nuevas tÉcnicas de diagnÓstico de … · • rna –etanol 95% • rna later o trizol. tipo y...
TRANSCRIPT
NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE
ENFERMEDADES DEL CAMARÓNNIMIADINA HERRERA T
XI SIMPOSIO INTERNACIONAL
DE CAMARON DE CULTIVO Y EXHIBICION COMERCIAL
LAS ENFERMEDADES
EL MAYOR DESAFIO
LA COSTOS DE
PRODUCCION#1,
ENFERMEDADES #2
EN ASIA LAS
ENFERMEDADES SON #1
¿Cómo disminuimos el
impacto?
• Identificación
del agente
causal de la
enfermedad
• Técnicas no
invasivas
• Alta
especificidad y
sensibilidad
MANEJO - CONTROL The role of genomics in shrimp
improvement. a.tassanakajon
•Histopatología
•Hibridación in situ
•Ensayo de anticuerpos monoclonales,
•Inmunohistoquímica
•Cromatografía de flujo lateral
•Microscopía electrónica.
•Métodos moleculares (PCR, PCR de un paso,
anidados, tiempo real, isotermal (aislada o loop
mediated), digital.
TECNICAS DE DIAGNOSTICO
ACTUALES
Histórico
Frederick Sanger
ANALISIS DE LOS DATOS
DIAGNOSTICO MOLECULAR
Incluye técnicas de biología molecular
en beneficio de la salud humana y de las
especies animales de interés económico,
detectando y/o cuantificando secuencias
genéticas específicas de ácido
desoxirribonucleico (ADN), ácido
ribonucleico (ARN) o proteínas
Técnicas Moleculares
Herramientas de la Biología Molecular
• Aloenzimas, Southern,
Northern, Dot Blot
• RFLP’s
• PCR- simples, multiples,
cuantitativas
– Microsatélites
– AFLP’s
• SECUENCIACION
– Sanger
– NGS
• MICROARREGLOS
PGH
3BILLONES DE PARES DE
BASES ES DECIR 3GB
GENOMA DEL CAMARON
ES DE 2.5 GB
LOS “OMA”
• Genoma: Gen + cromosoma. Núcleo.
• Proteoma
• Metaboloma
• Microbioma
• La biología de sistemas se dedica a estudiar
las interacciones que se están produciendo
dentro de una célula en respuesta a cualquier
cambio externo o interno y así establecer la red
de interacciones (el interactoma).
Una hoja de ruta de la secuenciación
PlatformTemplate
PreparationChemistry
Max
Read
length
(bases)
Run Times
(days)
Max Gb per
Run
Roche 454 Clonal-emPCR Pyrosequencing 400‡ 0.42 0.40-0.60
GS FLX
TitaniumClonal-emPCR Pyrosequencing 400‡ 0.42 0.035
Illumina MiSeqClonal Bridge
Amplification
Reversible Dye
Terminator2x300 0.17-2.7 15
Illumina HiSeqClonal Bridge
Amplification
Reversible Dye
Terminator2x150 0.3-11 1000
Illumina
Genome
Analyzer IIX
Clonal Bridge
Amplification
Reversible Dye
Terminator[13][14]2x150 2-14 95
Life
Technologies
SOLiD4
Clonal-emPCR
Oligonucleotide 8-
mer Chained
Ligation
35-50 4-7 35-50
Life
Technologies
Ion Proton
Clonal-emPCRNative dNTPs,
proton detection200 0.5 100
Complete
Genomics
Gridded DNA-
nanoballs
Oligonucleotide 9-
mer Unchained
Ligation[17][18][19]
7x10 11 3000
Helicos
Biosciences
Heliscope
Single
Molecule
Reversible Dye
Terminator35‡ 8 25
Pacific
Biosciences
SMRT
Single
Molecule
Phospholinked
Fluorescent
Nucleotides
10,000
(N50);
30,000+
(max)[20]
0.08 0.5
NGS Platforms
15
DATOS
1. Especificidad (pueden detectar solo la molécula o microorganismo de
interés),
2. Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo
microorganismo), VIH
3. Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de 24
horas) y
4. Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnóstico en un
menor tiempo y reducir los costos).
5. Identificar nuevos microorganismos, los cuales no había sido posible
su cultivo e identificación por técnicas tradicionales
6. Permiten estudiar las poblaciones microbianas sin hacer
aislamientos, de microorganismos altamente patógenos, los cuales
pueden ser identificados muertos evitando así los riesgos de
infección del analista
7. Nuevas variantes de enfermedades genéticas, cáncer, enfermedades
infecciosas
DIAGNOSTICO MOLECULAR
Transportar la PCR desde la mesa de trabajo en el laboratorio
a la Finca.
POCKIT Xpress
cubee mini centrifuga
Pipetas
Analizador de Acidos Nucleicos
1000ul
50ul
1. Relacionado con las enfermedades de la lista de la OIE
2. Fines:
a. vigilancia;
b. “certificación” de existencias o de la instalación
c. diagnóstico de la enfermedad.
Muestreo
¿Qué muestra tomar ?
• dependen de la enfermedad o agente patógeno por
detectar
• del tamaño de los animales
• el objetivo de los análisis, diagnóstico de una enfermedad manifiesta,
una detección de portadores subclínicos del agente
patógeno o
una toma de muestras para la vigilancia dirigida con el fin
de demostrar la ausencia de una determinada
enfermedad.
Guía de la OIE para la Vigilancia Sanitaria de los Animales Acuáticos (Corsin et al.,
2009) y los capítulos sobre cada enfermedad en particular en este Manual
Acuático.
¿Cómo preservo mis muestras ?
• DNA – ETANOL 95% GRADO MOLECULAR
• DNA – Buffer de Lisis
• DNA – Congelado
• RNA – Muestras vivas
• RNA – ETANOL 95%
• RNA Later o Trizol
Tipo y cantidad de muestra
El número y tipo de muestras que deben tomarse para
el análisis varían en función de cuál fin se persiga.
Importante tomar el tejido adecuado donde se puede
detectar el patógeno, la cantidad y la calidad de la
muestra son importantes
una técnica 100% sensible y
especifica, PCR.
Tamaño de
la muestras
De acuerdo
al tamaño
del
espécimen
Ems- IQ PLUSTipo de
muestra Tamaño de muestra
Estomago 1 pieza
Intestino
medio1 cm
Muestra de
heces 1 cm
< PL6 25-50 PLs
PL6-15 10-30 PLs
Agua del
estanque
1.5 ml agua del estanque;
Centrifugar la muestra a 12.000
x g (12.000 rpm, r = 5 ~ 8 cm) o
en cubee durante 3 minutos.
Desechar el sobrenadante y
resuspender pellet en 100 μl de
PBS. Ir al procedimiento de
extracción paso 1
Muestra Cantidad de la
prueba
Límite de
detección
(Copias /
reacción)
Plásmido de
ADN de AHPND
/ EMS
50 copias / μl 100
<PL6 25-50 PLs 200
PL6 a 15 10-30 PL 200
Estómago 1 pieza 200
Intestino medio 1 cm 200
Hepatopancreas 10-25% 200
Estanque de
agua
1,5 ml de agua
del estanque
(véase la sección
V, parte c)
200
Organismo de
alimentación
(artemia, ostra,
calamar y
gusano de
sangre)
20 mg 200
Muestra fecal 1 cm 200
3 4 5 6
7
Kit IQ PLUS un sólo formato
todas las enfermedades
Procedimiento
Muestreo
Preparacion de la Muestra
Extraccion de DNA/RNA
Disolver la premezcla
Agregar Acidos nucleicos
Corrida en el POCKIT
Resultados en la pantalla del
POCKIT
15~20 minutes
57 minutes
15~20 minutes
• 1. IQ2000™ Sistema para la Detección y Prevención del AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, toxina 1, y el plásmido asociado a la AHPND/EMS (la región más estable del plásmido del AHPND)
• 2. IQ REALTM Sistema Cuantitativo AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, de la toxina 1, y el marcador del plásmido asociado al AHPND/EMS- ( en la región más estable del plásmido del AHPND)
• 3. IQ Plus™ Kit para Detección de AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar la IQ Plus™ la secuencia de la proteína Toxina 1 relacionada con la virulencia por AHPND/EMS en el plásmido en camarones de cultivos y en los ambientes de fincas,
• 4. IQ Plus™ kit para la detección del plásmido a AHPND/EMS: Para detectar y monitorear el plásmido asociado a Vibrio que puede o no contener el factor de virulencia la toxina 1.
IQ Plus™ AHPND/EMS
Toxina 1
IQ Plus™ AHPND/EMS Plásmido
Multiplex iiPCR para la detección cualitativa del
plásmido o la toxina 1 en muestras de tejido de
camarón (estómago, intestino medio), muestras
fecales, PL, agua y alimentos vivos.
Los fluorocromos o fluoróforos son VIC para
Plásmido y NED para el IC en el kit de deteccion
del plasmido. Para la deteccion de la Toxina 1 los
flouroforos son FAM Y NED.
Su uso es complementarios ya que cada Sistema
tiene reactivos para la deteccion del control
interno de las muestras.
Un laboratorio de PCR portátil
En la granja En el laboratorio de diagnóstico
Resultados de la Prueba
Mostrados en la pantalla Data almacenada en la tarjeta SD
Interpretar los
Resultados
1-2 control positivo, 3 control
negativo, 4 positivo ambos toxina 1
y plásmido; 5y7 negativo plásmido;
6 NTC;.
Formato IQ2000 IQ REALIQ
PLUS P
IQ PLUS
TOXIN 1 IQ2000
PLASMIDO 558 bpCt 14< + <Ct 35
+ + 0
TOXINA1 252bp Ct 14< + <Ct 35 + + 0
LIMITE DE
DETECCION100 copias 10 copias
10
copias10 copias na
Detección de blanco: AHPND-asociado
al plásmido Colección de muestras(intestino medio, estómago, heces, agua,
alimentos vivos, u otra possible fuentes)
Pruebas en el
sitio
Positiva Negativa
•Contiene el plásmido asociado al
AHPND
• Debe hacer un confirmatorio con
laboratorio central o local.
•Procedimiento de emergencia
que pueda ser aplicada a la finca.
•No contiene plásmido
asociado al AHPND.
•Debe continuar el
monitoreo periódicamente.
Eficaz para controlar / prevenir la
enfermedad infecciosa mediante la
detección temprana - Gestión de riesgos– Genera resultados rápidos
– Mejorar el nivel de seguridad biológica
• Monitoreo en tiempo real
• Inicie el control de la epidemia temprano de forma
oportuna
• Reducir las posibilidades de propagación de la
enfermedad
– Minimizar las pérdidas económicas
Diagnóstico in situ (punto de atención):
37
Si todos avanzamos juntos, entoncesel éxito se hace cargo de sí mismo.
• Henry Ford