obtención de extractos polifenólicos de orujos de vinos ... · primaria y la pared secundaria...
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Flavia Elías Huerta
Fernanda Ruiz Larrea
Facultad de Ciencia y Tecnología
Grado en Enología
2015-2016
Título
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
TRABAJO FIN DE GRADO
Curso Académico
Obtención de extractos polifenólicos de orujos de vinostintos de variedad Tempranillo
Autor/es
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2016
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Obtención de extractos polifenólicos de orujos de vinos tintos de variedadTempranillo, trabajo fin de grado
de Flavia Elías Huerta, dirigido por Fernanda Ruiz Larrea (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
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Trabajo de Fin de Grado
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
POLIFENÓLICOS DE ORUJOS
DE VINOS TINTOS DE LA
VARIEDAD TEMPRANILLO Autora:
FLAVIA ELÍAS HUERTA
Tutora: MARÍA FERNANDA RUIZ LARREA
Titulación:
GRADO EN ENOLOGÍA
Facultad de Ciencias y Tecnología
AÑO ACADÉMICO: 2015/2016
[1]
RESUMEN
En el presente trabajo se elaboraron vinos tintos de la variedad Tempranillo de la
D.O.Ca. Rioja en la campaña del 2014 y se trató de estudiar la eficacia en la
extracción de compuestos de color y polifenoles totales a partir de los hollejos y
restos sólidos recogidos después del descubado y prensado de los mismos, los cuales
constituían un material de desecho de la bodega. Se aplicaron dos tipologías
diferentes para la extracción de color y polifenoles de los hollejos recogidos: por un
lado mediante trituración mecánica y por otro, mediante la adición de enzimas
pectolíticas comerciales. Se descubrió que la extracción de los compuestos mediante
la trituración mecánica fue más elevada que con la adición de enzimas, sin embargo
la calidad fue mejor en el caso de la utilización de enzimas dando una mayor
proporción de compuestos rojos no oxidados con respecto al total de polifenoles
extraídos. También se pudo comprobar la ineficacia de enzimas comercializadas
para extracción en blancos en la extracción de los polifenoles de los hollejos tintos.
Se constató también la excelente extracción del color en el proceso empleado para la
elaboración de los vinos tintos de la variedad Tempranillo de este estudio.
Palabras clave: hollejos, enzimas pectolíticas, polifenoles, extractabilidad,
subproductos vitivinícolas.
ABSTRACT
In this study Tempranillo red wines of the Appellation of Origin Rioja were
elaborated during the 2014 vintage, and the efficiency of the extraction of colour
components and total polyphenols from the grape pomace was studied. Grape
pomace is a winery waste product and it was obtained after wine racking and
pressing of the recovered solids. Two different methodologies were used for colour
and polyphenol extraction: mechanic trituration and addition of commercial
pectolytic enzymes. It was shown that the extraction was higher by mechanic
trituration than by enzyme addition, nevertheless, the quality of the extracted
compounds was higher in the case of enzyme addition, rendering higher amounts of
non-oxidized red components relative to the recovered total polyphenols. It was
shown the inefficiency of white vinification enzymes in extracting polyphenols from
[2]
red grape skins. It was also shown the excellent colour extraction of the Tempranillo
red wine making method of this study.
Key words: grape skins, pectolytic enzymes, polyphenols, extractability, grape
pomace.
[3]
ÍNDICE
1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 7
1.1 La pared celular. Estructura y composición .................................................. 7
1.1.1 Polisacáridos de la pared celular ............................................................ 8
1.1.2 Proteínas ............................................................................................... 11
1.1.3 Lignina ................................................................................................. 11
1.1.4 Compuestos fenólicos .......................................................................... 11
1.2 Operaciones mecánicas para la extracción polifenólica .............................. 16
1.3 Proceso enzimático para la extracción polifenólica .................................... 18
1.4 Tipos de enzimas de interés enológico. Características y función .............. 19
1.4.1 Pectinasas ............................................................................................. 20
1.4.2 Hemicelulasas ...................................................................................... 20
1.4.3 Celulasas .............................................................................................. 21
1.4.4 Galactosidasas ...................................................................................... 21
1.4.5 Proteasas .............................................................................................. 21
1.5 Preparados enzimáticos de uso enológico ................................................... 22
2 OBJETIVO ........................................................................................................ 23
3 MATERIALES Y METODOLOGÍA ................................................................ 24
3.1 Elaboración de vino a partir de uva de la variedad Tempranillo ................ 24
3.2 Métodos de análisis físico-químicos del mosto y del vino elaborado ......... 27
3.3 Tratamientos de los hollejos para la extracción de polifenoles ................... 28
3.4 Extracción mecánica y en metanol de los polifenoles de los hollejos ........ 32
3.5 Extracción de los polifenoles de los hollejos mediante el uso de enzimas . 33
3.5.1 Estudio del efecto de la enzima Lallzyme Ex – V sobre los hollejos a
diferentes tiempos de incubación ....................................................................... 34
[4]
3.5.2 Estudio del efecto de Lallzyme Ex – V sobre los hollejos en diferentes
concentraciones .................................................................................................. 35
3.6 Estudio de la desviación estándar relativa del método ................................ 36
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 37
4.1 Elaboración del vino a partir de uva de la variedad Tempranillo ............... 37
4.2 Extracción mecánica y en metanol de los polifenoles de los hollejos ........ 38
4.3 Extracciones de los polifenoles de los hollejos mediante el uso de enzimas
40
4.3.1 Efecto de la enzima Lallzyme Ex – V sobre los hollejos a diferentes
tiempos de incubación ....................................................................................... 42
4.3.2 Estudio del efecto de Lallzyme Ex – V sobre los hollejos en diferentes
concentraciones y agitación de 2 horas .............................................................. 43
4.3.3 Estudio de la desviación estándar relativa del método ........................ 44
4.4 Comparación entre la extracción mecánica por trituración y la enzimática 45
5 CONCLUSIONES ............................................................................................. 46
6 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 47
7 ANEXOS ........................................................................................................... 50
7.1 ANEXO I: Fichas técnicas de los aditivos durante la vinificación ............. 50
7.2 ANEXO II: Fichas técnicas de las enzimas utilizadas en el estudio ........... 53
[5]
ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.- Preparación de las muestras para la extracción mecánica ....................... 32
Tabla 2.- Stocks para la cada una de las enzimas ..................................................... 33
Tabla 3.- Preparación de las muestras para la extracción enzimática ..................... 33
Tabla 4.- Preparación de las muestras ...................................................................... 35
Tabla 5.- Preparación de las muestras para la extracción a diferentes
concentraciones de Lallzyme Ex –V .......................................................................... 36
Tabla 6.- Preparación de las muestras para estudiar la desviación estándar relativa
................................................................................................................................... 37
Tabla 7.- Análisis de la vendimia .............................................................................. 37
Tabla 8.- Análisis fenólico del vino al final de fermentación .................................... 37
Tabla 9.- Análisis químico del vino al final de la fermentación ................................ 38
Tabla 10.- Desviaciones estándar relativas .............................................................. 44
Tabla 11.- Comparación de los resultados a 420, 520 y 620 nm y el IC
correspondiente ......................................................................................................... 45
[6]
ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1.- Cinética de fermentación ........................................................................ 38
Gráfico 2.- Parámetros del color del extracto de los hollejos con metanol .............. 39
Gráfico 3.- Parámetros del color del vino yema obtenido al final de la fermentación
alcohólica ................................................................................................................... 39
Gráfico 4.- Absorbancias e IC de los extractos de los hollejos tratados con distintas
enzimas pectolíticas ................................................................................................... 40
Gráfico 5.- IPT según tipo de enzima ........................................................................ 41
Gráfico 6.- Absorbancias e IC de los extractos de los hollejos tratados con Lallzyme
Ex –V durante distinto tiempo. .................................................................................. 42
Gráfico 7.- IPT de los extractos de los hollejos tratados con Lallzyme Ex –V durante
diferentes tiempos de agitación ................................................................................. 43
Gráfico 8.- IC para Lallzyme Ex –V a diferentes concentraciones y agitación de 2
horas .......................................................................................................................... 43
Gráfico 9.- IPT para Lallzyme Ex –V a diferentes concentraciones ......................... 44
[7]
1 INTRODUCCIÓN
Muy a menudo se utilizan en las vinificaciones de tintos productos elaborados a base
de enzimas con el fin de conseguir una mejor extracción de compuestos que se
encuentran en la piel de las bayas. Pero no es esa la única operación que se realiza
con este fin, puesto que también se llevan a cabo operaciones como los delestages,
bazuqueos o estrujados a la entrada de la vendimia. El abanico de posibilidades es,
por tanto, muy amplio y puede ser mediante operaciones mecánicas, químicas y/o
enzimáticas.
Los compuestos por los que la extracción de los hollejos es tan importante son los
polifenoles, puesto que a pesar de que se pueden encontrar en diferentes zonas del
grano de la uva su gran mayoría reside en las paredes celulares, presentando distinta
solubilidad y capacidad de difusión en función de la fase acuosa o alcohólica del
medio. Así pues, se van extrayendo a lo largo de la elaboración del vino, cambiando
con respecto al tiempo y de los cuales dependen, en gran parte, las características del
vino. De igual manera los compuestos fenólicos están sujetos a diferentes factores
como la cantidad presente en la uva, la composición de la pared celular o la
maduración del grano ya que cuando éste madura también se produce una
solubilización de los polisacáridos de la pared de las células del hollejo favoreciendo
así la cesión de compuestos al vino (Adoración, 2013). También influyen las
prácticas vitícolas, las condiciones ambientales y el área de producción entre otros
factores.
1.1 La pared celular. Estructura y composición
La pared celular se puede diferenciar en tres partes: la lámina media, la pared
primaria y la pared secundaria (aunque ésta no siempre aparece). Durante la división
celular se origina la primera capa que da lugar a la lámina media a partir de la cual se
van a desarrollar las siguientes capas, una a cada lado. Entre cada lado de esta
lámina y la membrana plasmática se continúa depositando material que va a
constituir la pared celular de tal forma que la lámina media quedará en la parte más
externa de la célula mientras que las paredes primaria y secundaria se van formando
hacia el interior. En la pared celular primaria se encuentran los tejidos jóvenes y en
[8]
crecimiento mientras que al finalizar el crecimiento celular aparece la pared
secundaria por lignificación de los tejidos (figura 1).
Figura 1.- Micrografía electrónica de transmisión de la pared celular (Romero, 2008)
En cuanto a la composición de la pared celular, se distinguen tres tipos principales
que son: polisacáridos (celulosa, hemicelulosa y pectinas), proteínas, compuestos
fenólicos y lignina (Romero, 2008).
Las paredes celulares primarias están compuestas hasta en un 90% por polisacáridos
(hemicelulosas, celulosas y sustancias pécticas) mientras que las paredes secundarias
están formadas por acumulación de xilanos y lignina (los cuales impiden el
crecimiento de los tejidos) y la lámina media está formada básicamente por pectinas
(Hidalgo, 2010).
Durante el proceso de maduración de las bayas se produce una degradación por parte
de sus enzimas endógenas de los polisacáridos de la lámina media y de la pared
primaria dando lugar al debilitamiento de la pared celular y provocando así la
pérdida de adhesión entre las células.
1.1.1 Polisacáridos de la pared celular
Los polisacáridos son moléculas formadas por la unión mediante enlace glicosídicos
de unidades de monosacáridos. En las bayas de uva se encuentran de forma
predominante en la pared primaria, tanto en la pulpa como en los hollejos,
[9]
habiéndose hallado en estos últimos cantidades superiores al 50% en peso fresco
(Hidalgo, 2010). Se clasifican en tres grupos: celulosas, hemicelulosas y pectinas.
En la figura 2 se representa la pared celular y la disposición que toman los
polisacáridos en ella. Los compuestos mencionados se desarrollan a continuación.
Figura 2.- Estructura de la pared celular (Alda, 2014)
Celulosa
La celulosa es un polímero formado por moléculas de D-glucosa unidas por enlaces
β(1→4) formando cadenas lineales que se agregan para formar fibrillas
macromoleculares (figura 3). Esta estructura de microfibrillas, se encuentra
embebida por una red formada por polisacáridos de tipo hemicelulósico y que al
mismo tiempo está inmersa en una matriz de pectinas (Alda, 2014).
Figura 3.- Estructura de la celulosa (Melo; Cuamatzi, 2007)
Su función es la de conferir resistencia a la pared celular. En cuanto a su cantidad en
las paredes, McNeil y sus colaboradores afirmaron que puede ser variable (Romero,
2008) mientras que Hidalgo (2010) expone que suponen el 20% de la pared celular
primaria.
Hemicelulosas
Las hemicelulosas son macromoléculas que se encuentran tanto en la pared primaria
como en la secundaria.
[10]
- En la pared primaria: se asocian a la celulosa mediante enlaces no covalentes
confiriendo una mayor resistencia a la pared. Su concentración es de
aproximadamente el 30%
- En las secundarias: limitan la velocidad de elongación de la célula.
- También se han encontrado en semillas, componiendo hasta el 100% de las
paredes celulares.
Existen una gran variedad de moléculas dentro de este grupo, pero se destaca el
xiloglucano en el caso de las bayas de uva ya que es el más abundante. Este está
formado a base de moléculas D-glucosa unidas mediante enlaces α(1→4) y
sustituciones de moléculas D-xilosa a las cuales a su vez se pueden unir otros
azúcares. Su unión a las microfibrillas de celulosa se da mediante puentes de
hidrógeno entre éstas y la cadena principal del xiloglucano (Romero, 2008).
Pectinas
Se trata de polímeros del ácido D-galacturónico, cuyas funciones ácidas están en
gran medida unidas por enlaces metílicos. Se encuentran, casi en su totalidad, en la
lámina media. También en la pared primaria, pero en menor cantidad y, junto con las
proteínas, actúan como sustancias cementantes. Sus componentes mayoritarios son
el homogalacturonano, ramnogalacturonano I y ramnoglacturonano II (Hidalgo,
2010).
El homogalacturonano es un polímero lineal formado por cadenas de ácido D-
galacturónico con enlaces α(1→4) que pueden estar metilesterificados; el esqueleto
base del ramnogalacturonano I es D-galactosa y L-ramnosa, unidos en α(1→4) y
α(1→2) respectivamente y el ramnogalacturonano II tiene una estructura de al
menos 8 moléculas de galactosa unidas por enlaces α(1→4) y que contiene cadenas
laterales poliméricas con diferentes azúcares. Además, en el caso del
ramnogalacturonano II a pesar de que en uva se encuentra en concentraciones del 0.5
al 5%, no es degradable por enzimas pectolíticas (Hidalgo, 2010).
Durante la maduración del grano se produce un reblandecimiento de la pared, lo cual
es debido a la solubilización de los homogalacturonanos principalmente y pérdida de
galactosa (Mariot, 2010).
[11]
1.1.2 Proteínas
La mayoría de las proteínas de la pared son glicoproteínas, es decir, cadenas de
aminoácidos que contienen ligadas a ellas otras cadenas de azúcares. En total
suponen el 10% de esta englobando tanto proteínas enzimáticas como estructurales.
De las proteínas estructurales las más caracterizadas son las extensinas
(glicoproteínas cuyo aminoácido predominante es la hidroxiprolina), las cuales
actúan con las pectinas y cuya función no se conoce con exactitud aunque se cree
que forman una red de fibras independiente a la celulósica que refuerza la pared
celular (Romero, 2008).
Por otro lado se encuentran las proteínas enzimáticas; suponen las enzimas
endógenas de las células y se pueden encontrar solubles en el apoplasto o enlazadas
a las paredes tanto iónica como covalentemente (Azcón-Bieto y Talón, 2013). Estas
enzimas utilizan sustratos sencillos tales como O2, H2O2, H2O y son capaces de
actuar sobre prácticamente todos los componentes de las paredes celulares, incluidas
las de patógenos.
1.1.3 Lignina
Se trata de una macromolécula fenólica compleja, la segunda más abundante tras la
celulosa, que se encuentra unida covalentemente a la pared celular. Aparece en la
pared secundaria y debido a su carácter hidrofóbico desplaza el agua aumentando la
resistencia química y física de las paredes además de dotarlas de una mayor rigidez
(Romero, 2008).
1.1.4 Compuestos fenólicos
Este grupo de compuestos se caracteriza por tener en su estructura un anillo
bencénico con, al menos, un radical hidroxilo (figura 4). Dado que los más
interesantes se encuentran en los hollejos de las uvas, es necesaria una extracción de
los mismos durante una maceración que en términos generales consigue extraerlos
en un 60% del contenido total de la uva. Dentro de esta fracción que se extrae, un
40% corresponde a antocianos y un 20% a taninos (Hidalgo, 2010).
[12]
Figura 4.- Estructura del fenol
Se diferencian dos grupos: no flavonoides, que comprende los ácidos fenólicos y sus
derivados, y flavonoides, que solo existen en hollejos y partes leñosas.
Se detallan a continuación los compuestos que comprende cada grupo:
No flavonoides
También llamados ácidos fenólicos, se encuentran tanto en la pulpa como en las
zonas leñosas. Se dividen a su vez en dos grupos: los ácidos benzoicos con
estructura C6-C1 (un anillo bencénico unido a un grupo ácido) y los ácidos
cinámicos con estructura C6-C3. Estos ácidos se pueden encontrar en el vino de
forma libre como productos de la hidrólisis de otros polifenoles, especialmente de
los antocianos cuando se degradan o esterificados, principalmente con ácido tartárico
(figura 6).
Figura 5.- Reacción de esterificación del ácido hidroxicinámico con el ácido tartárico (Fernández, 2013)
Otros compuestos contenidos en la vendimia pertenecientes a este grupo son los
estilbenos, entre los que destaca el resveratrol, situado en el hollejo de la uva o en las
pepitas y que es producido por la vid como respuesta a un ataque fúngico
(Rodriguez, 2006) y sobre el que se atribuyen acciones biológicas importantes en su
ingesta (Fernández, 2013).
[13]
Flavonoides
Esta familia de compuestos se caracteriza por tener en su estructura base 15 átomos
de carbono dispuestos en C6-C3-C6, de tipo 2-fenil-benzopirona (figura 6). Se trata
de un conjunto de moléculas muy importantes ya que dan las propiedades de color y
sensación en boca, además que de ellas dependen las características del
envejecimiento (Vila, 2002). Dependiendo del grado de oxidación del grupo pirano
se diferencian: flavonoles, antocianos, 3-flavonoides, flavanonoles y flavonas
siendo estos dos últimos menos importantes.
Figura 6.- Flavonoides (Hidalgo, 2010)
Los flavonoles son moléculas de color amarillo, que se forman como respuesta a la
radiación UV de la luz solar y localizándose en hollejos, raspones y hojas tanto en
variedades blancas como en tintas (Tomás y Núñez, 2015). En cuanto a su
estructura, presentan un enlace insaturado entre C2 y C3 y otro en C4 unido a un
oxígeno tal y como se representa en la figura 7 (Vila, 2002).
Figura 7.- Estructura del flavonol
[14]
Los antocianos son las moléculas en forma glicosídica de la forma aglicona que es
la antocianidina la cual necesita glicosidarse con un azúcar para estabilizarse. Estos
compuestos se encuentran en las vacuolas de las células del hollejo y en el caso de
las variedades tintoreras también en la pulpa. También aparecen en las hojas al final
del ciclo vegetativo.
Las antocianidinas están formadas por dos anillos bencénicos unidos por un
heterociclo hidroxigenado insaturado; cuando este oxígeno tiene un carácter iónico
la molécula se llama catión flavilio y es el responsable de la coloración roja. Según
el antociano del que se trate, varían algunos carbonos de los anillos benzénicos o del
anillo heterocíclico (Rodriguez, 2006).
En la figura 8 se representa la estructura de un antociano, observándose el catión
flavilio unido a una molécula de glucosa:
Figura 8.- Estructura de los antocianos (Fernández, 2013)
Por tanto, las antocianidinas presentan en varios carbonos grupos hidroxilo y a veces
grupos metoxilo. Dependiendo del número y la posición de estos se diferencian 5
antocianidinas: cianidina, delfinidina, malvidina, petunidina y peonidina. Los
azúcares que pueden formar parte de las antocianidinas pueden clasificarse en:
Monósidos: Glucosa, galactosa, ramnosa y arabinosa
Diósidos: xilosa, rutinosa, sambubiosa, genciobiosa, soforosa
Triósidos: cadenas de los azúcares anteriores, lineales o ramificados
En Vitis vinífera el color del vino tinto se debe a los antocianos monoméricos,
aunque no existe una relación directa entre la concentración de antocianos y el color
del caldo (Vila, 2002).
[15]
Una propiedad importante de estos compuestos es que se encuentran en equilibrio en
función del pH (figura 9) siendo la especie roja la que predomine a pH ácidos,
tornándose a azules con pH más básicos. Además de este equilibrio dinámico, otra
característica de la cual dependen es de la cantidad de sulfuroso puesto que la
especie bisulfito actúa como blanqueante sobre los antocianos (Fernández, 2013).
Figura 9.- Equilibrio de los antocianos según pH (Zamora, 2013)
En cuanto a los 3-flavanoles se distinguen dos tipos; los monómeros (catequinas) y
las proantocianidinas o taninos y cuya principal diferencia es que los segundos
tienen la capacidad de precipitar con las proteínas (Vila, 2002).
Dentro de las catequinas las principales son: (+) y (-) catequina y (+) y (-)
epicatequina. En su esqueleto aparecen dos anillos benzénicos y un heterociclo que
contienen un oxígeno (Vila, 2002).
[16]
Figura 10.- 3-flavanoles monómeros en la uva (Hidalgo, 2010)
A partir de dos monómeros las moléculas formadas se llaman proantocianidinas o
taninos y tienen la capacidad de liberar antocianidinas en medio ácido y caliente
(Rodriguez, 2006). Catequinas y taninos se encuentran en el hollejo y partes leñosas
de la baya y según su procedencia, se pueden agrupar en dos grandes grupos: los
condensados, contenidos en la uva, responden a las características descritas
anteriormente (diferenciándose diferentes tipos según la unión que los forma) y los
hidrolizables, procedentes de la madera de roble con propiedades diferentes.
Figura 11.- Tanino proantocianidol tipo B (Hidalgo, 2010)
1.2 Operaciones mecánicas para la extracción polifenólica
Existen algunas operaciones mecánicas enfocadas a activar la maceración en las
vinificaciones de vinos tintos. Estas operaciones se realizan tanto durante una
maceración prefermentativa y postfermentativa, como durante la fermentación
alcohólica. Antes de centrarnos en ellas se hablará del concepto de esta operación.
[17]
Conducción de la maceración
La maceración es el intercambio de sustancias entre las partes sólidas de la uva:
hollejos, pepitas y en su caso, raspones y la fase líquida. Estas partes sólidas se
mezclan con el mosto una vez estrujada la vendimia aportando principalmente
taninos y antocianos así como diversas sustancias aromáticas, compuestos
nitrogenados, polisacáridos, minerales, etc.
Existen diferentes formas de llevar a cabo la maceración, como por ejemplo durante
la fermentación alcohólica, prefermentativa en frío, postfermentativa, flash-
expansión, termovinificación o maceración carbónica (Benito, 2011).
Remontados
Esta operación consiste en extraer el mosto- vino en fermentación para ser
impulsado por medio de una bomba hacia la parte superior del mismo. Sus objetivos
son: homogeneización del mosto, mezcla de aditivos y en su caso, aireación del
mosto o la vendimia en fermentación, especialmente durante los primeros días para
favorecer una mayor población de levaduras que permitan un buen desarrollo de su
metabolismo, especialmente la síntesis de esteroles y ácidos grasos insaturados que
aumentan la permeabilidad de las membranas celulares; de hecho, la carencia de
suficiente oxígeno molecular es uno de los factores que provoca paradas de
fermentación (Hidalgo, 2010).
Los remontados se pueden dar con o sin aireación, dependiendo si a la salida del
caldo hay un pequeño recipiente abierto de unos cuantos hectolitros donde se vierte
el mosto en fermentación y desde el cual se aspira e impulsa con una bomba hacia la
parte superior del depósito.
Además, aparte de conseguir una mayor extracción, con la aireación se consigue una
estabilización del color entre antocianos y taninos ya que se da una polimerización
cruzada de ambos compuestos evitando la polimerización lineal de tanino- tanino y
antociano- antociano que pueden perderse fácilmente por precipitación debido a la
obtención de un alto peso molecular. (Fernández, 2013).
[18]
Bazuqueos
Esta técnica consiste en romper los canales preferenciales que se forman en el
sombrero, mediante la utilización de un bazuqueador manual o automático. De esta
forma se consigue romper el sombrero permitiendo al mosto que lo moje por
completo y pueda arrastrar consigo los compuestos extraídos (Gutiérrez, 2013).
Delestage
En este caso lo que se hace es sacar un volumen del vino que se pone en otro
depósito. Una vez reunido todo se echa de una vez sobre el sombrero. Es una técnica
más agresiva que las anteriores, provocando una gran rotura al sombrero y
aumentando así la extracción de los hollejos (Gutiérrez, 2013).
1.3 Proceso enzimático para la extracción polifenólica
Las enzimas son proteínas que ayudan a catalizar ciertas reacciones. Normalmente
solo actúan sobre un sustrato y a un pH y temperatura óptimos aunque unas tienen
mayor especificidad que otras. De igual manera, su actuación se ve afectada por la
presencia de compuestos inhibitorios o potenciadores.
Las uvas ya disponen de sus enzimas endógenas, pero hay ocasiones (de hecho es
bastante frecuente) que se adicionen a los mostos y vinos para conducir la
vinificación de acuerdo a las preferencias del enólogo.
Como ya se ha comentado anteriormente, los polifenoles se encuentran repartidos
por diferentes zonas de la baya. Cuando se usan en la maceración prefermentativa de
la vendimia, se adicionan preferiblemente justo en el encubado. Su acción se puede
ordenar de la siguiente manera (Palacios et al., 2003):
- Tras la rotura de la baya, comienza la extracción de los antocianos, taninos
libres y otros compuestos fácilmente extraíbles mediante la disgregación de
la pulpa que facilita el acceso a la cara interna del hollejo. El SO2 favorece
esta extracción.
- Luego las enzimas comienzan a degradar el hollejo del cual extraen los
taninos condensados y ligados a polisacáridos. En este momento la
concentración de alcohol en el caldo ha aumentado y este es capaz de ayudar
[19]
en el proceso. Se liberan también gracias a las enzimas moléculas aromáticas
unidas a precursores.
- Gracias al aumento de la fase alcohólica la difusión de los compuestos se ve
facilitada, y llega un momento que los propios antocianos inhiben las
enzimas y es el alcohol el que sigue degradando.
Por tanto la extracción con enzimas se ve reforzada por más factores como el SO2 y
el alcohol. Pero también operaciones como la agitación mecánica actúan
sinérgicamente favoreciendo la extracción de todos estos compuestos (Gutiérrez,
2013).
La principal ventaja que suponen las enzimas es que ayudan en la liberación de
antocianos y taninos en las primeras fases de la maceración, que si se da una
pequeña aireación favorece las polimerizaciones cruzadas estabilizando el color
(Palacios et al, 2003).
En definitiva, para la extracción polifenólica es muy importante tener en cuenta la
composición de la pared celular ya que de su degradación va a depender el control
de las extracciones y maceraciones en la vinificación. En todo caso, el color del vino
va a depender del potencial fenólico de la uva. Este a su vez viene marcado por
factores intrínsecos como la variedad, el suelo y métodos de cultivo del viñedo que
afectan a la producción, composición, estado sanitario e integridad de la vid.
1.4 Tipos de enzimas de interés enológico. Características y función
Dado que en la pared de las bayas hay una gran diversidad de compuestos, no
cualquier enzima es capaz de catalizar su degradación por lo que dependiendo del
sustrato del que se trate actuará un tipo de enzima u otro. También es importante en
cuanto a la extracción de compuestos en las bayas la localización de éstos puesto que
mientras hay enzimas que actúan sobre componentes de la lámina media, otras lo
hacen sobre las paredes primaria y/o secundaria. Las enzimas relevantes en cuanto a
la extracción de los compuestos de las bayas en enología son las siguientes:
[20]
1.4.1 Pectinasas
Son enzimas con actividad pectolítica, capaces de degradar la pectina de las paredes
celulares, dentro de la cual es más soluble y por tanto resulta más sencilla de
degradar la que se encuentra formando la lámina media. Dentro de las pectinasas se
diferencian cuatro tipos (Romero, 2008):
- La Pectinesterasa (PE), que produce una desesterificación de la pectina
rompiendo los enlaces del grupo metilo y liberando un ácido
poligaracturónico más un hidróxido de metilo. Es de los principales
causantes del reblandecimiento de la baya una vez alcanzada la maduración
de ésta.
- La poligalacturonasa (PG). Se trata de una enzima de despolimerizante la
cual rompe los enlaces entre unidades de ácido galacturónico no esterificado.
Dentro de las poligaracturonasas se encuentran las endo-PG que actúan al
azar a lo largo de la cadena y las exo-PG que rompe los enlaces no reducidos
del final de la cadena.
- La pectinliasa (PL) es también despolimerizante y se caracteriza porque
rompe de manera aleatoria los enlaces entre moléculas metiladas, eliminando
a su vez una molécula de agua de cada enlace roto y dejando una de las
cadenas con un doble enlace C=C. Esto provoca que las cadenas de
poligaracturanos se vayan acortando progresivamente.
- La pectatoliasa (PAL) que, de forma similar a la liasa anterior, rompe
uniones glicosídicas entre moléculas de ácido galacturónico no metiladas en
pectinas poco metoxiladas. Es también por tanto despolimerizante.
1.4.2 Hemicelulasas
Para poder degradar la hemicelulosa de las paredes hace falta un complejo
enzimático con varias enzimas con su respectiva especificidad y modos de acción.
Se distinguen: arabinasas, xilanasas, galactanasas y glucanasas dependiendo del
sustrato que sean capaces de hidrolizar.
[21]
1.4.3 Celulasas
Se trata, al igual que las hemicelulasa, de un complejo enzimático formado por endo-
glucanasas, exo-glucanasas y celobiasas o β-glucosidasa. La celobiasa es capaz de
degradar la celobiosa liberando dos moléculas de glucosa lo que hace que se inhiban
las dos glucanasas. Estas encimas se encuentran mayoritariamente en las paredes
primaria y secundaria de la pared celular, donde provocan una disminución de la
cohesión entre las fibras de celulosa y la pared primaria (ayudadas por otras enzimas
como las celobiosas, hemicelulosas y poligalacturonasas). Cuando el sustrato
celulosa tiene un alto grado de cristalización es difícilmente degradable pero esto
cambia cuando el grado de cristalización es bajo (Adoración, 2013).
1.4.4 Galactosidasas
Se distinguen α-galactosidasa y β-galacotsidasa y actúan sobre la α-galactosa y β-
galactosa respectivamente. La α- galactosidasa actúa sobre el ramnogalacturonano
II, los galactoglucomananos y galactomananos mientras que la β-galactosidasa actúa
sobre ramnogalacturonanos I y xiloglucanos.
Según estudios de Ortega-Regules en 2006, su acción aumenta a medida que la baya
va madurando y puede que tenga un papel importante en el reblandecimiento de la
pared de la baya (al igual que la PE o la PG). Otros autores como Barnavon y
Nunan, con sus respectivos colaboradores, pudieron ver que disminuye en el envero
(Romero, 2008).
1.4.5 Proteasas
Estas enzimas, cuando se adicionan al estrujado de uvas o al mosto, actúan
hidrolizando las proteínas glicosiladas de la pared celular. Consecuentemente se
produce la liberación de péptidos de las paredes celulares. Existen diferentes tipos de
proteasas como la lisina, autolisina o extensina peroxidasa.
[22]
1.5 Preparados enzimáticos de uso enológico
El empleo de enzimas en la elaboración de los vinos se ha vuelto una práctica muy
común, con la que se pretende lograr mejores clarificaciones y mayor rendimiento de
los mostos, mayor extracción de compuestos responsables del color en el caso de
tintos o mayor extracción de compuestos aromáticos en el caso de blancos.
Para su obtención se utiliza el material extracelular obtenido a partir de
fermentaciones controladas de diferentes cepas de Aspergillus Niger. Así pues,
dependiendo de la cepa que se utilice se obtiene un preparado con diferentes
actividades enzimáticas los cuales, pueden estar compuestos con un tipo de enzima o
enzimas para un fin determinado. La concentración de enzimas resultantes de estas
preparaciones dependerá de la cepa utilizada, las condiciones de fermentación y el
sustrato fermentado (Adoración, 2013). Es decir que diferentes preparados
comerciales presentan diferentes efectos y distinta eficacia sobre un mismo vino. No
obstante, a la hora de comprar un producto es importante medir su eficacia y tener en
cuenta las actividades enzimáticas principales así como las secundarias de otras
enzimas también presentes en menor concentración.
Las actividades enzimáticas principales en los preparados son pectolíticas,
concretamente se utilizan: pectinliasas (provocan una rápida disminución de la
viscosidad del mosto y el desfangado del mosto se acelera), poligalacturonasas
(junto con las PL ayudan a mejorar la clarificación de mostos y vinos) y
pectinesterasas (Adoración, 2013).
Como actividades secundarias se encuentran hemicelulasas, celulasas, proteasas o
glicosidasas que refuerzan la acción de las pectinasas. Por otro lado, es importante
tener en cuenta los preparados con acción glucosidásica, ya que si bien son positivos
para liberar precursores aromáticos, la hidrólisis de los enlaces glucosídicos también
afecta a la unión de las antocianinas con sus respectivos azúcares provocando la
decoloración del vino. Además también se producen cambios en el gusto del caldo
ya que con la acción de celulasas y hemicelulasas se liberan taninos.
Ahora bien, si nos centramos en la extracción de materia colorante para el caso de
tintos, los preparados utilizados son aquellos con actividades PG, PE y PL y
celulasa y hemicelulasa como secundarias. Lo importante es romper los
polisacáridos de las paredes celulares donde se encuentran mayoritariamente los
[23]
compuestos polifenólicos, pero como ya se ha comentado anteriormente al no estar
todos ubicados en las mismas zonas se necesitan distintas actividades para romper el
máximo número de compuestos de la pared posible.
No obstante, a pesar de ser un tema muy estudiado, no hay unos resultados certeros
y generales de la utilización de enzimas ya que mientras que autores como Ought y
colaboradores que consiguieron obtener una mayor extracción de compuestos
fenólicos en menor tiempo con respecto al control por medio de la utilización de
pectinasas, otros como Alvarez y colaboradores observaron en sus estudios
pequeños aumentos en la extracción de compuestos polifenólicos y del color con
respecto al control pero también un aumento en astringencia y amargor, lo que
supone un efecto negativo (Romero, 2008).
Es muy importante también tener en cuenta y controlar los preparados que contengan
pectínesterasa ya que libera grupos metoxi de las pectinas tal y como se ha indicado
anteriormente. El problema de esto radica en que el metanol es un alcohol tóxico
para el cuerpo y en altas concentraciones puede incluso provocar la muerte. De ahí el
interés en controlar su contenido en el vino y que sus cantidades máximas se hallen
legisladas.
2 OBJETIVO
Con la realización de este trabajo por un lado se elaboró durante la vendimia del
2014 vino tinto de la D.O.Ca. Rioja de la variedad Tempranillo, siguiendo una
metodología sin empleo de enzimas pectolíticas, y se trató de conocer de una forma
más detallada el potencial uso de las enzimas en la recuperación de los subproductos
de la vinificación, realizando una serie de pruebas con diferentes enzimas, a
diferentes concentraciones y con diferentes tiempos de maceración sobre una misma
matriz que eran los orujos, constituidos fundamentalmente por los hollejos, y
obtenidos tras la vinificación del vino.
Para realizar este estudio se analizaron los parámetros de color (Índice de color) y de
polifenoles totales (Índice de polifenoles totales).
[24]
3 MATERIALES Y METODOLOGÍA
3.1 Elaboración de vino a partir de uva de la variedad Tempranillo
Se elaboró un vino tinto en la Bodega institucional de La Rioja (La Grajera) durante
la campaña de vendimia del año 2014. Se expone en este apartado la metodología
seguida para la vinificación.
La uva utilizada fue de la variedad Tempranillo, variedad por excelencia en esta
zona ya que tanto por su buen comportamiento en la vinificación como por sus
características organolépticas y comportamiento en viñedo es actualmente la más
cultivada en la DOCa Rioja.
La vendimia se realizó un 6 de Octubre de 2014, en palots de 200 Kg hasta llegar a
un total de 16000 Kg. Estos palots se iban volcando sobre una tolva que mediante
vibración transportaba la vendimia hacia la despalilladora- estrujadora para acabar
encubada en un depósito de acero inoxidable y forma troncocónica. Es importante
destacar la función de esta máquina puesto que lo que se lleva a cabo en la
despalilladora- estrujadora es un cambio en el estado físico de la vendimia pasando
de ser una masa heterogénea a una más homogénea.
Despalillado
- Disminución del volumen de vendimia
- Evitar pérdidas de antocianos y otros polifenoles por absorción del raspón
- Alcance de un mayor grado alcohólico al quitar los raspones que lo absorben
- Disminución del oxígeno disuelto al disminuir los huecos en la masa
Estrujado
- Extracción más temprana y comienzo de la fermentación alcohólica
[25]
-
Figura 12.- Tren formado por la tolva, despalilladora y estrujadora a favor de la gravedad
Sulfitado del mosto
A su salida de la estrujadora se fue inyectando gaseoso a razón de 30 mg/Kg de
vendimia. El dispositivo utilizado fue el que se muestra en la figura 13; consiste en
un equipo estático que dosifica el sulfuroso en pequeñas dosis directamente sobre la
tubería de vendimia durante el proceso de trasiego de la pasta, con un caudal
regulable.
Figura 13.- Dosificador del sulfuroso gaseoso y bombona con el gas
Adiciones al mosto
Dado que la vendimia entró algo blanda, no se adicionaron enzimas como apoyo a la
degradación de los hollejos. Sí se adicionaron, en cambio, taninos de la marca VR
[26]
Supra de la casa Laffort (ANEXO I) a razón de 30 g/hl. Se trata de taninos
proantociánicos y elágicos cuyas funciones son las siguientes:
- Favorecer la protección de la materia colorante. Ya que al combinarse con
los antocianos estos se estabilizan y además precipita las proteínas del mosto
- Inhibición de las enzimas naturales de oxidación lacasa y tirosinasa (PFO)
complementando a la función antioxidásica del
- Favorece la clarificación de los mostos y vinos
- Mejora de la estructura de los vinos en boca
Se adicionaron directamente durante el encubado a fin de lograr un mayor reparto.
Una vez que toda la vendimia estaba en el depósito, se inoculó con LSA del tipo ICV
D254 (ANEXO I) de la casa Lallemand. Estas levaduras fueron del tipo
Saccharomyces cerevisiae cerevisiae y entre sus características más importantes
destacan:
- Liberación importante de polisacáridos durante la fermentación
- Fase de latencia corta y alta necesidad de aireaciones en la fase tumultuosa
- Producción de acidez volátil entre 0.3 y 0.45 g/l HAcO
- Baja producción de SO2 y SH2
Como ya es conocido, las levaduras siguen un patrón bastante bien definido de su
desarrollo durante la fermentación y por tanto una fase de latencia corta quiere decir
que su aclimatación al medio es rápida para dar lugar a la fase exponencial (en la que
su población se multiplica) de forma rápida. Se comenzaría también rápidamente el
inicio de fermentación lo cual es importante porque como ya se ha comentado la
vendimia entró blanda y con unas levaduras haciendo pronto su trabajo el oxígeno se
desplaza del medio haciendo que las enzimas oxidásicas actúen lo menos posible.
Al día siguiente de la siembra de LSA se adicionaron nutrientes de la marca
Moxaferm de Oenobrands (ANEXO I) a razón de 15 g/hl. Tal y como dice el
prospecto se adicionaron la mitad en ese momento y la otra mitad a los dos días,
cuando se estipuló que la fermentación alcohólica habría llegado al ecuador. La
dosis empleada en la segunda adición fue la misma. Estos nutrientes están formados
en un 60% de levaduras inactivadas, sales de amonio en un 39.96% y tiamina en un
0.04%.
[27]
Fin FOH
La fermentación duró 9 días; hasta el 15 de Octubre de 2014. Durante todo este
tiempo se hizo el control de la fermentación cuya gráfica de la cinética de
fermentación se muestra en el apartado de Resultados.
Una vez terminada la fermentación alcohólica se sangró el vino y se llevó a un
depósito de 10000 litros de capacidad, momento en el que se analizó químicamente.
Se procedió entonces a descubar los hollejos del sombrero que se prensaron con una
prensa vertical (figura 14).
Figura 14.- Prensa vertical
3.2 Métodos de análisis físico-químicos del mosto y del vino elaborado
Cuando entró la uva a la bodega se midieron parámetros de temperatura, densidad,
grado probable, pH, acidez total y sulfuroso libre y total.
Para la temperatura y densidad se utilizaron un termómetro y densímetro
convencionales, así como la acidez total que se obtuvo mediante una valoración con
hidróxido de sodio. En cambio para conocer el pH y suluroso libre y total se utilizó
un aparato automático llamado TitroMatic 2S de Crison que se basaba en el método
de Ripper para la medición de los sulfurosos.
Para conocer el grado probable se cotejaban dos resultados; el proporcionado por el
densímetro y mediante unas tablas de conversión y el proporcionado por un
refractómetro digital Atago WM-7.
[28]
Una vez el vino finalizó la fermentación alcohólica se midieron los parámetros de
color e IPT mediante espectrofotometría, utilizando un espectrofotómetro de la
marca Thermo, modelo Spectronic Helios. En el caso de la medición de IPT primero
hubo que tratar la muestra y diluirla 100 veces (1 ml de vino en 100 ml de agua
destilada) puesto que si no se saldría de rango y el dato no sería del todo certero. La
absorbancia se midió en el ultravioleta a 280 nm y la cubeta utilizada fue de cuarzo.
Una vez tomada la absorbancia y para conocer el valor de IPT real, al resultado
obtenido se multiplicó por 100 ya que es el factor de dilución.
En el caso del Índice de color, se utilizó el método de Glories (1984) en el cual
primero se miden por separado las muestras a 420, 520 y 620 nm en cubetas de 1
mm de espesor y de plástico y a los resultados obtenidos se les multiplicó por 10
para expresar los resultados en base a 1 cm de longitud óptica. Así pues, se
calcularon Índice de color y Tonalidad mediante las siguientes operaciones:
También se estimó la cantidad de g/l de taninos como sigue:
Sobre el vino terminado también se midieron ácido málico y azúcares reductores
mediante un método enzimático utilizando un reflectómetro RQFlex 10 de la marca
Merck y acidez volátil con un destilador de Raypa modelo Alcotest.
Por último, en cuanto a los hollejos de las uvas de Tempranillo vinificadas, cuando
se descubaron a la prensa se cogió una pequeña porción en una bolsa de plástico y
fueron transportados al laboratorio de Bioquímica y Biología molecular del
departamento de agricultura y alimentación de la Universidad de La Rioja.
3.3 Tratamientos de los hollejos para la extracción de polifenoles
Materiales empleados
- Hollejos obtenidos en los apartados anteriores
[29]
- Agitador rotativo
- Metanol técnico 99%, Cofracas
- Tubos Falcon de 50 y 15 ml (Falcon 50 y Falcon 15)
- Aparato homogeneizador Masticator
- Balanza analítica
- Centrífuga Megafugue 1.0
- Vórtex
Enzimas utilizadas para los ensayos (ANEXO II)
Lallzyme Ex –V (Lallemand)
Se trata de pectinasas (hasta un 70%), celuasas y hemicelulasas a partir del hongo
Aspergillus niger. Especialmente indicadas para el periodo de maceración ya que
todas ellas en su conjunto consiguen una ruptura más rápida de las paredes celulares,
con un alta actividad secundaria que proporciona la liberación de los polisacáridos.
Endozym Rouge (AEB Ibérica S.A.)
Se trata también de una enzima de maceración, con actividad principal pectolítica y
celulasa y hemicelulasa como secundarias, obtenidas a partir de Aspergillus niger.
Para su mayor efectividad en cuanto a degradación de las paredes celulares se ha
comprobado que la temperatura óptima sería de 25 ºC. Además está indicado que se
encuentra purificada en pectinesterasas, cinamilesterasas y antocianasas.
Cuveé Blanc (Lallemand)
Especificadas solo para maceración de uvas blancas, este producto está elaborado a
partir de pectinasa granulada con actividad β- glicosidasa. En este caso, las
pectinasas tienen un alto grado de actividad glicosidasa pero bajo en cuanto a
celulass y hemicelulasas ya que al tratarse de uvas blancas no es necesario una
maceración como se hace en tintas sino que interesa extraer compuestos terpénicos
responsables de los aromas.
Aquí las temperaturas varían entre 5 y 12 ºC siendo el tiempo de extracción de 2 a 12
horas respectivamente. Es decir que a menor temperatura más rápida es la acción.
[30]
Parámetros medidos
Los parámetros que se tuvieron en cuenta para la realización del estudio fueron los
siguientes: Intensidad colorante (IC), Tonalidad (T) e Índice de polifenoles totales
(IPT).
Para calcular el IC se utilizó el método de Glories el cual sugiere que el IC
corresponde a la suma de las absorbancias a 420, 520 y 620 nm (Glories, 1984)
medidas en cubetas de 1 mm de espesor y de plástico. A la hora de expresar los
resultados se multiplicó por 10 para darlos en base a 1 cm de longitud óptica.
Cada una de las longitudes de onda representa a un color diferente y su análisis
puede dar información sobre el estado del caldo o la evolución del mismo. Es
importante destacar que es una medida adimensional y también es importante tener
en cuenta que cuando se dice que una muestra que absorbe a 420 nm y da un valor
elevado, esta tiene muchos colores amarillos. La razón viene dada porque dichas
moléculas absorben a un color complementario al amarillo, haciéndonos a nosotros
verlo. En la figura 15 se representan las longitudes de onda, los colores que
representan y sus complementarios.
- Absorbancia a 420 nm: Con esta medida se consiguen determinar los colores
amarillos/marrones de un vino. Los compuestos no flavonoides no
contribuyen de forma directa al color del vino pero pueden oxidarse química
o enzimáticamente dando lugar a tonalidades amarillas/ marrones. Esto se
conoce como el pardeamiento, visible en vinos blancos ya que en el caso de
los tintos su coloración roja lo enmascara. Los compuestos principalmente
responsables de este pardeamiento son los ácidos hidroxicinámicos (también
Figura 15.- Colores complementarios (Fuente: García, 2013)
[31]
son relevantes en cuanto al color gracias a su capacidad de actuar como
copigmentos) y algunos flavonoles.
- Absorbancia a 520 nm: Da información sobre los compuestos que reflejan la
luz roja. Estos son los compuestos más abundantes en vinos jóvenes ya que
tienen alta concentración de antocianos y todavía no tienen el tiempo
suficiente como para que se degraden. Lo interesante es estabilizar la materia
colorante para que no caiga el color.
- Absorbancia a 620 nm: En este caso se podrán conocer la cantidad de
tonalidades azules. Al igual que en el caso anterior, estos tonos son
mayoritarios en vinos jóvenes y dependen del pH.
En cuanto a la Tonalidad, se calculó como la razón resultante de dividir la
absorbancia a 420 entre la absorbancia a 520 nm. Una mayor tonalidad indicaría la
mayor presencia del color amarillo, es decir vinos más tejas que podrían relacionarse
con un mayor envejecimiento o también con una posible oxidación.
Por el contrario, una tonalidad menor sería indicativa de vinos tintos más jóvenes,
por ejemplo.
Como ya se ha comentado, con las enzimas se pretende romper las paredes de los
granos de uva a fin de extraer los compuestos polifenólicos que se encuentran, en su
gran mayoría, en ella. Lo cierto es que en la extracción de estos compuestos entran
una gran variedad de factores como el tiempo de contacto con la piel, la graduación
alcohólica, la temperatura de fermentación, la agitación, la intensidad del prensado,
la variedad de uva, etc. Es decir que los datos obtenidos en este experimento podrían
variar en el caso de que se analizase otro vino vinificado de manera diferente y por
tanto las enzimas no son las únicas responsables de la estructura polifenólica de un
vino.
El IPT se rige por medida de absorbancia en el UV de dicho anillo. Es decir, que se
tiene en cuenta que el anillo fenol es característico de estos compuestos y se actúa en
base a él.
La longitud de onda a utilizar para este método fue 280 nm puesto que es absorbida
en cualquier tipo de vino y para cualquiera de las sustancias fenólicas. Cuando se
[32]
trata de vinos, el método señala que hay que hacer una dilución antes pero dado que
estamos hablando de una extracción a partir de uvas ya tratadas con enzimas
previamente, la concentración fue tan pequeña que no hizo falta. Las cubetas que se
utilizaron fueron de cuarzo y 1 cm de espesor.
3.4 Extracción mecánica y en metanol de los polifenoles de los hollejos
En una primera extracción, se pesaron los hollejos (tabla 1) y se metieron en una
bolsa ziploc junto con 25 ml de metanol. Se procesaron las muestras con el triturador
Masticator durante 20 segundos, 3 veces. Finalizados los ciclos se vertió su
contenido en tubos Falcon 50 incluyendo los sólidos y se centrifugaron a 3000xg
durante 25 minutos.
Una vez separadas la fase sólida y líquida se trasvasaron 15 ml del sobrenadante a
otro Falcon 50. Se repitió el proceso con las partes sólidas añadiendo 10 ml de
metanol y agitando con vórtex, tras lo que se centrifugó a 3000xg durante 25
minutos y se recogieron 10 ml del ml del sobrenadante que se juntaron al anterior.
Tabla 1.- Preparación de las muestras para la extracción mecánica
Peso hollejos (g)
Media aritmética (g)
Desviación estándar (g)
3,03 3,08 0,0557 3,14
3,07
Figura 16.- Falcon 50 con los productos extraídos en la extracción mecánica
[33]
3.5 Extracción de los polifenoles de los hollejos mediante el uso de enzimas
Se comenzó preparando un stock para cada enzima según se indica en la tabla 2:
Tabla 2.- Stocks para la cada una de las enzimas
Nombre de la enzima
Casa comercial Código Enzima
(g)
Agua desionizada
(ml)
[stock] (g/l)
Lallzyme Ex – V Lallemand A 0,3117 50 6,234
Endozym Rouge AEB Ibérica SA B 0,3038 50 6,076
Cuveé Blanc Lallemand C 0,3019 50 6,038
A continuación se pesaron los hollejos (tabla 3) y se colocaron en tubos Falcon 50.
Se añadió 1 ml de la disolución stock de la enzima correspondiente y se adicionó a
cada tubo 10 ml de agua desionizada, llevando cada muestra a un volumen final de
aproximadamente 15 ml con agua. Las muestras se mantuvieron a temperatura
ambiente durante 24 horas con agitación continua en el agitador rotativo tal y como
se muestra en la figura 18.
Figura 17.- Agitador rotativo
Tabla 3.- Preparación de las muestras para la extracción enzimática
Tubo Enzima
Hollejos
(g)
Vol. stock de enzima (ml)
Vol. agua desionizada
(ml)
Contenido final de la enzima
(g/l) EE1 A 3,36 1 10 0,4 EE2 A 3,33 1 10 0,4 EE3 B 3,3 1 10 0,4 EE4 B 3,32 1 10 0,4 EE5 C 3,3 1 10 0,4 EE6 C 3,35 1 10 0,4 EE01 - 3,34 0 11 0,0 EE02 - 3,39 0 11 0,0
[34]
A continuación lo que se hizo fue una extracción de los compuestos a una fase
orgánica de metanol. Para ello, una vez incubados los tubos se adicionaron 15 ml de
metanol y se agitó con vórtex para seguidamente centrifugar durante 25 minutos a
3000xg. Se recuperaron primero 15 ml del sobrenadante, se añadieron 5 ml de
metanol al precipitado de sólidos, se agitó con vórtex y se volvió a centrifugar en las
mismas condiciones. Se recogieron 5 ml del sobrenadante que se juntaron al anterior.
Figura 18.- Tubos Falcon con hollejos tras la centrifugación (izquierda) y sobrenadantes recuperados tras las centrifugaciones (derecha)
3.5.1 Estudio del efecto de la enzima Lallzyme Ex – V sobre los hollejos a
diferentes tiempos de incubación
Una vez obtenidos los resultados anteriores, se eligió la enzima Lallzyme Ex – V
para continuar con los estudios. Así pues, se procedió a averiguar la influencia que
tiene el tiempo sobre la extracción de polifenoles con la enzima. Se preparó una
disolución stock con 0.6036 g de enzima en 50 ml de agua desionizada:
Se prepararon las muestras que se indican en la tabla 4 y se mantuvieron a
temperatura ambiente con agitación en el agitador rotativo durante el tiempo
indicado.
[35]
Tabla 4.- Preparación de las muestras
Tubo Hollejos (g)
Vol. stock de enzima
(ml)
Vol. agua desionizada
(ml)
Contenido final de la enzima
(g/l)
Tiempo de incubación
(h) C1 3,14 0 11 0,0 0 C2 3,13 0 11 0,0 E1 3,28 1 10 0,8 E2 3,34 1 10 0,8 C3 3,23 0 11 0,0 1 C4 3,3 0 11 0,0 E3 3,25 1 10 0,8 E4 3,3 1 10 0,8 C5 3,49 0 11 0,0 2 C6 3,42 0 11 0,0 E5 3,43 1 10 0,8 E6 3,41 1 10 0,8 C7 3,28 0 11 0,0 4 C8 3,25 0 11 0,0 E7 3,27 1 10 0,8 E8 3,28 1 10 0,8 C9 3,34 0 11 0,0 7 C10 3,33 0 11 0,0 E9 3,31 1 10 0,8 E10 3,27 1 10 0,8 C11 3,2 0 11 0,0 24 C12 3,23 0 11 0,0 E11 3,33 1 10 0,8 E12 3,39 1 10 0,8
Después de la incubación se añadieron 15 ml de metanol a cada muestra y se agitó
con vórtex. Se centrifugaron las muestras a 3000xg durante 25 minutos y se
recogieron 15 ml del sobrenadante en tubos Falcon 15 para su posterior análisis de
color e IPT.
3.5.2 Estudio del efecto de Lallzyme Ex – V sobre los hollejos en diferentes
concentraciones
A continuación lo que se hizo fue estudiar la acción de la misma enzima pero con
diferentes concentraciones y con agitación continua durante un tiempo fijo de 2
horas.
Se preparó una disolución stock de la enzima de:
[36]
A partir de este stock de enzima se prepararon las muestras en los tubos con los
hollejos y la cantidad de enzima y agua desionizada que se indica en la tabla 5. Al
final todos los tubos alcanzaban el volumen aproximado de 15 ml.
Tabla 5.- Preparación de las muestras para la extracción a diferentes concentraciones de Lallzyme Ex –V
Tubo Hollejos (g) Agua
desionizada (ml)
Vol. stock de enzima
(µl)
Contenido final de la enzima
(g/l)
Tiempo incubació
n (h) A1 3,29 11,00 0,00 0,000 2 A2 3,27 11,00 0,00 0,000 2 B1 3,31 10,80 165 0,791 2 B2 3,29 10,80 165 0,791 2 C1 3,32 10,70 330 1,581 2 C2 3,30 10,70 330 1,581 2 D1 3,31 10,30 660 3,162 2 D2 3,30 10,30 660 3,162 2
3.6 Estudio de la desviación estándar relativa del método
Por último se estudió la desviación del método de extracción metanólica empleado
en el estudio de las enzimas pectolíticas. Se prepararon 8 muestras en tubos Falcon
50 con aproximadamente 3 gramos de hollejos sumergidos en agua desionizada
hasta un volumen final de 15 ml. Se adicionaron 15 ml de metanol y seguidamente
se agitó vigorosamente con el vórtex. Luego se llevaron a centrifugar durante 25
minutos a 3000xg.
Tras la centrifugación se recuperaron 15 ml del sobrenadante que se llevaron a un
tubo Falcon 15. En la tabla 6 se observa el procedimiento llevado a cabo en la
preparación de las muestras.
[37]
Tabla 6.- Preparación de las muestras para estudiar la desviación estándar relativa
Tubo Hollejos (g)
Agua (ml)
Metanol (ml)
A1 3,32 11,00 15,00 A2 3,27 11,00 15,00 B1 3,3 11,00 15,00 B2 3,29 11,00 15,00 C1 3,3 11,00 15,00 C2 3,27 11,00 15,00 D1 3,32 11,00 15,00 D2 3,31 11,00 15,00
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Elaboración del vino a partir de uva de la variedad Tempranillo
En este apartado se exponen los resultados obtenidos a partir de los parámetros
medidos durante la elaboración del vino en el laboratorio de la bodega institucional
del Gobierno de La Rioja.
En las tablas 7, 8 y 9 se muestran los resultados de los análisis físico - químicos del
mosto y del vino obtenido al final de la fermentación alcohólica, la cual duró 9 días,
tal y como muestra el gráfico 1. Como se observa, el pH de mosto y de vino se
encontraba en el rango de valores por encima de 3,5, y el valor del contenido en
ácido málico del vino (1,72 g/l) era bajo. Estos datos concuerdan con el hecho de
que la vendimia fue tardía y que consecuentemente la textura de las bayas era
blanda. Además estas observaciones motivaron que no se añadieran enzimas
pectolíticas al encubado.
Tabla 7.- Análisis de la vendimia
Grado alcohólico probable (%vol)
T (C) Dens (g/l) Densím Refractóm pH AT (g/l) SO2 l (mg/l) SO2 t (mg/l)
16 1100 13,8 14 3,6 5,65 23 68
Tabla 8.- Análisis fenólico del vino al final de fermentación
A420 A520 A620 IC T A280 IPT g (tanino)/l 0,435 0,985 0,12 15,4 0,44 1,041 52,05 3,64
[38]
Tabla 9.- Análisis químico del vino al final de la fermentación
Ác. Málico pH AT (g/l TH2) AV (g/l HAcO) Az. Reductores (g/) 1,72 3,52 6,07 0,27 < 0,65
Gráfico 1.- Cinética de fermentación
En el gráfico 1 se muestra que la evolución de la fermentación alcohólica fue
satisfactoria y que la actividad de las levaduras inoculadas fue la esperada, de tal
modo que la temperatura de fermentación se mantuvo en todo momento por debajo
de los 28ºC y se correlacionó inversamente con el consumo de los azúcares del
mosto. La levadura empleada (ICV D254 de la especie Saccharomyces cerevisiae
cerevisiae) era una levadura aislada de vinos tintos de la variedad Syrah del valle del
Rhône y, como indican los proveedores, estaba seleccionada entre otras razones, por
su tolerancia al atanol (hasta el 16%), su facilidad para la fermentación de tintos y
por liberar polisacáridos durante la fermentación (http://www.icv.fr/en/oenological-
products/wine-yeasts/icv-d254). Esta levadura demostró unas excelentes
características tecnológicas para la fermentación del vino de este trabajo.
4.2 Extracción mecánica y en metanol de los polifenoles de los hollejos
En este apartado se exponen los resultados obtenidos a partir de las muestras
procesadas por el procedimiento mecánico explicado en el apartado 3.4. Además se
0
5
10
15
20
25
30
980
1000
1020
1040
1060
1080
1100
1120 ºC g/l
Densidad
Temperatura
[39]
muestran también los resultados obtenidos en el vino al final de la fermentación
alcohólica.
Gráfico 2.- Parámetros del color del extracto de los hollejos con metanol
Gráfico 3.- Parámetros del color del vino yema obtenido al final de la fermentación alcohólica
Como se puede observar, los parámetros de color del vino obtenido mostraron unos
valores elevados típicos de un vino de la variedad Tempranillo, y el índice de color
extraído de los hollejos prensados fue 26 veces más bajo, predominando asimismo
las tonalidades amarillas/marrones en este extracto obtenido de los hollejos
recogidos al final del prensado. Estos datos concuerdan con los resultados siguientes
obtenidos en el análisis de polifenoles totales:
IPT del vino: 52,05; IPT del extracto de hollejos: 2,34,
donde el valor del IPT del extracto es 22 veces menor que el del vino. Es decir que la
extracción de compuestos polifenólicos de los hollejos una vez prensados es en torno
a 20 veces menor que en el vino una vez concluida la maceración/ fermentación.
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700
420 nm 520 nm 620 nm IC
Abs
orba
ncia
(U.A
.)
0 2 4 6 8
10 12 14 16 18
420 nm 520 nm 620 nm IC
Abs
orba
ncia
(U.A
.)
[40]
Estos resultados indican que el método empleado durante la elaboración del vino
para conseguir la máxima extracción de color y que éste se mantuviera estable en el
vino final, fue muy acertado. Presumiblemente la adición de los taninos enológicos a
las uvas de esta vendimia en un estado de maduración elevado, unido al empleo de la
levadura seleccionada, hayan constituido una estrategia acertada para la extracción y
estabilidad del color en el vino, incluso sin la adición de enzimas pectolíticas al
estrujado de uvas en momentos previos o iniciales de la fermentación.
En cualquier caso, la recuperación de color de unos productos de desecho de la
bodega, como son los orujos que contienen mayoritariamente los restos sólidos de
los hollejos y pepitas, y la posible revalorización de estos productos continúa siendo
un objetivo importante y una línea actual de I+D+I (Rohm et al., 2015).
4.3 Extracciones de los polifenoles de los hollejos mediante el uso de enzimas
Gráfico 4.- Absorbancias e IC de los extractos de los hollejos tratados con distintas enzimas pectolíticas
Según se observa en el gráfico 4, la enzima Lallzyme Ex –V (A) fue capaz de extraer
compuestos responsables del color rojo en mayor cantidad que las otras enzimas
ensayadas. También se observa que estadísticamente las diferencias no eran
significativas y que la larga agitación mantenida durante 24 horas en el agitador
rotativo provocó una alta desviación respecto a la media aritmética de los valores
medidos en las muestras controles sin enzima y en las muestras tratadas con la
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
Lallzyme Ex - V
Endozym Rouge
Cuveé Blanc Control negativo
Abs
orba
ncia
s (U
.A.)
420 nm
520 nm
620 nm
IC
[41]
enzima Cuveé Blanc (C), especialmente recomendada para vinos blancos, que
presenta una baja actividad de maceración debido a su bajo contenido en celulasas y
hemicelulasas (Anexo II, especificaciones de la enzima comercial).
En el gráfico 5 se muestran los resultados del análisis de IPT realizado con el fin de
buscar diferencias más claras entre los tratamientos.
Gráfico 5.- IPT según tipo de enzima
Lo que se observa atendiendo a los IPT es que se confirma que la enzima Cuveé
Blanc no favorecía la extracción de los compuestos polifenólicos y los valores del
IPT no se diferenciaban de los valores de las muestras control mantenidas en
agitación sin adición de enzimas. Además también se confirma que la enzima
Lallzyme Ex –V logró la mayor extracción de polifenoles y por lo tanto fue la
seleccionada para continuar con los ensayos posteriores.
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
Lallzyme Ex - V
Endozym Rouge
Cuveé Blanc Control negativo
Abs
orba
ncia
s (U
.A.)
[42]
4.3.1 Efecto de la enzima Lallzyme Ex – V sobre los hollejos a diferentes
tiempos de incubación
Gráfico 6.- Absorbancias e IC de los extractos de los hollejos tratados con Lallzyme Ex –V durante distinto tiempo.
En el gráfico 6 se representa para cada tiempo los controles sin adición de enzima,
representados con la letra C, y al lado las muestras tratadas durante el mismo tiempo
con 0,8 g/l de enzima, representadas con la letra E. Además también se indica el
número de horas que las muestras de los hollejos permanecieron con agitación a
temperatura ambiente con el tratamiento.
Se puede ver cómo en las muestras tratadas durante 1 y 2 horas con la enzima, los
extractos obtenidos presentaban valores de absorbancias e IC ligeramente más
elevados que en las muestras control sin enzima, y especialmente las muestras
tratadas con la enzima durante 2 horas presentaban valores para las absorbancias del
rojo y del amarillo más elevados que sus respectivos controles. Con tiempos de
tratamiento más largos, las muestras control comenzaban a presentar valores de IC
elevados y con una mayor desviación respecto al valor medio. Esto puede inducir a
pensar que las enzimas endógenas de los propios hollejos más la agitación mecánica
eran las que producían la extracción.
En cuanto a los IPT estos fueron los resultados:
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
C0 E0 C1 E1 C2 E2 C4 E4 C7 E7 C24 E24
0 horas 1 hora 2 horas 4 horas 7 horas 24 horas
Abs
orba
ncia
s (U
.A.)
420 nm
520 nm
620 nm
IC
[43]
Gráfico 7.- IPT de los extractos de los hollejos tratados con Lallzyme Ex –V durante diferentes tiempos de agitación
Se observa en el gráfico 7 que aparece una diferencia ligeramente significativa entre
los valores de las muestras tratadas con la enzima y sus correspondientes controles a
las 2 horas de tratamiento, y a partir de las 4 horas las muestras controles comienzan
a presentar mayores desviaciones respecto al valor promedio que no permiten
establecer diferencias significativas a esos tiempos de incubación más largos. Se
eligió por tanto, un tiempo de tratamiento con la enzima de 2 horas para la
realización de los estudios posteriores.
4.3.2 Estudio del efecto de Lallzyme Ex – V sobre los hollejos en diferentes
concentraciones y agitación de 2 horas
Gráfico 8.- IC para Lallzyme Ex –V a diferentes concentraciones y agitación de 2 horas
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 2,000
C0 E0 C1 E1 C2 E2 C4 E4 C7 E7 C24 E24
0 horas 1 hora 2 horas 4 horas 7 horas 24 horas
Abs
orba
ncia
(U.A
.)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,0 g/l 0,8 g/l 1,6 g/l 3,2 g/l
Abs
orba
ncia
s (U
.A.)
420 nm
520 nm
620 nm
IC
[44]
Tal y como se ve en el gráfico 8, no hay diferencias significativas entre los datos de
los controles y las muestras tratadas con enzima hasta 1,6 g/l. Es en la concentración
de 3,2 g/l donde se observa una diferencia significativa en el índice de color, a favor
de Lallzyme Ex –V.
En cuanto a los IPT, se muestran en el gráfico 9 los resultados:
Gráfico 9.- IPT para Lallzyme Ex –V a diferentes concentraciones
Se observa que en este caso la mayor desviación estándar relativa se encuentra en las
muestras con la concentración de enzima de 3,2 g/l.
A la vista de estos resultados se realizó el estudio de la repetitividad del método,
repitiéndose 8 veces el proceso de extracción metanólica.
4.3.3 Estudio de la desviación estándar relativa del método
Como ya se avanza en el apartado anterior, una vez plasmados los resultados se
observó que hay mucha variabilidad entre ellos así que se planteó estudiar la
precisión del método elaborando 8 muestras de la forma que se describe en el
apartado 3.8.
Tabla 10.- Desviaciones estándar relativas
420 nm 520 nm 620 nm IC IPT Media aritmética 0,122 0,096 0,037 0,254 1,20
Desviación estándar 0,019 0,017 0,013 0,043 0,29 Desviación estándar
relativa 0,152 0,173 0,342 0,169 0,24
Desviación estándar relativa porcentual
16,9 % 23,9 %
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
0 g/l 0,8 g/l 1,6 g/l 3,2 g/l
Abs
orba
ncia
s (U
.A.)
[45]
Lo que se observó en este caso fue unos valores de desviación estándar relativa
porcentual muy grandes. Es decir que en la medida de las muestras sin enzimas y
agitación solo con vórtex, la extracción de compuestos fue muy irregular entre ellas,
produciendo los valores que se observan en la tabla 10 para IC e IPT. También se ve
que en cuanto a los IPT la desviación es mayor, lo que hace pensar que el método no
es apto para las muestras sin enzimas exógenas en las cuales las propias enzimas del
grano provocan una extracción muy irregular.
A la vista de estos resultados se deduce que el método para el análisis de la eficacia
de la extracción enzimática de los polifenoles de los orujos puede ser mejorado,
incluyendo, entre otros factores, un aumento en el número de repeticiones del ensayo
para conseguir una mayor precisión en el análisis.
4.4 Comparación entre la extracción mecánica por trituración y la enzimática
En este apartado se comparan las absorbancias medias obtenidas a 420, 520 y 620
nm en relación a su IC medio correspondiente, mostradas previamente en el gráfico
2 y en el gráfico 8. La tabla 11 muestra los resultados obtenidos:
Tabla 11.- Comparación de los resultados a 420, 520 y 620 nm y el IC correspondiente
Extracción mecánica Extracción enzimática
t=24 h 0,8 g/l y t=2 h
1,6 g/l y t=2 h
3,2 g/l y t=2 h
Abs 420 nm 0,382 0,119 0,104 0,15 Abs 520 nm 0,145 0,094 0,077 0,115 Abs 620 nm 0,058 0,03 0,026 0,048
IC 0,585 0,242 0,207 0,312 Abs 420 nm/IC 0,653 0,492 0,502 0,481 Abs 520 nm/IC 0,248 0,388 0,372 0,369 Abs 620 nm/IC 0,099 0,124 0,126 0,154
Se observa que con la extracción mecánica se consiguió extraer muestras con un
mayor IC que en las extracciones enzimáticas. No obstante, los compuestos más
extraídos fueron de coloración amarilla/marrón (Absorbancia a 420 nm), lo cual
puede ser procedente de zonas herbáceas como semillas o algún pedicelo. Por tanto,
la trituración mecánica fue más eficaz en cuanto a la extracción de compuestos
[46]
polifenólicos totales, pero presentaba una baja proporción de pigmentos rojos y alta
de marrones, y esto indica que durante la maceración y vinificación previas del vino
se extrajeron muy eficazmente el resto de polifenoles de coloración roja, tal y como
era el objetivo desde el punto de vista del enólogo.
Cuando las absorbancias a 520 nm se dividen por el correspondiente IC se observa
que la enzima ha logrado extraer más compuestos rojos en relación al IC (> 0,36)
que la extracción mecánica (0,248). Por otro lado, no se aprecian diferencias
significativas de absorbancias a 620 nm, es decir que los compuestos responsables
de la tonalidad azul se agotaron en la extracción durante la vinificación del vino y
posterior prensado de los hollejos.
5 CONCLUSIONES
1. La fermentación alcohólica de los mostos de uvas tintas de la variedad
Tempranillo de la cosecha de 2014 que se llevó a cabo en este trabajo con la
metodología seleccionada, se desarrolló de forma satisfactoria en el tiempo esperado
de 9 días.
2. El vino tinto elaborado presentó un índice de color (IC) y de polifenoles totales
(IPT) de 15,4 y 52,05 respectivamente. Estos valores fueron 26 y 22 veces más
elevados que los que se obtuvieron en las muestras extraídas de los hollejos
prensados y recogidos después de la fermentación (material de desecho de la bodega,
orujos), indicando con ello que el método empleado para la elaboración del vino de
este trabajo logró una excelente extracción del color de las uvas al vino tinto.
3. Con la extracción mecánica y en metanol empleada en este trabajo se consiguieron
los IC e IPT más elevados de los extractos obtenidos a partir de los orujos de la
fermentación. No obstante, los compuestos más extraídos fueron de coloración
amarilla/marrón.
4. Del estudio comparativo realizado con los tres preparados comerciales
pectolíticos: Lallzyme Ex –V, Endozym Rouge y Cuveé Blanc, fue Lallzyme Ex –V
el que presentó los mejores resultados en cuanto a la extracción de polifenoles, por
encima de los valores obtenidos con los otros preparados enzimáticos y en las
[47]
muestras control sin tratamiento enzimático. Por el contrario, el preparado
pectolítico Cuveé Blanc comercializado para la extracción en blancos, no fue eficaz
en la extracción de los polifenoles.
5. El tiempo óptimo para el tratamiento de las muestras con agitación continua a
temperatura ambiente con el preparado Lallzyme Ex –V fue de 2 h para la extracción
de los polifenoles.
6. Con la extracción mediante el empleo del preparado comercial pectolítico
Lallzyme Ex –V se consiguió extraer una mayor proporción de compuestos rojos que
con la extracción mecánica sin adición de enzimas.
7. Los orujos recogidos al final de las fermentaciones en bodega constituyen una
excelente fuente de polifenoles y poseen un alto potencial para su revalorización y la
obtención de productos de elevado valor añadido, favoreciendo con ello la
sostenibilidad del sistema.
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[50]
7 ANEXOS
7.1 ANEXO I: Fichas técnicas de los aditivos durante la vinificación
[51]
[52]
[53]
7.2 ANEXO II: Fichas técnicas de las enzimas utilizadas en el estudio
[54]
[55]