nuevas aproximaciones a la evaluación de ingredientes y ... · 1. ¿por qué necesitamos alimentos...

Nuevas aproximaciones a la evaluación de ingredientes y alimentos funcionales

Daniel Ramón Vidal

1. ¿Por qué necesitamos alimentos funcionales?

2. El efecto antioxidante como ejemplo



3. Cacao y Alzheimer

4. Probiótico frente a la enfermedad celíaca

¿Qué es Biópolis SL?

• Biopolis SL es una compañía biotecnológicafundada en el 2003

• Ofrece servicios de I+D+i a empresas y• Ofrece servicios de I+D+i a empresas yproducción industrial de microorganismos yceunta con desarrollos propios que licencia

• Damos estos servicios en totalconfidencialidad, de forma ágil y efeicaz(“tailor-made biotechnology”)

La misión

• La misión de Biopolis SL es desarrollar solucionesbiotecnológicas a medida para los problemas denuestros clientesnuestros clientes

• Trabajamos con ellos en el marco de una estrictaconfidencialidad y un contacto constante

• Esta oferta transversal y global es el mayor activode la empresa

Biopolis I+D

• El Centro de I+D de Biopolis SL está situado en el Parc Cientific de la Universitat deValència; es un edificio con 1500 m2

• El centro está compuesto por once laboratorios y dos plantas de producción (una GMOy otra no-GMO), así como toda una serie de instalaciones anejas

• Todas las instalaciones han sido autorizadas por el Comité Nacional de Bioseguridad

Lifesequencing SL

• Lifesequencing Sl es una compañía especializada enla secuenciación genómica masiva

• Los socios son Biopolis SL (60%) y Secugen SL (40%)

• La compañía tiene dos tecnologías desecuenciación: pirosecuenciación por 454 FLX GSde Roche y ultrasecuenciaicón por Ion Torrentde Roche y ultrasecuenciaicón por Ion Torrent

• Además, Lifesequencing Sl tiene una alianzacomercial con el Beijing Genomics Institute que lepermite ofrecer la tecnología de Illumina

• Lifesequencing SL ha establecido recientementeuna alianza de interés económico con GenometraSL para reforzar sus actividades bioinformáticas

• La compañía está radicada en el Centro de I+D deBiopolis SL

Las plataformas de Biopolis SL

Bioquímica Cultivos celularesGenómica

Microbiología

Biología molecular

Organismos modelo

Escalado

Fermentación

Metabolómica

Modelos murinos

Nuestra plantilla

• En el grupo Biopolis trabajan 43 personas(36 en Biopolis SL y 7 en Lifesequencing SL)

• La mayoría son doctores (18) o licenciados(15); el resto son FP de grado superior (10)(15); el resto son FP de grado superior (10)

• Nuestra plantilla incluye biólogos,biotecnólogos, farmacéuticos, informáticos,ingenieros agrónomos e ingenierosquímicos, químicos, tecnólogos dealimentos, abogados y economistas

La oferta de Biopolis

Alimentación humana y animal Química fina y farmacia

El mercado de los alimentos funcionales

• El mercado de la alimentación funcional es unarealidad incuestionable

• Según los últimos datos de Leatherhead Foods(Junio 2011), entre el año 2003 y el 2010, elmercado de la alimentación funcional se ha

VENTAS(miles de millones US$)

mercado de la alimentación funcional se haincrementado 1.5 veces con una tasa anual decrecimiento compuesto (CAGR) del 14%

• Hay 4 regiones de interés: Japón (39.2% delmercado), Estados Unidos (31.1%), la UniónEuropea, en particular Alemania, España,Francia, Italia y el Reino Unido (28.1%) yAustralia (1.6%)

AÑO

El mercado funcional del futuro

• Entre el año 2010 y el 2014 se espera un crecimientodel mercado mundial de alimentos y bebidasfuncionales del 22.8%

• Se esperan alcanzar ventas por valor de 29.800millones de dólares

• En Japón se espera un crecimiento del 21% para•generar un negocio de 11.300 millones de dólares

• En Estados Unidos se esperan cifras de crecimientodel 20.7% para generar 9.100 millones de dólares enventas

• En la Unión Europea se espear el mayor crecimientodel negocio, un 27% que supondrían ventas por valorde 8.900 millones de dólares

• En Australia el crecimiento esperado es del 34.2%con ventas por valor de 530 millones de dólares

El Reglamento UE 1924/2006

JULIO 2003Primera propuesta

PolémicasClima de presión

DICIEMBRE 2006Aprobacion in

extremis

¿Qué implica el nuevo Reglamento?

Definición del (los) biomarcado(es) adecuado(s)

Ensayos clínicos en voluntarios humanos

Identificación bioquímica o microbiológica del ingrediente funcional

Definición de la ruta(s) metabólica(s) afectada(s) por el ingrediente

Definición del (los) biomarcado(es) adecuado(s)

La complejidad de la evaluación

• Debe ser similar, pero no idéntica, a la de losfármacos

• Los alimentos no curan , sólo ayudan a mejorar lasalud y, por lo tanto, a prevenir

• Las industrias farmacéuticas invierten una parteimportante de sus beneficios en I+D; lasimportante de sus beneficios en I+D; lascompañías alimentarias apenas lo hacen

• El desarrollo de un fármaco es un proceso largo; elde un alimento no puede ser más de tres años

• El valor añadido de un fármaco es alto; el de unalimento es muy bajo

• La vida comercial de un fármaco es larga; la de unalimento es muy corta

Cuellos de botella en la evaluación

• Los ensayos con roedores son lentos y caros

• Cada vez hay más actitudes sociales en contrade la experimentación animalde la experimentación animal

• Hay que buscar modelos alternativos y el apoyode las tecnologías “ómicas”

• Los ensayos con voluntarios sanos son de difícilinterpretación

• Decisiones precipitadas de EFSA

La búsqueda de organismos modelo

• Fácil de usar en el laboratorio

• Ciclo de vida corto

• Tamaño pequeño

• Disponibilidad de herramientas genéticas• Disponibilidad de herramientas genéticas(clásicas y moleculares)

• Buena colección de mutantes

• Genoma secuenciado y bien anotado

• Alto porcentaje de homología con el genomahumano

• Si es posible, por razones éticas, animalespequeños

Caenorhabditis elegans

• Es un animal muy simple (pequeño, transparente ycon una anatomía y una embriología bien descrita)

• Fácil de crecer (en placas de cultivo comiendo labacteria Escherichia coli)

• Los cultivos retienen la viabilidad durante muchotiempo; se pueden congelar y preservar más de 40añosaños

• Ciclo de vida corto (21 días)

• Potentes herramientas genéticas

• Buena colección de mutantes

• Genoma totalmente secuenciado

• Herramientas post-genómicas (colección de 16000cepas de E. coli que expresan todos los RNAi)

Estrés oxidativo: el cacao como ejemplo

• Hay muchas referenciasbibliográficas sobre polifenolesdel cacao y prevención del riesgocardiovascularcardiovascular

• Un polvo de cacao convencionaltiene un 3-4% de polifenoles

• Un producto con mayorcontenido en polifenoles seríamuy interesante

Diagrama de producción de CocoanOX

Selection of fruits PPO inactivation Drying Winnowing

MillingFat extraction dryingCocoa cake

E. Cienfuegos-Jovellanos, F.K. Jaisli, M.A. Pasamar, Y. Castilla, F.J. Arcos, D. Ramón. (2007). Method for obtaining polyphenol-rich cocoa powder with a low fatcontent and cocoa thus obtained. WO2007/096449

Sieving Extraction-purification

CocoanOX 12% CocoanOX 30-45-70%

Biodisponibilidad del CocoanOX

8.6 X

0,25

0,5

0,25

0,5

0,25

0,5

0,25

0,5

0,25

0,5

0,25

0,5

0,25

0,5

Δ ANTIOXIDANT ACTIVITY (mmol/l)

F.A. Tomás-Barberán, E. Cienfuegos-Jovellanos, A. Marín, B. Muguerza, A. Gil-Izquierdo, B. Cerdá, P. Zafrilla, J. Morillas, J. Mulero, A. Ibarra, M.A. Pasamar, D.Ramón, J.C. Espín. (2007). A new process to develop a cocoa powder with higher flavonoid monomer content and enhanced bioavailability in healthy humans.Journal of Agricultural and Food Chemistry 55: 3926-3935

-0,5

0,25

0

1 2 3

-0,5

0,25

0

1 2 3

-0,5

0,25

0

1 2 3

-0,5

0,25

0

1 2 3

-0,5

0,25

0

1 2 3

-0,5

0,25

0

1 2 3

-0,5

0,25

0

1 2 3

Time (h)Standard cocoa milk drink

CocoanOX cocoa milk drink

Efecto antioxidante en C. elegans

C. elegans

Estrésoxidativo

5 hours5 dÍas

+ CCX

C. elegans

EXPERIMENTO % SUPERVIVENCIA

SINCCX 5

CON CCX 39

- CCX

Efecto en el mutante SIR 2.1

TRANSCRIPTÓMICA DIFERENCIAL

EXPERIMENTO % SUPERVIVENCIA

SIN CCX WT 5

CONCCX WT 39

CON CCX SIR 2.1 7

HST3 SIR2 SIR1

La ruta diana

DAF-2

AGE-1

Insulin-like

peptides

AKT-1SGK-1

AKT-2

AKT-1SGK-1

DAF-16 SKN-1

SIR-2

DAF-16 LONGEVIDAD

PAR-5FTT-2

CITOPLASMA

NÚCLEO

Aumento de la esperanza de vida

C. elegans

>21 días

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122

days of adult

% wormsalive

- CCX

+ CCX

EXPERIMENTO LIFESPAN (días)

SIN CCX 15.2

CON CCX 17.8

P. Martorell, J. V. Forment, R. de Llanos, F. Montón, S. Llopis, N. González, S. Genovés, E. Cienfuegos, H. Monzó, D. Ramón. (2011). Cocoa polyphenols increaselifespan in Caenorhabditis elegans by a SIR-2.1 and DAF-16 dependent mechanism. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 2077-2085

El efecto en un vertebrado

A B D E G H

A. Leal-Tassias, A. V. Sánchez-Sánchez, M. Piquer-Gil, N. Rodríguez, P. Martorell, S. Genovés, M. Díaz-Llopis, D.l Ramón, J. L. Mullor. A polyphenol-enriched cocoa extract presents antioxidant properties and increases life span of medaka embryos. Enviado para su publicación.

Producto en el mercado

Probióticos y estrés oxidativo

Bifidobacterium

(15 cepas)Streptococcus

(9 cepas)Lactobacillus

(75 cepas)

ESCRUTINIO MASIVO

Escrutinio en dos pasos

Placas NG

4 días

Huevos

(1mL Buffer M9)

1 día

L1 Larvae

3 días

25°C

5 horas

Sincronización Alimentación

25°C 25°C

Adultos

Ensayo1

C. elegans

BA17 fem-1

Placas NG

M9 + ColesterolProbiótico

Inhibición E. coli

Estrés oxidativo

20°C25°C

Viabilidad

25°C 25°C

G. Grompone, M.C. Degivry, D. Ramón, P. Martorell, N. González, S. Genovés, S. Legrain-Raspaud, I. Chabaud, R, Bourdet-Siscard. (2011). Method for selecting bacteria with antioxidant activity. WO2011/083353A1

2

C. elegans

wild –type (N2)

Estrésoxidativo

(3mM H2O2)

5 horas5 días

NG+LAB

NG+OP50

Resultados en líquido

• En general, las bacterias lácticas incrementan la resistencia al estrésoxidativo

• Se detectó un fuerte efecto en 11 cepas pertenecientes a los génerosLactobacillus y Streptococcus; una de ellas denominada Lactobacillus

rhamnosus CNCM I-3690 funcionó de forma muy eficaz

• No se observó efecto en bifidobacterias

Transcriptómica de la cepa L10C

CNCM I-3690 CNCM I-4317E. coli OP50

Insulin like-pathway Metabolismo de lípidos Respuesta a estrésSistema inmune innato

DAF-16

Confirmación del papel de DAF-16

C. elegans

(daf16)

No hay incremento de la esperanza de vida al

alimentarse con la cepa L10C

C. elegans

(wild-type)

Hay un 34% de reducción de grasa en gusanos alimentados

con la cepa L10C

C. elegans

(fat7)

Sólo hay un 9% de reducción de grasa en gusanos

alimentados con la cepa L10C

Relación entre DAF-16 y NF-κβ

• En mamíferos, el equivalente a DAF-16 es FoxOque regula la homeostasis del sistema inmunitario

• En mamíferos, cualquier incremento en laseñalización de FoxO incrementa la resistenciacelular e inhibe la inflamación mediada por NF-κβ

• No hay homólogo a NF-κβ en C. elegans

• Aun así, cualquier ingrediente que aumente laseñalización de DAF-16 en el gusano debeaumentar la señalización de FoxO en mamíferos y,por lo tanto, debe tener efecto antiinflamatorio

• Si esta hipótesis es cierta, la cepa LC10 debe serun probiótico con clara respuesta antiinflamatoria

Propiedades antiinflamatorias

• Se ensayaron cocultivos de las cepas L10C Y L10Fcon células HT-29 de epitelio intestinalestimuladas con TNFα

• En comparación con el control de la cepa L10F,las células cocultivadas con la cepa L10C dieronlugar a una reducción en la producción de NF-κβe IL-8

• Se hicieron cocultivos de ambas cepas en unsistema de células HT-29 en la capa apical ycélulas dendríticas humanas en la capa basal

• Sólo la cepa L10C fue capaz de reducir los ratiosde citoquinas proinflamatorias IL-12/IL-10, IL-6/IL-10, IL-8/IL-10 y TNFα/IL-10; además sedetectó un 90% de reducción en la expresión deCD86 y HLA

Resultados en un modelo murino

• Se ensayó la administración intragástricadurante 5 días de 108 ufc de la cepa L10Cen un modelo de rectocolitis inducida porTNBS en ratones Balb/c; como controlpositivo se utilizó prednisolona y comocontrol negativo se usó el tampón deadministración del probiótico

No colitis Vehicle + TNBSadministración del probiótico

• Se realizó un análisis histopatológico

• El coeficiente de Wallace fue de 3.4 en elgrupo control con el placebo y de 1.5 en elgrupo de la prednisolona; el valor en elgrupo tratado con la cepa L10C fue de 2.4

G. Grompone, P. Martorell, S. Llopis, N. González, S. Genovés, A.P. Mulet, T. Fernández-Calero, I. Tiscornia, M. Bollati-Fogolin, I. Chambaud, B. Foligné, A.Montserrat, D. Ramón. (2012). Anti-inflammatory Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 strain protects against oxidative stress and increases lifespan inCaenorhabditis elegans. PLOS ONE 7: e52493

No colitis Vehicle + TNBS

CNCMI-3690 + TNBS Prednisolone + TNBS

La enfermedad de Alzheimer

Estrés oxidativoInflamación

Degeneración neuronalHaces neurofibrilares

Inhibición de PEPEfecto antioxidante in vivo

Búsqueda de ingredientes

• Material de partida común ybarato (CB)

• Disponibilidad del ensayo deinhibición de PEP (para-nitrofenilinhibición de PEP (para-nitrofenilderivado)

• Modelo de estrés oxidativo en C.

elegans

• Modelo de agregación de la placaamiloidea en C. elegans

Δt

Péptidos desde CB

Hydrophobic Interaction chromatography (HIC)

HIDRÓLISIS PROTEÍCA

FRACCIONES HIC

“COCOA BARQUILLO”

FRACCIONES HIC POSITIVAS

Reverse Phase Chromatography (RPC)

FRACCIONES RPC

FRACCIONES RPC POSITIVAS

MALDI-TOF

IDENTIFICACIÓN DE LOS PÉPTIDOS

Efecto in vivo

50

60

70

80

% W

orm

Su

rviv

al (

C. e

leg

an

s N

2)

Antioxidant Activity

50

75

100

125

NGM

ZPP

F8

F9

F10

not induced

Per

cen

tag

e N

ot

par

alyz

ed

xxx

0

10

20

30

40

NGM NGM+vitamin C RPC F8 RPC F9 RPC F10

% W

orm

Su

rviv

al (

24 41 43 45 47 49 51 530

25

50 F10

Time (h)

Per

cen

tag

e N

ot

par

alyz

edEfecto antioxidante Parálisis

Identificación del péptido

FRACCIONES RPC POSITIVAS

IDENTIFICACIÓN MALDI-TOF

SECUENCIAS PEPTÍDICAS (17 péptidos)

Theobroma cacao 21 kDa seed protein (221 aas)

mktatavvlllfaftsksyffgvanaanspvldtdgdelqtgvqyyvlssisgagggglalgratgqscpeivvqrrsdldngtpvifsnadskddvvrvstdvniefvpirdrlcststvwrldnydnsagkwwvttdgvkgepgpntlcswfkiekagvlgykfrfcpsvcdscttlcsdigrhsdddgqirlalsdnewawmfkkasktikqvvnakh

SECUENCIAS PEPTÍDICAS (17 péptidos)

Diseño de péptidos

9L-mer 11R-mer

13L-mer 13R-mer

Resultados

0

10

20

30

40

50

60

70

80

% W

orm

Su

rviv

al (

C. e

leg

an

s N

2)

Antioxidant Activity

24 41 43 45 47 49 51 530

25

50

75

100

125

NGM

ZPP

9L

11R

13L

13R

not induced

Time (h)

Per

cen

tag

e N

ot

para

lyze

d • Paralysisassay

IC50 PEP 13-mer(0.19 mg/ml)

0,0001 0,001 0,01 0,1 1

% In

hibi

tion

-20

0

20

40

60

80

100

0

NGM NGM+vitamin C 9L 11R 13L 13R Time (h)[13-mer] mg/ml

0,0001 0,001 0,01 0,1 1

• El valor IC50 más bajo para la inhibición de PEP lo dió el péptido 13L-mer (0.19 mg/mL)

• Este péptido presentó la mayor actividad antioxidante in vivo

• También fue el más eficaz en la reducción de la parálisis

• Curiosamente, el péptido 13L-mer inhibe in vitro la enzima humana PLA2

• Hemos detectado trazas de este péptido en chocolates comerciales

Actividad antioxidante ParálisisInhibición PEP

Transcriptómica

PÉPTIDO 13L-mer

RegulaciónMetabolismo del

piruvato

RegulaciónProteasoma

RegulaciónMetabolismo del

triptófano

Acetil coA Turnover de proteínas Serotonina

Función sináptica Reducción delagregado amiloide

LocomociónApetito

REDUCCIÓN DE LATOXICIDAD DE Aβ

Inhibición de la agregación de Aβ

112

Rat

io d

e ag

rega

ció

n

0,8

1

1,2

25

30

61

13

Tubulina

Placebo 13LR

atio

de

agre

gaci

ón

0

0,2

0,4

0,6

0,8

Dinámica molecular

Free energy ofbinding (Kcal/mol)

Average number ofclose atoms

Average number ofhydrogen bonds

Peptide - amyloid -91,4669 488,16 1,66

Dimer of amyloids -152,5017 631,04 3,89

Isolated Peptide - amyloid -91,4669 488,16 1,66

simulationsDimer of amyloids -152,5017 631,04 3,89

Aggregation of second amyloid in presence of peptide Peptide - amyloidpresence of peptide Peptide - amyloid

-94,7409 715,32 2,72(Analysis) 1 complex with amyloid 2

Peptide - amyloid

-61,3742 671,17 3,572 complex with amyloid 1

Amyloid - amyloid

-97,6058 734,23 3,37with peptide

Peptide - amyloid 1 Not applicable 345,04 2,11

Peptide - amyloid 2 Not applicable 389,19 1,26Amyloid – amyloid Not applicable 326,13 1,46

Disaggregation of an amyloid dimerwith the introduction of a peptide Peptide - amyloid

1064,52 3,92(Analysis) 1 complex with amyloid 2

Peptide - amyloid

1253,15 4,472 complex with amyloid 1

Amyloid - amyloid

-61,2820 535,79 2,35with peptide

Peptide - amyloid 1 Not applicable 362,21 1,45

Peptide - amyloid 2 Not applicable 173,58 0,9Amyloid – amyloid Not applicable 890,94 3,02

La herramienta C. elegans

Efecto antioxidante

Longevidad

Inflamación

Moleculas puras

Probióticos

Extractos/fracciones

Inflamación

Alzheimer

Replication de virus

Infecciones bacterianas

Obesidad

Matriz alimentaria

Disoluciones

La triada celíaca

PRESENCIA DE GLUTENY PÉPTIDOS DEL GLUTEN

FACTORES GENÈTICOS(HLA-DQ2 Y HLA-DQ8)

CAMBIOS EN LA PERMEABILIDADY LA MICROBIOTA INTESTINAL

• En los individuos con enfermedad celíaca (EC)hay cambios sustanciales en la microbiota deltracto intestinal, aun siguiendo una dieta librede gluten

• Hay más cantidad de microbiota Gram negativa(diferentes especies del género Bacteroides y E.

Microbiota del tracto digestivo del celiaco

(diferentes especies del género Bacteroides y E.

coli) y menos microbiota beneficiosa(Bifidobacterium)

• Hay un incremento en factores de virulencia deenterobacterias que colonizan el intestino

• Hay tests in vitro que demuestran que estamicrobiota estimula localmente la producciónde citoquinas proinflamatorias (IFN-γ y TNF-α)y disminuye la producción de citoquinasantiinflamatorias (IL-10)

Origen de la cepa

• La cepa ES1 fué aislada por el grupo de la Dra.Yolanda Sanz en el Instituto de Agroquímica yTecnología de Alimentos del Consejo Superior deInvestigaciones Científicas en Valencia

• Se aisló a partir de las heces de un niño sano, menorde tres meses y sometido a lactancia materna

• Mediante taxonomía molecular (secuenciación de laregión del gen que codifica el rRNA 16S) se haregión del gen que codifica el rRNA 16S) se haclasificado como un miembro de la especieBifidobacterium longum

• Dicha especie está incluida en los listados GRAS yQPS de la Food and Drug Administration y laEuropean Food Safety Agency, respectivamente

• La cepa está protegida por una patente y depositadaen la Colección Española de Cultivos Tipo bajo elcódigo CECT 7347; esta patente fue licenciada enexclusiva a Biopolis SL y está transferida a variospaíses

Propiedades probióticas

• La cepa ES1 mantiene un alto grado deviabilidad a pH 2.0 (57.9±2.3), pH 2.5(86.2±13.0) y pH 3 (99.4±4.2)

• Además es parcialmente resistente aconcentraciones elevadas de sales biliares:concentraciones elevadas de sales biliares:89.22±0.7% para una concentración del 0.5%,82.65±1.6% para 1%, 69.95±0.33% para 2% y67.28±1.31% para 3%

• La cepa se adhiere a mucina

• Se ha comprobado con voluntarios humanosque la cepa ES1 mantiene la viabilidad tras elpaso por el tracto digestivo

Actividad antimicrobiana

CEPA DIANA* DIÁMETRO DE INHIBICIÓN (cm)

Bacteroides vulgatus 1.3

Clostridium difficile 1.6Clostridium difficile 1.6

Clostridium perfringens 1.2

Escherichia coli 1.9

Klebsiella oxytoca 2.0

Staphylococcus epidermidis 1.0

*Aislados provenientes de heces de enfermos celíacos

Capacidad para degradar gliadinas

0,2 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0 16,3 17,5 18,8 20,0 21,3 22,8-1,2

5,0

10,0

15,0

22,3PEPTID_8_3_07 #35 [modified by JOSE VICENTE GIL] Muestra35 UV_VIS_2mAU

min1 - 1,047

2 - 2,427

3 - 3,140

4 - 8,687

5 - 16,807 6 - 21,140WVL:220 nm

• Los sobrenadantes de cultivo de la cepa ES1 tienen capacidad in vitro parahidrolizar parcialmente el péptido 33-mer(LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF) y los péptidos PA2(PQPQLPYPQPQLP) Y PA9 (QLQPFPQPQLPY) de la α-gliadina

• Muchas propiedades de esta cepa están relacionadas con esta capacidadpara degradar las gliadinas

Respuesta anti-inflamatoria en células PBMC

• Se ha realizado un estudio con heces de niños celíacossometidos a dieta libre de gluten, así como hecesprovenientes de niños sanos

• En todos los casos las heces se coincubaron con la cepaES1 y se diseñaron controles negativos sin la cepa; lasmuestras se usaron posteriormente para estimularmuestras se usaron posteriormente para estimularcélulas mononucleares de sangre periférica (PBMC)provenientes de individuos adultos sano

• Las heces de los individuos celíacos dieron lugar a unincremento de la producción de TNFα y la expresión deCD86 y a una disminución de la producción de IL-10 y laexpresión de CD4

• Las heces coincubadas con la cepa ES1 suprimieron estarespuesta pro-inflamatoria e incrementaron laproducción de IL-10

Digestión de las gliadinas por la cepa ES1

• Un extracto comercial de gliadinas se sometió a digestión gastrointestinal in vitro y,posteriormente, se coincubó con la cepa ES1 o con otras cepas de bifidobacterias

• La colección de péptidos derivados de las gliadinas producida por la cepa ES1 fue distinta delas generadas por las otras bifidobacterias; los péptidos eran mucho más pequeños

• Las distintas colecciones de péptidos se adicionaron a cultivos de células de epiteliointestinal humano Caco-2 y, posteriormente, las células se tiñeron para cuantificar toxicidad

• La única colección que no fue tóxica fue la obtenida con la cepa ES1

• Además, se midieron los niveles detranscripción de los genes que codificanel receptor CXCR3, NFκβ y TNFα

• Por ELISA se analizaron los niveles de las

Respuesta anti-inflamatoria en células Caco-2

• Por ELISA se analizaron los niveles de lasproteínas correspondientes y de IL-1β yp50

• Los cultivos celulares coincubados conla cepa ES1 tenían reducidos los nivelesde transcripción y, consecuentemente,las concentraciones celulares de IL-1β,NFκβ , p50 y TNFα

• Se estudió el proteoma de células Caco-2expuestas a los hidrolizado de gliadinas enpresencia o ausencia de la cepa ES1

• Las gliadinas sin la cepa ES1 indujeron la

Estudios proteómicos

• Las gliadinas sin la cepa ES1 indujeron laproducción diferencial de diversas proteínasrelacionadas con la apoptosis, la inflamacióny la desorganización del citoesqueleto

• Por el contrario, cuando la cepa ES1 estabapresente se producían proteínasrelacionadas con la homeostasis del calcio yla supervivencia y la función celular

Respuesta anti-inflamatoria en células dendríticas

• Se investigó la interacción de la cepa ES1 concélulas dendríticas derivadas de monocitos(CDDM), en combinación con gliadinas ycélulas Caco-2

• Al contrario que algunas cepaspatógenas(Escherichia coli o Shigella CBD8),patógenas(Escherichia coli o Shigella CBD8),la cepa ES1 indujo mínimos cambiosmorfológicos en las células CDDM y activómenos la adhesión, la propagación y laproducción de citoquinas inflamatorias

• Además, promovió una menor inducción dela expresión de CD86 y CD40 y unareducción en la producción inducida porgliadinas de IFN-γ, y dio lugar a unincremento en la secreción de IL-10

Estudio preclínico de efectividad en ratas

• Se usó un modelo de enteropatíainducida por gliadinas utilizando ratasrecién nacidas sensibilizadas con IFN-γque fueron alimentadas con la cepa ES1frente a un grupo control alimentadascon placebo

B. longum ES1

Placebo

con placebo

• Las ratas alimentadas con la cepa ES1tenían importantes cambios en lamorfología del epitelio intestinal

• En concreto, era posible detectar en lasratas de este grupo una restauración dela altura de los enterocitos, una de lascaracterísticas negativas de laenfermedad celiaca

• Además, en los dos grupos se analizó laproducción de componentes del sistemainmunitario y se estudió la microbiotade las heces

• Los yeyunos de las ratas alimentadas

Respuesta anti-inflamatoria en animales

TNFα

(n

g/

g te

jido

)

TNFα (inflamatorio)IL-10 (antiinflamatorio)

• Los yeyunos de las ratas alimentadascon la cepa ES1 contenían menos TNF-αy más IL-10

• También aumentaba en este órgano laexpresión del gen que codifica el factorNFκβ, dando lugar a una señalización derespuesta regulatoria antiinflamatoria

TNFα

(n

g/

g te

jido

)

IL-1

0 (

pg

/ g

tejid

o)

Placebo ES1

Estudios de seguridad alimentaria in vitro

• Se evaluó la seguridad alimentaria del probiótico ES1 siguiendo lasrecomendaciones de FAO y OMS

• Se analizó la producción de metabolitos no deseados (aminas biogenas, ratioD-láctico/L-láctico y sales biliares desconjugadas,) no detectándose valoresproblemáticos

• Se determinaron los break-points de una veintena de antibióticos de usoclínico y no se detectó resistencia significativa a alguno de ellos

Estudios de seguridad alimentaria in vivo

• En colaboración con el Instituto Pasteur deMontevideo, se llevó a cabo un estudio deingesta aguda de la cepa ES1 (109 ufc/día)en ratones BALB/c sanos o sometidos ainmunodepresión por tratamiento conciclofosfamida

• No se detectó mortalidad ni patologíasasociadas a la ingesta de la cepa

• Tampoco se observó translocación de lacepa, pudiéndose concluir la seguridadalimentaria de la misma

Secuenciación del genoma de la cepa

• Se ha secuenciado el genoma de la cepa ES1utilizando técnicas de pirosecuenciacióngenómica masiva

• El genoma de la cepa ES1 tieneaproximadamente 2.5 Mb

• En total se dispone de casi 75 Mb de• En total se dispone de casi 75 Mb deinformación (aproximadamente 30X desecuencia del genoma)

• No se detectan genes de virulencia ofactores de patogenicidad

• No hay genes funcionales de resistencia aantibióticos

Escalado de producción

• Se ha escalado la fermentación de la cepa ES1, desde el laboratorio a la planta piloto ydesde la planta piloto a la planta de producción

• El proceso de fermentación ya está optimizado

• También se ha escalado y optimizado el proceso de secado por liofilización

Ensayo clínico fase I

• Se llevó a cabo con 12 voluntarios humanos(edad media 30.3 años, rango de 23 a 40años); fue un ensayo doble ciego, aletaorio ycon control de placebo

• Los voluntarios ingirieron la cepa ES1 o elplacebo durante dos semanas (109 ufc/día),posteriormente se realizó un período delavado de 2 semanas y luego se siguió lalavado de 2 semanas y luego se siguió laingesta cruzada durante otras 3 semanas

• La ingesta de la cepa ES1 no produjo efectosadversos

• La microbiota de las heces de los individuoscontrol frente a los que habían ingerido lacepa ES1 no presentó diferenciassignificativas, si bien el 70-80% de las cepasde bifidobacterias en los individuosproblema eran la cepa ES1

Ensayo clínico fase II (I)

• Se llevó a cabo un ensayo doble ciego,aletaorio y con control de placebo sobre 40niños celiacos voluntarios de edadescomprendidas entre los 2 y los 14 años(Hospital Universitari Sant Joan de Reus yHospital Sant Joan de Déu de Barcelona)

• Uno de los grupos recibió la cepa ES1• Uno de los grupos recibió la cepa ES1durante 3 meses en una dosis diaria de 109

ufc y el otro recibió un placebo

• Al analizar sangre periférica se detectó unadisminución de la concentración de TNF-α yde linfocitos CD3+

• Finalmente, los individuos del grupo quehabía ingerido el probiótico presentaron unamayor talla y peso (si bien en este últimocaso la diferencia no fue estadísticamentesignificativa)

Ensayo clínico fase II (II)

• El estudio de la microbiota de los dos grupos reveló datos muy interesantes

• Se detectó una disminución estadísticamente significativa de Bacteroides yClostridium en el grupo que recibió el probiótico ES1 frente al grupo querecibe el placebo

• El grupo que recibió la cepa ES1 presentó mayores recuentos debifidobacterias, aunque los datos no fueron estadísticamente significativos

Artículos científicos

• Izquierdo E, Medina M, Ennahar S, Marchioni E, Sanz Y. (2008). Resistance tosimulated gastrointestinal conditions and adhesion to mucus as probiotic criteriafor Bifidobacterium longum strains. Current Microbiology 56: 613-618

• Medina M, de Palma G, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. (2008).Bifidobacterium strains suppress in vitro the pro-inflammatory milieu triggeredby the large intestinal microbiota of coeliac patients. Journal of Inflammation 3:5-19

• Laparra JM, Sanz Y. (2010). Bifidobacteria inhibit the inflammatory response• Laparra JM, Sanz Y. (2010). Bifidobacteria inhibit the inflammatory responseinduced by gliadins in intestinal epithelial cells via modifications of toxic peptidegeneration during digestion. Journal of Cell Biochemistry 109: 801-807

• Olivares M, Laparra M, Sanz Y. (2011). Influence of Bifidobacterium longum CECT7347 and gliadin peptides on intestinal epithelial cell proteome. Journal ofAgricultural and Food Chemistry 59: 7666-7671

• Laparra JM, Olivares M, Gallina O, Sanz Y. (2012). Bifidobacterium longum

CECT7347 modulates immune responses in a gliadin-induced enteropathy animalmodel. PLoS ONE 7: e30744

• de Palma G, Kamanova J, Cinova J, Olivares M, Drasarova H, Tuckova L, Sanz Y.Modulation of phenotypic and functional maturation of dendritic cells byintestinal bacteria and gliadin: relevance for celiac disease. Journal of LeukocyteBiology 92:1043-1054

El producto Proceliac

Daniel Ramón Vidal ([email protected])

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