientos de G. diazotrophicus recuperados en este estudio, pertenecen al mismo grupo de los
reportados en trabajos previos o se pueden clasificar en nuevos subgrupos.
4.1.5. Selección de aislamientos de G. diazotrophicus
Los aislamientos caracterizados serán evaluados con respecto a la actividad de la enzima
nitrogenasa y la producción de la fitohormona ácido indolacético (AIA); se seleccionará el
aislamiento con mejor desempeño en la producción de estos metabolitos obtenido a partir de caña y
de tomate para las subsiguientes etapas de optimización de medio de cultivo y del estudio cinético.
4.1.5.1. Determinación de la actividad nitrogenasa
La actividad de la enzima nitrogenasa se determinará mediante el método de reducción del acetileno
(ARA) descrito por Muthukumarasamy et al., (1999). Se emplearán viales de 100 mL, los cuales
contendrán 20 mL de medio de cultivo LGI. El acetileno será inyectado en los viales a 10 kPa y el
medio se sembrará con un inóculo del 2% que contendrá 108 UFC/mL, correspondiente al tubo 0,5
de la escala de Mc Farland (Rojas et al., 2009). Los viales serán incubados a 30°C durante 60
minutos. La producción de etileno será medida empleando un cromatógrafo de gases con una
columna Porapak-Q y un detector de ionización de llama. También se analizará un vial de control
sin inoculante, pero con acetileno. La actividad media de la nitrogenasa se expresará en µg/mL de
etileno formado.
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4.1.5.2. Determinación de ácido indolacético
Para evaluar la producción de AIA, los aislamientos se cultivarán en medio LGI suplementado con
cloruro de amonio 1mM y 100 µg/mL de L-triptófano y se sembrará con un inóculo del 2% que
contendrá 108 UFC/mL, correspondiente al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland (Rojas et al., 2009);
éstos serán mantenidos en condiciones de agitación por 48 horas a 30°C (Madhaiyan et al., 2004b).
La cantidad de compuestos de indol producidos por los aislamientos evaluados se determinará en la
fase logarítmica de crecimiento luego de remover las células de G. diazotrophicus por
centrifugación a 10000 rpm durante 30 minutos. Las auxinas se extraerán del cultivo acidificado
(pH 2,5-3,0 con HCl) con igual volumen de acetato de etilo, el extracto se secará y los residuos
serán disueltos en etanol al 80%. Las auxinas serán analizadas por HPLC en una columna C18 (5
µm). Las auxinas serán eluidas con metanol al 30% (acidificado con ácido 3-fluoroacético a pH de
3,0) a un caudal de 0,5 mL/min y detectadas a 280 nm empleando un espectrofotómetro. Se utilizará
una solución estándar de AIA para efectos de obtención de las curvas patrón (Ivanova et al., 2001).
4.1.6. Preservación de aislamientos seleccionados
A fin de preservar los aislamientos obtenidos se aplicará el método sugerido por Siqueira et al.,
(2009). Para preparar una reserva (stock) del cultivo de estos microorganismos, se sembrarán los
aislamientos en 50 mL de medio DYGS (ANEXO B) en erlenmeyers de 250 mL, incubados a 30°C
con agitación orbital a 120 rpm durante 48 horas. Luego de este período de incubación, se
depositarán alícuotas de 0,5 mL de estos cultivos en tubos de 1,5 mL y adicionando 0,5 mL de una
solución de glicerol al 50%; posteriormente se almacenarán a -20°C.
4.2. OPTIMIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE
BIOMASA CELULAR, NITROGENASA Y ÁCIDO INDOLACÉTICO OBTENIDOS
A PARTIR DE LA BACTERIA Gluconacetobacter diazotrophicus
4.2.1. Activación y producción del inóculo de la bacteria G. diazotrophicus
La preparación del inóculo se realizará en dos etapas. Primero (etapa de activación), se tomarán dos
microtubos del cultivo de reserva congelado a -20°C y se trasferirán a 25 mL de medio DYGS
contenido en erlenmeyer de 125 mL; los frascos serán incubados durante 20 h aplicando las mismas
condiciones empleadas en la preparación del cultivo de reserva. En segundo lugar (etapa de
producción de inóculo) una cantidad de este cultivo (5% v/v) se empleará para inocular 50 mL de
medio fresco DYGS en un erlenmeyer de 250 mL de capacidad que se llevará a incubación durante
20 h. Estos cultivos activos serán usados para inocular el medio de fermentación (Siqueira et al.,
2009).
4.2.2. Condiciones del medio de cultivo
Con el fin de determinar las condiciones del medio de cultivo como pH, temperatura y agitación,
que influyen en la producción de la bacteria G. diazotrophicus, se tuvieron en cuenta las
investigaciones descritas en la literatura (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Attwood et al., 1991;
Dong et al., 1995; Ureta y Nordlund, 2001; Ahmad et al., 2004; Madhaiyan et al., 2004b;
Rodríguez et al., 2005; Luna et al., 2006). Las condiciones seleccionadas se describen en la Tabla 2.
14
Tabla 2. Condiciones del medio de cultivo.
4.2.3. Identificación de los componentes más relevantes del medio de cultivo
Para la identificación de los componentes más relevantes del medio en cuanto a producción de
biomasa celular de la bacteria G. diazotrophicus, nitrogenasa y AIA se empleará el diseño
experimental de Plackett-Burman. Se tomará como referencia la formulación del medio de cultivo
LGI empleado para el aislamiento de microorganismos fijadores de nitrógeno (Cavalcante y
Döbereiner, 1988), al cual se le adicionará triptófano requerido para la expresión de AIA (Tabla 3).
A partir de la formulación del medio se definirán los rangos bajos y altos de la cantidad a evaluar de
cada nutriente. Como variables de respuesta se evaluará la concentración de biomasa mediante
densidad óptica expresada en g/L de peso seco empleando una curva de calibración, así como la
actividad nitrogenasa y la producción de ácido indolacético. El procedimiento se llevará a cabo en
erlenmeyers de 250 mL que contendrán 50 mL del medio de cultivo que serán sembrados con un
inóculo del 1% (v/v). Los cultivos se mantendrán bajo agitación durante 24-48 horas. La matriz del
diseño experimental que se aplicará para evaluar los factores más relevantes se presenta en la Tabla
4. En estos experimentos se examinará la magnitud y dirección de los efectos de los factores a fin
de determinar las variables que son de mayor importancia; lo anterior se realizará mediante análisis
de varianza empleando un software estadístico.
Tabla 3. Valores mínimos, máximos y fijos evaluados para la selección de los componentes del
medio de cultivo.
4.2.4. Determinación de las concentraciones óptimas de los componentes del medio de
cultivo
Con el fin de definir las concentraciones óptimas de los componentes del medio de cultivo que
presentaron mayor relevancia, se planteará un diseño compuesto central. Para ello, se fijarán los
valores de las concentraciones de los componentes del medio de cultivo que no presentaron un
efecto importante de acuerdo con los resultados del diseño de Plackett-Burman. Para los factores
más relevantes se definirán cinco niveles y se evaluarán como variables de respuesta la
concentración de biomasa celular, la actividad nitrogenasa y la concentración de AIA. Los
resultados obtenidos serán evaluados mediante el correspondiente análisis de varianza con ayuda
del programa estadístico empleado. Mediante análisis de regresión se obtendrá la ecuación
correspondiente que muestre cómo varía la concentración de biomasa de la bacteria en función de
los factores del diseño. La forma de la ecuación de regresión se relaciona a continuación:
pH Temperatura Agitación
°C rpm
5,5 30 100
Sacarosa
(g/L)
Extracto de
levadura (g/L)
L-
Triptófano
(µg/mL)
K2HPO4 (g/L) KH2PO4 (g/L)MgSO4 .
7H2O (g/L)
CaCl2 .
2H2O (g/L)
Na2MoO4.
2H2O (g/L)
FeCl3 .
6H2O (g/L)
Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9
Bajo 70 0,003 90 0,03 0,07 0,03 0,003 0,0003 0,002
Alto 130 0,100 110 1,00 1,40 1,00 0,100 0,01 0,09
Valor
15
𝑌∗(𝑥, 𝑎) = 𝑎0 ∑ 𝑎i 𝑥i + ∑ ∑ 𝑎ij
𝑘
j=2
𝑘−1
j=1
𝑘
i−1
𝑥𝑖𝑥𝑗 + ∑ 𝑎𝑖𝑗
𝑘
i=1
𝑋12
(1)
Con esta ecuación se determinarán los valores óptimos de los factores (componentes del medio) que
maximicen la producción de biomasa celular para lo cual se utilizará el método de análisis de
superficies de respuesta. Luego, se realizará un ensayo de fermentación por triplicado empleando un
medio de cultivo cuyas concentraciones de sus componentes corresponden a los valores óptimos de
los factores; este ensayo permitirá comprobar experimentalmente los resultados del análisis de las
superficies de respuesta empleando el diseño central compuesto. Igual procedimiento de análisis,
incluyendo los ensayos comprobatorios, se aplicará en el caso de la producción de AIA y de la
determinación de la actividad nitrogenasa.
Tabla 4. Matriz de diseño de dos niveles con seis variables.
a Ver codificación de los factores en la Tabla 3.
4.3. ESTUDIO CINÉTICO DEL CULTIVO SUMERGIDO DE LA BACTERIA
Gluconacetobacter diazotrophicus PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA
CELULAR, NITROGENASA Y ÁCIDO INDOLACÉTICO
4.3.1. Condiciones de fermentación
Para llevar a cabo la fermentación se empleará el medio de cultivo para producción de biomasa
celular de G. diazotrophicus definido de acuerdo con el procedimiento descrito en el numeral 4.2.3.
Se determinará experimentalmente la cinética del proceso de producción de biomasa celular,
nitrogenasa, ácido indolacético y consumo de sustrato a nivel de laboratorio mediante fermentación
sumergida por lotes. Se utilizará un biorreactor de mezcla completa de 3 L de capacidad. El
seguimiento de la fermentación se realizará tomando muestras periódicas en intervalos definidos de
tiempo. De esta manera se obtendrán los perfiles en el tiempo de sustrato, biomasa celular y
productos (AIA, nitrogenasa).
Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9
1 + - + - - - + + +
2 + + - + - - - + +
3 - + + - + - - - +
4 + - + + - + - - -
5 + + - + + - + - -
6 + + + - + + - + -
7 - + + + - + + - +
8 - - + + + - + + -
9 - - - + + + - + +
10 + - - - + + + - +
11 - + - - - + + + -
12 - - - - - - + + +
Factores codificadosa
No.
16
4.3.2. Procedimientos analíticos y determinación de la producción de biomasa y ácido
indolacético, de la actividad nitrogenasa y del consumo de sustrato
La morfología de las células será monitoreada mediante tinción de Gram. El crecimiento celular se
determinará mediante densidad óptica a 600 nm a partir de muestras del caldo de fermentación; los
valores de densidad óptica se convertirán en valores de concentración (g/L) usando las ecuaciones
resultantes de las curvas de calibración. La producción de células totales (ΔX) se calculará por la
diferencia entre Xm (máxima concentración celular) y X0 (concentración celular inicial). La
productividad celular (Prx) se calculará a través de ΔX/Δt. La velocidad de crecimiento celular
(dX/dt) se obtendrá de la derivada del polinomio que mejor se adapte al conjunto de datos
experimentales. El promedio de crecimiento específico (µX) se calculará dividiendo el promedio de
crecimiento entre la concentración celular y su respectivo tiempo. La velocidad específica máxima
de crecimiento celular (µmax) se calculará a partir de la regresión lineal del logaritmo natural de la
concentración de biomasa versus tiempo. La pendiente de la recta obtenida por regresión lineal
corresponderá a µmax. Con los datos experimentales obtenidos, se aplicarán técnicas de
modelamiento (modelación) matemático a fin de describir la cinética de fermentación del sistema
estudiado.
La actividad de la enzima nitrogenasa se determinará mediante la actividad de reducción del
acetileno (ARA) descrito por Muthukumarasamy et al., (1999). El ácido indolacético se
determinará mediante el procedimiento descrito por Madhaiyan et al., (2004b). Igualmente se
medirán azúcares reductores por el método de DNS (DuBois et al., 1956) para cuantificar el
consumo de sustrato.
4.4. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA BACTERIA Gluconacetobacter
diazotrophicus COMO PROMOTORA DEL CRECIMIENTO DEL CULTIVO DE
TOMATE (Solanum lycopersicum L.)
Localización: Granja Tesorito de la Universidad de Caldas, ubicada en inmediaciones del parque
agroindustrial Juanchito a una altura de 2280 msnm, precipitación anual de 1800 mm, humedad
relativa de 78% y temperatura promedio de 17.5°C (Universidad de Caldas, 2010).
La evaluación de la actividad promotora del crecimiento en plantas de tomate (Solanum
lycopersicum L.), se evaluará inicialmente en la etapa de germinación bajo condiciones
semicontroladas de luz y temperatura en el germinador de plantas hortícolas de la granja Tesorito,
inoculando semillas de tomate híbrido comercial Torrano, con una solución al 5% del centrifugado
del caldo de fermentación de G. diazotrophicus, resuspendido en agua estéril y ajustado a una
concentración de 1x109bacterias/mL. Se realizarán evaluaciones y medición de variables a los 10 –
20 y 30 días (momento del trasplante de la plántula a campo). Se empleará un diseño
completamente al azar con cuatro repeticiones, en cada una de las cuales se medirán 10 plantas que
conformarán la unidad experimental. Las variables a evaluar serán volumen de raíces, peso fresco y
seco de raíces y de la parte aérea de la plántula. Se empleará como testigo semillas con aplicación
de agua destilada estéril en lugar del inoculante.
Las plántulas serán trasplantadas a macetas de 5 kilos de capacidad, utilizando un diseño estadístico
de bloques completos al azar, con cuatro repeticiones y 10 plantas por unidad experimental. El
sistema de producción será semi-invernadero, con condiciones normales de riego. Serán usados
como testigos plántulas con aplicación de agua destilada estéril en lugar del inoculante y
condiciones normales de riego y fertilización. Todas las unidades experimentales mantenidas en
condiciones de invernadero serán plantadas usando como sustrato suelo previamente esterilizado a
una temperatura de 120 ˚C, 15 minutos y 3 Atm de presión. Las variables a evaluar serán: altura de
17
las plantas, peso seco de raíz y área foliar evaluados cada mes durante el ciclo de cultivo.
Adicionalmente, a partir de la recuperación de las bacterias inoculadas se evaluará la producción de
AIA y actividad nitrogenasa.
18
5. RESULTADOS ESPERADOS
5.1. GENERACIÓN DE NUEVO CONOCIMIENTO
Protocolos de aislamiento, selección y determinación de la actividad promotora de crecimiento de la
bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus.
Al menos tres aislamientos de G. diazotrophicus caracterizados bioquímica y molecularmente.
Consolidar procesos de proyección social a través de la oferta de servicios en esta área.
Memorias de la investigación aplicada sobre cómo seleccionar, optimizar medios y cultivar el
microorganismo y cómo aplicarlo a las hortalizas seleccionadas a fin de estructurar a futuro un
eventual paquete tecnológico para ofrecerlo al sector productivo y las comunidades.
5.2. FORTALECIMIENTO DE LA COMUNIDAD CIENTÍFICA COLOMBIANA
Mediante la realización del presente trabajo se proyecta la articulación del trabajo con grupos de
investigación del área a nivel nacional e internacional y empresas del sector productivo. Se
contribuirá a la consolidación del área de Bioprocesos Enzimáticos y de Fermentación del Instituto
de Biotecnología Agropecuaria de la Universidad de Caldas, así como al desarrollo de la línea de
investigación en Biotecnología Industrial del grupo de investigación en Alimentos y Agroindustria
de esta misma universidad. Paralelamente, se posibilitará la formación de un investigador a nivel
doctoral en el marco del recién creado programa de Doctorado en Ciencias Agrarias de la
Universidad de Caldas. Igualmente se espera la consolidación de una masa crítica en la Universidad
Católica de Manizales en el área de la propuesta a fin de fortalecer la proyección institucional a
nivel de investigación, docencia y proyección social, mediante la formación de un estudiante de
Doctorado y estudiantes de la Especialización en Microbiología Industrial. Igualmente se
fortalecerán la Línea de Investigación en Bioinsumos de la universidad mencionada y con ello
alcanzar un reconocimiento institucional, regional y nacional. Igualmente, se fortalecerá el Grupo
de Investigaciones Biológicas de la Universidad Católica de Manizales. Ofrecimiento de las
tecnologías y metodologías desarrolladas a las empresas del cluster de Conocimiento en
Biotecnología, permitiendo la integración con el sector productivo de la región.
5.3. APROPIACIÓN SOCIAL/PÚBLICA DEL CONOCIMIENTO
Capacitación y divulgación mediante un taller, a comunidades rurales (agricultores) o empresas del
sector productivo interesadas en aspectos puntuales de los esquemas de producción de los
biofertilizantes desarrollados. Informes de avance semestral. Divulgación científica: al menos un
artículo aceptado para publicación en revista internacional A1 o A2, al menos dos artículos
aceptados para publicación en revistas nacionales indexadas A o B, participación en al menos dos
eventos científicos nacionales o internacionales.
5.4. IMPACTOS ESPERADOS A PARTIR DEL USO DE LOS RESULTADOS
Los principales impactos esperados de este proyecto corresponden principalmente a:
La entrega de una solución ambiental y tecnológica para disminuir el uso de fertilizantes químicos y
promover el desarrollo sostenible mediante la aplicación de Buenas Prácticas Agrícolas
19
Aplicaciones del inóculo de Gluconacetobacter diazotrophicus como promotor de crecimiento
(fijación de nitrógeno, producción de fitohormonas)
Desarrollo de los procesos de obtención de un inoculante microbiano promotor de crecimiento a
base de Gluconacetobacter diazotrophicus
Formación de un investigador a nivel de doctorado
Conformación de redes relacionadas con el objeto de estudio de la propuesta donde se involucren
diferentes actores, instituciones y centros de investigación
Contribución a la formación de una masa crítica en la UCM y UDC y consolidación de los grupos
de investigación en ambas instituciones.
20
6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
Revisión bibliográfica Estado del arte del área en estudio Docente investigador
Consecución de equipos Disponer de los recursos necesarios para ejecutar el
trabajo de campo.Docente investigador
Consecución de materiales Disponer de los recursos necesarios para ejecutar el
trabajo de campo.Docente investigador
Aislamiento y caracterización
fenotípica de la bacteria G.
diazotrophicus a partir de cultivos
colombianos de hortalizas.
Aislamiento, identificación y caracterización del
microorganismo en estudioDocente investigador
Docente investigador
Optimización de medios de cultivo
para la producción de biomasa celular,
nitrogenasa y ácido indol acético
obtenidos a partir de la bacteria G.
diazotrophicus
Medio de cultivo optimizado Docente investigador
Docente investigador
Estudio cinético del cultivo sumergido
de la bacteria G. diazotrophicus para
la producción de biomasa celular,
nitrogenasa y ácido indol acético
Estudio cinético Docente investigador
Docente investigador
Evaluar la capacidad de la bacteria G.
diazotrophicus como promotora del
crecimiento de los cultivos de
hortalizas seleccionados
Evaluación en campo del comportamiento del
microorganismoDocente investigador
Docente investigador
Elaboración de informe finalEstructura del informe final, análisis de la
información, análisis de resultadosDocente investigador
Docente investigador
Divulgación de resultados
Difundir a la comunidad académica los resultados
obtenidos y fortalecer la capacidad investigativa
en la UCM.
Docente investigador
Docente investigador
Año 3
Actividades Resultado Responsable
Año 1 Año 2
Meses Meses
INFO RME FINAL
Meses
PRIMER INFO RME
SEGUNDO INFO RME
TERCER INFO RME
CUARTO INFO RME
Q UINTO INFO RME
21
7. PRESUPUESTO
UCM/Solicitado UCM/Recurrente UDC/Solicitado UDC/Recurrente
Administración -
Bibliografía -
Construcciones 13.000.000,00 13.000.000,00
Equipos 11.000.000,00 15.600.000,00 10.000.000,00 44.800.000,00 81.400.000,00
Mantenimiento -
Materiales y reactivos 17.970.000,00 1.806.666,00 5.350.000,00 1.131.666,00 26.258.332,00
Personal científico 81.429.075,00 48.708.000,00 130.137.075,00
Personal de apoyo 4.200.000,00 10.800.000,00 15.000.000,00
Salidas de campo 525.000,00 525.000,00
Servicios técnicos 1.000.000,00 1.000.000,00
Software -
Viajes 4.500.000,00 2.500.000,00 7.000.000,00
TOTAL 34.470.000,00 103.035.741,00 31.375.000,00 105.439.666,00 274.320.407,00
12,57 37,56 11,44 38,44 100,00
FUENTESRUBROS TOTAL
* Equipos y personal propios
22
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24
ANEXO A
Encuesta para recolección de información de los cultivos evaluados para el aislamiento de la
bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus
Encuesta N. Fecha
Departamento Municipio
Vereda Finca
Cultivo Variedad
Edad del Cultivo Propietario
Tipo de examen
Pregunta Respuesta
1. Sistemas de producción 1. Monocultivos
2. Intercalados (con qué cultivo)
2. Método empleado en el manejo
de arvenses 1. Químico (producto)
2. Mecánico
3. Realiza fertilización Si
Química
Orgánica
Productos
No
4. Hace manejo de plagas Si
Productos
No
5. Hace manejo de enfermedades Si
Productos
No
6. Aplica microorganismos
antagonista Si
Cuáles?
Trichoderma
Paecilomyces
Micorrizas
No
7. Altura Temperatura promedio
8. Manejo general del cultivo B R
M
DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
UNIVERSIDAD DE CALDAS
ENCUESTA PARA RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN DE CULTIVOS DONDE SE
REALIZARÁ AISLAMIENTO DE LA BACTERIA Gluconacetobacter diazotrophicus
25
ANEXO B
Medios de cultivo que se emplearán para la etapa de aislamiento de la bacteria G.
diazotrophicus
A. Solución salina para dilución (Moutia et al., 2003) Reactivo Cantidad/Litro
KH2PO4 3.4 g
MgSO4.7H2O 0.2 g
NaCl 0.1 g
CaCl2.2H2O 0.02 g
Solución de micronutirentes 2 mL
Solución de FeEDTA 1.64% 4 mL
KOH 4.5 g
El volumen se completa a 1000 mL con agua destilada y el pH se ajusta a 7.0 con
KOH.
B. Medio semisólido LGI (en tubo de ensayo) (Cavalcante y Döbereiner, 1988) Reactivo Cantidad (g/L)
K2HPO4 0,2
KH2PO4 0,6
MgSO4 . 7H2O 0,2
CaCl2 . 2H2O 0,02
Na2MoO4. 2H2O 0,002
FeCl3 . 6H20 0,01
Solución de azul de bromotimol al 5% en KOH 0,2 N 5 mL
Agar 1,8 g
Azúcar de caña cristalizada 100g
pH final: 6.0
C. Medio LGI con ácido acético (en tubo de ensayo) (Cavalcante y Döbereiner, 1988) Reactivo Cantidad (g/L)
K2HPO4 0,2
KH2PO4 0,6
MgSO4 . 7H2O 0,2
CaCl2 . 2H2O 0,02
Na2MoO4. 2H2O 0,002
FeCl3 . 6H20 0,01
Solución de azul de bromotimol al 5% en KOH 0,2 N 5 mL
Agar 2,2 g
Azúcar de caña cristalizada 100g
pH final: 4.5 (ajustar con ácido acético)
D. Medio con jugo de caña diluido (en tubo de ensayo) (Cavalcante y Döbereiner, 1988) Reactivo Cantidad
Medio semisólido LGI 250 mL
Jugo de caña de azúcar 250 mL
Agua Completar hasta un litro
E. Agar LGI en cajas de Petri empleado para aislamiento de colonias (Cavalcante y
Döbereiner, 1988) Reactivo Cantidad (g/L)
K2HPO4 0,2
KH2PO4 0,6
26
MgSO4 . 7H2O 0,2
CaCl2 . 2H2O 0,02
Na2MoO4. 2H2O 0,002
FeCl3 . 6H20 0,01
Solución de azul de bromotimol al 5% en KOH 0,2 N 5mL
Agar 15
Extracto de levadura 0,02
Azúcar de caña cristalizada 100
pH final: 6.0
F. Agar papa (Cavalcante y Döbereiner, 1988)
Composición del medio por litro:
Papa (200 g): azúcar morena (100 g); solución de micronutrientes (2 ml) y solución de vitaminas (1
mL); agar (25 g).
La papa se pelará y lavará. Se cortará en cubos pequeños y se cocinará en 400 mL de agua destilada
por 30 minutos. La preparación se filtrará a través de un paño de algodón. Los componentes se
adicionarán sobre el filtrado. El volumen se completará a 1000 mL con agua destilada y el pH se
ajustará a 5.5 con ácido acético.
G. Medio LGI suplementado con jugo de caña de azúcar y ciclohexamida (Madhaiyan et al.,
2004b)
Medio LGI semisólido suplementado con jugo de caña de azúcar 0.5% a pH 4.5 (Cavalcante y
Döbereiner, 1988) y ciclohexamida (150 mg L-1
)
H. Medio LGI suplementado con extracto de levadura y ciclohexamida (Madhaiyan et al.,
2004b)
Se preparará a partir de agar ácido acético LGI el cual será suplementado con extracto de levadura
(50 mg L-1
) y ciclohexamida (150 mg L-1
)
I. Medio DYGS (Rodriguez Neto et al., 1986): Reactivo Cantidad (g/L)
Glucosa 2
Ácido málico 2
Peptona 1,5
Extracto de levadura 2
K2HPO4 0,5
MgSO4.7H20 0,5
Ácido L- glutámico 1,5
pH final: 7.0
J. Medio GYC (Sievers y Swings, 2005): Reactivo Cantidad (g/L)
Glucosa 100
Extracto de levadura 10
CaCO 20
Agar 20
27
ANEXO C
Caracterización morfológica y bioquímica de la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus
Coloración de Gram
Las colonias de 18-24 horas de incubación en agar papa dextrosa se emulsificarán en solución
salina. Posteriormente se preparará un frotis delgado y uniforme sobre un portaobjetos limpio, el
cual se dejará secar a temperatura ambiente. Luego se fijará la preparación pasando la placa por la
llama de un mechero. Luego se realizará el procedimiento de coloración descrito a continuación:
Se cubrirá la placa con colorante cristal violeta, y se dejará por 1 minuto.
El colorante se escurrirá, se lavará el extendido y se cubrirá con lugol durante 1 minuto.
A continuación se lavará el portaobjetos con una solución de alcohol acetona.
Se eliminará el exceso de alcohol con agua y se teñirá el portaobjetos con safranina durante 1
minuto.
Luego se volverá a lavar el extendido, se secará con papel absorbente y se examinará en el
microscopio.
Microscopía de luz
Las láminas coloreadas con Gram se observarán en lente de aceite de inmersión con un aumento de
100x. Se tendrá en cuenta la forma de la bacteria y el tamaño usando un micrómetro ocular.
Ensayos fisiológicos
Muchas características fisiológicas se pueden determinar mediante el empleo del kit API 20E®
(Biomérieux, Francia). La batería de pruebas API 20E® es un sistema de identificación rápida para
bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram negativas. Básicamente consta de
21 pruebas bioquímicas estandarizadas y miniaturizadas y una base de datos (BIOMÉRIEUX,
2010). Las pruebas y reacciones se describen en la Tabla 5.
Tabla 5. Reacciones observadas en el sistema API 20E®.
Prueba Reacción/Enzimas
ONPG Beta-galactosidasa
ADH Arginina deshidrolasa
LDC Lisina descarboxilasa
ODC Ornitina descarboxilasa
CIT Utilización de citrato
H2S Producción de H2S
URE Ureasa
TDA Triptófano desaminasa
IND Producción de indol
VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer)
GEL Gelatinasa
GLU Fermentación/oxidación de glucosa
MAN Fermentación/oxidación de manitol
INO Fermentación/oxidación de inositol
SOR Fermentación/oxidación de sorbitol
RHA Fermentación/oxidación de ramnosa
SAC Fermentación/oxidación de sacarosa
MEL Fermentación/oxidación de melobiosa
AMY Fermentación/oxidación de amigdalina
ARA Fermentación/oxidación de arabinosa
OX Citocromo oxidasa
28
Prueba de movilidad
El medio Motility GI (Difco, EUA) se preparará de acuerdo a las instrucciones del distribuidor, para
verificar si los aislamientos de G. diazotrophicus son móviles. La incubación se realizará en
oscuridad a 35°C.
Prueba de oxidasa
Se emplearán tiras de identificación de oxidasa, en cultivos de 18-24 horas en agar papa dextrosa.
Prueba de catalasa
Se realizará empleando peróxido de hidrógeno al 30%, el cual se adiciona a una masa de células que
están sobre una lámina limpia. En la lámina se examinará la formación de burbujas.