1

UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE

OBTENCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y BIOACTIVIDAD DE

BIOCERÁMICAS MONOFÁSICAS

Departamento de Ciencia de Materiales Óptica y Tecnología Electrónica

Facultad CC. Experimentales

Grado en Biotecnología

Autora: Rocío González Molina

Tutores: Piedad N de Aza Moya

Patricia Mazón Canales

Curso 2014-2015

2

ÍNDICE

0. RESUMEN 4

1. INTRODUCCIÓN 6

1.1. CLASIFICACIÓN DE LAS BIOCERÁMICAS 6

1.2. MATRICES TRIDIMENSIONALES POROSAS 8

1.3. MECANISMO DE FORMACIÓN DE HIDROXIAPATITO EN BIOCERÁMICAS 10

1.4. BIOACTIVIDAD 11

1.4.1. Ensayos in vitro 11

1.4.2. Ensayos in vivo 12

1.5. CERÁMICAS MONOFÁSICAS 12

1.5.1. Fosfato tricálcico 12

1.5.2. Silicato dicálcico 12

1.5.3. Nurse´s A Phase: 7CaOP2O52SiO2 12

2. OBJETIVOS 13

3. MÉTODOS Y TÉCNICAS EXPERIMENTALES 14

3.1. TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO 14

3.1.1. Homogenización 14

3.1.2. Prensado isostático 14

3.1.3. Molienda 14

3.1.4. Procesamiento térmico 14

3.1.5. Preparación de muestras para microscopía 14

3.2. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN 15

3.2.1. Difracción de rayos X (DRX) 15

3.2.2. Microscopía electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva

de rayos X. (SEM-EDS) 16

3.3. ENSAYOS DE BIOACTIVIDAD “IN VITRO” 17

4. ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS MATERIALES: FOSFATO TRICÁLCICO,

SILICATO DICÁLCICO, 7CaOP2O52SiO2 19

4.1. FOSFATO TRICÁLCICO 19

4.1.1. Tratamientos térmicos 19

4.1.2. Difracción de rayos X 20

4.1.3. Microscopía electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva

de rayos X. 21

3

4.2. SILICATO DICÁLCICO 21

4.2.1. Tratamientos térmicos 21

4.2.2. Difracción de rayos X 23

4.2.3. Microscopía electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva

de rayos X. 23

4.3. NURSE’S A PHASE: 7CaOP2O52SiO2 24

4.3.1. Tratamientos térmicos 24

4.3.2. Difracción de rayos X 25

4.3.3. Microscopía electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva

de rayos X. 26

5. ENSAYOS DE BIOACTIVIDAD 27

5.1. FOSFATO TRICÁLCICO 27

5.2. SILICATO DICÁLCICO 29

5.3. NURSE´S A PHASE: 7CaOP2O52SiO2 30

6. CONCLUSIONES 32

7. PROYECCIÓN FUTURA 33

8. BIBLIOGRAFÍA 34

4

RESUMEN

En los últimos años la ingeniería de tejidos juega un papel esencial en la regeneración de los

tejidos dañados o enfermos, por lo que se están desarrollando matrices artificiales extracelulares

altamente porosas que permiten el crecimiento de las células y la regeneración del tejido. En este

sentido, uno de los materiales que más interés está generando como material de soporte en la

ingeniería de tejido óseo son las cerámicas bioactivas, debido a que presentan una buena

bioactividad gracias a que son capaces de establecer un enlace directo con el hueso sin la

participación de tejido conectivo fibroso.

Con el objetivo de obtener estas matrices porosas, se empleó un porógeno, la celulosa, sobre

tres materiales cerámicos monofásicos: fosfato tricálcico, silicato dicálcico y la fase A. A continuación,

se les aplicó un tratamiento térmico para eliminar el porógeno y se procedió a su caracterización

mediante Difracción de Rayos X (DRX) y Microscopía Electrónica de Barrido equipado con

Espectroscopía Dispersiva de Energía de Rayos X (SEM-EDX). Finalmente, se analizó la bioactividad de

estas estructuras porosas mediante estudios in vitro realizando inmersiones en suero fisiológico

artificial (Symulated Body Fluid (SBF)) según el procedimiento introducido por Kokubo et al [1].

Los resultados ponen de manifiesto como la celulosa cambia la microestructura del material,

pasando de un material compacto a una estructura porosa. Los ensayos de bioactividad han

resultado positivos dado que los tres materiales presentan un depósito de hidroxiapatito en su

superficie.

ABSTRACT

In recent years, tissue engineering plays an essential role in the regeneration of damaged or

diseased tissues, as artificial extracellular highly porous matrices are developing to allow cell growth

and tissue regeneration. In this regard, one of the materials which is generating more interest as

carrier material in the bone tissue engineering are the bioactive ceramics. They have a good

bioactivity because they are able to establish a direct link with the bone without the fibrous

connective tissue involvement.

In order to obtain these porous matrices it was employed a porogen, cellulose, on three

single phase ceramic materials: tricalcium phosphate, dicalcium silicate and their mixture in a 2/1

molar ratio (C2S / TCP). Then, it applied a heat treatment to each of them to remove the porogen

and proceeded to their characterization by X-ray diffraction (XRD) and Scanning Electron Microscopy

equipped with Energy-Dispersive X-ray spectroscopy (SEM-EDX). Finally, the bioactivity of these

porous structures was analyzed by in vitro studies doing inmersions on Symulated Body Fluid (SBF)

according to the procedure introduced by Kokubo et al [1]

5

The results show as the cellulose changes the microstructure of the material, from a compact

material to a porous structure. Likewise the bioactivity assays have tested positive since all three

materials exhibit a deposit of hydroxyapatite on the surface.

6

1. INTRODUCCIÓN

El hombre siempre ha tenido un gran interés en mejorar su calidad de vida, y por

consiguiente, reparar cualquier tejido que se ha dañado, o ha sufrido mucho desgaste, lo que le ha

llevado a buscar materiales capaces de sustituirlos o repararlos.

El empleo de algunos materiales para ciertas aplicaciones con un grado de adaptación

relativamente aceptable, se remonta a hace miles de años, de hecho hace 2500 años los egipcios ya

desarrollaron sofisticados implantes con fines de distinción social [2].

También se sabe qué hace más de 2000 años, los chinos, fenicios, etruscos y aztecas ya

empleaban oro para la cirugía dental. Las cerámicas también han sido empleadas desde hace muchos

años, como demostró Amadeo Bobbio en 1972, al descubrir cráneos Mayas, que poseían dientes de

nácar como sustituyente de piezas dentales.

La Ciencia de los Biomateriales no se desarrolló rigurosamente hasta bien entrado el siglo XX,

en respuesta a ofrecer tratamientos paliativos a los accidentes causados en la segunda guerra

mundial. Estos biomateriales, definidos como “materiales sintéticos diseñados para cumplir una

función cuando se implantan en un sistema vivo” constituyen en la actualidad, un campo

importantísimo para la investigación y el desarrollo.

Un aspecto de enorme importancia sobre la posible aplicación de los biomateriales es la

necesidad de que tanto los componentes, como los productos que se generan en el proceso de

biodegradación, tienen que ser biocompatibles, es decir, deben de tener la capacidad de dar una

respuesta apropiada en una aplicación específica sin producir rechazo o respuesta toxica.

Se pueden fabricar biomateriales con metales, cerámicas, polímeros, etc.

Los fosfatos cálcicos son los principales componentes minerales de los tejidos duros biológicos.

En forma de carbohidroxiapatito, están presentes en hueso, dientes y tendones, dando a estos

órganos estabilidad y fortaleza. Por lo tanto, las biocerámicas basadas en fosfato de calcio, tiene

muchas aplicaciones clínicas en la reparación de defectos óseos, aumento de hueso, cementos óseos

y en el revestimiento para implantes metálicos.

Una característica que tienen en común todas las cerámicas bioactivas, es la modificación

cinética que sufre su superficie tras la implantación del material. La superficie forma una capa de

carbohidroxiapatita biológicamente activa, proporcionando la interfaz de unión química con los

tejidos vivos [3].

1.1. CLASIFICACIÓN DE LAS BIOCERÁMICAS

Las biocerámicas se definen como “un material cerámico diseñado para lograr un

comportamiento fisiológico específico al ser usado en la construcción de prótesis u órganos

artificiales internos” según la norma ISO/TR 10993-9 de 1994. Las biocerámicas son materiales

7

difíciles de producir, debido a las elevadas temperaturas necesarias para su elaboración, pero tienen

una serie de ventajas por las cuales es interesante utilizarlas como biomateriales, entre las que

destacan su inercia química, su excelente resistencia al desgaste, su alta resistencia a compresión y

su excelente apariencia estética.

Las biocerámicas se pueden clasificar bajo diferentes criterios [2]:

- Según el tipo de respuesta al tejido:

o Bioinertes: Son aquellas biocerámicas “estables”. La respuesta biológica que producen, es la

formación de una capsula de tejido fibroso, el cual hace que éstas queden aisladas del

medio. Entre las biocerámicas bioinertes encontramos la alúmina, la circona y los carbones

pirolíticos.

o Bioactivas: Tiene lugar una unión química entre éstas y el hueso, sin formación de tejido

conectivo en medio. El único material capaz de unirse directamente al hueso es el

hidroxiapatito (HA), que es un compuesto similar a la fase mineral del hueso. El resto de los

materiales biocerámicos bioactivos se unen al hueso a través de la formación previa de una

capa de HA sobre su superficie.

Dentro de este grupo están los biovidrios, vitrocerámicas y cerámicas bioactivas de

wollastonia, diposido, etc.

o Biodegradables: Se disuelven y se degradan, en el medio gradualmente, siendo sustituidas

por el tejido que las rodea. Son materiales ideales siempre que permanezcan en el cuerpo el

tiempo suficiente para que el tejido dañado se regenere, y que una vez se haya sanado, el

tejido sustituya al material. El problema de este tipo de materiales, reside en su resistencia,

la cual va disminuyendo a medida que se va reabsorbiendo el propio material. Pertenecen a

este grupo los corales y los fosfatos cálcicos, como el fosfato tricálcico (TCP), fosfato

tetracálcico, etc.

- Según la aplicación final:

o Estructurales: Son biocerámicas de gran resistencia mecánica, generalmente bioinertes.

Encontramos dentro de este grupo a la alúmina y zircona.

o No estructurales: Son biocerámicas bioactivas o biodegradables, densas o porosas, con baja

resistencia mecánica. En este grupo se encuentran el hidroxiapatito (HA) y el TCP.

- Según las características intrínsecas del material:

o Biocerámicas densas inertes: Son biocerámicas con nula porosidad que se unen al hueso

morfológicamente, de tres formas distintas: por crecimiento del tejido en las irregularidades

superficiales del implante; por unión a través de un cemento, o por acoplamiento del

8

implante en el defecto mediante presión. Un ejemplo típico de este tipo de materiales es la

alúmina.

o Biocerámicas porosas inertes: El biomaterial se une al hueso mecánicamente, con una

fijación biológica, debido a que se produce el crecimiento del hueso a través de los poros de

la biocerámica. Como ejemplo de este tipo de biocerámicas encontramos la alúmina

policristalina porosa.

o Biocerámicas densas o porosas bioactivas: La unión al tejido óseo es de tipo químico, y la

fijación biológica, ya que se produce por el crecimiento del hueso a través de los poros del

implante. A este grupo pertenecen los biovidrios y las vitrocerámicas bioactivas.

o Biocerámicas densas biodegradables: El implante, lentamente es reemplazado por el hueso.

A este grupo pertenecen el TCP y el sulfato cálcico.

1.2. MATRICES TRIDIMENSIONALES POROSAS

Tradicionalmente las lesiones óseas se trataban mediante cirugía reconstructiva, utilizando

implantes autólogos, alogénicos o xenogénicos que implicaban grandes restricciones tanto de

disponibilidad de tejido como desde el punto de vista inmunológico. Dadas las restricciones antes

mencionadas, ha sido necesario el desarrollo de una disciplina científica, como la ingeniería de

tejidos, que es capaz de desarrollar tejido viable para la implantación en el cuerpo humano y así

mantener o recuperar la funcionalidad perdida.

La ingeniería tisular afronta el reto de solucionar los crecientes problemas del tejido óseo

mediante la manipulación de matrices tridimensionales porosas (scaffolds) que hacen de soporte a

las células osteogénicas [4]. En este sentido, para cumplir su cometido, las matrices deben de reunir

una serie de requisitos como son:

- Osteogénesis: Aunque todos los sustitutos óseos terminan siendo sustituidos por el hueso en

mayor o menor grado, sólo el injerto autólogo de hueso se integra y desarrolla el proceso de

formación ósea desde el primer momento.

- Osteoconducción o capacidad del sustituto para que crezca el hueso desde los márgenes del

defecto, reabsorbiendo gradualmente la matriz implantada, como ocurre con los aloinjertos de

hueso cortical y los biomateriales reabsorbibles. Para que se dé un proceso de osteoconducción

adecuado, se precisa que el implante esté próximo al hueso vecino, permita la viabilidad de las

células osteogénicas que crecen aprovechando sus poros y que haya una estabilidad entre el

propio implante y el hueso vecino.

- Osteoinducción: Es la capacidad de un material para promover la transformación fenotípica de

células indiferenciadas en osteoblastos.

9

- Osteopromoción: Es la propiedad de las sustancias que mejoran o estimulan la cascada natural

de la reparación ósea.

Todos estos requisitos dificultan la obtención del material adecuado y muchos son los candidatos

para cumplir esta misión [5].

El cumplimiento de todos estos objetivos de optimizar los resultados obtenidos mediante la

ingeniería de tejidos, ha sido necesario ampliar el conocimiento sobre fisiología ósea, descartando la

visión del hueso como estructura inerte. El esqueleto óseo tiene funciones tan imprescindibles como

las de proteger órganos vitales, almacenar minerales y factores de crecimiento y albergar la médula

ósea roja, encargada de generar las células sanguíneas. El componente inorgánico más importante

que forma parte de los tejidos duros, como son los huesos, son los fosfatos cálcicos en forma de

carbohidroxiapatito (CHA), que tiene dos funciones primarias: mecánicas y homeostáticas. Estos

cristales de apatito refuerzan la matriz de colágeno, proporcionándole resistencia y rigidez al tejido,

además sirven como un depósito de almacenamiento para el Ca, el Mg y los iones de fosfato

inorgánico [6]. Por otra parte, los materiales basados en fosfatos cálcicos con sustituciones de Si son

interesantes dentro de las aplicaciones ortopédicas y maxilofaciales gracias a su biocompatibilidad y

su fuerte unión química directa con el hueso, es decir, su bioactividad, que da lugar a un crecimiento

de tejido sano directamente sobre la superficie del material. Si al hecho de mejorar las propiedades

osteogénicas le añadimos que se trata de materiales biodegradables, éstos proporcionan unos

niveles adecuados de iones de Si, Ca y P a su ambiente biológico, permitiendo su sustitución por

tejido nuevo [7, 8].

Se han realizado diversos estudios para intentar desarrollar poros en las biocerámicas densas

para poder utilizarlas como soportes celulares en implantes. Un estudio realizado fue determinar el

efecto sobre el crecimiento óseo de las interconexiones en hidroxiapatita y β-fosfato tricálcico. En

este estudio se comprobó que un tamaño medio de poros de 20 micras solo permite la penetración

celular y la formación de tejido condroide; sin embargo, los tamaños de los poros deben ser mayores

de 50 micras para favorecer el crecimiento del hueso nuevo dentro de los mismos [9].

El método de colada a base de congelación de canfeno, donde se elimina el canfeno congelado

mediante sublimación obteniendo canales de poros completamente interconectados. Se ha utilizado

para obtener biocerámicas de hidroxiapatita altamente porosa [10].

Otro método, es mezclando metil celulosa con el material en forma de una suspensión acuosa.

Las muestras se calientan lentamente, en una atmosfera de aire, a una temperatura suficientemente

alta para compactar el material y eliminar la metil celulosa. Este proceso lo que permite es obtener

una porosidad interconectada del orden de 60-90% con tamaños de poros que van desde 100 hasta

250 micras [11].

10

1.3. MECANISMO DE FORMACIÓN DE HIDROXIAPATITO EN BIOCERÁMICAS.

La unión entre la cerámica y el tejido óseo se lleva a cabo mediante una capa de

carbohidroxiapatito (CHA) biológicamente activo sobre la superficie del material implantado, siendo

ésta, tal vez, la única característica común de todos los materiales bioactivos que se conocen.

El mecanismo por el cual se forma la capa de CHA sobre las biocerámicas expuestas a medios

fisiológicos fue propuesto por primera vez por Hench [12] y consta de las siguientes etapas:

1) Lixiviación con intercambio iónico de protones del medio fisiológico por iones lábiles

modificadores de red (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, etc.). El intercambio catiónico incrementa la

concentración de grupos hidroxilo en la interfaz cerámica/solución, dando lugar a una

elevación del pH hasta niveles del orden de 10,5 tal como ha sido demostrado por De Aza et

al. [13] mediante medidas del pH interfacial con un microsensor (ISFET) en diferentes

materiales bioactivos.

2) La elevación del pH facilita la disolución de la red y formación de grupos silanoles adicionales,

así como, la pérdida de sílice soluble en forma de Si(OH)4 que pasa a la disolución.

3) Polimerización de la capa rica en SiO2 mediante condensación de los grupos vecinos de Si-OH,

dando lugar a una capa rica en sílice amorfa.

4) En esta etapa, se produce una migración de iones Ca2+ y PO43- a la superficie de la capa rica

en sílice, formando un film amorfo rico en CaO-P2O5 seguido por el crecimiento de dicho film

debido a la incorporación de Ca2+ y PO43- procedentes de la disolución.

5) Cristalización del film amorfo de CaO-P2O5 por incorporación de los aniones OH-, CO32-, o F-

desde la disolución para formar un carbohidroxiapatito o un fluorcarbohidroxiapatito.

Frente al mecanismo descrito por Hench, hoy en día parece admitirse como innecesaria la

migración de los iones calcio y fosfato a través de la capa de sílice amorfa (etapa 4ª), para facilitar la

nucleación de los iones calcio y fosfato procedentes del medio fisiológico. Además, las cerámicas

bioactivas basadas en CaO, SiO2 son capaces de formar una capa de apatito sobre su superficie

cuando son sumergidas en suero fisiológico artificial (SFA), lo que indica que el material no necesita

tener P en su estructura para producir HA [14].

Posteriormente, Kokubo et al. [15] consideraron que los grupos silanoles formados en la

superficie del material son los responsables de la formación de la capa de CHA al proporcionar sitios

favorables para su nucleación y crecimiento.

1.4. BIOACTIVIDAD

Para que un material sea utilizado en un implante ha de caracterizarse por tener una alta

biocompatibilidad.

11

A nivel mundial existen tres tipos de normas, unas de carácter general para materiales y

dispositivos, otras específicas para un tipo determinado de material, y por último, los que se refieren

a un método de ensayo concreto.

1.4.1. Ensayo “in vitro”

Los ensayos “in vitro” centran sus ensayos en cultivos celulares o en fluidos fisiológicos [16].

Los ensayos en cultivos celulares para evaluar la biocompatibilidad del material vienen siendo

empleados desde hace varias décadas, hasta el punto que se han generado bancos de células para la

realización de dichos ensayos. Raramente se usan las células primarias (salvo los eritrocitos en

ensayos de hemólisis) porque presentan menos reproducibilidad en el ensayo y, en algunos casos,

disponibilidad.

Los ensayos realizados en cultivos celulares son de toxicidad, donde se miden los efectos tóxicos

del material en el cultivo, tales como, alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular,

inhibiciones enzimáticas,… Los cultivos de proliferación y adherencia celular sobre un sustrato del

material a estudiar proporcionan información sobre las características de la superficie de éste.

Estudios de biodegradación o mutagénesis por parte de los cultivos frente al material completan los

ensayos “in vitro” más utilizados con células.

Para obtener la respuesta y el comportamiento de los distintos materiales en un ambiente que se

asemeje al de los fluidos biológicos, en el interior del cuerpo humano, se realizan ensayos en fluidos

biológicos.

Los ensayos en suero fisiológico artificial (SFA) recrean las condiciones de composición y pH

existentes en el cuerpo humano, lo que permite extrapolar, y conocer de antemano, el

comportamiento del material al ser implantado. Otro ensayo con fluido corporal sería el realizado

con saliva humana parotidea.

1.4.2. Ensayos “in vivo”

Estos ensayos tienen como objetivo medir la respuesta del huésped frente al material, es decir la

respuesta al tejido adyacente y en particular su unión determinaran como de bueno es el material

para su inserción [17]. Existen cuatro tipos de respuestas que puede provocar el tejido adyacente al

implante:

- El tejido circundante se necrosa, por lo que el material es tóxico.

- Se forman varias capas de tejido fibroso irregular que aíslan al material, no hay necrosis y no se

forma unión química, el enlace es únicamente físico. El material es inerte.

- La prótesis se ancla mediante un enlace químico al tejido, por lo que el material es bioactivo.

- Biodegradable: Un material biodegradable no es tóxico y se disuelve al colocarlo en el medio

biológico. La composición del material debe ser tal que pueda ser disuelto químicamente por los

fluidos fisiológicos, o bien consumido por los macrófagos.

12

1.5. CERÁMICAS MONOFÁSICAS

1.5.1. Fosfato tricálcico

El fosfato tricálcico es el material para implantes óseos más conocido entre los compuestos de

fosfato de calcio. Se utiliza en cerámicas de sustitución ósea, recubrimientos de prótesis metálicas,

cementos y materiales compuestos [2].

La fórmula química del fosfato tricálcico es Ca3(PO4)2, tiene una relación molar Ca/P de 1,5.

Pertenece a la familia de las Whitlockitas que corresponden a la formula general (Ca,Mg)3(PO4)2, en la

cual el calcio puede ser sustituido total o parcialmente por magnesio (Mg+2).

El fosfato tricálcico, existe en cuatro isoformas diferentes, de las cuales todas, salvo el α´TCP,

se utilizan como biomaterial.

El α-TCP puede ser retenido a temperatura ambiente en un estado metaestable, y su gama

de estabilidad está fuertemente influenciada por las sustituciones iónicas. Al igual que el β-TCP, es

biocompatible, pero más soluble, e hidroliza rápidamente hidroxiapatita deficiente en calcio, lo que

lo convierte en un componente útil para la preparación de materiales biocerámicos biodegradables y

materiales compuestos para la reparación ósea [18].

1.5.2. Silicato dicálcico

Desde el descubrimiento del Bioglass por Hench y sus colaboradores en los años 70, varios tipos

de vidrios y vitrocerámicas de silicato, tales como los vidrios bioactivos, y las vitrocerámicas AW, han

sido investigadas como posibles biomateriales para reparación y sustitución ósea. Los resultados de

dichas investigaciones muestran cómo los biomateriales que contienen CaO y SiO2 presentan una

excelente bioactividad y poseen la capacidad de unión al hueso vivo y a los tejidos blandos.

Además, los estudios realizados por Lamy y col. y Liu y col. han demostrado que el silicato

dicálcico (Ca2SiO4) en forma de recubrimiento por plasma en sustratos de aleaciones de titanio,

presenta una buena bioactividad [19,20]. También el C2S es una fase importante del cemento

Portland, modificado a MTA (mineral trióxido agregado), para prótesis cementadas ampliamente

utilizado en odontología [21].

1.5.3. Nurse’s A phase: 7CaOP2O52SiO2

La Fase A, más conocida como la fase de Nurse o Nurse´s A phase, corresponde a la composición

estequiométrica 7CaO·P2O5·2SiO2, pero no debe ser confundida con el mineral de la misma

composición química identificado como Nagelschmedita (fase R), ya que poseen la misma estructura

asociada a la solución sólida continua a alta temperatura ϒ-C2S-α'-TCP. Para evitar confusiones en la

nomenclatura el término Nagelchsmedita puede ser extendido para describir todo el rango de (ϒ C2S-

α'-TCP)ss [22]. La Fase A transforma directamente a R a 1350°C ± 20°C, observándose que es un

material que se restringe a un campo muy pequeño, menor del 1% alrededor de los 47,38% en peso

en el sistema C2S-TCP [23].

13

2. OBJETIVOS

Con el presente proyecto se persigue un propósito de gran incidencia social, como es la

mejora de la salud y la calidad de vida de la población a través del diseño y obtención de materiales

biocerámicos monofásicos porosos que podrían ser empleados como implantes óseos.

De entre todas las técnicas que existen para obtener matrices tridimensionales porosas se

optó por la utilización de un porógeno, en nuestro caso, celulosa, que posteriormente se eliminó

mediante un tratamiento térmico adecuado, permitiendo de esta forma, que en el lugar donde se

encontraba la celulosa, se forme un poro.

Los objetivos principales son:

1. Obtención de tres tipos de biocerámicas monofásicas:

El primer material desarrollado fue el fosfato tricálcico (α-TCP), cuya bioactividad ha sido

ampliamente demostrada.

El segundo material, fue el silicato dicálcico (C2S) ya que se ha demostrado que el silicio juega un

importante papel en el crecimiento óseo, y es capaz de aumentar la bioactividad de otros materiales.

Finalmente se desarrolló su intermedio, la fase A, más conocido como la fase de Nurse o Nurse´s A

phase, correspondiente a la composición 7CaO·P2O5·2SiO2.

2. Caracterización de los materiales obtenidos mediante difracción de rayos X y Microscopía

electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva de rayos X (SEM-EDX).

3. Realización de ensayos de bioactividad de los materiales obtenidos mediante su inmersión

en suero fisiológico artificial (SFA)

4. Caracterización del precipitado de HA mediante Microscopía electrónica de barrido-

Microanálisis de energía dispersiva de rayos X (SEM-EDX).

14

3. MÉTODOS Y TÉCNICAS EXPERIMENTALES

3.1. TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO

3.1.1. Homogenización

Es una técnica que se emplea para mezclar los compuestos utilizados para la elaboración de

la muestra. Se utilizó para ello una capsula de porcelana, donde se introdujo los compuestos en

polvo, los cuales se mezclaron, empleando para ello acetona y una varilla de vidrio. Cuando la

muestra consiguió una adecuada homogeneidad, se introdujo en la estufa, para que la acetona se

evaporara. Esto se realizó en tres ocasiones, asegurando una correcta homogenización.

3.1.2. Prensado Isostático

En primer lugar se preparó la muestra. Para ello el material se introdujo en gomas de látex,

primero en una goma de un número superior y luego sobre esta goma otra de un número inferior

evitando de esta forma que el aceite de la prensa entrase en contacto con el material.

La muestra se introdujo en la prensa, que disponía de una bomba que aumenta la presión del

aceite que hay en su interior, permitiendo de esta forma que el material se prense isostáticamente.

La prensa isostática que se empleó fue la de la empresa ASTUR SINTER, S.L, que posee una

bomba manual de ultra-alta presión de la empresa ENERPAC 11-400 A 1204 C.E. Esta prensa está

compuesta por un cierre superior, una válvula de presión, una bomba de diafragma, un tanque de

almacenamiento de fluido (aceite) y un elevador neumático.

Para prensar las muestras se empleó una presión de 20000 bares durante 20 minutos,

consiguiendo de esta forma una compactación de la muestra uniforme en todas las direcciones,

obteniéndose así un sinterizado más uniforme.

3.1.3. Molienda

Se empleó para moler la muestra el mortero de ágata. El material se trituró, y molió con ayuda

de acetona, reduciendo de esta forma el tamaño de grano. Luego para que se evaporase la

acetona, se introdujo en la estufa. Esto se repite dos veces.

3.1.4. Procesamiento térmico

Para realizar los tratamientos térmicos de las muestras se utilizó el horno de alta

temperatura de tipo vertical de la marca ENTECH referencia EEF 1/17 Elevetor furnace.

Este tipo de hornos, alcanzan una temperatura máxima de 1650 oC, gracias a que disponen

de elementos calefactores de silicuro de molibdeno. Este horno tiene un panel digital (JUNMO

IMAGO 500) que permite programar los distintos tratamientos, controlando de esta forma, la

temperatura, los tiempos de subida, mantenimiento y bajada de temperatura.

3.1.5. Preparación de muestras.

La preparación de las muestras se dividió en los siguientes pasos:

15

- Cortar: En primer lugar hay que cortó una pastilla del material lo más plano posible para que

luego pudiera verse de forma correcta en el SEM. Para ello se empleó una cortadora de precisión

que posee un disco de diamante.

- Embutir: La muestra obtenida, se embutió en moldes, con resina epoxi. En los casos en que la

muestra es muy porosa, esta se embute al vacío con el fin de rellenar todos los poros con la

resina, evitado de esta manera que pueda romperse durante los posteriores procesos.

- Pulir: La fase de desbastado se realiza mediante el sistema modular “tegrasystem” de

“STRUERS”, con una pulidora-desbastadora “TagraPol-15” equipada con un brazo, en el que se

montaron discos abrasivos. El abrasivo que se empleó para el desbastado de las muestras

cerámica fue el de Carburo de Silicio, para eliminar la rugosidad, y obtener de esta forma una

superficie más uniforme. Luego estas muestras se pulieron con el disco Dur y después con el

disco Mol, empleando para ello sus respectivos lubricantes.

- Ataque: El último paso consiste en el ataque mediante una disolución al 1% en volumen de ácido

acético en agua a diferentes tiempos, dependiendo del material a atacar. El ataque mediante

acido afecta en diferente medida a los distintos cristales, fases y límites de grano de la muestra,

por lo que se consigue revelar su superficie.

3.2. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN

3.2.1. Difracción de rayos X

En el año 1895 el físico Wilhelm Conrad Röntgen, descubrió que del ánodo de los tubos de

rayos catódicos con los que trabajaba, salían emanaciones, a las que denomino rayos X. Este

descubrimiento tuvo gran importancia tanto en el desarrollo sucesivo de la ciencia como en sus

aplicaciones prácticas.

Dada la propiedad de los rayos X de atravesar sustancias y de ser absorbidos de distinta

manera por diferentes sustancias dependiendo de su composición y densidad, fueron

inmediatamente aplicados a lo que después se llamó radiografía. Como es bien sabido los rayos X se

utilizan ampliamente en la medicina, así como en la industria para la correcta fabricación de

materiales [24].

Los rayos X se definen como una radiación electromagnética de longitud de onda corta

producida por la desaceleración de electrones de elevada energía o por transiciones electrónicas que

implican electrones de los orbitales internos de los átomos. El intervalo de longitudes de onda de los

rayos X va desde aproximadamente 10-6 nm hasta alrededor de 10 nm.

Actualmente la difracción de rayos X se emplea con fines analíticos, siendo la única técnica

capaz de resolver con toda evidencia las estructuras cristalinas o la diferenciación de formas

alotrópicas o isomórficas.

16

El fundamento del método de difracción de rayos X, como demostró Max von Laue en 1912,

radica en que un cristal es una distribución regular en el espacio de sus átomos, iones o moléculas

constituyentes y que la distancia entre ellos es del mismo orden de magnitud que la longitud de onda

de los rayos X, por lo que los cristales, de acuerdo con las leyes ópticas, pueden producir fenómenos

de difracción de la radiación característica.

El espacio que hay entre dos átomos vecinos en una red cristalina actúa como pequeños

agujeros por los que la luz pasa y produce la difracción.

Posteriormente al descubrimiento de Laue, W.L. Bragg, desarrolló una explicacion alternativa

a la de Laue, que resulto ser mas sencilla.

Cuando una haz monocromático de rayos X llega a un cristal con un ángulo de incidencia ϴ,

para que la radiación reflejada esté en concordancia de fase y por lo tanto de lugar a la difracción (

con interferencias constructivas y destructivas), es necesario que la diferencia de recorrido de dos

rayos sea ,multiplo de la longitud de onda [25].

2d sen ϴ = nλ

El difractómetro de Rayos X que se utilizó para la carecterización de materiales en el

presente proyecto es el modelo D8 ADVANCE de la casa BRUKER AXS.

3.2.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM). Microanálisis de energía dispersiva de rayos X

(EDX)

El SEM permite generar figuras de una superficie, con una alta resolución y una apariencia

tridimensional dentro de un intervalo amplio de aumentos. Una de las funciones más importante es

que permite realizar microanálisis para determinar la presencia cualitativa y/o cuantitativa de

elementos en detalles microscópicos [26].

El SEM proporciona figuras y datos físico-químicos de la superficie de cuerpos generalmente

opacos a los electrones, por medio de un delgadísimo haz de electrones que recorre dicha superficie

y de detectores que transducen las señales que de ella emanan, transformándolas en corrientes

eléctricas que se emplean en formar una figura en un monitor.

Las figuras principales producidas en el SEM son:

i. Figuras de electrones secundarios.

ii. Figuras de electrones retrodispersados.

Algunas colisiones son elásticas de modo que algunos electrones del haz primario pueden salir de

la superficie de la muestra sin una significativa pérdida de energía, estos son los llamados electrones

retrodispersados. Pero la mayoría de las colisiones son inelásticas y, entre otros efectos, originan

emisión de electrones de baja energía conocidos como electrones secundarios [27].

17

El SEM tiene un rango de aumentos que va desde x10 hasta x200.000, y depende de la

relación entre las dimensiones de la figura final y el área de la muestra. Los electrones acelerados

incidentes pueden tener una energía de entre 500 eV hasta 50 KeV.

Para poder utilizado se requiere muy poco en lo que respecta a la preparación de las

muestras, a excepción de que las muestras deben ser compatibles con el uso del vacío. Si la muestra

es conductora no hay problema alguno. El problema reside en si es aislante, pero en este caso, el

material se recubre con una película conductora de carbono, oro o algún otro metal. En nuestro caso

se empleó para ello paladio.

El microscopio empleado va equipado con un detector de dispersión de rayos X, que se basa

en la captura de fotones de alta energía que emite cada elemento al ser bombardeado por el haz

primario de electrones, permitiéndonos obtener una información detallada de los átomos que

forman parte de la muestra.

El microscopio electrónico de barrido que se utilizó en el presente proyecto fue el modelo S-

3500 de HITACHI, con un poder de resolución de 30Å y equipado con un detector de dispersión de

rayos X de la casa Oxford Link Analytical, que permite conocer los elementos que constituyen un área

de la muestra y además, de forma semicuantitativa, el porcentaje de cada uno de los elementos

involucrados en la superficie de la misma. El sistema permite realizar el análisis de todo el área que

se encuentre bajo observación en el microscopio al cual está acoplado, y además se pueden

seleccionar puntos específicos en el área observada correspondientes a la amplificación elegida,

teniéndose entonces la posibilidad de analizar puntos tan pequeños como 1µm o aún áreas menores,

dependiendo de las características que la muestra posea.

3.3. ENSAYOS DE BIOACTIVIDAD

La finalidad del ensayo “in vitro” es poder observar la bioactividad de los distintos materiales

sinterizados mediante su inmersión en SBF a distintos intervalos de tiempo. Para realizar el ensayo

de bioactividad “in vitro”, se preparó SBF por disolución en agua miliQ de cloruro de sodio (NaCl),

cloruro de potasio (KCl), bicarbonato de sodio (NaHCO3), hidrogenofosfato de potasio trihidratado

(K2HPO4·H2O), cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2·6H2O) y cloruro de calcio (CaCl2),

tamponado a un pH de 7,25 con trihidroximetil aminometano (Ca4H11O3N) y ácido clorhídrico (HCl)

[1].

Las concentraciones de iones de SBF se muestran en la Tabla 1.

18

Iones Suero humano (mM)

SBF (mM)

Na+ 142

142

K+ 5

5

Mg 2+ 1,5

1,5

Ca 2+ 2,5

2,5

Cl- 103

148,8

HCO-3 13,5

4,2

HPO4-2 1

1

Tabla 1. Concentraciones de los iones del suero humano y SBF.

En 50 ml de dicho suero, en tubos de Falcon a la temperatura del cuerpo humano (36,6 oC) y

con agitación periódica, se introdujeron muestras de los materiales sinterizados de

aproximadamente 1 centímetro de grosor.

Los botes con las muestras se agitaron todos los días, para evitar sobresaturación del medio.

A pesar de esta agitación el ensayo se denomina estático puesto que el suero no se cambia.

Tras los tiempos de inmersión, las muestras se extrajeron y se secaron previamente a su

caracterización.

19

4. ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS MATERIALES: FOSFATO TRICÁLCICO, SILICATO DICÁLCICO

Y 7CaOP2O52SiO2.

4.1. FOSFATO TRICÁLCICO

4.1.1. Tratamientos térmicos

Hay varios métodos para obtener TCP. Para la realización del presente trabajo se obtuvo TCP

por reacción en estado sólido a partir de los óxidos de partida [28], de esta forma podemos obtener

el material de una forma mucho más económica. Para preparar el material se partió de:

Carbonato cálcico (CaCO3), de la marca Fluka.

Hidrogenofosfato cálcico (CaHPO4), de la marca Panreac.

2CaHPO4 + CaCO3 Ca3(PO4)2 + H2O + CO2

Las cantidades se pesaron en una balanza con un error de aproximadamente 0,0001 g. La

mezcla se homogenizó con acetona en una cápsula de porcelana. Después de evaporar la acetona en

la estufa, se procedió a realizar el tratamiento térmico correspondiente para obtener el polimorfo α-

TCP. El material se calentó con una rampa de subida de dos horas hasta 1550 oC, y se mantuvo a esta

temperatura durante 3 horas. Seguidamente se realizó un “quenching” con nitrógeno líquido para

enfriar rápidamente el material, y conseguir de esta forma que la fase de TCP a alta temperatura

fuera estable a temperatura ambiente.

Finalizado el tratamiento térmico, se procedió a realizar un DRX para comprobar qué

polimorfismo de TCP se había obtenido.

Obtenido el material, se molió y mezcló con celulosa con una relación del 70% en peso de

TCP - 30% en peso de celulosa. La mezcla se homogenizó con acetona y se prensó isostáticamente.

Posteriormente se le aplicó un tratamiento térmico, con el objetivo de eliminar la celulosa y generar

una estructura porosa. El material se calentó a 900 oC con una rampa de subida de 2 horas, y se

mantuvo a esta temperatura durante 5 horas, posteriormente se llevó a 1400 oC con una rampa de

subida de 1 hora y se mantuvo a esta temperatura durante 5 horas. Una vez finalizado se apagó el

horno y se dejó enfriar libremente (Figura 1).

20

Figura 1. Tratamiento térmico para eliminar la celulosa del TCP.

4.1.2. Difracción de rayos X.

En primer lugar, se muestran los resultados de la caracterización del material desde el punto

de vista mineralógico. En las Figuras se pueden ver los difractogramas realizados al material una vez

sinterizado (Figura 2A) y después de haber eliminado la celulosa del material (Figura 2B).

Se observa cómo el tratamiento térmico que se ha empleado para eliminar la celulosa, no

produce ningún efecto sobre la composición mineralógica del material, pues sigue siendo el

polimorfo alfa.

Según la ficha PDF: 09-0348, todos los picos corresponden a la fase α-TCP, demostrando de

esta forma que el material se encuentra en equilibrio metaestable.

Figura 2. (A) Difractograma del α-TCP sinterizado y (B) del α-TCP después de eliminar la celulosa.

α-TCP celulosa eliminada (B)

α-TCP (A)

21

4.1.3. Microscopía electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva de rayos X.

En segundo lugar, se realizó una caracterización de la microestructura del material obtenido

antes (Figura 3) y después de la eliminación de la celulosa (Figura 4). En la Figura 3 se muestra una

microfotografía de SEM del α-TCP, en la cual se puede apreciar que el material obtenido era

monofásico.

Comparando ambas Figuras se puede ver cómo al eliminar la celulosa, el material presenta

unos huecos de mayor tamaño, observándose una matriz que no posee una estructura uniforme.

Figura 3. Microfotografía de la microestructura del α-TCP.

Figura 4. Microfotografías de la microestructura del α-TCP después de eliminar la celulosa.

4.2. SILICATO DICÁLCICO

4.2.1. Tratamientos térmicos

Para sintetizar el C2S por reacción en estado sólido a partir de óxidos [28], se empleó las

cantidades estequiometricas de los siguientes compuestos de partida:

Carbonato cálcico, CaCO3, de la marca Fluka.

Óxido de silicio, SiO2, de la marca Strem Chemicals.

500 um

500 um 10 um

22

Se pesó las correspondientes cantidades estequiométricas, y se homogenizó la mezcla con

acetona. Luego a la muestra se le aplicó un tratamiento térmico de 12 horas a 1000 oC en el horno

para descarbonatarla.

Una vez finalizó el tratamiento térmico de descarbonatación, se molió y prensó isostáticamente,

y se le aplicó el correspondiente tratamiento térmico. Se le programó una rampa de subida de 5

horas hasta 1525 oC se mantuvo a esa temperatura durante 12 h, con su posterior rampa de bajada

de 5 horas.

Una vez obtenido el material, se procedió a realizar el mismo procedimiento que con el TCP.

Se mezcló con celulosa con una relación del 70% en peso de C2S - 30% en peso de celulosa. La mezcla

se homogenizó con acetona y se prensó. Posteriormente se le aplicó el tratamiento térmico,

mediante el cual se eliminó la celulosa. El material se calentó a 900 oC con una rampa de subida de 2

horas, y se mantuvo a esta temperatura durante 5 horas, posteriormente se llevó a 1100 oC con una

rampa de subida de 2 horas y se mantuvo a esta temperatura durante 5 horas (Figura 5).

Sin embargo, no se obtuvo el material bien consolidado con esta relación de peso, por lo que

se procedió a comprobar si disminuyendo la cantidad de celulosa empleada y realizando el mismo

tratamiento térmico, se podía obtener el material bien consolidado. Se utilizó por lo tanto, una

relación del 80% en peso de C2S - 20% en peso de celulosa, a la cual se le aplicó el mismo

tratamiento térmico. Con esta relación en peso, tampoco fue posible obtener una buena

consolidación, puesto que el material se rompió al ser manipulado. Por dicho motivo, se probó

realizar la mezcla con una relación del 90% en peso de C2S - 10% en peso de celulosa, al que se le

aplicó el mismo tratamiento térmico. Finalmente se obtuvo C2S bien consolidado.

Figura 5. Tratamiento térmico para eliminar la celulosa.

23

4.2.2. Difracción de rayos X.

A continuación se presentan los resultados de la caracterización del material desde el punto

de vista mineralógico. Se realizó dos DRX, uno al material sin mezclarse con celulosa, y otro después

de su eliminación (Figura 6A y 6B).

Como se puede apreciar en la Figura 6, el tratamiento térmico que se empleó para eliminar la

celulosa no hace variar la composición mineralógica del material.

Según la ficha PDF: 87-1257 todos los picos corresponden a la fase ϒ-C2S, obteniéndose la

forma polimórfica de baja temperatura.

Figura 6. (A) Difractograma del ϒ-C2S sinterizado y (B) del ϒ-C2S después de eliminar la celulosa

4.2.3. Microscopía electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva de rayos X.

Se realizó una caracterización de su microestructura.

Se vio en el SEM las Figuras que se muestran a continuación. La Figura 7 corresponde al ϒ-C2S

antes de la eliminación de la celulosa, y en la Figura 8 se aprecia los pequeños hueco que generó la

eliminación de la celulosa.

Figura 7. Microfotografía del ϒ-C2S antes de eliminar la celulosa

C2S con celulosa eliminada (B)

C2S (A)

500 um

24

Figura 8. Microfotografías de la microestructura del ϒ-C2S después de eliminar la celulosa.

4.3. NURSE´S A PHASE: 7CaOP2O52SiO2

4.3.1. Tratamientos térmicos.

Para obtener la Fase A, por reacción en estado sólido a partir de los óxidos de partida [28], se

partió de una mezcla estequiométrica de los siguientes compuestos:

1. Óxido de silicio, SiO2, de la marca Strem Chemicals.

2. Carbonato cálcico, CaCO3, de la marca Fluka.

3. Hidrogenofosfato cálcico (CaHPO4), de la marca Panreac.

La mezcla de los compuestos nombrados se homogenizó con acetona en una cápsula de

porcelana. Después se procedió a realizar el tratamiento térmico correspondiente para obtener la

fase A (Figura 9). El material se calentó con una rampa de subida de hora y media hasta 1300 oC, y se

mantuvo a esta temperatura durante 3 horas. Luego se bajó la temperatura a 1200 oC con una rampa

de bajada de media hora y se mantuvo a esa temperatura durante 24 h y se dejó enfriar.

Figura 9. Tratamiento térmico de la fase A.

500 um 20 um

25

La fase A, se molió y se mezcló con celulosa con una relación en peso del 70% - 30% de fase A

y celulosa respectivamente. A esta mezcla, se le aplicó el correspondiente tratamiento térmico para

la eliminación de la celulosa. Para ello, se calentó a 900 oC con una rampa de subida de 2 horas, y se

mantuvo a esta temperatura durante 5 horas, posteriormente se llevó a 1200 oC con una rampa de

subida de 3 horas y se mantuvo a esta temperatura durante 5 horas (Figura 10).

Figura 10. Tratamiento térmico para eliminar la celulosa

4.3.2. Difracción de rayos X.

En la siguiente Figura podemos ver los resultados del DRX realizado a la fase A. La Figura 11A

corresponde al difractograma de la fase A cuando no se ha mezclado con celulosa, y la Figura 11B

representa el difractograma de la fase A una vez mezclada y eliminada la celulosa.

Según la ficha PDF: 11-0676 todos los picos corresponden a la fase A: 7CaOP2O52SiO2,

obteniéndose un material monofásico.

Fase A con celulosa eliminada (B)

Fase A (A)

26

Figura 11. (A) Difractograma de la Fase A sinterizada y (B) de la Fase A después de eliminar la

celulosa.

4.3.3. Microscopía electrónica de barrido-Microanálisis de energía dispersiva de rayos X.

Luego se realizó una caracterización microestructura de la fase A obtenida antes (Figura 12) y

después de la eliminación de la celulosa (Figura 13). Comparando las Figuras se puede ver cómo al

eliminar la celulosa del material, éste presenta unos huecos de mayor tamaño, observándose una

matriz que no posee una estructura uniforme.

Figura 12. Microfotografía de la fase A antes de eliminar la celulosa

Figura 13. Microfotografías de la microestructura de la Fase A después de eliminar la celulosa.

100 um

100 um 30 um

27

5. ENSAYO DE BIOACTIVIDAD

Una vez eliminada la celulosa de los materiales, se cortó discos de unos 10 mm para sumergirlos

en SBF a diferentes tiempos, con el fin de saber si se producía la formación de hidroxiapatito en la

superficie del material. Los tiempos que se emplearon para cada material fueron los siguientes:

El α-TCP se ensayó a 1 día, 3 días, 5 días, 7 días, 14 días y 21 días.

El ϒ-C2S y la fase A se ensayaron a 6 horas, 1 día, 3 días, 5 días y 7 días

Una vez pasados los correspondientes tiempos, se sacaron las muestras y se dejaron secar.

5.1 FOSFATO TRICÁLCICO

1, 3 y 5 días en SBF

En la Figura 14.A, 14.B y 14.C se muestra una microfotografía pasados 1, 3 y 5 días de

inmersión en SFB, respectivamente. Tras un día de inmersión no se encuentra ningún cambio

aparente en la superficie del material. Pasados tres días, se aprecia como empiezan a formarse

pequeñas partículas esféricas blanquecinas aisladas, y cómo al cabo de cinco días éstas crecen en

número y en tamaño, con una distribución irregular.

Figura 14. Microfotografía SEM del TCP en SBF durante 1 día (14.A), 3 días (14.B) y 5 días (14.C)

Los resultados del EDX sobre la superficie del material, muestran que la relación Ca/P es de

aproximadamente 1,5 lo que nos confirma que el material que estamos viendo es TCP. Los EDX

realizados sobre las pequeñas partículas son de una relación Ca/P ligeramente superior a la de la

superficie.

14.A

14.C

14.B

100 um 100 um

100 um

28

7 y 14 días en SBF

Pasados 7 y 14 días de inmersión en SBF (Figura 15.A y 15.B respectivamente), se genera

sobre la superficie del TCP un precipitado blanquecino, resultado de la fusión y aglomeración de las

partículas esféricas blanquecinas mencionadas anteriormente. Se puede apreciar cómo se aglomeran

en distintas zonas de la superficie, por lo que hay zonas en las que podemos seguir viendo la

superficie original del material.

Esto se comprueba con los resultados del EDX realizados sobre la superficie, ya que estos nos

muestran una relación Ca/P de aproximadamente 1,5.

Figura 15. Microfotografía SEM del TCP durante 7 (15.A) y 14 (15.B) días.

21 días en SBF

En la Figura 16 se observa como en casi toda la superficie del material se ha generado un

precipitado. La formación de este precipitado no es de forma homogénea en todo el material, ya que

hay zonas donde apenas hay, y zonas donde las estructuras esféricas propias de este precipitado han

aumentado en gran medida de tamaño, y se han fusionado unas con otras, originando grandes

aglomerados.

Los resultados del EDX realizados en la superficie del precipitado nos sugieren que se está

formando un tipo de apatito, puesto que la relación Ca/P resultante es de 1,64 por lo que es

probable que estemos ante la formación de hidroxiapatito (HA), el cual tiene una relación Ca/P de

1,67.

Figura 16. Microfotografía SEM del TCP 21 días en SBF.

15.A 15.B

100 um

100 um 100 um

29

5.2. SILICATO DICÁLCICO

6 horas y 1 día en SBF

En las siguientes microfotografías (Figura 17) se observa las muestras de silicato dicálcico una

vez pasadas 6 horas (17.A) y un día (17.B) en SBF.

Se aprecia la formación de pequeñas partículas esféricas blanquecinas en la superficie del

material. Estas partículas no recubren toda la superficie, puesto que se puede apreciar zonas donde

no aparecen.

Los resultados del EDX del fondo de la muestra indica la presencia de silicio, calcio y fósforo.

Sin embargo, el EDX del precipitado indica que la cantidad de fósforo detectado es mayor pasado un

día, aumentando de 4,01 % a 30,53 %, y un drástico descenso en el silicio detectado, pasando de

31,76 % a 9,32 %.

Figura 17. Microfotografías SEM del ϒ-C2S durante 6 horas (17.A) y 1 día (17.B) en SBF.

3 y 5 días en SBF

Pasados 3 y 5 días de su inmersión en SBF, el silicato dicálcico muestra en su superficie como

las pequeñas partículas esféricas mencionadas anteriormente, han aumentado en cantidad y

tamaño, pasando de 0,5µm a un tamaño medio de 1/1,3 µm, llegándose a fusionar unas con otras

hasta formar un precipitado blanquecino en toda la superficie del material.

Los resultados del EDX realizados en la superficie del material nos sugieren que el grosor de

esta capa de precipitado no es muy espesa, puesto que aún se detecta el silicio correspondiente a la

superficie original del C2S. El grosor es mayor a los 5 días ya que la cantidad de silicio detectado

disminuye, indicando además que el material se está lixiviando.

Los resultados del EDX del depósito formado muestran una relación Ca/P próxima a la del

hidroxiapatito, 1,67 dando a entender que la capa de precipitado corresponde a este tipo de apatito.

17.A 17.B

100 um 100 um

30

Figura 18. Microfotografía SEM del ϒ-C2S durante 3 (18.A) y 5 días (18.B) días en SBF.

7 días en SBF

En la Figura 19 se observa un aumento del tamaño de las partículas esféricas y como estas se

han fusionado hasta generar un precipitado blanquecino que cubre completamente toda la

superficie del material.

El EDX realizado a la superficie del precipitado nos da una relación Ca/P de 1,78. Esta relación

es mayor que la que tiene el HA, que como se ha mencionado anteriormente es de 1,67. Esto sugiere

que el apatito que se ha generado en la superficie del C2S corresponde a carbohidroxiapatito (CHA),

el cual posee una relación Ca/P superior a la que tiene el HA.

Figura 19. Microfotografía SEM del ϒ-C2S durante 7 días en SBF.

5.3. NURSE´S A PHASE: 7CaOP2O52SiO2

6 horas, 1 y 3 días en SBF

En la microfotografía (Figura 20) se observa la formación de pequeñas partículas esféricas

blanquecinas aisladas. A las 6 horas de inmersión en SBF de la fase A (20.A), empiezan a aparecer de

forma muy dispersas estas partículas. A medida que aumenta el tiempo de inmersión, aparecen más

cantidad de ellas, viéndose a los 3 días (20.B) que la superficie del material está completamente

cubierta, e incluso han empezado a aglomerarse y a fusionarse unas con otras hasta llegar a formar

una capa de precipitado.

Los resultados del EDX de la superficie del material correspondiente a las 6 horas de

inmersión, muestran la presencia de calcio, fósforo y silicio. El porcentaje de silicio detectado en la

18.A 18.B

100 um

100 um 100 um

31

superficie de la fase A disminuye en gran medida al día de inmersión, pasando de 13,48% a 2,08%

esto es debido a que estamos analizando la composición de las partículas, y al cubrir el material casi

por completo no se detecta el silicio. De hecho, tanto al día como a los tres días, la relación Ca/P

obtenida de las partículas esféricas es de 1,6 lo que da a entender la formación de un tipo de apatito,

que posee una relación Ca/P muy próxima a la del hidroxiapatito, 1,67. La capa de precipitado que se

genera a los tres días, posee un grosor considerable puesto que el EDX no detecta el silicio de la

superficie original del material.

Figura 20. Microfotografía de la Fase A durante 6 horas (20.A), 1 (20.B) y 3 días (20.C) en SBF.

5 y 7 días en SBF

Se observa cómo las partículas esféricas blanquecinas aumentan de tamaño y se siguen

fusionado unas con otras dando lugar a placas sobre las cuales siguen formándose más de ésta

estructura esférica. Estas partículas alcanzan un tamaño de alrededor 5µm. En algunas zonas su

fusión da lugar a capas siendo imposible la medición de dichas esferas. A los 7 días de inmersión el

precipitado tiene un grosor considerable, tal que al secarse se generan en él una serie de grietas.

Figura 21. Microfotografía SEM de la Fase A durante (21.A) y 7 días (21.B) en SBF.

21.A 21.B

20.C

20.A 20.B

10 um

100 um

100 um

100 um

100 um

32

6. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que:

- Se ha desarrollado la metodología para la obtención de un material poroso mediante la

incorporación de un porógeno, como es la celulosa, a la composición de los materiales y su

posterior eliminación.

- Los resultados del SEM de las microestructuras de los materiales nos demuestran un cambio

aparente en la microestructura antes y después de eliminar la celulosa.

- Se ha demostrado una alta bioactividad en los tres materiales estudiados, puesto que en todos

ellos se genera una capa de un tipo de apatito pasado un tiempo determinado en SBF. Sin

embargo, de todos ellos el TCP es el que menor bioactividad presenta, puesto que es el material

que más tiempo tarda en presentar una capa uniforme en toda su superficie, ya que tarda 21

días en cubrir toda la superficie.

Para el C2S y la fase A, en cambio, a las 6 horas ya se aprecia que la superficie está

prácticamente cubierta de partículas esféricas, si bien, la cantidad formada es mayor en el C2S.

Estos materiales a los 7 días ya presentan precipitado en toda la superficie.

- Los resultados del EDX ponen en manifiesto que el apatito generado en las superficie de los

materiales es carbohidroxiapatito (CHA) el cual posee una relación Ca/P superior a la del HA.

33

7. PROYECCIONES FUTURAS

Identificar el tipo de hidroxiapatito obtenido mediante Microscopía electrónica de

Transmisión (TEM) y por Infrarrojos con Transformada de Fourier (FTIR), técnicas capaces de detectar

que tipo de apatito ha precipitado

Aplicar técnicas de Espectroscopía de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP) sobre los iones

de Ca, P y Si del suero para determinar el mecanismo de precipitación del HA deficiente en calcio

sobre el material. Todo ello nos permitiría comparar dicho mecanismo con otros propuestos por

Ohtsuki [14], kokubo [15].

Añadir diferentes porcentajes de celulosa a las composiciones inicial de los materiales, para

generar pequeños poros en toda la superficie, obteniendo de esta forma una matriz porosa

uniforme. Se tendría que hacer más ensayos en SBF hasta obtener en cada material una capa

homogénea de HA.

Además una vez realizados todos los estudios “in vitro” pertinentes, se tendría que realizar

los ensayos “in vivo” para comprobar la eficacia de estos materiales como implantes óseos en

personas.

34

8. BIBLIOGRAFÍA

[1] T. Kokubo, H. Takadama, “How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity?”, Biomaterials,

vol. 27, nº 15, p.p 2907–2915, (2006).

[2] R. Sastre, S. De Aza, J. San Román, “Biomateriales”, (2004).

[3] Roderic S. Lakes, Joon Park, “Biomaterials: An Introduction”, (2006).

[4] Catalina Estrada, Ana Cristina Paz, Luis Ernesto López, “Ingeniería de tejido óseo: Consideraciones

Básicas” EIA, Escuela de Ingeniería de Antioquia, nº 5, p.p. 93-100, (2006).

[5] SECOT, “Biomateriales y sustitutos óseos”, de Manual de Cirugía Ortopedica y Traumatologia,

(2010).

[6] J.X Lu, B. Flautre, K. Anselme, P. Hardouin, A. Gallur, M. Descamps, B. Thierry, “Role of

interconnections in porous bioceramics on bone recolonization in vitro and in vivo”, Journal of

Materials Science: Materials in Medicine, vol. 10, nº 2, p.p. 111-120, (1999).

[7] Alexis M. Pietak, Joel W. Reid, Malcom J. Stott, Michael Sayer, “Silicon substitution in the calcium

phosphate bioceramics” Biomaterials, vol. 28, nº 28, p.p. 4.023-4.032, Octubre (2007).

[8] M Vallet-Regí, D Arcos, “Silicon substituted hydroxyapatites. A method to upgrade calcium

phosphate based implants”, Journal of Materials chemistry, nº 15, p.p. 1509-1516, (2005).

[9] N. Ozgür Engin, A. Cüneyt Tas, “Manufacture of macroporous calcium hydroxyapatite

bioceramics”, Journal of the European Ceramic Society, vol. 19, nº 13-14, p.p. 2569-2572, (1999).

[10] Eun-Jung Lee, Young-Hag Koh, Byung-Ho Yoon, Hyoun-Ee Kim, Hae-Won Kim, “Highly porous

hydroxyapatite bioceramics with interconnected pore channels using camphene-based freeze

casting” Materials Letters, vol. 61, p.p. 2270–2273, mayo (2007).

[11] NÖ Engin, AC Taş, “Preparation of Porous Ca10 (PO4) 6 (OH) 2 and β‐Ca3 (PO4) 2 Bioceramics”,

Journal of the American Ceramic Society, vol. 83, p.p. 1581–1584, Julio (2000).

[12] L. L. Hench, R. J. Splinter, W. C. Allen, T. K. Greenlee, “Bonding mechanisms at the interface of

ceramic prosthetic materials”, Journal of Biomedical Materials Research, vol. 5, p.p. 117–

141, Noviembre (1971).

[13] P.N. De Aza, F. Guitian, A. Merlos, E. Lora-Tamayo and S. De Aza. “Bioceramics-Simulated body

fluid interfaces: pH and its influence on Hydroxyapatite formation”, Journal of Materials Science:

Materials in Medicine, vol. 7, p.p. 399-402, Julio (1996).

[14] C Ohtsuki, T Kokubo, T Yamamuro, “Mechanism of apatite formation on CaO SiO 2 P 2 O 5

glasses in a simulated body fluid”, Journal of Non-Crystalline Solids, vol. 143, p.p. 84-92, (1992).

[15]T Kokubo, “Apatite formation on surfaces of ceramics, metals and polymers in body

environment”, Acta Materialia, vol. 46, p.p. 2519–2527, Abril (1998).

[16] Ratner B.D, Hoffman A.S, Schoen P.J, Lemons J.E, “Biomaterials Science: An introduction to

Materials in Medicine”, (1996).

35

[17] W.M.S. Russell, R.L. Burch, C.W. Hume “The principles of humane experimental technique”

Johns Hopkins: Bloomberg School of public health, (1959).

[18] C Frondel, “Whitlockite: a new calcium phosphate, Ca3 (PO4)2”, Am. Mineral, vol. 26, p.p. 145-

152, (1941).

[19] D Lamy, AC Pierre, RB Heimann, “Hydroxyapatite coatings with a bond coat of biomedical

implants by plasma projection”, Journal of Materials Research, vol. 11, p.p. 680-686, marzo (1996).

[20]X Liu, S Tao, C Ding, “Bioactivity of plasma sprayed dicalcium silicate coating”, Biomaterials, vol.

23, p.p. 963–968, febrero (2002).

[21]Z Gou, J Chang, “Synthesis and in vitro bioactivity of dicalcium silicate powders”, Journal of the

European Ceramic Society, vol. 24, p.p. 93–99, Enero (2004).

[22] RW Nurse, JH Welch, W Gutt, “High-temperature phase equilibria in the system dicalcium

silicate–tricalcium phosphate”, Journal of the Chemical Society, p.p. 1077-1083, (1959).

[23] W Fix, H Heymann, R Heinke, “Subsolidus Relations in the System 2CaO· SiO2‐3CaO· P2O5

“,Journal of the American Ceramic Society, vol. 52, p.p. 346–347, Junio (1969).

[24] C. Richard, A. Charles, JR. Evans, S. Wilson, “Encyclopedia of materials characterization” en “X-

Ray Diffraction, XRD”, (1992).

[25] E. Braun, “¿Qué son los rayos x? ¿Por qué usar los rayos X?”, de Arquitectura de sólidos y

líquidos, Fondo De Cultura Económica.

[26] Gerardo Vázquez Nin, “Introducción a la Microscopía Electrónica Aplicada a Las Ciencias

Biológicas”, (2000).

[27] C. R. Brundle,Charles A. Evans,Shaun Wilson, “Encyclopedia of Materials Characterization:

Surfaces, Interfaces, Thin Films”, (1992).

[28] GJ. Lugo, P. Mazon, P De Aza “Phase transitions in single phase Si-Ca-P-based ceramic under

thermal treatment” Journal of the European Ceramic, (2015).