neps latinoamerica tinep 2011
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Adriana Sáenz Aponte
Juan Carlos López Núñez Luz Angela Galindo
Glosario G losario de Morfología de Nematodos
Adanal: situado en la proximidad del ano. Adcloacal: sitiado en la proximidad de la cloaca. Anfidios: órganos sensoriales pares localizados en el extremo anterior. Generalmente están situados cerca de los labios. Su tamaño y forma son variables. Anillo nervioso: Anillo de fibras nervio-sas situadas alrededor de la boca, esófago, etc. El anillo nervioso representa la conexión ventral y dorsal de los ganglios laterales. Alas caudales: ver bursa. Anfidelfico: referente a úteros opuestos. Posición y dirección de los úteros, no de los ovarios. Anfimixis: relativo a la unión de 2 game-tos en la reproducción sexual. Opuesto a automixis. Ano: Abertura posterior del tacto digesti-vo. Automixis: autofecundación; ovulo y esperma provenientes del mismo indivi-duo. B Bursa: expansiones cuticulares laterales a modo de alas generalmente situadas en el extremo posterior. C Cálamo: mango o cuello de la espícula. Cefálico: referente al extremo anterior.
Cloaca: en los machos, recinto recubierto por cutícula que recibe los productos del intestino y del tracto reproductor. Conducto excretor: tubo o canal a través del cual son eliminados los productos del sistema excretor. Corpus: extremo anterior del esófago, generalmente de forma cilíndrica pero puede estar dilatado. En algunos grupos el corpus está dividido en procorpus, mesocorpus y metacorpus. Crura: segmentos cuticularizados longitudinales que refuerzan la lamina del gubernáculo. Cuerdas longitudinales: engrosamientos longitudinales de la hipodermis. D Dauer: termino de origen alemán que se refiere al estado de quiescencia que ciertos juveniles adquieren cuando están protegidos por la cutícula del estadio precedente. Denticulo: expansiones dentiformes pequeñas. Ducto espermático: vas deferens. E Epiptigma: expansiones cuticulares situadas en la abertura de la vulva. Esófago: tubo que conecta el estoma o estilete con el intestino. Espermateca: porción agrandada del sistema reproductor femenino que sirve de
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reservorio almacenando esperma del macho. Espículas: órgano intromitente masculi-no que se extruye a través de la cloaca y transfiere el esperma a la hembra durante la Copula. Esticocito: célula del esticosoma.
Esticosoma: series longitudinales de células (esticocitos) que forman las Glándulas esofágicas posteriores. Estilete: estructura hueca delgada y filiforme que cumple función. Estoma: abertura bucal, segmento del tracto digestivo situado entre la abertura oral y el esófago. Estrías longitudinales: a nivel de la cutícula se refiere a los surcos que reco-rren longitudinalmente el cuerpo del nemato-do. F Fasmidios: órganos sensoriales pares de posición postanal. Filiforme: con aspecto o forma de hilo. Fosoria: dientes móviles del queilostoma. G Gametogénico: referente a la reproduc-ción sexual. Glándulas esofágicas: glándulas elonga-das
o simplemente túbulos ramificados localizados en la región esofágica con secreciones de naturaleza enzimática. Gubernáculo: estructura acanalada cuticularizada que se halla presente en los machos y sirve de guía de las espículas. H Hemizonido: comisura nerviosa proveniente del anillo nervioso, que es retráctil cuando se une con el cordón nervioso ventral y cerca del poro excretor. I Infectivo: estadio capaz de penetrar en el hospedero y causar enfermedad en el mismo. Istmo: segmento del esófago que conecta el corpus con el bulbo basal. J Juvenil: estadio inmaduro no adulto. Se aconseja usar este término en lugar de “larva”, para evitar confusión con los estadios inmaduros en insectos. L Lamina: Cuerpo de la espícula, porción principal. Leptodera: Tipo de bursa en la que las alas caudales se encuentran por delante del extremo de la cola del macho. M Manubrio: porción anterior (“cefálica”) y expandida de la espícula. Mesorabdiones: paredes del mesostoma
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Mesostoma: Una de la subdivisiones del prostoma, localizado entre el prostoma y el metastoma. Metacorpus: bulbo medio. Subdivisión posterior del corpus. Metarabdion: paredes del metacorpus. Metastoma: subdivisión posterior del prostoma. Monorquico: que tiene un único testis. Monoxénico: referente a la cría o cultivo de un organismo con la presencia de una úni-ca especie de organismo asociado al mismo.
Mucron: terminación en forma de ma-melon o espina en el extremo caudal. O Ovario: gónada femenina involucrada en la producción de huevos. Oviducto: tubo de pasaje de huevos que conecta el ovario con el útero. Ovíparo: hembra que expulsa huevos que eclosionan al ser eliminados en el exterior. Ovovivíparo: hembra que produce hue-vos que son retenidos e incubados en el útero. Los huevos eclosionan dentro del útero. P Papila: órgano sensorial. Es una expan-sión o
proyección cuticular en forma de pápula o granular. Partenogenético: desarrollo de un individuo proveniente de un huevo no fecundado. Pelodera: tipo de bursa en la que las alas caudales se fusionan por detrás de la cola. Poro excretor: orificio localizado en el lado ventral a través del cual son eliminados los productos del sistema excretor. Postcorpus: subdivisión anterior del esófago, donde se localizan las glándulas esofágicas. Procorpus: subdivisión anterior del cor-pus generalmente de aspecto cilíndrico. Prodelfico: útero paralelo y anteriormen-te dirigido. Prorabdion: pared del prostoma. Prostoma: en nematodos rhabditoides, se refiere a la porción media del estoma, delimitada anteriormente por el queilostoma y posteriormente por el telostoma. Pseudocel: cavidad corporal no limitada por mesodermo. Pseudopelodera: tipo de bursa en la que las alas caudales no se reúnen un poco an-tes
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del extremo caudal. Q Queilorabdion: paredes cuticularizada del queilostoma. Queilostoma: cavidad labial del estoma delimitada anteriormente por la abertura oral y posteriormente por el prostoma. R Rabdion: pared del estoma. Rostro/um: proyección distal de la espí-cula. S Septicemia: condición mórbida que ocu-rre en la cavidad corporal del hospedero que es causada por bacterias patógenas y sus toxinas. Seta: expansión de la cutícula a modo del filamento fino. T Testis: gónada masculina que produce espermatozoos. Telostoma: segmento corto que conecta a modo de válvula la estoma con el esófago.
Trofosoma: modificación intestinal en la cual las paredes y el lumen desaparecen, resultando en un sincicio. U Útero: región del oviducto modificada que
sirve para el desarrollo de los huevos. V Vagina: porción terminal del tracto reproductor femenino que se abre al exterior. Vector: organismo que transmite o disemina organismos patógenos o de otro tipo. Velo: expansión membranosa delicada localizada en la cara interna de la espícula Vulva: abertura genital femenina que esta delimitada en sus márgenes por la cutícula
encontraba en su fase inicial en colaboración con científicos de países desarrollados (Kaya et al 2006). A su vez, la búsqueda a nivel mundial de nuevas especies y aislamientos adaptados a diferentes
condiciones climáticas y hospederos se incrementó significativamente. Como resultado, miles de nuevos aislamientos y muchas nuevas especies se recuperaron y otras en proceso de caracterización e identificación. Condiciones necesarias para ampliar el conocimiento de la biodiversidad y distribución geográfica de tan importantes microorganismos (Stock, 2002).
Actualmente, se cuenta con cerca de 54 especies de NEPs identificados en todo el mundo y muchos otros en proceso de ser descritos, de los cuales nueve están disponibles comercialmente en Estados Unidos, Europa, Australia y Asia. Se conoce que diferentes especies y cepas de nematodos muestran diferencias en la supervivencia, infectividad y reproducción, lo cual los hace más o menos favorables para determinadas
Estatus de la Biodiversidad de Nematodos Entomopatógenos en América Latina
Introducción
Ana Milena Caicedo, Arturo Carabalí, Gerardo A. Torres , Jaime Eduardo Muñoz, Paola Andrea Zuluaga y Mabell Orobio, Miguel Uribe
A comienzos de la década de 1970 se evidenció el interés tanto en investigación como en desarrollo comercial de los nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) y sus bacterias asociadas (Xenorhabdus y Photorhabdus). Este gran interés se generó principalmente por la necesidad de disponer de herramientas efectivas y ambientalmente adecuadas para el control de especies-plaga del suelo (Klein, 1990) y por la facilidad de producir estos microorganismos en forma comercial (Ehlers, 2001). Adicionalmente, el hallazgo de que las bacterias asociadas producían antibióticos y toxinas y que podían servir como modelos para entender las asociaciones simbióticas, generó un mayor interés de entender el complejo nematodo/bacteria (Boemare, 2002).
Este interés científico se concentró principalmente en América del Norte y en Europa Oriental. De igual forma, entre 1980 y 1990, los científicos Australianos realizaron importantes contribuciones en la producción masiva y en el conocimiento de la biología de la bacteria. Mientras que en el resto del mundo, la investigación en este campo apenas se
Contenido del Capítulo
Introducción Avance en el conocimiento de la diversidad y distribución geográfica de NEPs en Latinoamérica
Importancia de la caracterización morfológica y molecular de especies de
Importancia del establecimiento de una red latinoamericana de NEPs
Conclusiones Referencias Bibliográficas
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NEPs debe priorizarse en nuestra región latinoamericana, sobre lo cual es muy poco lo que se conoce comparado con otros países.
Se pretende ilustrar el avance en el conocimiento de la biodiversidad y distribución geográfica de NEPs en los países latinoamericanos y se enfatiza la importancia de establecer una red de investigadores Latinoamericanos para alcanzar un conocimiento general sobre la diversidad y distribución de las principales especies identificadas y su potencial en la producción de frutas de Latinoamérica.
especies de insectos (Stock, 2002). Además, la plasticidad ecológica de los NEPs les ha permitido adaptarse y resistir condiciones adversas, por lo que se encuentran distribuidos en una amplia variedad de hábitats y tipos de suelo (Adams et al. 2006).
La biodiversidad constituye en la actualidad, la mayor riqueza potencial de los países en vías de desarrollo. Las perspectivas de su explotación adecuada y racional están relacionadas con el conocimiento sobre su uso, lo que es a su vez otra riqueza potencial que debe ser conservada por las culturas locales. Es así como el conocimiento de la biodiversidad y la distribución geográfica de los
Avance en el conocimiento de la diversidad y distribución geográfica de NEPs en Latinoamérica
Diversas especies y numerosas cepas nativas se han descubierto de muchos países, los cuales en su mayor proporción se han recuperado del suelo. Estudios extensivos han utilizado el método del insecto-trampa desarrollado por Bedding & Akhurst (1975), con lo cual se ha demostrado la amplia distribución en todos los continentes a excepción de la Antártida (Hominick et al 1996).
El interés actual de estudiar los Neps no es sólo por su potencial de control biológico sino también para responder preguntas en los campos de la ecología, biodiversidad, evolución, bioquímica, simbiosis y genética molecular (Burnell and Stock, 2000).
Entre las especies que presentan una amplia distribución se tiene a S. carpocapsae y S.feltiae en regiones templadas y H. bacteriophora en regiones continentales y clima mediterráneo, H. indica se encuentra en el trópico y subtrópico. Otras especies
como S. rarum, S. kushidai, S. ritteri y H. argentinensis parecen tener una distribución mucho más restringida, pero a medida que se incrementan los muestreos es posible que se amplíe su distribución (Hazir et al 2003). Asimismo, H. indica se ha encontrado en la región tropical de la India, Sri Lanka, Japón, Norte de Australia, Cuba y el Caribe. Mientras que H. bacteriophora presenta una distribución más amplia en el Sur de Europa, Norte y Sur América, Australia y China. Esta variación en la presencia de NEPs en Europa ha sido documentada por diversos autores, donde los Steinernematidos predominan sobre los Heterorhabditidos (Adams et al. 2006; Kaya et al. 2006).
En Latinoamericana el mayor interés de investigación en NEPs es en el uso de estos como controladores biológicos de importantes especies-plaga. Además, las exploraciones de aislamientos nativos promisorios en esta región por la gran
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diversidad en los diferentes países. La mayor parte de Sur América permanece
aún sin explorar para NEPs. De acuerdo a Poinar (1990), el primer reporte sobre el cual una especie podía pertenecer al género Heterorhabditis fue descrita hace mas de 65 años como Rhabditis hambletoni Pereira. Posteriormente, S. glaseri, una especie descrita de Norte América fue recuperada de los huevos de Migdolus fryanus (Westwood) colectada en campo en el estado de São Paulo, Brasil. Nuevas especies descritas de Sur América incluye S. rarum (Doucet, 1986) y S. ritteri Doucet y Doucet (1990), en Argentina y S. scapterisci aislado del grillo Scapteriscus vicinus Scudder colectado en Uruguay (Nguyen y Smart, 1990). La especie H. argentinensis Stock (1993) aislada de Graphognatus sp. en Santa Fé, Argentina.
Actualmente en los 12 países Suramericanos se ha adelantado algún tipo de investigación relacionada con NEPs, entre los que se destaca México, Costa Rica, Honduras, Venezuela, Surinam, Colombia, Ecuador, Brasil, Perú, Bolivia, Argentina y Chile. La cual comprende estudios morfológicos, taxonómicos, biología y ecología, evaluación en laboratorio de cepas nativas y exóticas, recuperación de suelos y estudios preliminares de producción masiva.
A continuación se resume las investigaciones más relevantes desarrolladas en cada uno de los países Latinoamericanos:
En México, a mediados de la década de los 90, los investigadores mostraron gran interés por el desarrollo de los NEPs como controladores biológicos, por lo cual en el año de 1997 promovieron un simposio internacional para promover el uso y aplicación de nematodos entomopatógenos, a través de los avances de investigación, desarrollo
de tecnología y regulación existentes a nivel nacional e internacional con la colaboración de investigadores de tres universidades de Estados Unidos, California, Texas y Florida.
El reconocimiento de NEPs en diferentes estados Mexicanos han permitido la recuperación de aislamientos de las dos familias. Un ejemplo de ello es el aislamiento de S. carpocapsae en Chihuahua México (Poinar, 1990) y H. indica aislado de la región subtropical de la La Sierra, Tabasco, México (Cortez-Madrigal et al., 2003). Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. fueron colectados de áreas semidesérticas a una altitud mayor de 2000 m en Zacatecas (Cortez-Madrigal et al., 2003). Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. también fueron aislados de 10.9% de suelos de 64 sitios muestreados de maíz, sorgo y pastos en seis estados Mexicanos (Molina–Ochoa et al., 2003), y en Jalisco, México, un Hete-rorhabditis sp. fue aislado de muestras de suelo (Diaz-Mederos et al., 2002). Ruiz-Vega et al. (2003) colectaron S. feltiae y una especie sin identificar de Heterorhabditis de Oaxaca, Mexico.
Salas et al (2001) reportaron la existencia de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae) en agrosistemas del cañon de Juchipila en el estado de Zacatecas. 18 NEPs del género Steinernema y 12 del género Heterorhabditis, inspección que demuestra la gran distribución y diversidad existente en México. En el año 2002, Díaz reporta la presencia de un aislamiento del género Heterorhabditis asociado a larvas del género Phyllophaga en el estado de Jalisco.
En el 2004, Nguyen et al. (2004) describen la nueva especie Mexicana, Heterorhabditis mexicana Nguyen, Shapiro-Ilan, Stuart,McCoy.
En cuanto a la evaluación del potencial de control biológico se destacan los trabajos realizados
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desarrolladas hasta el momento, se presentan trabajos desarrollados en torno a la caracterización molecular de los aislamientos de NEPs en diferentes regiones de México y es así como Orozco et al (2008) adelantan la caracterización molecular de NEPs mediante la obtención de secuencias de DNAr ITS y LSU para la Identificación de un aislado de NEPs, encontrando que con la región ITS se obtiene un 97% de similaridad con la especie S. carpocapsae y con la región LSU el mayor porcentaje de similaridad es con la especie S. websteri.
En cuanto a la producción in vitro, los investigadores Mexicanos son los que van a la
vanguardia en la evaluación y estandarización de medios para su producción, es así como Vergara et al (2010) presentan los resultados obtenidos del cultivo monoxénico sumergido de l nema todo entomopatógeno, Steinernema carpocapsae CABA01 aislado del estado de Hidalgo, en biorreactor airlift con recirculación interna y utilizando un medio de
cultivo complejo que contiene 10% (volumen/volumen, v/v) aguamiel de agave (Agave spp.), 2% v/v aceite de maíz, 1% (peso/volumen, p/v) yema de huevo deshidratada, 0.5% p/v NaCl y 1% p/v extracto de levadura. Los experimentos comenzaron con aproximadamente 1,000 nematodos en fase infectiva juvenil (IJ) por mililitro (ml) de medio, alcanzando el día 16, 126,882 en fase IJ en fermentación 1, lo cual indica unas condiciones específicas hidrodinámicas y de presencia oxígeno.
Espino et al (2004), evaluaron el uso de lactosuero ácido para la producción en cultivo sumergido de S. feltiae en el estado de Hidalgo, donde se dispone de gran cantidad de este medio,
en laboratorio para diferentes especies-plaga como los trabajos desarrollados por Solano et al 2004, evaluando nueve aislamientos introducidos de NEPs (ocho especies de Steinernema y una de Heterorhabditis) para el control de la mosca del cuerno Haematobia irritans, en condiciones de laboratorio con tres sustratos diferentes, los resultados mostraron que en suelo y estiércol, ocho de los nueve aislamientos causaron mortalidades entre el 22 y 100% sobre las larvas.
Toledo et al (2005) evaluó la susceptibilidad de larvas de Anastrepha obliqua Macquart (Diptera: Tephritidae) a Heterorhabditis bacteriophora (poinar) (rhabditida: heterorhabditidae) en condiciones de laboratorio, los resultados obtenidos permitieron determinar al tercer estadío inicial como más susceptible, pero la infección estuvo muy dependiente del nivel de humedad, a menor humedad menor mortalidad.
Igualmente, evaluaron la patogenicidad de cuatro especies de Steinernema, tres introducidas y la especie S. mexicana y dos especies de Heterorhabditis una introducida y una nativa, sobre larvas de A. ludens. Las especies H. indica, S. mexicana y S. carpocapsae All presentaron los porcentajes de mortalidad entre 75 y 52%.
Aquino et al (2006), evaluaron hongos y nematodos entomopatógenos para el control biológico del picudo negro Scyphophorus interstitialis Gyllenhal importante en el cultivo de agave en el estado de Oaxaca. Los adultos mostraron una mortalidad del 100% con una concentración de S. feltiae y H.bacteriophora de 9000 por ml después de 50 días.
En concordancia con las investigaciones
Durante los años 2007 y 2008 se tomaron muestras en todo el campus de la escuela
agrícola Zamorano en búsqueda de NEPs nativos con
el apoyo financiero de la Cuenta del Milenio,
encontrándose un solo aislamiento del género Heterohabditis spp.
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el cual resultó ser mucho más económico que otros medios evaluados y con una producción de NEPs comparable con los mismos.
En Costa Rica se presenta el ejemplo de la colaboración de investigadores internacionales en el desarrollo de la investigación de NEPs en Latinoamérica. Se estableció un programa de investigación con la asesoría internacional de la Dra. Patricia Stock, realizando un reconocimiento sistemático de NEPs durante los años 2003-2004 (Uribe-Lorio et al. 2005), recuperando dos aislamientos de Steinernema y uno de H. indica de muestras de suelo.
Posteriormente se identificaron dos nuevas especies, S. costarricense y S. putavense mediante morfología y caracterización molecular con la región 28S del ADN ribosomal (Uribe-Lorio et al 2007).
En el año de 2009, Powers et al (2009) realizaron un estudio para determinar la diversidad y estratificación vertical de los nematodos en bosques húmedos tropicales de Costa Rica, dentro del cual aislaron seis especies de NEPs, identificadas tres en el género Steinernema, S. puntauvense, S. feltiae y S. websteri y tres especies de Heterorhabditis, H. indica, H. bacteriophora y una especie sin describir Heterorhabditis sp.
Rodríguez et al (2009), también realizaron reconocimiento de NEPs en diferentes zonas y sistemas agrícolas de Costa Rica y evaluaron la patogenicidad de seis aislamientos obtenidos sobre larvas de Phyllophaga elegans (L2 y L3), pero sólo una causó el 60% de mortalidad sobre larvas L2 de P. elegans, aislamiento que fue identificado solamente a nivel de género, Heterorhabdithis sp. de los aislamientos restantes no se especifica a que género pertenecen.
Ferrer et al (2004), evaluaron las posibilidades del uso de NEPs de los géneros Steinernema y Heterorhabditis para el control de Aeneolamia varia en caña de azúcar con mortalidades de 71,35 y 75,4%, en dosis de 50 a 100 millones de nematodos por hectárea, es importante destacar que no se especifica la especie de los nematodos utilizados.
En Honduras el inicio de los trabajos de
recuperación de NEPs es relativamente reciente, Trejo y Funez (2004) evaluaron NEPs
nativos de los dos géneros Steinernema y Heterorhabditis sobre diferentes especies-plaga en condiciones de laboratorio, Phyllophaga spp, Spodoptera sunia, Manduca sexta, Leptophobia aripa e Hypothenemus hampei con la colaboración de los investigadores de Inglaterra y Colombia para manejo y cría. No obstante no se suministró mayor información de la procedencia de las especies nativas ya que la información no se encuentra publicada en revistas indexadas.
Como un primer intento de reconocimiento de NEPs está documentado igualmente en una página de internet de la organización La cuenta del Milenio, es así como mencionan que durante los años 2007 y 2008 se tomaron muestras en todo el campus de la escuela agrícola Zamorano en búsqueda de NEPs nativos con el apoyo financiero de la Cuenta del Milenio, encontrándose un solo aislamiento del género Heterohabditis spp.
Con el desarrollo del proyecto del establecimiento de un laboratorio de control biológico, se inició el programa de producción masiva de diferentes controladores biológicos como Phytoseiulus persimilis (Acari: Phytoseidae), Orius insidiosus (Hemiptera: Anthocoridae), Eretmocerus eremicus (Hymenoptera: Encirtidae) y el NEPs nativo Heterorhabditis sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae) entre otros, lo cual
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un reconocimiento de NEPs durante tres años en 9 provincias y 20 localidades. El resultado fue el hallazgo de siete aislamientos de NEPs de 251 muestras de suelo y 27 cultivos (Rodríguez et al 2011).
Estudios realizados por Pozo et al. (2003) en la Estación Experimental de la Universidad Central, en cultivos de I. batatas, Oriza sativa L., Musa sp. y Sorghum bicolor (L.) Moench, encontraron solo dos muestras positivas en sorgo, perteneciente al género Heterorhabditis, los cuales fueron denominados como CIAP-DEY-6 y CIAP-DEY-7 e igualmente no se conoce la especie.
Es así que de los aislamientos de NEPs encontrados en Cuba sólo se cuenta con la identificación de dos especies, Steinernema cubana (cubanum) (Mracek, Hernández y Boemare), y H. indica (Poinar, Karunakar y David), cepa P2M, reflejándose una vez más el desconocimiento real de la biodiversidad de este importante grupo de microorganismos a pesar de los esfuerzos por su recuperación (Rodríguez et al 2011).
Actualmente, es un reto para los investigadores Cubanos, teniendo en cuenta la aceptación por parte de los productores, el desarrollo del cultivo líquido (por fermentación) de NEPs aprovechando la capacidad instalada y experiencia acumulada en la producción de otros entomopatógenos (Rodríguez et al 2011).
En Colombia, se han realizado reconocimiento sistemáticos de NEPs, actualmente se cuenta con cinco, de los cuales tres de ellos se encuentran bien documentados y publicados en revistas nacionales e internacionales indexadas. Los cuales se realizaron asociados a tres especies de insectos-plaga en diferentes cultivos: Cyrtomenus bergi Froeschner en
constituye un proyecto que pretende contribuir al mejoramiento de la calidad de vida de los agricultores de Honduras (cuenta del milenio-Honduras).
Cuba es uno de los países que mayor trayectoria tiene tanto en producción masiva in vivo como en aplicaciones para el control de especies-plaga. Los NEPs representan eficientes agentes de control biológico de una amplia gama de insectos y su uso está extendido, por su producción y uso, a zonas agrícolas en todo el territorio nacional. Se destaca el hecho de que instituciones cubanas han abordado investigaciones básicas y aplicadas en todas las fases para el desarrollo de un producto a base de NEPs el cual es producido en forma artesanal en los Centro de Reproducción de Entomófagos y Entomopatógenos (CREE) del país, aplicándose en más de 50 municipios. Una de las especies-plaga que se controla efectivamente con las aplicaciones de NEPs es Plutella xylostella en cultivos de Brassica oleracea (Rodriguez et al 2006).
Rodríguez et al (2006), menciona que el conocimiento de la biodiversidad de estos microorganismos en Cuba se inició desde el hallazgo de Montes en el año 1978, de la especie Neoplectana sp. identificada así por Plumas & Hernández sobre larvas del picudo verde azul de los cítricos Pachnaeus litus Germar en la Habana, la cual posteriormente fue identificada como H. heliothidis (Khan, Brook y Hirschmann) por Artega y Mrácek y finalmente identificada como H. indica Poinar, Karunakar y David. Posteriormente, Chang (1988) hace mención de la presencia de nematodos del género Heterorhabditis en larvas de Cylas formicarius Fab. en Ipomoea batatas Lam. en la Habana, pero no se especifica la especie.
En 1994, investigadores del CENSA realizaron
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yuca y cebolla (CIAT) (Caicedo & Bellotti 1996) , Hypothenemus hampei en café (López 2001; López 2007) y Tecia solanivora en papa (Univ. Nacional de Colombia Bogotá) (Saenz 1999).
En 2007, López-Núñez y colaboradores, realizaron un reconocimiento en la región cen-tral Andina de Colombia, de las cuales el 92% correspondieron a Steinernema y sólo 7,2% a Heterorhabditis. La caracterización morfológica y molecular permitió establecer que de los cinco aislamientos de Steinernema spp., uno correspondía a la especie S. websteri y cuatro especies aún permanecen sin describir. Posteriormente en el 2008, se reporta la primer nueva especie para Colombia S. colombiense (López et al 2008). Los Heterorhabditis fueron identificados como dos especies sin describir de Heterorhabditis spp. Estos resultados aunque muy limitados a una sola región geográfica sugiere que la biodiversidad de NEPs en Colombia es bastante amplia como en los demás países Latinoamericanos.
A partir del año 2009, se realizó una búsqueda de NEPs asociados a cultivos de chontaduro, Bactris gasipaes en tres veredas del municipio de Buenaventura-Valle del Cauca, los cual permitió la recuperación tanto de cuatro aislamientos de Steinernematidos (Olaya 2008). En el año 2010, se inició la búsqueda de NEPs asociados a guaduales, Guadua angustifolia en el Valle del Cauca y el Quindío, del cual se aisló tres Steinernematidos y un Heterorhabditido, los cuales se encuentran en proceso de caracterización morfológica y molecular. Además, se han evaluado en el manejo de larvas del picudo de los cítricos, Compsus sp.
López (2005) menciona las diferentes investigaciones
realizadas en Colombia como potencial biológico de NEPs, las cuales son las que mayor desarrollo y continuidad presentan en el manejo integrado de la broca del café, las cuales incluyen: búsqueda y selección de aislamientos nativos patogénicos a broca, estudio del comportamiento y estrategias de búsqueda de hospedante realizado por Molina y López durante los años de 2002 y 2003, ciclo de vida de nematodos nativos, evaluación de sistemas de aplicación por Lara y López en el año de 2005 y evaluaciones bajo condiciones de invernadero y de campo en pequeña escala por Giraldo en el 2003 y Lara y colaboradores en 2004. Molina y Lopez (2003) evaluaron el efecto de tween y glicerina en
el aumento de la capacidad de S. feltiae y H. bacteriophora para el control de la broca del café, Hypot-henemus hampei. De igual forma Saenz (1999) y Saenz y Luque (2000a y 2000b) y Saenz (2003) han desarrollado diferentes estudios básicos y aplicados para evaluar el potencial de los aislamientos nativos para el control
de diversas especias-plaga de importancia agrícola en el país.
En Brasil, el primer muestreo sistemático documentado, lo realizó Fowler durante el año de 1987, lo cual permitió la recuperación de 18 aislamientos of S. carpocapsae y 13 aislamientos de Heterorhabditis (Fowler, 1988). Steinernema feltiae también fue recuperada de insectos muertos por NEPs del estado de São Paulo (Fowler y García, 1988).
Posteriormente, Dolinski et al (2008) muestrearon el bosque lluvioso de Monte Negro Rondonia en Brasil, recupendo 19 aislamientos, los
En Brasil, el primer muestreo sistemático documentado, lo realizó Fowler durante el año de 1987, lo cual permitió la
recuperación de 18 aislamientos of S. carpocapsae y 13
aislamientos de Heterorhabditis (Fowler, 1988).
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H. bacteriophora y H. argentinensis Stock (Stock, 1992, 1993, 1995).
En Perú, una especie de Heterorhabditids adaptada al frio se aisló del picudo de la papa en los andes y mostró un potencial para el control de este insecto (Parsa 2009,). Otro nematodo del género Heterorhabditis se aisló de la región costera. Evidencias moleculares sugieren que ambos Heterorhabditis parecen ser nuevas especies (Kaya et al 2006).
En Ecuador, Hernández et al (2008) realizaron un trabajo de prospección de NEPs en tres provincias productoras de papa y evaluaron la patogenici-dad de los aislamientos, como una alternativa de control biológico de la plaga. De un total de 357 muestras de suelo se encontraron 28 aislamientos de NEPs. de los cuales se evaluaron 11 aislamientos, cuatro aislamientos del género Heterorhabditis y siete
cuales todos resultaron del género Heterorhabditis. Cuatro cepas fueron estudiadas morfológica y molecularmente, las cuales se identificaron como Heterorhabditis indica y Heterorhabditis baujardi.
Recientemente, Barbosa-Negrisoli et al (2010), realizaron un reconocimiento de NEPs en el estado Rio Grande del Sur, quienes procesaron 121 muestras de suelo, de las cuales el 10% resultaron positivas para Steinernematidos y el 6% a Heterorhabditidos. Las especies Steinernema feltiae, S. rarum y S. riobrave fueron aislados por primera vez en Brasil, lo cual muestra la amplia diversidad de NEPs localmente. Steinernema rarum y Heterorhabditis bacteriophora fueron las especies más comúnmente aisladas.
En Argentina, un reconocimiento exhaustivo fue realizado en la región de la Pampa liderando el aislamiento de S. feltiae, S. carpocapsae, S. scapterisci,
Importancia de la caracterización morfológica y molecular de especies de NEPs
Adams et al (2006) resumen la secuencia de la evolución de la taxonomía mediante caracteres morfológicos y moleculares de NEPs a partir de procesos de concertación y estandarización de métodos y técnicas para su desarrollo. A pesar que más de la mitad de las especies actualmente identificadas se describieron desde el año de 1995, fue en la primera conferencia Internacional de EPN en Asilomar, California en 1990, que consideraron que por la confusión y frustración con los cambios en la nomenclatura y la variabilidad se considera la taxonomía de nematodos entomopatógenos como en estado de flujo.
Cinco años después, en la segunda conferencia
internacional en Honolulu, Hawái, con el adveni-miento de las técnicas moleculares y la fertilización cruzada se empezó a incorporar en la descripción de especies, y en ese momento la taxonomía se consideró en un estado de transición. Posteriormente, casi una década después, numerosos eventos lideraron el mejoramiento taxonómico, como la estandarización de criterios para la identificación (Adams y Nguyen, 2002;) y la interpretación de las relaciones filogenéticas en el phylum Nematoda basado en la evidencia molecular (Blaxter et al., 1998); la generación de conceptos teóricos y aplicados de especies (Adams, 2006); y la actualización de la clasificación del phylum Nematoda (De Ley and
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Blaxter, 2002). Lo cual conllevó a la sistemática de los EPNs en una fase de estabilidad y crecimiento.
Quizás la contribución más grande a la estabilidad sistemática surgió de la inclusión de las hipótesis en la consideraciones taxonómicas como la de Blaxter et al. (1998) citado por Adams (2006), en el marco de la filogenética molecular para Nematoda quienes consideraron que la familia Heterorhabditidae estaba más relacionada con los Strongylida, un grupo de parásitos vertebrados que comparten el ancestro mas reciente con Pellioditis, un bacterívoro de vida libre. Asímismo, la hipótesis para la familia Steinernematidae como más relacionada con Panagrolaimoidea (nematodos de vida libre y asociados a insectos) y Strongyloididae (parásitos de vertebrados), y como miembro de un grupo grande que incluye de vida libre, fungívoros y parásitos de plantas. Este estudio filogenético soporta la tesis de Poinar (1993) la cual establecía que los heterorhabditidos probablemente provenían de un ancestro de vida libre bacterívoro, mientras que los steinernematidos, de una reconstrucción del hábitat trófico de los ancestros (Blaxter et al., 1998).
Con el incremento del número de especies descritas, las metodologías tradicionales como la morfología comparativa se volvió una herramienta limitada para la identificación o diagnóstico de NEPs. Entre las limitaciones morfológicas se tiene la poca variabilidad morfológica y en especial para grupos que presenten una divergencia reciente o estén muy relacionados como las especies de Heterorhabditis y la mayoría de caracteres utilizados para la identificación de especies son sólo útiles para diagnóstico pero no para análisis filogenéticos, ya que presentan estados plesiomórficos o altamente homoplásicos (Stock, 2002; Stock and Reid, 2003).
La aplicación del concepto biológico de
especies mediante el método de reproducción cruzada con las especies del género Steinernema, el cual está muy cuestionado por lo dispendioso y porque los resultados pueden tener poco significado evolutivo (Adams, 1998). Adicionalmente, el descubrimiento de especies de steinernematidos hermafroditas por Griffin et al. (2001) por lo que se debe tener precaución en considerar la hibridación como un ensayo válido para especies en este grupo.
Por lo tanto, una serie de métodos moleculares se han investigado como potenciales sustitutos o complementos a los métodos tradicionales morfológicos. Técnicas como electroforesis de proteínas son consideradas adecuadas especialmente en la identificación de especies hermanas, pero con poco uso a nivel de género o la separación de organismos a nivel de subespecie (Akhurst, 1987).
El método de polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs) son considerados como una herramienta diagnóstica para la discriminación de especies de Steinernema desde comienzos de la década del 90 y desde entonces han sido utilizados ampliamente para complementar descripciones morfológicas de especies sin caracterizar de Steinernema spp. y también estimar relaciones filogenéticas entre especies de este género como lo documentan diferentes autores (Hominick et al., 1996; Stock et al.,1998).
Amplificaciones polimórficas al azar de ADN (RAPD) también se han utilizado en el diagnóstico y evaluación de relaciones filogenéticas de NEPs. Además, se han utilizado para medir la viariabilidad genética entre aislamientos y especies de Heterorhabditis and Steinernema. Sin embargo su uso no es muy amplio por la baja reproducibilidad del método, el cual se puede afectar por diversos
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información sobre la sistemática de los NEPs, también es posible generar una cantidad de datos sin ningún valor si no son obtenidos y analizados apropiadamente.
Según Stock y Reid, (2002), es un error pensar en reemplazar la morfología tradicional solo por los métodos moleculares. Programas de investigación han mostrado convincentemente la consideración que las dos herramientas, morfológica y molecular poseen grandes ventajas para el diagnóstico, las cuales continuarán ofreciendo una mejor comprensión de la evolución de los NEPs y un mejor soporte de las descripciones taxonómicas.
factores como la calidad y concentración de ADN y las condiciones de la PCR (Gardner et al., 1994; Liu and Berry, 1996).
Actualmente, el análisis de secuencias es el que ha mostrado ser una herramienta adecuada no solo para el diagnóstico a diferentes niveles taxonómicos sino también para los estudios filogenéticos (Nguyen et al., 2004; Stock et al., 2001). Grenier et al., (1997) mencionan que las secuencias de microsatelites de ADN, también han sido propuestas como herramienta para la identificación de especies de Heterorhabditis y Steinernema a nivel de poblaciones, pero no se han empleado exitosamente.
Es importante anotar que aunque las técni-cas moleculares han generado una cantidad de
Importancia del establecimiento de una red latinoamericana de NEPs De acuerdo al panorama actual de la investigación
y desarrollo de los NEPs en Latinoamérica y con todo el potencial de biodiversidad y uso que se refleja en los trabajos de investigación desarrollados hasta el momento por los diferentes grupos de investigación, se considera necesario establecer una red de investigadores Latinoamericanos especialistas en NEPs para aunar esfuerzos que contribuyan en la superación de las diferentes barreras de conocimiento que se presentan en la temática, especialmente lo que concierne a la identificación morfológica y molecular de especies donde se observa la mayor falencia para conocer el mapa real de biodiversidad de la región y la producción masiva en medio líquido, lo cual contribuirá a la aplicación en campo de una forma sistemática para el manejo de las diferentes especies-plaga evaluadas en laboratorio e invernadero.
La conformación de una red permitirá
obtener beneficios a la región, promoviendo el conocimiento de la biodiversidad y el uso de NEPs en sistemas agrícolas sostenibles y ambientalmente más saludables. La promoción mediante talleres, congresos, entrenamiento tanto de los científicos como de los estudiantes en centros de investigación y universidades permitirá reducir la brecha que nos separa de los países desarrollados.
Además, es importante iniciar un trabajo de promo-ción del estudio de los nematodos entomopatógenos en las universidades a nivel nacional, promover los proyectos colaborativos internacionales en los cuales siempre se involucre el personal científico nacional y se establezcan acuerdos que contribu-yan al intercambio de información, experiencias y material biológico para uso exclusivo en investigación y que se respeten las leyes de la conservación de la biodiversidad tanto a nivel nacional como internacional. De igual manera con
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esta red se puede iniciar un proceso de visibilización de la información de los países Latinoamericanos como un bloque y no individualmente.
De igual manera, es importante establecer el compromiso de publicar toda la investigación en
revistas indexadas que permitan un mayor impacto del desarrollo en el tema a nivel mundial, puesto que es una de las grandes falencias que se tiene, la información no está disponible en revistas de fácil acceso al público.
Conclusiones El mapa de la biodiversidad de NEPs en
Latinoamérica aún se encuentra en sus fases iniciales, a pesar del incremento de la investigación durante los últimos 15 años, el desconocimiento del tema es considerable.
La falta de políticas que incentiven el desarrollo del tema y el déficit de investigadores y es-pecialistas en el área, como por ejemplo: taxónomos, ha conllevado que la mayor parte de los aislamientos
recuperados se encuentren actualmente identificados sólo a nivel de género.
La escasa colaboración a nivel nacional e internacional y transferencia de tecnología no ha permitido el desarrollo y divulgación de los avances en obtenidos de una forma generalizada, de igual forma la falta de divulgación en revistas nacionales e internacionales de fácil acceso.
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Profesor Asistente. M.Sc. Unidad de
Ecología y Sistemática UNESIS.
Departamento de Biología. Pontificia
Universidad Javeriana. Cra 7a No 43-82
Ed 54 (Jesús Emilio Ramirez), Of. 200.
Heterorhabditis sp. SL0708 como una alternativa para el control de plagas
Introducción
Adriana Saenz Aponte
La incorporación de agentes biológicos para la regulación de insectos
y otros organismos plaga, se hace cada día más urgente como una
respuesta a las restricciones cada vez más estrictas para el uso de
agroquímicos y a las exigencias de calidad en los productos de origen
agrícola, para mercados internacionales y aún para los nacionales. No
menos importantes son las exigencias en lo que tiene que ver con la
protección del medio ambiente y la biodiversidad dentro de la moderna
concepción del desarrollo sostenible.
El uso de hongos, bacterias y virus entomopatógenos ha cobrado
especial vigencia durante las dos últimas décadas y el estudio de los
nematodos entomopatógenos, aunque no alcanza aún igual nivel de uso,
algunos autores como Kaya y Gaugler (1993); Kaya y Stock (1997);
Blaxter et.al (1998); Burnell y Stock (2000); Boemare (2002), lo consideran
prioritario por ser una de las alternativas promisorias de los próximos
años en el control de plagas agrícolas, pecuarias y aún aquellas que afectan
instalaciones industriales.
Los nematodos entomopatógenos que han mostrado más importantes
en el control biológico de plagas corresponden a las familias Steinernematidae y
Heterorhabditidae, cuyos miembros están mutualísticamente asociados
Contenido del Capítulo
Introducción Heterorhabditis sp. SL0708.
Biologia del complejo nematodo/bacteria
Rango de hospederos Interaccion Heterorhabditis sp. sl07087-Photorhabdus sp-hospedero
Comportamiento de heterorhabditis sp sl0708
Aplicación de Heterorhabditis sp SL0708
Consideraciones Finales Referencias Bibliográficas
con bacterias de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus que ocasionan septicemia y otros tipos de afecciones letales en sus
hospederos. Entre las características que hacen de éste un grupo promisorio de controladores biológicos
pueden destacarse las siguientes: Alta virulencia y rápida acción al matar al hospedero, el tercer estado o
juvenil infectivo no se alimenta, está morfológica y fisiológicamente adaptado para sobrevivir por largos
períodos en el suelo en ausencia de su hospedero, tienen un alto potencial reproductivo y muestran
respuesta numérica con respecto al hospedero, pueden criarse masivamente en laboratorio, tienen un
amplio rango de acción, aunque algunos son muy poco específicos, alta resistencia a productos químicos y
a condiciones ambientales adversas, tanto los nematodos entomopatógenos como sus bacterias, son
inocuos para humanos y animales domésticos, no causan ningún daño a las plantas por ser específicos para
á
Heterorhabditis sp. SL0708.
observados, este rango amplio de hospederos puede
incluir algunos insectos benéficos); limitada
tolerancia a condiciones ambientales (por ejemplo,
requerimientos de humedad); tiempo corto de
almacenamiento; pobre persistencia en campo y
altos costos en comparación a los pesticidas químicos
(Kaya. 1993).
insectos, algunas especies se pueden reproducir
sin la presencia del macho, están exentos de
registro para su comercialización en Europa y
Estados Unidos (Klein. 1990; Kaya. 1993; Kaya y
Gaugler. 1993; Georgia y Manweiler. 1994).
Dentro de los atributos negativos está incluido
su amplio rango de hospederos (aunque efectos
negativos en hospederos no blanco no han sido
Heterorhabditis sp. SL0708, es un nematodo
aislado con la técnica de insecto trampa de suelo
de guadua de Alcalá, Valle del Cauca. Heterorhabditis
sp. SL0708 pertenece a la familia Heterorhabditidae,
es un agente importante para el control biológico
de plagas. Vive en el suelo y es capaz de infectar
insectos de los órdenes Díptera, Lepidóptera,
Hemíptera y Coleóptera (Sáenz y López 2011).
Heterorhabditis sp. SL0708 tiene un complejo ciclo
de vida que incluye generaciones hermafroditas y
amfimícticas que ocurren dentro del hospedero
parasitado muchas veces y superponiéndose. Una
característica particular es que guarda una relación
mutualista con un simbionte bacteriano del género
Photorhabdus (Enterobacteriaceae) que alojan en su
intestino. Esta relación le da una ventaja competitiva
al parásito pues mata a su hospedero durante las
primeras 24 a 48 horas después de infección
(Sáenz y López 2011).
El estado infectivo de Heterorhabditis sp.
SL0708 no se alimenta, está morfológica y
fisiológicamente adaptado para la dispersión,
sobrevivir largos periodos en el suelo, buscar e
infectar su hospedero. Este estado es conocido
como juvenil infectivo (JI). Los JI responden al
insecto hospedero en el suelo por quimiotaxis. Los
JI ingresan al insecto a través de aberturas naturales
(boca, ano, espiráculos) o penetran las membranas
intersegmentales del hospedero mediante un diente
en la parte anterior. Una vez en el hemocele del
insecto, los JI liberan sus bacterias simbiontes, las
cuales se multiplican rápidamente secretando toxinas
y enzimas líticas. Estas secreciones son letales para
los insectos que mueren dentro de las 48 horas
(Forst et al. 1997). Las células bacterianas y tejidos
del hospedero proporcionan un medio rico para el
crecimiento y reproducción de Heterorhabditis sp.
SL0708. Los nematodos pueden desarrollar una
generación en Collaria scenica Stal (Hemíptera: Miridae),
Delia platura (Meigen) (Diptera: Anthomyiidae) o
dos generaciones en Galleria mellonella L
(Lepidoptera: Piralydae) y emerger al suelo en dos
semanas.
Biologia del complejo nematodo/bacteria Heterorhabditis sp. SL0708, es un patógeno
obligado en la naturaleza; tiene un estado de vida
libre que no se alimenta, conocido como juvenil
infectivo, juvenil dauer o JI, que infecta los
á
insectos hospederos en el suelo. El
juvenil infectivo es el único estado que se
encuentra fuera del insecto hospedero y
conserva la cutícula del segundo estado
para protección en el ambiente y la
pierden justo antes o después de la
infección del hospedero. Además, la
asociación nematodo-bacteria es
específica. En los juveniles infectivos,
las células bacterianas son llevadas en
el tracto intestinal.
El ciclo de vida de Heterorhabditis sp.
SL0708 dura 19 días a 20oC o 15 días a
25oC. Está compuesto de un ciclo largo
con dos generaciones y ciclo corto con
una generación pero esto depende del
número de JI que inicialmente invade el
hospedero y la disponibilidad de nutrientes
para los estados de desarrollo. Este
nematodo nativo presenta ocho estados
de desarrollo: huevo, cuatro estados
juveniles (J1, J2, J3-JI, J4), separados por
mudas y adultos hermafroditas, machos y
hembras. Todos los estados son
morfológicamente distintos. (Figura 1 y
2).
La sintomatología exhibida por los hospederos
de Heterorhabditis sp. SL0708 es cuerpo flácido y no
putrefacto, coloración roja o vinotinto, característica
presente en infecciones por especies de la familia
Heterorhabditidae (Figura 3). La coloración del
hospedero con Heterorhabditis sp. SL0708 cambia a
medida que pasa el tiempo en aproximadamente 24
horas, algunos pueden permanecer por cuatro a
cinco días con coloraciones anaranjadas y terminar
con coloraciones vinotinto como se observa en la
Figura 1. Estados de desarrollo de la primera generación de
Heterorhabditis sp.SL0708. A. Adulto hermafrodita. B. Desprendimiento
anterior en el proceso de muda de un J4. C. Hermafrodita juvenil
sin desarrollo de la vulva. D. Hermafrodita madura con vulva
desarrollada. (Barras de escala A, C, D=100µm; B=40µm).
El juvenil infectivo ingresa al hospedero a
través de aberturas naturales (boca, espiráculos,
ano) o áreas delgadas de la cutícula del hospedero y
penetra dentro del hemocele del hospedero. Los
juveniles infectivos liberan la bacteria por la boca.
La bacteria mutualista se propaga y produce
sustancias que rápidamente matan el hospedero y
protegen el cadáver de la colonización de otros
microorganismos. Los nematodos inician su
desarrollo, se alimentan de las células bacterianas y
los tejidos del hospedero son metabolizados por la
bacteria. Como los recursos
de alimento en el cadáver del
hospedero son agotados, una
nueva generación de juveniles
infectivos es producida y
emerge desde el cadáver del
hospedero en el suelo para
buscar un nuevo hospedero.
En cuanto a la producción
acumulada de JI, se inicia
después de los 15 días de
infección, recuperando en
promedio 10.414 JI (10.414-
17.784) y con producción
total de 150.000 a 280.000 JI/
larva de G. mellonella hasta el
agotamiento del hospedero,
siendo el quinto y sexto día,
los de mayor recuperación de
á
Figura 2. Estados de desarrollo
de Heterorhabditis sp. SL0708.
A. Desplazamiento del huevo
dentro del útero de hembra no
grávida. B. Huevos maduros
cerca a la abertura de la vulva.
C. Huevos con desarrollo del
J1. D. J1. E. J2. F. J3. G.
Juvenil infectivo conservando
la cutícula del J2. H. Hembra.
I. Macho con bursa expuesta.
(Barras de escala en A=100
µm (figura izquierda), 25µm
(f igura derecha); B-C-
D=40µm; E=10µ; F-G-
H=33µm; I-J=100µm).
á
Las especies de nematodos están asociadas
con una especie específica de bacteria simbiótica, pe-
ro las especies bacterianas pueden estar asociadas
con más de una especie de nematodo. Akhurst y
Boemare (1990) establecen que la mejor reproducción
de nematodos se presenta con su simbionte
natural, pero en algunos casos, los nematodos
pueden desarrollarse con otras especies bacteriales.
La relación entre los nematodos y la bacteria es
mutualista, porque los nematodos son dependientes
de la bacteria, dado que matan rápidamente su
insecto hospedero; crean un ambiente favorable
para su desarrollo por producir antibióticos que
suprimen la competencia de otros microorganismos;
transforman los tejidos del hospedero en una fuente
de alimento y sirve como recurso alimenticio. La
bacteria necesita del nematodo para protegerse del
ambiente externo; penetrar el hemocele del hospedero
e inhibir las proteínas antibacteriales del hospedero.
Photorhabdus sp es una bacteria perteneciente
a la familia Enterobacteriaceae, gran negativa,
facultativa, no forma esporas y son anaeróbicas
(Fischer et al 1999; Burnell y Stock. 2000; Boemare.
2002;; Hazir et. al 2005). Se caracteriza por la
luminiscencia, produce células diferentes conocidas
como forma primaria (fase I) y forma secundaria
(fase II) (Forst y Clarke. 2002). La forma primaria
está asociada naturalmente con los juveniles
infectivos, mientras la forma secundaria surge
espontáneamente cuando los cultivos bacteriales
están en estado estacionario de no crecimiento en
cultivos in vitro. No se ha establecido para Photorhabdus
sp, cambiar de la forma secundaria a primaria.
Las dos formas bacteriales presentan diferencias,
por ejemplo, la forma primaria produce antibióticos,
absorbe ciertos colorantes y desarrolla grandes
inclusiones intracelulares compuestas de cristales
de proteínas; mientras la forma secundaria produce
semanalmente antibióticos o no produce, no
absorbe colorantes y produce ineficientemente
inclusiones intracelulares. La forma primaria es la
que tiene la capacidad de soportar la propagación
de nematodos in vitro (Lysenko y Weiser 1974;
Ehlers et. al. 1990; Aguillera et. al. 1993; Aguillera y
Smart. 1993; Jackson et. al. 1995; Babic et.al. 2000;
Vivas y Goodrich-Blair. 2001; Boemare. 2002;
Martens et. al. 2003).
Figura 3. Cambios de coloración en Galleria mellonella afectadas por Heterorhabditis sp. SL0708.
á
Rango de Hospederos En el laboratorio, la mayoría de las
especies de nematodos entomopatógenos
infectan una variedad de insectos cuando
existe un contacto seguro, las condiciones
ambientales son óptimas y no hay barreras
ecológicas o comportamentales para la
presencia de la infección (Hominick.
2002; Hazir et. al. 2003a, b). En el campo,
los nematodos entomopatógenos atacan
un limitado rango de hospederos más que
en laboratorio. No obstante, son seguros
como agentes de control biológico.
Además, están adaptados al ambiente suelo,
dado que los principales hospederos son
insectos del suelo.
En estudios desarrollados en el
laboratorio de control biológico de la
Pontificia Universidad Javeriana, se ha
podido comprobar alta virulencia de
Heterorhabditis sp. SL0708 en la chinche
de los pastos (Collaria scenica (Naranjo et
al. 2010, Díaz 2011, Fig. 4, 5), la mosca
de la semilla (Delia platura (Celeita y
Sáenz 2011), el picudo de la guayaba
(Conotrachelus psidii Fig. 6), polilla dorso
de diamante (Plutella xylostella, Fig. 7) y
la polilla mayor de las colmenas (Galleria
mellonella), (Sáenz y López 2011).
Interaccion Heterorhabditis sp. sl07087-Photorhabdus sp-hospedero.
Figura 4. Collaria scenica afectada por nematodos entomopatógenos.
Figura 5. Juveniles infectivos de Heterorhabditis sp. SL07087
migrando de cadáveres de Collaraia scenica.
especies de insectos y su estado de desarrollo (Eidt
y Thurston. 1995; Simoes y Rosa. 1996). Uno de
los factores que afecta la eficacia de los juveniles
infectivos, es que la mayoría de los insectos habitantes
Así como la mayoría de especies de nematodos
entomopatógenos tienen un amplio rango de
hospederos, su eficacia varía con muchos factores
biológicos, incluyendo especies y cepas de nematodos,
á
la de Dípteros).
Los juveniles infectivos de Heterorhabditis sp
SL0708 pueden penetrar el insecto usando varias
rutas, dependiendo de cuál es más accesible (Sáenz
y López 2011). En algunos insectos, la ruta usual
de entrada puede ser inaccesible, como la boca, al
estar obstruida por filtros orales y/o, ser angosta
(insectos con partes bucales chupadoras como el
caso de la chinche de los pastos o insectos pequeños
con partes bucales masticadoras como el picudo de
la guyaba). El ano, por ser estrecho por la presencia
de fibras musculares u otras estructuras y los
espiráculos cubiertos con setas (larvas de lepidópteros)
o platos filtradores (larvas de escarabajos) o
simplemente ser angostos para la entrada de los
nematodos (algunos dípteros y lepidópteros).
También pueden penetrar a través de la cutícula
(incluyendo las tráqueas) o el intestino para entrar
al hemocele. Para ingresar a través de la cutícula,
del suelo han desarrollado
comportamientos para reducir su
descubrimiento, fijación o penetración
de los juveniles infectivos. Algunos
de los comportamientos incluyen
una alta tasa de defecación que
reduce la infección por el ano
(larvas de escarabajos) (De Bach.
1964); bajo rendimiento de liberación
de CO2 que minimiza la señal
química (pupas de lepidópteros y
larvas de escarabajos) (Tanada y
Kaya. 1993); formación de cocones
impenetrables o celdas de suelo
antes de la pupación que sirven
como barreras físicas (muchos
lepidópteros y escarabajos); comportamiento
evasor que reduce el contacto con los juveniles
(larvas de escarabajos, larvas que se cuelgan como
Figura 6. Conotrachelus psidii afectada por Heteror-
habditis sp. SL07087
Figura 7. Larva y pupa de Plutella xylostella afectada por Heterorhabdi-
tis sp. SL07087.
á
defensas del insecto, tal es el caso de la especie S.
glaseri, la cual inicialmente es encapsulada por lar-
vas del escarabajo japonés Popillia japonica, pero
ésta escapa de la cápsula e infecta con éxito al
hospedero, ya que la superficie de los nematodos
tiene proteínas que suprimen la respuesta inmune
de su hospedero y destruye las células antibacteriales
del insecto (Wang et. al. 1995; Wang y Gaugler.
1998). Sin embargo, la invasión de los nematodos
puede producir factores inmuno-inhibitorios que
destruyen los factores antibacteriales producidos
por el insecto y permite que la bacteria mutualista
produzca toxinas insecticidas que rápidamente
matan al hospedero (Bowen et. al. 1998). Los
nematodos pueden también producir exotoxinas
paralizantes y enzimas extracelulares proteolíticas y
citotóxicas. Las reacciones anter iores son
dependientes en el insecto hospedero, en el
complejo nematodo-bacteria y contribuyen a la
variabilidad en la eficacia de los nematodos
los nematodos emplean la fuerza física, clavando
su cuerpo para romper y atravesar las delgadas
tráqueas, como Heterorhabditis sp SL0708 que usa
su diente anterior para penetrar directamente el
hemocele. Para entrar a través del intestino, usan
fuerzas físicas y/o secreciones proteolíticas, para
digerir tejidos del intestino medio y acceder al
hemocele (Peters y Ehlers. 1994). Además dentro
del hemocele, la bacteria y los juveniles infectivos
resisten la respuesta inmune del hospedero, que
involucra la interacción de factores humorales y
celulares.
Para contrarrestar las células bacteriales, los
insectos pueden usar proteínas antibacteriales,
seguido de la formación de nódulos e inactivar los
nematodos, para el caso de Heterorhabditis sp
SL0708, no se ha observado con los hospederos
expuestos a este nematodo. Los insectos pueden
encapsular el juvenil infectivo. En algunos casos, el
tercer estado del nematodo puede superar las
Comportamiento de Heterorhabditis sp sl0708 bajo la superficie del suelo, tales como las prepupas
de lepidópteros, hormigas o larvas de escarabajos.
Los juveniles infectivos emboscadores (S. carpocap-
sae y S. scapterisci) se caracterizan por la baja movilidad y
una tendencia a permanecer cerca de la superficie
del suelo. Además, no responden a las señales de
contacto del hospedero al menos que presente una
apropiada secuencia y eficiente movilidad de las
especies hospederas t a l e s como mar iposas ,
saltamontes o gusanos cortadores cerca de la
superficie del suelo. Los juveniles infectivos cruceros
se caracterizan por la alta movilidad y están
distribuidos a través del perfil del suelo; los juveniles
se orientan por sustancias volátiles del hospedero y
lo localizan; infectan hospederos sedentarios como
Uno de los factores limitantes del rango de
hospederos de los nematodos entomopatógenos es
el comportamiento de forrajeo de los juveniles
infectivos. Estos nematodos emplean estrategias
para localizar e infectar al hospedero, dentro de
éstos están los emboscadores (esperan a su hospedero)
o cruceros como Heterorhabditis sp SL0708, H.
bacteriophora (buscan activamente a su hospedero).
La mayoría de las especies de nematodos están
situadas dentro de estos dos comportamientos; sin
embargo, algunas tienen comportamientos
intermedios dentro de estas dos, como S. riobrave o
S. feltiae (Campbell y Gaugler. 1997; Campbell y
kaya. 1999a, b). Estas estrategias intermedias están
adaptadas para infectar insectos que permanecen
á
Aplicación de Heterorhabditis sp
parándose en su cola y tomando una postura recta
o alternando períodos sin movimiento y activo
ondeamiento (Campbell y Kaya. 1999a, b). Los
juveniles cruceros de Heterorhabditis sp SL0708
pueden ondear su cuerpo, pero no pueden pararse
en su cola. Los juveniles que pueden pararse en su
cola y ondear su cuerpo, pueden saltar también.
Este comportamiento de salto puede ser utilizado
para atacar al hospedero o como mecanismo de
dispersión.
prepupas y pupas de coleópteros, d ipteros y
lepidópteros.
Otro comportamiento de los juveniles infectivos
es su típico ondeamiento corporal o nictación,
donde del 30 al 95% de su cuerpo es levantado del
sustrato por unos pocos segundos. La mayoría de
especies de nematodos que tienen una estrategia de
forrajeo emboscador o intermedio pueden ondear
su cuerpo y levantarlo en un 95% del sustrato,
Heterorhabditis sp SL0708 se está aplicando
mediante cadáveres de insectos infectados que se
depositan cerca de focos del picudo de la guayaba y
mediante suspensiones acuosas que son aplicadas con
jeringas dosificadoras y sistemas de aspersión para el
control de Delia platura. Dentro de estos sistemas, la
aspersión representa ventajas comparativas frente a
los demás, debido a que es más económico en grandes
extensiones, demanda menor uso de mano de obra y
ofrece una mejor distribución en el campo y mayor
humedad a los juveniles infectivos.
El método de aplicación al suelo es el más
común para la aplicación de nematodos, la principal
condición que se debe tener con este método es la
humedad del suelo, debido a que esta no puede ser
deficiente ya que los juveniles infectivos son muy
susceptibles a la deshidratación, ni excesiva porque
limita su movimiento. Además, los sistemas de aplicación
deben distribuir homogéneamente los juveniles
infectivos dentro de un cultivo, debido a que esto
influye en su capacidad para controlar las plagas.
En general para elegir un equipo de aspersión
para aplicar Heterorhabditis sp SL0708 debe tenerse en
cuenta las características del área y cultivo en el cual
se va a implementar, como la pendiente, la extensión,
la distancia de siembra y la biología de la plaga,
adicionalmente debe considerarse el costo del equipo,
la frecuencia de aplicación y la velocidad requerida
para tratar el área.
Al seleccionar los equipos de aspersión para la
aplicación de Heterorhabditis sp SL0708 deben
preferirse los equipos más usados en la zona de
interés, de esta manera se evitarán costos adicionales
por la compra de equipos al agricultor y no se
presentará la necesidad de capacitar a los operarios,
pues ya están familiarizados con su manejo.
Adicionalmente, se debe tener en cuenta que los equipos
pueden someterlos a condiciones adversas como:
altas presiones, altas temperaturas, déficit de oxígeno
en tanques y mangueras, lo cual puede causarles
daños físicos, mortalidad, inactividad, susceptibilidad
a los rayos UV y a la desecación, reduciendo su
viabilidad y parasitismo. En este sentido para la
aplicación de Heterorhabditis sp SL0708 en Colombia
deben evaluarse los equipos más comunes y de mayor
uso en los cultivos, dentro de los que se encuentran
equipos de palanca, presión previa retenida,
motorizados de espalda y semiestacionarios.
á
Consideraciones Finales físicos y biológicos los cuales se reflejan en pérdidas
de energía, reducciones de virulencia, viabilidad y
persistencia, entre estos factores los principales
son: la temperatura, la humedad, la aireación, el
pH, la radiación, altas presiones, la disponibilidad
de hospedantes, depredadores, patógenos y
Para la implementación de Heterorhabditis sp
SL0708 como controlador biológico, deben
optimizarse aspectos relacionados con su
producción masiva, aplicación y establecimiento en
campo, debido a que durante estos procesos existen
diversos factores que pueden provocarle daños
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Los nemátodos son organismos morfológica, genética y ecológicamente
diversos, representan cerca del 80% de los animales en la tierra, lo que los
convierte en el grupo animal más abundante en cuanto a número de individuos
(Poinar, 1983; Parkinson et al. 2004; Coghlan, 2005). Su gran abundancia
se debe a su habilidad de adaptación, así como a su tamaño pequeño, cutícula
resistente y a la capacidad de adquirir pequeños cambios en su plano
corporal, permitiéndoles invadir diversos hábitats y parasitar plantas,
vertebrados, insectos e incluso otros nemátodos (Blaxter, 2003; Coghlan,
2005).
Los nemátodos parásitos de insectos o nemátodos entomopatógenos
(NEPs), se conocen desde el siglo XVII. En la década de 1930 se puso
mayor interés en ellos por su capacidad para el control biológico y fue a
principios de los 80 que los NEPs de las familias Steinernematidae y
Heterorhabditidae se consideraron como agentes biocontroladores de
gran importancia (Smart, 1995; Reyes y De la Torre, 2005). Los NEPs
son letales para muchas plagas de plantas con importancia agronómica y
presentan la ventaja de no ser perjudiciales para plantas y vertebrados
(Poinar, 1975; Smart, 1995; Burnell y Stock, 2000). Muchos de estos
nemátodos tienen la particularidad de ser parásitos obligados de insectos
Implementación de técnicas moleculares para la identificación de nematodos entomopatógenos
Introducción
Introducción Uso de técnicas moleculares
El laboratorio de genética
molecular
Protocolos
Resultados esperados
Conclusiones Agradecimientos
Referencias bibliográficas
Contenido del Capítulo
Mitzi Flores-Ponce1 y Rafael Montiel2
(Burnell y Stock, 2000; Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002).
Existen varios géneros de nemátodos parásitos de insectos, sin embargo las especies más importantes
para el control biológico se concentran en las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae (Poinar,
1979; Smart, 1995; Burnell y Stock, 2000). Estos nemátodos poseen varias cualidades atractivas, que incluyen:
su persistencia y viabilidad en el suelo debido a una etapa infectiva de resistencia; poseen la habilidad de
buscar activamente a su hospedero; no contaminan, por lo que son seguros para el ambiente y no causan
una mortandad indiscriminada; presentan cierta especificidad hacia insectos, lo que los hace seguros e ino-
cuos para el usuario, otros animales y medio ambiente; tienen un rango extenso de hospederos por lo que
pueden controlar una gran variedad de plagas de importancia agrícola; actúan en un rango amplio de tem-
1y2 Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad, CINVESTAV-IPN. Km. 9.6 Libramiento Norte Carretera Irapuato – León. Irapuato, Guanajuato, México.
E-mail: [email protected]
peraturas; son de fácil aplicación y se encuentran
disponibles a nivel comercial, por su habilidad de
crecer en medio artificial, lo que permite su
producción en masa (Smart, 1995; Shapiro-Ilan y
Gaugler, 2002; Rodríguez Solano et al. 2004; Reyes
y De la Torre, 2005).
La familia Heterorhabditidae (Nematoda:
Rhabditida), contiene al género Heterorhabditis.
Mientras que la familia Steinernematidae
(Nematoda: Rhabditida) contiene los géneros
Steinernema y Neosteinernema, este último contiene
sólo a la especie N. longicurvicauda, la cual parasita
termitas (Reticulitermes flavipes) (Smart, 1995). De
acuerdo con un estudio realizado y con la base
de datos Taxonomy del NCBI, se han descrito y
registrado 63 especies del género Steinernema y 18
especies de Heterorhabditis (Smart, 1995; Sayers et al.
2009). Ambos géneros, Steinernema y Heterorhabditis,
á
presentan una relación simbiótica con enterobacterias
gram negativas de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus,
respectivamente (Burnell y Stock, 2000; Gouge y
Snyder, 2006). Ya que la bacteria es incapaz de
entrar en el insecto hospedero por sí sola y el
nemátodo sólo alcanza su crecimiento óptimo
cuando la bacteria está presente, esta relación
simbiótica es forética y mutualista al mismo tiempo
(Georgis y Poinar Jr, 1994; Griffin et al. 2005). Esta
relación simbiótica es altamente específica lo cual
hace que los NEPs constituyan modelos muy
complejos (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002; Carrero y
Planes, 2008). Especies del genero Steinernema se
asocian con una sola especie de Xenorhabdus y
muestran diferencias en rango de hospedero, infectividad,
tolerancia al ambiente y facilidad de producción
para su comercialización (Burnell y Stock, 2000;
Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002).
Uso de técnicas moleculares en la identificación Inicialmente, la identificación específica de
los nemátodos entomopatogénicos y desde luego
la identificación de nuevas especies, se basó
primordialmente en el análisis de caracteres
morfológicos. Sin embargo, la fiabilidad de las
determinaciones específicas a nivel morfológico
depende en gran medida de la experiencia de la
persona que realiza el análisis, de tal forma que
solo unos cuantos expertos en el mundo están
plenamente reconocidos para llevar a cabo dichas
identificaciones. Sin embargo, el advenimiento de
las técnicas moleculares ha provisto de nuevas
herramientas en este ámbito, junto con la esperanza
de hacer más asequible la identificación específica
de forma reproducible, de tal suerte que un
estudiante, con la debida formación, pueda llevar a
cabo esta tarea de manera fiable.
Es en este concepto que se basa la ahora
popular técnica del código de barras del DNA
(Hebert et al. 2003), que consiste en la caracterización
de un fragmento específico de DNA mitocondrial
de las especies animales para su posterior uso en la
identificación de especies e incluso para la identificación
de especies nuevas (Hajibabaei et al. 2007). En
general, diversos estudios han demostrado que el
código de barras del DNA puede resolver la
mayoría de las especies, aunque algunos taxones se
han mostrado intratables, debido entre otras
dificultades a la existencia de especies crípticas
(Waugh, 2007). Otro de los principales problemas
puede ser la escasa variación de la secuencia
comúnmente encontrada entre especies cercanas,
además de su completa inutilidad en estudios
poblacionales. Por este y otros motivos, esta técnica
ha recibido severas críticas (p.ej. Rubinoff et al.
2006). Sin embargo, en los últimos años este método
ha sido cada vez más utilizado y las ventajas y
limitaciones se han identificado con claridad a
medida que se ha incrementado el número de
organismos estudiados (Frézal y Leblois, 2008). A
pesar de todo, su uso en la identificación de
nemátodos entomopatogénicos ha sido prácticamente
inexistente, lo que limita su aplicación en esta área.
En cualquier caso, lo importante de la técnica del
código de barras del DNA es que
muestra la eficacia que pueden tener
los métodos moleculares en la
identificación y que en el peor de los
casos serán muy buenos complementos
de los estudios morfológicos. Por
otra parte, también es posible percibir
que los métodos de identificación
molecular serán más potentes en la
medida en la que se cuente con más
información de las especies de interés. Así, en el
caso de los nemátodos entomopatógenos, actualmente
hay información suficiente de una variedad de loci
del DNA que pueden ser útiles para este fin y que
efectivamente están siendo utilizados en la identificación.
Estos loci inicialmente atrajeron interés por su
potencial en la resolución de la filogenia de estas
especies.
Los esfuerzos iniciales incluyeron el análisis
mediante PCR-RFLP de regiones del espaciador
interno transcrito (ITS, por sus siglas en inglés) del
DNA ribosomal (Reid, 1994; Reid et al. 1997).
Otras aproximaciones incluyeron combinaciones
de DNA polimórfico amplificado de manera
áó é
aleatoria (RAPD, por sus siglas en inglés) y datos
morfológicos (Liu y Berry, 1996). Posteriormente y
por primera vez a nivel de secuenciación de DNA,
se utilizó el gene de la subunidad menor ribosomal
(SSU, por sus siglas en inglés; también conocido
como 18S) para resolver la filogenia dentro y entre
los géneros Steinernema y Heterorhabditis (Liu et al.
1997). Más tarde se utilizaron genes nucleares y
mitocondriales (Szalanski et al. 2000) incluyendo la
subunidad mayor del DNA ribosomal (LSU, también
conocido como 28S) (Stock et al. 2001; Adams et al.
2007), el ITS (Adams et al. 1998; Nguyen et al.
2001; Spiridonov et al. 2004), la
subunidad 4 de la NADH
deshidrogenasa mitocondrial
(ND4) (Liu et al. 1999) y el gene de
la citocromo oxidasa I (COI)
(Blouin, 2002).
Algunos de estos genes son evolutivamente
conservados, como los genes
ribosomales (SSU, LSU) y algunos
otros presentan una variación
mayor, como el ITS, pasando por genes que
presentan variaciones intermedias, como los
mitocondriales (NAD4, COI). Esto hace que se
puedan obtener resultados contradictorios en
análisis filogenéticos cuando se comparan las
filogenias resultantes de los distintos genes utilizados
(Blouin, 2002; Nadler et al. 2006a), pero también
representa una oportunidad de contar con
herramientas útiles para distintos fines. Los genes
conservados serían más útiles para la resolución de
conflictos en las zonas basales de las filogenias,
aún siendo útiles para la diferenciación de muchas
especies (p.ej. De Ley et al. 1999; He et al. 2005) y
los menos conservados servirían para estudios de
Los genes conservados serían más útiles para la resolución de conflictos en las zonas
basales de las filogenias, aún siendo útiles para la
diferenciación de muchas especies
variabilidad poblacional (Spiridonov et al. 2004). A
primera vista, para la identificación de nemátodos
serían más útiles los genes conservados, sin embargo
debemos considerar el problema de las especies
crípticas, que presentarán una misma secuencia en
genes conservados a pesar de ser especies distintas
(Waugh, 2007), lo que nos llevaría a una identificación
errónea. El caso contrario lo representa el uso de
genes de secuencia muy variable (o métodos como
RAPD), que resultarían en secuencias distintas (o
patrones de RAPD distintos) entre especímenes de
la misma especie (Adams et al. 1998; Spiridonov et
al. 2004), lo que nos podría llevar a concluir, de
forma equivocada, que estamos en presencia de
dos especies distintas. Bajo esta luz, parece claro
que un análisis multi-locus será siempre más fiable,
sobre todo si los datos moleculares pueden
combinarse con datos morfológicos (Nadler et al.
á
2006b).
Por otra parte, también hay que considerar,
en la elección de los fragmentos de DNA a analizar,
la información existente de las especies bajo estudio.
Como hemos visto, en el caso de los nemátodos
entomopatógenos existe información para un
número de genes, por lo que actualmente podemos
considerar que contamos con buenas herramientas
para la aplicación de las técnicas moleculares en la
identificación de estas especies, adoptando un marco
filogenético robusto para evaluar la fiabilidad de la
identificación. Esto se logra realizando análisis
filogenéticos con la información disponible en las
bases de datos, en los que se incluye las secuencias
que determinemos de los especímenes en cuestión,
lo que nos dará un mejor panorama de dónde se
sitúan nuestros especímenes en la filogenia.
El laboratorio de genética molecular La implementación de un laboratorio de
genética molecular para conducir experimentos de
identificación de nemátodos es una tarea relativamente
sencilla, pero requiere cierta planeación para garantizar
el rigor y calidad de los resultados, así como un
presupuesto adecuado. Actualmente hay una gran
variedad de equipos de distintas capacidades y
precios, por lo que un buen laboratorio no tiene
porque ser necesariamente muy costoso, en
función de los objetivos que se pretendan. La
identificación molecular de nemátodos es un
proceso de relativa baja complejidad y no requiere
equipos con especificaciones muy altas, por lo que
de una forma sencilla se puede montar un buen
laboratorio que garantice los mejores resultados.
Uno de los principales problemas al trabajar
con DNA y específicamente con DNA amplificado
mediante la técnica de PCR, es la contaminación
cruzada, por lo que conviene diseñar el laboratorio
de tal forma que nos permita separar las áreas de
trabajo, idealmente en torno a las siguientes
actividades: 1) extracción de DNA; 2) amplificación
por PCR; 3) electroforesis de DNA y procedimentos
post-PCR (adicionalmente podría ser necesario
secuenciar el DNA, sin embargo, para la secuenciación
lo más recomendable es recurrir a un servicio
especializado, pues actualmente los precios de
secuenciación son muy asequibles y por otra parte,
no es recomendable realizar la inversión en aparatos
de secuenciación a menos que se les vaya a dar un
uso verdaderamente intensivo); y 4) el análisis de
datos. Veamos a continuación las características
esenciales de cada una de estas áreas de trabajo:
1) Extracción de DNA: La extracción de
DNA consiste en separar esta biomolécula del
resto de componentes celulares de los organismos.
Los pasos pueden incluir la destrucción física de
los tejidos, la digestión de proteínas, la separación
del DNA de los restos proteicos y la purificación y
concentración del DNA (Sambrook y Russell,
2001). Se requiere una mesa de trabajo de laboratorio;
una campana de extracción de humos (muchos de
los protocolos requieren trabajo con sustancias
tóxicas) y equipo estándar de biología molecular,
que incluye microcentrífuga (idealmente refrigerada),
baños o placas termostáticas, vórtex, micropipetas
de varios calibres, refrigerador y congelador. En la
sección siguiente (Protocolos) se provee una lista
del equipo, material y reactivos, que puede servir
de guía sobre el equipo mínimo que se requiere en
cada etapa del análisis. Además, será necesario
considerar también el material y equipo para
procesar las muestras antes de la extracción del
DNA, como sonicadores, morteros, molinillos
motorizados, etc.
2) Amplificación del DNA: El PCR es un
método que permite obtener billones de copias de
un fragmento de DNA, a través de un proceso
iterativo de copiado, llamado amplificación, en el
que el número de copias se incrementa
exponencialmente en cada ciclo de replicación
(Figura 1). Es un método específico que hace posible
amplificar un determinado fragmento que
inicialmente puede estar purificado o que puede
ser parte de una mezcla compleja de materiales
biológicos (Mullis y Faloona, 1987). Para su
funcionamiento se vale de los principios básicos de
la termodinámica y de las propiedades químicas de
la molécula del DNA, como su conformación en
doble cadena con apareamiento específico de
bases. Requiere para su funcionamiento, una DNA
áó é
polimerasa termoestable, cebadores o primers para
iniciar el copiado específico, nucleótidos (dTNPs),
cloruro de magnesio y DNA molde o templado (el
DNA que se pretende amplificar) (Saiki et al. 1988).
Uno de los problemas más graves del PCR es
la contaminación cruzada entre las muestras, ya
que puede confundir el análisis e invalidar los
resultados. Esto se debe a que durante el PCR se
producen billones de copias específicas del
fragmento amplificado (estas copias son llamadas
amplicones), de tal forma que una partícula de
aerosol, que pude ser generada al abrir un tubo o al
pipetear, puede contener miles de amplicones. Si
una de estas partículas de aerosol termina en los
reactivos, o en las pipetas que se utilizarán para
extraer el DNA, puede contaminar severamente
los experimentos y producir resultados erróneos.
Para ilustrar el potencial de contaminación que
tienen los amplicones, Kwow y Higuchi (1989) han
hecho notar que una reacción de PCR puede generar
1012 copias de un fragmento de DNA en 100 µl y
si fuese posible diluirlos uniformemente en una
piscina olímpica, una alícuota de 100 µl de líquido
de la piscina contendría 400 moléculas amplificables.
Más aún, la décima parte de un microlitro de una
reacción de PCR, transportada en una punta de
pipeta, podría contener 109 copias de la secuencia
amplificada (Kwok y Higuchi, 1989) y un picolitro
(10-6 µl) podría contener 10,000 moléculas (Walder
et al. 1993). La transferencia de los amplicones
contaminantes de un sitio a otro puede darse
también a través de la piel, el pelo y la ropa de los
investigadores (Kitchin et al. 1990; Rys y Persing,
1993), por lo que también es adecuado tomar
precauciones en este sentido.
á
Figura 1. Representación esquemática de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los fragmentos largos se acumulan siguiendo una producción lineal, en tanto que los fragmentos de tamaño específico son producidos exponencialmente (Tomado de Montiel, 2001).
Las condiciones recomendadas para el manejo
de las muestras son similares a las que usan los
microbiólogos para el manejo y cultivo de
microorganismos (Kwok y Higuchi, 1989; Cimino
et al. 1990) o incluso más extremas (Kitchin et al.
1990), e incluyen:
Separación física de las áreas de preparación
de PCR y de las áreas donde se almacenan y
manipulan los productos, incluyendo la separación
de material, equipo y batas.
Autoclavado de las soluciones y de los
tubos. Esto es útil hasta cierto punto, pues
fragmentos pequeños de DNA pueden permanecer
intactos, sobre todo si se utiliza una temperatura
baja.
Alicuotar los reactivos, lo que reduce el riesgo
de contaminar las soluciones “stock” y permite
eliminar poco material si existe contaminación.
Utilizar guantes, cambiándolos frecuente-
mente, pues podrían facilitar el transporte de
amplicones. Evitar exponer otras superficies de la
piel cuando se prepara una reacción, utilizando
batas y mascarillas quirúrgicas o caretas de plástico
transparente.
Evitar las salpicaduras al abrir los tubos, ya
que pueden escapar aerosoles cargados con una
gran cantidad de copias.
Usar pipetas de desplazamiento positivo o
puntas con filtro capaces de retener aerosoles.
Premezclar los reactivos para minimizar el
número de veces que se requiere abrir los tubos y
el número de veces que se introducen las pipetas
en los reactivos. Esto tiene además la ventaja de
que se reduce el error de pipeteo, que se presenta
con cantidades inferiores a 1 µl.
áó é
El DNA que se quiere amplificar debe
añadirse al final, después de que se han puesto en
el tubo todos los reactivos.
Escoger adecuadamente los controles
positivos y negativos. El DNA para el control
positivo no debe estar muy concentrado. Si se
procesan muchas muestras, es recomendable
incluir más de un control negativo.
También, debe tenerse precaución con los
equipos que se utilizan para el análisis de los
amplicones. Las cubetas de electroforesis, las
superficies de los transiluminadores, las centrífugas
o los baños, pueden representar una fuente muy
importante de contaminación y la mayoría de estos
objetos pueden limpiarse si es necesario con HCl 1
M (Kwok y Higuchi, 1989), aunque lo más
importante es ser consciente de su potencial
contaminante.
Además, algunos autores (Rys y Persing,
1993; Espy et al. 1993) recomiendan el uso de
por lo menos un sistema adicional de esterilización
como la irradiación de los reactivos con luz UV.
El equipo necesario incluye una campana de
flujo laminar, un termociclador, una minicentrífuga,
refrigerador, congelador y un juego de micropipetas,
todo ello en un área de pre-PCR, separada del área
de extracción y del área de electroforesis. Una lista
más detallada de equipo, material y reactivos puede
encontrarse en la sección siguiente.
3) Electroforesis de DNA: La electroforesis
en gel de agarosa es una técnica simple y rápida,
que permite separar, identificar y purificar
fragmentos de DNA (Sambrook y Russell, 2001).
La elección de las medidas del gel depende del
tamaño de los fragmentos de DNA que se quiere
Los siguientes protocolos fueron diseñados
para realizar una práctica de un día en el marco del
Primer Taller Internacional de Nematodos
Entomopatógenos “Retos del Uso de Nematodos
Entomopatógenos en Latinoamérica para la
Sustentabilidad Agroalimentaria en el marco del
Cambio Climático”. Como tal, se han buscado
métodos sencillos y rápidos con la idea fundamental
de ilustrar los procedimientos utilizados en la
identificación molecular de nemátodos entomopatogénicos
y su implementación. No pretenden ser exhausti-
vos y no abarcan todas las posibilidades existentes,
por lo que deben ser considerados como una guía
inicial para el desarrollo de estas estrategias. La
práctica incluye la extracción de DNA y la
amplificación de fragmentos de dos genes
ribosomales comúnmente utilizados en la identificación
de nemátodos, el 18S y el 28S, así como la amplificación
con dos primers de RAPD, que nos ayudarán a
observar los problemas y virtudes de la técnica.
Debido al escaso tiempo disponible para la práctica,
no se realizará la purificación y secuenciación de
los genes ribosomales, como sería necesario para
completar el proceso de identificación; sin embargo,
en caso de interés, estos pasos pueden ser desarrollados
posteriormente. Por otra parte, dentro de la práctica se
separar. En general, los fragmentos pequeños se
separan bien en recorridos cortos (geles pequeños)
en tanto que fragmentos de mayor tamaño, requieren
recorridos más largos (geles grandes). Esta separación
corre generalmente de manera horizontal en un
campo eléctrico de flujo constante y en una dirección
(el DNA tiene carga neta negativa, por lo que
migrará hacia el polo positivo del campo eléctrico).
El trabajo en esta área es el que presenta el mayor
riesgo de contaminar los reactivos de extracción de
DNA y PCR, por lo que debe estar debidamente
separada de las otras áreas de trabajo, ya sea físicamente
o por lo menos logísticamente, con una mesa
dedicada exclusivamente a este tipo de análisis,
incluyendo el material y el equipo necesarios. El
trabajo en esta área y las manipulaciones posteriores
se consideran procedimientos post-PCR, por lo
que deberían ubicarse en un área que podría
etiquetarse con este nombre, zona de post-PCR. Se
requieren cubetas de electroforesis, fuentes de
á
poder para generar el campo eléctrico y un juego
de micropipetas. Una lista más detallada de equipo,
material y reactivos puede encontrarse en la
sección siguiente.
Otros procedimientos post-PCR, útiles en la
identificación molecular de especies, incluyen
digestión de los amplicones con enzimas de
restricción, o bien, la purificación de los productos
de PCR para envío a secuenciación. Para estos
procesos se requieren baños o bloques termostáticos,
microcentrífugas y pipetas.
4) Análisis de datos: Se requiere un espacio
de trabajo adecuado para acomodar por lo menos
una computadora y conexión a internet. Muchos
de los programas que se utilizan actualmente para
el análisis trabajan accediendo a bases de datos en
línea. Existe una amplia gama de programas para el
análisis de secuencias de DNA. Como punto de
inicio se recomiendan los siguientes programas:
BioEdit (Hall, 1999) para manipulación de secuen-
Protocolos
incluye una demostración del análisis bioinformático
de secuencias, para ilustrar esta parte importante
del proceso de identificación.
I. Extracción de DNA de Nemátodos
Objetivo: Extraer DNA de nemátodos para
amplificación por PCR. El protocolo está diseñado
para funcionar desde un nemátodo, útil para analizar
variabilidad poblacional, o variabilidad de especies
en aislados crudos (potencialmente con más de una
especie), hasta 5 nemátodos, cuando se quiere
tener más cantidad de DNA para más reacciones
de PCR y cuando el aislado está purificado
(contiene una sola especie).
Equipo y Material:
- Microcentrifuga para tubos tipo eppendorf 1.5 ml
(idealmente refrigerada)
- Termobloc para tubos tipo eppendorf de 1.5 ml
(se puede substituir por baño termostático, en este
caso se requieren flotadores para tubos eppendorf
de 1.5 ml).
- Micropipetas de: 0.5 -2 µl, 2 - 20 µl y 1 ml
- Puntas para micropipeta blancas, amarillas y
azules (compatibles con marca de micropipetas),
estériles o esterilizadas por autoclave
- Receptáculos para puntas y tubos de desecho
- Microtubos tipo eppendorf de 1.5 ml, estériles o
esterilizados por autoclave
- Tubos Falcon de 15 y 50 ml
- Gradillas para tubos eppendorf de 1.5 ml
- Gradillas para tubos Falcon de 15 y 50 ml
- Sanitas (toallas de papel desechable de laboratorio)
áó é
- Hielo picado y contenedores para incubación
- Picetas para agua y etanol
- Contenedor para baño de hielo seco con etanol
(opcional)
- Guantes quirúrgicos.
Reactivos:
- H2O destilada
- Etanol de 70° o 96° para laboratorio
- H2O Milli-Q, esterilizada por autoclave (ó SIG-
MA W4502-1L)
- Cloro comercial (hipoclorito de sodio 5-10%)
- Sodium chloride – SIGMA S3014-500G (o
equivalente)
- Potasium chloride solution 1M – SIGMA 60142-
100ML-F (o equivalente)
- Trizma® hydrochloride (Tris-HCl) – SIGMA
T5941-100G (o equivalente)
- Magnesium chloride solution 1M – SIGMA
M1028-10X1ML (o equivalente)
- Triton® X-100 – SIGMA T8787-50ML (o
equivalente, puede substituirse por NP-40)
- TWEEN® 20– SIGMA P9416-50ML (o equivalente)
- Proteinase K 800 units/ml – SIGMA P4850-
1ML (o equivalente)
- Hielo seco (opcional).
Soluciones stock:
- Etanol al 70%
- NaCl 0.8%
0.1 M Tris-HCl pH 8.3
Procedimiento
Preparar el tampón de lisis de nemátodos:
Tomar 1 ml de nemátodos
Lavar con cloro 10% por 7 min (en agitación)
Centrifugar a 12000 rpm por 1 min y desechar
sobrenadante
Lavar con NaCl 0.8% una vez
Lavar con H2O destilada una vez
En un tubo eppendorf limpio añadir la proteinasa
nasa K 800 units/ml)
Introducir 1 nemátodo en el tampón de lisis
de tampón de lisis).
Congelar el tubo en un baño de hielo seco con
etanol, o congelar a -80°C por al menos dos horas
(opcional)
Incubar durante una hora a 65 °C
Inactivar la proteinasa K incubando a 95 °C por
15 min
Puede almacenarse el sobrante a -80 °C para uso
posterior.
á
II. Amplificación por PCR
Objetivo: Amplificación de fragmentos de
DNA mediante la técnica de reacción de
polimerización en cadena (PCR).
Equipo y Material:
Campana de flujo laminar
Termociclador, cualquier marca (recomendable
con opción FAST)
Minicentrífuga (para centrifugaciones rápidas).
Bloques termostáticos para tubos eppendorf
(mantenidos a -20°C)
Micropipetas de: 0.5 -2 µl, 2 - 20 µl y 20 – 200 µl
(distintas a las usadas en la extracción)
Puntas para micropipeta blancas y amarillas
(compatibles con marca de micropipetas),
estériles o esterilizadas por autoclave
Receptáculos para puntas y tubos de desecho
Microtubos tipo eppendorf de 1.5 ml, estériles o
esterilizados por autoclave
Microtubos tipo eppendorf de 0.2 ó 0.5 ml
(compatibles con bloque del termociclador),
estériles o esterilizados por autoclave
Gradillas para tubos eppendorf de 0.2 ó 0.5 ml y
de 1.5 ml
Hielo picado y contenedores para incubación
Guantes quirúrgicos.
Reactivos:
Agua Milli-Q estéril (ó agua grado PCR – SIGMA
W1754-1VL)
Taq DNA polimerasa con tampón de reacción
10X y MgCl2 – SIGMA D4545-50UN (o equivalente)
Worm Lysis
Buffer (WLB):
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl pH 8.3
2.5 mM MgCl2
0.45% Triton-X-100
Proteinasa K: 20 mg/ml u 800units/ml
Deoxynucleotide Mix, 10 mM – SIGMA D7295-
.2ML (o equivalente)
Primers:
Sc-18S_F44
5'-TGATGAGGAGCTAATCGGAAACG-3'
Sc-18S_R246
5'-CACCATCCACCGAATCAAGAAAG-3'
Sc-28S_F286
5’-GCGTTTCGTCTTTGCTTTTC-3’
Sc-28S_F1135
5' -TAGGGACAGTGGGAATCTCG 3'
PplaRAPD-R
5’-CACGGGCAATAG-3’
OP-H15
5’-AATGGCGCAG-3’
Los primers del 28S de S. carpocapsae se diseñaron
con el software Primer3 (v.0.4.0) en línea (http://
frodo.wi.mit.edu/primer3) (Rozen y Skaletsky,
2000), tomando como templado la secuencia del
gen ribosomal 28S reportada en el GeneBank del
NCBI.
Procedimiento:
1.Preparar en un tubo eppendorf la mezcla de
reacción.
2.Adicionar los siguientes componentes, excepto el
DNA:
*Una vez que se adiciona la Taq polimerasa se
deben mantener los tubos a 4ºC o menos. Es
conveniente utilizar bloques termostáticos para
este fin (o hielo picado).
3.Alicuotar 20 µl de mezcla en microtubos tipo
eppendorf de 0.2 ml (compatibles con termociclador).
4.Agregar 5 μl de DNA a cada tubo.
5.Mezclar y centrifugar brevemente.
áó é
6.Colocar los tubos en el termociclador y correr el
siguiente programa:
Puede ser necesario duplicar el tiempo de extensión
para insertos mayores a 1.5 Kb.
Puede ser necesario determinar la temperatura
óptima dependiendo de los primers
Puede ser necesario determinar las concentraciones
óptimas de MgCl2 y Taq por cada lote de enzima.
7. Verificar la amplificación por electroforesis en
un gel de agarosa al 2%.
III. Electroforesis de DNA
Objetivo: Separar fragmentos de DNA de distinto tamaño en un gel de agarosa.
Equipo y Material
- Microondas para fundir la agarosa (o placa calefactora)
Componente Concentración
Final Vol. para 1 reacción
H20 ajustar a 25µl 13.8 µl
Buffer 10X sin Mg 1X 2.5 µl
50 mM MgCl2 3 mM 1.5 µl
10 mM dNTPs 0.4 mM 1 µl
Primer F 10 µM 0.2 µM 0.5 µl
Primer R10 µM 0.2 µM 0.5 µl
Taq 5 U/µl 1 U 0.2 µl
DNA variable 5 µl
Volumen total 25 µl 25 µl
1
ciclo 35 ciclos
1
ciclo
Tiempo 5:00
min
0:30
min 0:30 min
1:00
min 7:00
T°C 94ºC 94ºC
59-63ºC
dependiendo
de los
primers
72ºC 72ºC 4ºC
- Cámara de electroforesis en gel de agarosa
(pequeña)
- Cubetas y peines para preparación de geles
(compatibles con la cámara)
- Cinta “masking tape”
- Fuente de poder para electroforesis (mínimo
100V)
- Transiluminador UV
- Sistema de fotodocumentación (puede substituirse
por sistema polaroid o cámara digital)
- Agua destilada
- Micropipeta de: 0.5 -10 µl ó 2 - 20 µl (diferentes
de las usadas en los protocolos anteriores)
- Puntas para micropipeta blancas (compatibles
con marca de micropipetas)
- Receptáculos para puntas y tubos de desecho
- Microtubos tipo eppendorf de 1.5 ml
- Gradillas para tubos eppendorf de 1.5 ml
Reactivos
- Tris-Borate-EDTA buffer – SIGMA T7527-1L
(o equivalente)
- Agarose – SIGMA A9539-10G (o equivalente,
uso rutinario)
- Ethidium bromide solution – SIGMA E1510-
10ML (o equivalente)
- PCR 100 bp Low Ladder – SIGMA P1473-1VL
(o equivalente)
- Gel Loading Buffer – SIGMA G2526-5ML (o
equivalente)
- Guantes quirúrgicos
ADVERTENCIA: El bromuro de etidio es en ex-
tremo mutagénico; use guantes al manipularlo y
á
tome precauciones al desecharlo.
Procedimiento
7. Para geles de Agarosa al 2%, pesar 2gr de agarosa
y disolver en 100 ml de TBE.
8. Calentar en horno de microondas hasta que la
agarosa se haya fundido.
9. Es conveniente mezclar varias veces mientras se
está calentando.
10.Dejar enfriar (sin que solidifique) mientras se
prepara la cubeta para el gel.
11.
etidio (concentración final de 0.5 μg/ml).
Otra opción es no adicionar bromuro de
etidio a la agarosa y teñir el gel en 0.5 μg/ml de
bromuro de etidio, durante 15-30 min, una vez que
se ha corrido el gel. Generalmente no es necesario
desteñir, pero si se quiere reducir la fluorescencia
de fondo, el gel puede enjuagarse con H2O
destilada durante 15 min.
5. Para preparar la cubeta se deben tapar los extremos
abiertos. Existen en el mercado gomas especiales
para ello, sin embargo pueden sustituirse sin
problema por cinta adhesiva (tipo “masking-
tape”).
6. Una vez lista la cubeta, verter la agarosa e insertar
los peines.
7. Dejar solidificar de 20 a 30 min y colocar la
cubeta en la cámara de electroforesis.
8. Cubrir el gel con buffer TBE sin que sobrepase
un par de milímetros.
9. Tomar 2 µl de buffer de carga y depositar en un
papel parafilm.
10.Tomar 4 µl de muestra y depositar encima del
buffer de carga.
11.Mezclar perfectamente con la punta de la
micropipeta.
12.Cargar toda la muestra en cada pozo del gel, a
partir del segundo pozo.
13.Cargar 2 µl de marcador de peso molecular en
el primer pozo.
14.Conectar la cámara de electroforesis a la fuente
de poder y correr las muestras en el gel a 100-
110 Volts (~5Volts/cm) durante 40 min.
*Puede correrse más tiempo a criterio personal.
Para esto es necesario observar la migración del
colorante azul de bromofenol.
15.Desconectar la fuente de poder y retirar la cubeta
de la cámara de electroforesis.
16.Colocar el gel en un transiluminador con luz
UV para observar las bandas y tomar fotografías
del gel. Es conveniente utilizar una tapa acrílica
áó é
con el transiluminador u otro medio de protección
de la luz UV.
IV. Demostración de análisis bioinformático:
La demostración incluirá los siguientes procedimientos:
Alineamiento de la secuencia de interés con una
secuencia de referencia, mediante el programa
BioEdit (Hall, 1999).
Colecta de secuencias en las bases de datos y
alineamiento para análisis filogenético.
Determinación del mejor modelo evolutivo para
nuestros datos, mediante el programa MEGA 5
(Tamura et al. 2011).
Reconstrucción filogenética, mediante el programa
MEGA 5 (Tamura et al. 2011).
Interpretación de resultados.
Resultados Esperados Se espera que los participantes en
el curso se familiaricen con la
terminología de los métodos
moleculares y con los distintos
pasos del análisis. Se realizará un
proceso de extracción de DNA
sencillo y rápido que produce
DNA con las características
suficientes para ser usado en la
amplificación por PCR. En la
práctica de PCR se espera obtener
amplificaciones de fragmentos de
tamaños distintos, para familiarizarse
Figura 2. Geles de agarosa al 2%, en ambos casos a la izquierda se
observa el marcador de peso molecular, una escalera de 100 pb. a)
Fragmento correspondiente a los primers 28S (850bp); 1, control
negativo; 2-6 DNA de S. carpocapsae. b) Fragmento correspondiente a
los primers 18S (203bp); 1, control negativo; 2-6, DNA de S. carpocap-
Actualmente la aplicación de técnicas moleculares
para la identificación de nemátodos entomopatógenos
es posible debido a la información que se ha ido
acumulando desde los primeros estudios encaminados
a resolver la filogenia de los dos géneros principales
de este tipo de nemátodos. Aunque todavía existe
el debate sobre si la identificación específica con
estos métodos podrá algún día prescindir de los
análisis morfológicos, por el momento se acepta
que son una herramienta de apoyo de gran importancia
y en algunos casos podrían considerarse suficientes,
por ejemplo, en el caso de la identificación de
especies ya muy bien caracterizadas, siendo todavía
riesgoso la definición de nuevas especies basada
únicamente en la evidencia molecular. En este
documento se presenta información fundamental
para implementar este tipo de técnicas, sin embargo,
se anima a los lectores a profundizar en los distintos
temas abordados, sobre todo en lo referente a las
distintas alternativas existentes de protocolos
experimentales.
con la estimación de tamaño de fragmentos de
DNA en gel de agarosa (Figura 2).
Se realizará también la técnica de
RAPD para que los participantes cuenten
con un punto de referencia de un método
que no requiere secuenciación. Para
valorar la potencialidad y problemática
de la técnica de RAPD se uti l izarán
primers de dos tamaños distintos (10 y 12
pb), que producen resultados distintos
en cuanto a la reproducibilidad del
patrón de bandas obtenido (Figura 3).
Finalmente, la demostración de
análisis bioinformático servirá para que
los participantes puedan integrar los
resultados obtenidos durante el trabajo
práctico con el proceso de identificación
molecular en su conjunto.v
á
Conclusiones
Figura 3. Geles de agarosa al 2%, en ambos casos el marcador
de peso molecular es una escalera de 100 bp. a) RAPD con el
primer OP-H15 de 10 pb; 1-11 DNA de H. bacteriophora, se
observa la falta de reproducibilidad de algunas bandas; 12, con-
trol negativo. b) RAPD con el primer PplaRAPD-R de 12 pb; 1-
9, DNA de H. bacteriophora, se observa mayor reproducibilidad
de las bandas; 10, control negativo.
Agradecimmientos El trabajo sobre nemátodos entomopatógenos en el laboratorio de los autores ha sido financiado por el proyecto Fomix-Hgo-2008-C01-97032 del Fondo
Mixto Conacyt-Gobierno del Estado de Hidalgo, otorgado a RM. MF-P cuenta con una beca de Cona-cyt para estudios de doctorado (Reg. No. 219899).
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Uso de Nematodos Entomopatógenos en el Manejo Integrado de la Broca del Café: Una Herramienta Para Beneficio de los Caficultores
Generalidades Contenido del Capítulo
Generalidades Nematodos entomopatógenos con potencial en el control de insectos plaga
Uso de nematodos entomo-patógenos en el cultivo del café
Referencias Bibliográficas
Juan Carlos López Núñez
En el ámbito mundial, el cultivo del café cuenta con dos plagas de
importancia económica: el minador de la hoja del café Leucoptera coffeella
(Guer-Meneville) (Lepidoptera: Lyonetiidae) que ataca la hoja del café y la
broca del café Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Curculionidae),
que ataca el fruto (Villacorta, 1998); esta última, se considera como la más
importante (Le Pelley, 1968), al encontrarse distribuida en todos los países
productores de café. Para Colombia, actualmente representa el problema
más severo para la caficultura, ya que su ataque se dirige a la almendra o
endospermo (Decazy, 1990), causando la pérdida parcial o total de los
frutos cosechados, disminuyendo su peso al ser atacados por las larvas y
la caída prematura de frutos menores de tres meses de edad cuando son
atacados, traduciéndose en la disminución del precio de venta y en la calidad del producto final (Bustillo,
1991 y 2006).
Este insecto se introdujo al continente americano desde el África, y desde entonces ha ocasionado
reducción en el rendimiento entre el 5 y 24%, reducciones en el peso de la almendra infestada hasta del 55
%, lo que ha permitido estimar el costo de la broca en pérdidas al menos por 75 millones de dólares anuales
para Colombia (Montoya 1999; Duque y Baker 2003). Globalmente, la importancia de la comercialización
del café como producto agrícola es innegable. En el 2003 supero en más de 14 mil millones de dólares las
exportaciones agrícolas de Estados Unidos; en más de 50 países productores del grano es el sustento de
por lo menos 20 millones de familias cafeteras, y teniendo en cuenta un promedio de cinco personas por
familia, se podría estimar que al menos 100 millones de personas dependen directamente del cultivo del
café (Osorio 2002; Vega et al.,2003)
Dinámica de la broca en el suelo: Con el ánimo de entender la no sencilla dinámica de la broca en
el suelo, se debe considerar principalmente la población del insecto que se resguarda y reproduce en los
frutos remanentes en el suelo, pues este factor es del que depende la infestación a los frutos sanos de las
nuevas cosechas (Peralta, 1995; Bustillo, 2006). Un segundo factor y no menos importante, son los frutos
de café que caen al suelo principalmente después de las cosechas, ya que ofrecen al insecto alimento para
á ó úñ
1972), y hasta algunas condiciones que se presentan
de manera fortuita o esporadica como efecto de
tormentas eléctricas, que afectan secando los troncos,
las ramas y frutos (Leguizamón y Arcila, 1992), o
las emanaciones del volcán Nevado del Ruiz, fenómeno
que causó la caída de frutos entre un 5 a 10%
(Arcila y Valencia, 1985), son factores que favorecen
la presencia de frutos tanto sanos como infestados
por la broca en el suelo, siendo el principal
reservorio de la plaga donde además se proteje de
condiciones ambientales que pudieran afectarla
sobre todo en períodos donde no hay cosecha, y
las condiciones agrestes en las que se presenta la
caficultura colombiana, hacen difícil retirar estos
frutos del suelo, lo que permite
que la broca se mantenga
como el enemigo escondido
haciendo presencia silenciosa y
constante en cualquier lugar
donde el cultivo se mantenga.
Bajo este panorama, y
entendiendo que el control de
la broca del café requiere de
un enfoque integral en el que se consideren que
todos los métodos de control disponibles sean
compatibles, y a la vez disminuyan las poblaciones
del insecto en el campo de manera efectiva y
armoniosa con el ambiente, es que en Colombia la
Federación Nacional de Cafeteros en manos de
Cenicafé ha implementado un manejo integrado de
la broca que incluye componentes químicos,
culturales y biológicos (Bustillo, 2006). Dentro de
este último componente, Cenicafé ha invertido
recursos en la búsqueda de alternativas como el caso de nema-
todos entomopatógenos, que puedan ser incorporadas dentro
de los programas de manejo de la plaga.
su desarrollo y le sirven como medio de dispersión
durante la época de escasez de frutos (Bernal et al.,
1999). Si se tiene en cuenta que lo anterior está
siendo afectado, tanto por condiciones bióticas como
abióticas, esta dinámica del insecto se torna más
compleja; por ejemplo, después de un periodo seco,
se presenta un aumento poblacional de la broca en
dichos frutos y con la llegada de las lluvias, los
adultos emergen y se dispersan por el cafetal,
atacando frutos sanos (Baker et al.,1994; Bustillo,
2002).
Son diferentes razones, por la que hay
presencia en mayor o menor número de frutos en
el suelo en un cultivo de café. Dentro de los mas
relevantes, las enfermedades como
roya (Leguizamón y Arcila, 1991),
mancha de hierro (Leguizamón,
1997), mal rosado (Cadena, 1981),
yaga macana y negra (Castro y
Montoya, 1997), causan en general el
secamiento de ramas y caída de fruto.
Algunos problemas fisiológicos
causados por factores climáticos
como sequías o exceso de lluvia (Valencia y Arcila,
1975), y desequilibrios en la fertilización
(Valencia, 1972), ocasionan en la planta la caída
prematura de frutos. La acción de algunos insectos
sobre las regiones productivas de la planta y las
hojas, causa caída directa de frutos y repercute en
su secamiento y defoliación, como es el caso del
minador, chinche harinoso y arañas (Cárdenas,
1985; Cárdenas y Orozco, 1983; Cárdenas et al.,
1997). Finalmente, la ejecución de labores que se
realizan para incrementar la productividad del
cultivo, como la fertilización, deshierba, zoqueo y
hasta la ocurrencia de cosechas abundantes y el
tránsito de los trabajadores por los lotes (Valencia,
Cenicafé ha implementado un manejo integrado de la broca que incluye componentes químicos, culturales y
biológicos. En este último componente se ha invertido en la búsqueda de alternativas como los
NEPs.
á
Las especies de las familias Steinernematidae
y Heterorhabditidae, son los candidatos con el
mayor potencial en el control de plagas, no
solamente porque además de ser altamente virulentas
sobre mas de 200 especies de insectos considerados
plaga (Tanada y Kaya, 1993; Stock y Hunt, 2005), y
guardar una asociación simbiótica con varias especies
de bacterias de los géneros Xenorhabdus spp. y Photorhabdus
spp., respectivamente, que son las directamente
responsables de la muerte del hospedante durante
las primeras 24 a 48 horas después de infección
(Akhurst y Boemare, 1990; Griffin et al., 2005;
Lengyel et al., 2005; Tailliez et al., 2006), sino por-
que buscan a su presa activamente lo que los hace
altamente eficientes y letales, a diferencia de otros
entomopatógenos (Reed y Wallace, 1965; Ishibashi
y Kondo, 1990; Campbell y Kaya, 1999).
Adicionalmente, los novedosos avances,
durante los últimos 15 años, en los sistemas de
producción masiva aseguran el suministro de estos
agentes de control (Capinera y Epsky, 1992, Ehlers
y Shapiro-Ilan, 2005). Adicionalmente, especies
representantes de estas familias, son las que
actualmente están incluidas en programas exitosos
de manejo en el campo e invernadero como
Heterorhabditis bacteriophora, H. zealandica H. megidis,
Steinernema feltiae, S. carpocapsae, S. riobrave S. kraussei,
S. scarabaei en el control de Cyclocephala borealis,
Popillia japonica, Phyllophaga spp. (Grewal et al.,
2004), Otiorhynchus sulcatus (Lola-Luz et al., 2005),
Bradysia spp. (Jagdale et al., 2004), Liriomyza spp.
(Williams y MacDonald, 1995), Frankliniella occiden-
talis (Ebbsa et al., 2004), Diaprepes abbreviatus
(McCoy et al., 2002), Cosmopolites sordidus (Treverow
Nematodos entomopatógenos con potencial en el control de insectos plaga.
ó
Uso de nematodos entomopatógenos en el cultivo del café La información sobre su uso práctico es escasa.
En Cuba, se tienen registros el uso de de
Heterorhabditis bacteriophora (cepa HC1) y Verticillium
lecanii, integrándolos dentro del manejo de la chinche
harinosa en el cultivo del café (Martínez et al.,
1998). En este registro se menciona que en las
localidades donde se realizaron las aplicaciones
entomopatógenos combinadas con prácticas
agronómicas, se disminuyeron los niveles de
infestación y se obtuvieron mayores rendimientos.
En cuanto a trabajos en que consistentemente se
presenten resultados que permitan considerar a los
nematodos entomopatógenos como una herramienta
de control de plagas en la caficultura, la información
es limitada y Cenicafé ha sido pionero en estas
investigaciones generando espacios en los que por
medio de investigaciones, ha desarrollado esta
herramienta de control biológico, enfocada al
control principalmente de poblaciones de broca
que se resguardan en los frutos del suelo (López,
2005) y que son la principal fuente de infestación
para cosechas posteriores (Bustillo, 2006).
Nematodos y la broca del café
Hasta el momento sólo se tienen dos registros
de nematodos afectando naturalmente la broca del
café; el primero se presentó en India en 1994, donde
á ó úñ
CIBC, 1990; Georgis y Hom, 1992).
El primer trabajo que registra el efecto de
especies de estas familias, se realizó en Inglaterra,
en 1989, cuando en el laboratorio describen el
efecto parasítico de Heterorhabditis bacteriophora,
sobre larvas y adultos de la broca (Allard y Moore,
1989). Posteriormente, otros registros en el laboratorio
presentan el efecto patogénico de Steinernema glaseri,
S. feltiae, S. carpocapsae y Heterorhabditis bacteriophora,
principalmente, sobre adultos (Lubego, 1992; Castillo y
Marbán, 1996). En Cuba se registró la susceptibilidad
de larvas, pupas y adultos de broca a S. cubanum, H.
indica y H. bacteriophora (Valdés y Escobar,
2006). No obstante que actualmente las
especies comercialmente
disponibles ofrecen una
perspectiva muy prometedora
para usarlos como reguladores
de la broca del café, no son
específicas para la broca, y por
lo tanto, se requiere incrementar
esfuerzos en la búsqueda de
especies de estos nematodos
con atributos para controlar biológicamente a la
broca, así como también es necesario desarrollar
los métodos para multiplicarlos (Castillo, 2007).
El uso de nematodos entomopatógenos aislados
de la misma región (nativos), presenta ventajas
como es la fácil adaptación a la zona donde van a
ser empleados a diferencia de aquellos exóticos,
donde las ‖condiciones ambientales extrañas‖ pueden
resultar fallidas al momento de la adaptación.
Además, para evitar el desplazamiento de cepas y/
o especies nativas, que son altamente suscptibles a
desaparecer cuando se realizan aplicaciones inun-
dativas con organismos exóticos, es preferible
Varaprasad y colaboradores en 1994, encontraron
a Panagrolaimus sp. (Panagrolaimidae), típico
nematodo bacterióvoro, afectando adultos de H.
hampei. El segundo registro fue en México, en el
municipio de Cacahoatán en Chiapas, en donde a
partir de hembras de broca extraídas de frutos de
café brocados caídos al suelo se aisló a Sphaerulariopsis
sp. (Thylenchida: Sphaerularioidea), nematodo
parásito de invertebrados (Castillo y Barrera, 1998;
Castillo et al., 2002), que finalmente fue descrito
como nueva especie Methaparasitilenchus hypothenemi
(Allantonematidae) (Poinar et al., 2004). Estos
registros, son evidencia de las diferentes asociaciones
que pueden presentar los nematodos del suelo con
la broca guarecida en el fruto, y de las
condiciones favorables que este hábitat
ofrece para el desarrollo y la
permanencia del patógeno. Esto último
concuerda con observaciones realizadas
en los laboratorios de Cenicafé, en
donde a partir de frutos brocados
recolectados de diferentes regiones
cafeteras colombianas, se ha registrado
diversidad de nematodos con hábitos
omnívoros, algívoros y bacterióvoros, principalmente
de la familia Diplogasteridae (resultados no
publicados).
Las especies de las familias de Steinernematidae
y Heterorhabditidae, tienen gran potencial para el
control de insectos como la broca del café, pues
además de ofrecer ciertas ventajas frente a los
insecticidas químicos por ser seguros al ambiente,
no afectar plantas ni humanos, ser de alta aceptación
comercial y ser activos al buscar el insecto plaga,
son letales a la hora de ser usados como
herramienta de control de insectos (Gaugler, 1981;
En Colombia, Cenicafé ha
enfocado sus esfuerzos,
realizando investigaciones para
usar esta herramienta para
controlar poblaciones de la plaga
en el campo.
á
implementar los programas de manejo con
organismos nativos. De esta manera, los trabajos
realizados en Cenicafé han permitido además de
mostrar la gran diversidad de especies nativas de
steinernematidos y heterorhabditidos de la región
cafetera colombiana (López et al., 2007 y 2008),
evaluar su virulencia frente a los diferentes estados
de broca del café, logrando caracterizarlos con éxito
frente a esta plaga, permitiendo que los caficultores
colombianos cuenten con un pull de organismos
altamente virulentos a la broca del café (Quintero
et al., 2010).
El conocimiento de los detalles de la interacción
nematodo – broca como virulencia de diferentes
especies, estrategia para la búsqueda de hospedante,
ciclo de vida sobre el insecto, vulnerabilidad de los
instares al ataque del patógeno y comportameinto
de este frente a su presa, permite tener argumentos
para la selección del patógeno que cumpla con los
requisitos suficientes para ser seleccionado (Molina
y López 2002, 2003; López 2002). Adicionalmente,
el conocimiento sobre sistemas de aplicación (Lara
y López, 2005), los resultados de control de broca con
aplicaciones en mezcla con hongos entomopatógenos
tanto en invernadero como en el campo, en pequeña
y mediana escala (Giraldo, 2003; Del Castillo,
2004; Lara et al., 2004), al igual que la posibilidad
de obtener nematodos de la mas alta calidad por
medio de la multiplicación in vivo de los nematodos
que permiten pensar en una rápida y efectiva adopción
del sistema de producción por parte de las empresas
de producción de biológicos (Realpe et al, 2007),
permiten considerar a esta herramienta biológica
como promisoria para ser incorporada dentro del
programa de Manejo Integrado de la Broca.
ó
Consideraciones Finales El beneficio intrínseco que se obtiene en el uso
de especies nativas, no sólo para preservar y proteger la
biodiversidad natural de ecosistemas frágiles, sino
también para aprovechar su adaptación natural al
medio ambiente, principalmente al clima y a las
condiciones del suelo, hacen de estos organismos unos
candidatos apropiados para desarrollar e implementar
programas de Manejo Integrado en Colombia,
contribuyendo con la sostenibilidad de la agricultura del
país, como ha sido tenido en cuenta por parte del
programa de Manejo Integrado de la Broca del café en
Colombia.
Es prioritario aunar esfuerzos y tumbar barreras
que puedan existir entre grupos de investigación y
empresas productoras de biológicos en Latinoamérica,
para poder aprovechar los conocimientos generados y
las experiencias adquiridas, sin que se desperdicien
recursos económicos repitiendo trabajos. Tal es el caso
de la producción in vitro, para la que urge el suministro
de material de alta calidad y disponible a los agricultores.
Las capacidades únicas con que cuenta este
biocontrolador, principalmente lo relacionado con la
tolerancia a rangos amplios de pH, temperatura, humedad,
rango amplio de insectos para infección, capacidad de
búsqueda activa de hospedantes, compatibilidad con
agroquímicos, facilidad de aplicación con equipos
convencionales entre otros, los hacen la ―herramienta
idónea de control biológico para el cambio climático‖,
lo que es una oportunidad sin igual para continuar o
iniciar proyectos donde su implementación y su
aplicabilidad en programas MIP en países latinoameri-
canos esté a la orden del día.
á ó úñ
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Para contrarrestar lo anterior, se ha buscado restaurar este proceso
natural tratando de reintroducir enemigos naturales a los sistemas agrícolas y así recuperar el equilibrio de
las poblaciones de insectos; este es el principal objetivo del Control Biológico al utilizar insectos depredadores, parasitoides,
entomopatógenos (hongos, bacterias y nematodos) para controlar las poblaciones de otros insectos (Dent
2000). El control Biológico puede ser una estrategia eficaz para el control de plagas con hábitos crípticos,
ya que los enemigos naturales pueden buscarlas activamente en los lugares donde estas se ocultan
(Rodríguez et al. 2006).
Teniendo en cuenta lo anterior, el presente trabajo evaluó la susceptibilidad de larvas de tercer instar de
Delia platura a NE de los géneros Steinernema y Heterorhabditis en condiciones de laboratorio, para lo cual se
cuantifica la mortalidad de larvas de Delia platura expuestas a los aislamientos Heterorhabditis sp. SL0708,
1Biólogo. [email protected] 2Profesor Asistente., Unidad de Ecología y Sistemática –UNESIS, Laboratorio de Control Biológico. [email protected].
Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N°43-82, Edf 54, Oficina 200. Bogotá, Colombia.
Susceptibilidad de Delia platura (Meigen, 1826)
(Diptera: Anthomyiidae) a Nematodos Entomopatógenos
Introducción
José Joaquín Celeita Bernal 1 y Adriana Saenz Aponte2
La interacción de los insectos y sus enemigos naturales es un proceso
ecológico esencial dado que este mantiene reguladas las poblaciones de
insectos evitando que estas se conviertan en potenciales plagas (Dent 2000).
Estos procesos ecológicos se ven interrumpidos por el establecimiento de
monocultivos y el uso de insecticidas para su mantenimiento dado que
estos no solo destruyen los insectos plaga sino también los enemigos
naturales (insectos benéficos) conllevando a que las poblaciones de los
insectos fitófagos se incrementen generando daños económicos importantes
y convirtiéndose posiblemente en plagas (Dent 2000). Como ejemplo de
estas plagas, están las moscas del género Delia (Anthomyiidae) las cuales
son de hábito fitófago en su etapa larval, pueden convertirse en plagas de
muchos cultivos (Hennig 1976; Griffiths 1990 en Gouinguene & Stadler 2005),
como cebolla (Allium fistulosum L.), atacado por Delia antiqua, semilla del frijol
(Phaseolus vulgaris L.), atacada por Delia platura, el nabo (Brassica rapa L . )
por Delia f lora l i s y l a co l (Brass i ca o l earacea ) atacada por Delia radicum; en general
los daños causados son en raíces de plántulas y semillas en germinación ya
que estas moscas ovipositan en el suelo y en este se desarrollan sus larvas
(Gouinguene y Stadler 2005).
Contenido del Capítulo Generalidades ¿Por qué estudiar los nematodos como posibles controladores biológicos de Delia platura?
Ciclo de vida de Delia Platura
Nematodos entomopatógenos Experiencias con Delia platura y Nematodos entomopatógenos colombianos.
Resultados Conclusiones Recomendaciones Referencias Bibliográficas
á á
¿Por qué estudiar los nematodos como posibles controladores biológicos de Delia platura?
tercer instar larval de Delia platura a cinco dosis del
mejor aislamiento y se evaluó la capacidad de re-
producción en las larvas.
Heterorhabditis bacteriophora HNI0100, Steinernema
colombiense SNI0198 y Steinernema websteri JCL006 y
posteriormente se compara la susceptibilidad del
En Colombia en el municipio de Cota, los
cultivos de espinaca Spinacia oleracea L., presentan
pérdidas por los daños de Delia platura. El daño
consiste en la destrucción del tallo, la raíz de la
plántula y el punto de crecimiento de la planta
cuando esta próxima a la cosecha. Los productores
realizan hasta 6 aplicaciones de plaguicidas en un
ciclo de cultivo de tan solo 60 días (Gil et al. 2007).
La mayoría de los plaguicidas utilizados son de alto
espectro como los organofosforados, organosulfu-
rados y piretroides por lo que eliminan indiscrimi-
nadamente insectos plaga y benéficos; además, el
uso inapropiado y frecuente de estos productos
genera problemas en la salud de los productores,
consumidores, daños ambientales y altos costos de
producción (Gil et al. 2007).
Delia platura se ha reportado también como
plaga de cultivos de remolacha (Beta vulgaris), alca-
chofa (Cynara scolymus), col de Bruselas (Brassica ole-
racea var. gemmifera), repollo (Brassica oleracea var.
viridis), melón (Cucumis melo), zanahoria (Daucus
carota), coliflor (Brassica oleracea var. botrytis), maíz
(Zea mays), pepino (Cucumis sativus), ajo (Allium sati-
vum), lechuga rizada (Lactuca sativa), habas (Vicia
faba), mostaza (Sinapis), cebolla (Allium cepa), arveja
(Pisum sativum), calabaza (Cucurbita), nabo (Brassica
rapa), habichuela (Judiaphaseolus vulgaris), espinacas
(Spinacia oleracea), papa (Solanum tuberosum) y tomate
(Solanum lycopers) (Capinera 2001).
Una de las alternativas para el control de D.
platura, es la implementación del control biológico,
ya que utiliza entre otras alternativas los NE para el
control de insectos plaga (Chen et al. 2003). Las
especies de las familias Steinernematidae y Hete-
rorhabditidae tienen atributos de patógenos por
que tienen quimiorreceptores que les facilita la
búsqueda del huésped (Kaya & Gaugler, 1993 en
Lacey et al. 2001), su asociación con bacterias mu-
tualistas de los géneros Xenorhabdus
( S t e i n e r n e m a t i d a e ) y P h o t o r h a b d u s
(Heterorhabditidae), hace que este complejo nema-
todo-bacteria sea altamente virulento matando a su
huésped en aproximadamente 48 horas (Lacey et al.
2001).
Al aplicar NE para el control de plagas cuyas
etapas larvales se desarrollan en el suelo, se puede
lograr un control efectivo de estas ya que el suelo
es el hábitat natural de los NE (Georgis y Manwei-
ler 1994; Koppenhober 2000 en (Lacey et al. 2001).
Los NE a diferencia de otros controladores bio-
lógicos, se reproducen masivamente, ya que de un
solo hospedero pueden emerger miles de JI y pue-
den persistir por largo tiempo en el suelo, contro-
lando de una forma continua las plagas (Fenton et
al. 2001).
Otras ventajas de utilización de los NE en el
control de plagas es que pueden ser aplicados me-
diante los mismos sistemas utilizados para plaguici-
á
El ciclo completo de Delia platura puede durar
de 15 a 77 días, normalmente en el trópico dura
alrededor de 22 días, el ciclo es más largo en zonas
templadas ya que la larva crece en verano y la pupa
entra en diapausa en invierno, el número de
generaciones por año es incierto ya que esto depende de si la
población entra en diapausa o no y de variables
ambientales (Capinera 2001).
Los huevos son elongados y ovoides de color
perla blanco, miden aproximadamente 0.99mm,
teniendo un rango entre los 0.90-0.95mm de largo
y 0.30mm de ancho,
por lo general los
huevos son puestos
individualmente o
máximo en grupos de
10 en la superficie del
suelo. La ovoposición
se da a temperaturas
entre los 10-27 ºC,
los sitos favoritos de
ovoposición son semillas en germinación o en
descomposición, también en material vegetal en
descomposición y fertilizantes orgánicos; la etapa
de huevo dura dependiendo de la temperatura ya
que entre los 15-28 ºC este eclosiona a los 2 o 3
días, mientras que a temperaturas de 5-7 ºC la
eclosión puede darse entre los 7 a 9 días (Capinera
2001).La larva es blanca y presenta tres instares, inicialmente
mide 0.7mm y 7mm al finalizar el tercer instar (Fig.
1a). Estas larvas se alimentan de forma gregaria, el
primer instar no puede dañar las plantas sanas, tan
sólo ataca las que están recién cortadas o con
heridas, por ejemplo en cortes de semillas de papa,
las larvas se alimentan y crecen mejor si él sustrato
está en proceso de descomposición, la rapidez del
crecimiento de la larva depende de la temperatura,
21-30 ºC es la temperatura óptima. Bajo estas
condiciones el primer instar dura 1-3 días, el
segundo 3-5 días y el tercer instar de 5-16 días
(Capinera 2001).
La pupa es ovalada y rojiza, antes de emerger
el adulto se torna café oscuro, esta puede medir de
4-5mm de largo y 1.5mm de ancho (Fig. 1b), la larva
en prepupa baja al suelo y en este, pasa a pupa, esto
ocurre a menudo en el lugar de alimentación o las
larvas se entierran en el sustrato del cual se están
alimentando y pupan. El periodo de pupa dura
aproximadamente 7-14 días a una temperatura de
18-24 ºC (Capinera 2001).
Ciclo de vida de Delia platura
Figura 1. Estados de desarrollo de Delia platura. a) Larva de tercer instar.
b) Pupa. c) Macho. d) Hembra.
das, por lo que no se generan costos extras por los
sistemas de aplicación (Shapiro-Ilan, et al. 2005).
El uso de los NE contribuye a la disminución en el
manejo con plaguicidas y por ende a la reducción
de la contaminación generada por estos, ya sea
rectamente al ambiente, a los productores y/o a las
personas que consumen residuos (trazas) de estos
en los alimentos que se producen bajo esta
modalidad de agricultura (Chen, et al. 2003).
género de NE se observo una mortalidad del 40%
al 60%, utilizando entre 50 y 250 JI por larva a una
temperatura de 18-20°C (Nielsen 2003).
Igualmente, se han registrado mortalidades de 70%
en experimentos realizados sobre larvas de tercer
instar de Delia radicum utilizando el NE Steinernema
feltiae mientras que con otras especies del mismo
á á
Experiencias con Delia platura y Nematodos entomopatógenos colombianos.
Cría de Delia platura: Se colectaron adultos
de Delia platura en cultivos de espinaca de 15 días
de edad en la Finca Sede Roso, vereda Roso, en el
municipio de Cota Cundinamarca, con el fin de
iniciar una cría de larvas. Para esto se utilizaron 20
botellas de plástico de 1.5 L de ca-
pacidad, con masato de arroz en fermento (3cm3/
botella) como atrayente, las botellas se colocaron
5 por surco, cada 15 metros entre si y dejando 5
surcos de por medio entre cada línea de botellas
(Fig. 3 a). Los adultos capturados se expusieron a
tubérculos de papa criolla (Solanum phureja) cortados
a la mitad, colocando la parte expuesta por el corte
hacia abajo sobre cuadros de icopor de 1cm3, esto
dentro de bandejas medianas plásticas en cuya base
se coloco arena estéril, el montaje se dejo por 8
días para que las hembras ovipositaran y se des-
arrollaran las larvas. La cría se mantuvo a una tem-
peratura de 20 ± 2ºC, humedad relativa de 75 ±
2%, 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (Fig. 3
b), como lo recomienda Jiménez et al. (2010).
Obtención de ne-
matodos entomo-
patógenos: Heteror-
habditis sp. SL0708
fue suministrado por
el laboratorio de
Control Biológico
de la Pontificia
Universidad Javeria-
na, Heterorhabditis
bacteriophora HNI0100,
Steinernema colombien-
se SNI0198 y Steiner-
n e m a w e b s t e r i k
JCL006, fueron obtenidos por el acuerdo 182 con
cenicafe. Las especies mencionadas fueron aisladas
de diferentes lugres y condiciones ambientales
(Tabla 1).
Figura 3. Obtención de estados de desarrollo de Delia platura (Meigen, 1826) a) Trampas para colecta de adultos. b) cría de larvas.
A
B
Prueba de patogenicidad: 15 larvas del tercer
instar larval de Delia platura fueron individualizadas en
vasos plásticos de 1fl.Oz de capacidad con papel
filtro esterilizado y 5g de papa criolla para que la
larva se alimentara. Luego se aplico una dosis de
2500 JI/larva en cada unidad experimental (Fig. 4
a). Las unidades experimentales se mantuvieron a
20 ± 2ºC, 70% de humedad y en oscuridad (Fig. 4
b). Este ensayo se realizo dos veces para un total
de 30 larvas por tratamiento. Se r ea l i z a ron
observaciones hasta los 8 días después de la
infección (DDI) y se registro el número de larvas
muertas y los síntomas diariamente. Las larvas muertas
se disectaron y observaron en un estereomicroscopio
con el fin de corroborar la presencia de diferentes
estados de desarrollo de NE.
Dosis de nematodos entomopatógenos:
15 Larvas fueron individualizadas en vasos plásticos de
1fl.Oz con papel filtro estéril y 5g de papa criolla
(Fig. 4 a). Las dosis 600, 1200, 2500, 5000 y 7500
JI/larva, se evaluaron de acuerdo al trabajo realizado
por Nielsen (2003) quien utilizo dosis similares
sobre Delia radicum, se aplicaron en las unidades
experimentales y se mantuvieron a la misma
temperatura y humedad relativa que el primer
bioensayo (Fig. 4 b). Este ensayo se realizo dos
veces para un total de 30 larvas por tratamiento. Se
realizaron observaciones hasta los 8 días después
de la infección (DDI) y se registro el número de
larvas muertas. Las larvas muertas se disectaron y
observaron en un estereomicroscopio con el fin de
corroborar la presencia de diferentes estados de
desarrollo de NE.
Diseño experimental y análisis estadístico: Los
bioensayos se organizaron en un diseño completamente
al azar (DCA). Se realizó una ANOVA para cada
bioensayo y posteriormente una prueba de compa-
ración múltiple de Tukey con el programa Statistix
8.0.
á
Especie Cepa Localidad Altura
(m) Tipo de suelo pH Vegetación
Steinernema websteri JCL006
Naranjal
Chinchiná
Caldas
1381
Unid Chinchina (Melanudans) Cenizas volcánicas
3,9-5,2 Bosque
Steinernema colombiense SNI0198
Maracay
Quimbaya
Quindío
1402
Unid Chinchina y Montenegro (Melanudans) Cenizas volcánicas
4,9 Café libre exposición
Heterorhabditis bacteriophora HNI0100
SL0708
Alcalá
Valle del Cauca
Franco arenoso 4,76 Guadual Heterorhabditis sp.
Tabla 1. Especies de nematodos entomopatógenos usados para los ensayos con Delia platura.
á á
Resultados
Figura 4. Evaluación de nematodos entomopatógenos en larvas de Delia platura a) Unidad experimental. b) Unidades experimentales en cámara para mantener las condiciones requeridas por los NE.
A B
Para el primer bioensayo Heterorhabditis bacte-
riophora HNI0100 presentó 46.6 % de mortalidad
sobre Delia platura, seguida de Heterorhabditis sp.
SL0708 con 36,6%, Steinernema websteri JCL006 con
20% y Steinernema colombiense SNI0198 con 16,6%
(Fig. 5). Se presentaron diferencias significativas
entre los tratamientos (F= 6,21; DF= 4; α= 0.05;
P= 0,0001) y el tratamiento con Heterorhabditis bac-
teriophora HNI0100 presento diferencias altamente
significativas. Estos resultados son opuestos a lo
reportado por Willmott et al. (2002), quien utili-
zando la misma especie de NE en dosis altas
(32000 JI/planta) no reportan mortalidad en Delia
radicum, bajo condiciones de campo. Igualmente
Chen et al. (2003), evalúan dosis de 1000JI/larva de
Heterorhabditis bacteriophora sobre Delia radicum, pero
no muestra efecto sobre las larvas, probablemente
debido a que es una dosis muy baja para que este
NE afecte las larvas de esta mosca, no obstante,
con la dosis de 2500JI/larva se alcanzó un porcen-
taje de mortalidad significativo para D. platura.
Por otro lado, las 2 especies del género Stei-
nernema presentaron los más bajos porcentajes de
mortalidad, esto coincide con el trabajo realizado
por Nielsen (2003) quien muestra que no todas las
especies de este género son efectivas en el control
de Delia radicum, ya que de 6 especies evaluadas,
solo Steinernema feltiae obtuvo una alta eficacia.
El tiempo de mortalidad muestra que la ma-
yor cantidad de larvas muertas por Heterorhabditis
bacteriophora HNI0100 fue entre las 24 y 144 horas
después de la infección (HDI), para Heterorhabditi
sp. SL0708 entre las 24 y 196 HDI mientras que
para las larvas infectadas por Steinernema colombiense
SNI0198 fue entre las 72 y 120 HDI y 24 y 192
HDI por Steinernema websteri JCL006 (Fig. 6).
Los síntomas presentados en la coloración
del cadáver son típicos de la infección por NE
(Fig. 7), ya que las bacterias asociadas Xenorhabdus
(Steinernema) y Photorhabdus (Heterorhabditis), presen-
tan diferencias para absorber o no colorantes, lo
que le confiere una coloración distintiva a las larvas
muertas por alguno de los dos géneros de NE
(Sáenz 2005). Además con las disecciones se
observó diferencias en el número de estados de
desarrollo encontrados de acuerdo a la especie,
para Steinernema colombiense SNI0198 y Steinernema
websteri JCL006, el ciclo del NE no se completó,
debido a que sólo ingreso un JI, mientras con Heteror-
habditis bacteriophora HNI0100 y Heterorhabditis sp.
SL0708, el ciclo del NE se completó, encontrando
J4, adultos, J1.
Se observó en el transcurso del tiempo de
evaluación, un cambio de comportamiento de
aproximadamente el 15% de las larvas, ya que estas
se pegaban a las paredes o a la tapa del vaso plástico
y no se alimentaron (Fig 8).
Los resultados del ensayo de dosis presentaron
diferencias significativas entre los tratamientos (F=
5,23; DF= 5; α= 0.05; P= 0,0002) y la mejor dosis
correspondió a 7500 JI/larva de Heterorhabditis
bacteriophora HN0100 con una mortalidad de
62.25%, seguida de 5000 y 2500 JI/larva con 35%,
mientras 1200 y 600 JI/larva solo presentaron el
31% y 34,8% de mortalidad respectivamente (Fig. 9).
Estos resultados coinciden con lo reportado por
Chen, et al (2003) y Steiner 1996 en Willmott et al.
(2002), sin embargo, en el presente trabajo aunque
á
Figura 5. Porcentaje de mortalidad de larvas de tercer instar de Delia platura expuestas a cuatro especies de nematodos entomopatógenos.
las patas son de color negro, las alas no tienen marcas,
pero si una venación oscura (Fig. 1d). Los adultos
pueden medir entre 4-5 mm de longitud (Capinera 2001).
Los adultos son de color pardo grisáceo, el macho
tiende a tener rallas en el tórax y una en la mitad
del dorso (Fig. 1c). Las hembras carecen de rallas,
á á
Nematodos entomopatógenos Los NE son efectivos controladores biológicos
de insectos plaga del suelo, debido a que este es su
hábitat natural (Georgis y Manweiler 1994;
Koppenhober 2000 en Lacey et al. 2001). Teniendo
en cuenta esto, se consideran los géneros Steinernema
y Heterorhabditis de alto potencial en el control
de insectos plaga en la horticultura (Simons
1981; Kakouli-Duarte et al. 1997 en Chen et al.
2003).
Las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae
son buenos controladores de él gorgojo de la raíz
de los cítricos (Diaprepes abbreviatus L, Coleoptera:
curcullionidae), el gorgojo negro de la vid
(Otiorhynchus sulcatus F, Coleoptera: curcullionidae),
el gusano cortador negro (Agrotis ípsilon H,
Lepidoptera: Noctuidae) en viveros y arandanos
(Lacey et al. 2001). Algunas especies de
nematodos son más efectivas contra un
insecto o grupo de insectos en particular, por
ejemplo Steinernema kushidai es eficaz contra
larvas de escarabajos (Coleópteros) y no
muy efectivos contra larvas de mariposas y
polillas (Lepidópteros) (Mamiya 1989 en
Lacey et al. 2001), Steinernema scapterisci es
buen controlador de grillos topo
(Ortópteros), pero no es eficaz contra otros
grupos de insectos (Nguyen y Smart 1991 en
Lacey et al. 2001).
Los NE se encuentran generalmente
hasta los 5cm del suelo, los JI infectan larvas
de vida libre y hábitats crípticos; la infección
se presenta a través de espacios intersegmentales y
entradas naturales (ano, espiráculos y boca),
(Fenton, et al. 2001). Dentro del insecto los JI liberan
sus bacterias asociadas, se reproducen y digieren la
hemolinfa del insecto parasitado, causándole la
muerte en aproximadamente 48 horas, proporcionando
así el alimento para los NE (Fenton et al. 2001),
(Fig. 2). Los NE permanecen dentro del insecto
por dos o tres generaciones, esto depende del
tamaño del huésped y disponibilidad de nutrientes.
Posteriormente, los JI salen del hospedero y regresan a
su ambiente natural para infectar un nuevo huésped
(Fenton et al. 2001). Los NE de los géneros Steiner-
nema y Heterorhabditis tienen alto potencial para el
control de insectos plaga en la horticultura (Simons
Figura 2. Nematodos entomopatógenos en hemolinfa de
una larva de Galleria mellonella L.
Otra característica importante de los NE es
el comportamiento de forrajeo, que puede afectar
su eficacia si no se tiene en cuenta el comportamiento
de la plaga, ya que algunas especies de NE son
emboscadoras por lo que se mantienen inmóviles
en espera de que su huésped pase cerca para
adherirse e infectarlo, como Steinernema carpocapsae y
Steinernema scapterisci (Campbell y Gaugler 1993;
Lewis et al. 1993 en Lacey et al. 2001). Otras especies
como Steinernema glaseri y Heterorhabditis bacteriophora
son cruceros por lo que se mantienen en constante
búsqueda de su huésped por lo que son más
efectivos para el control de insectos con poca
movilidad en el suelo (Lacey et al. 2001). Pero
factores como la humedad del suelo y la textura del
mismo pueden influir en la movilidad de los JI, si la
humedad es baja o por el contrario muy alta, los JI
no se pueden desplazar fácilmente (Koppenhofer
et al 1995. en Koppenhofer y Fuzy 2006).
La eficacia de los NE depende de la especie y
cantidad (dosis) de JI aplicada, así como del estado
de desarrollo de la plaga (Nielsen 2003). El hospedero
también puede reducir la eficacia de los NE, debido
a que ha desarrollado estrategias como el aseo y la
evasión para evitar ser infectados, un ejemplo de
esto es el escarabajo japonés Popillia japónica, a l
rozar su cuerpo contra los sustratos u objetos para
limpiarse los NE (Gaugler et al. 1994. en Ennis et
al. 2010). Esto conlleva a un desgaste energético
por parte del hospedero ya que incluso reduce su
alimentación para evitar ser infectado. O t r o s
estudios con gorgojos del pino Hylobius abietis,
muestran que este responde a las cepas de NE más
virulentas que a las menos virulentas (Girling et al.
2010. en Ennis et al. 2010) Por otra parte, la
mayoría de los dípteros entre ellos los del género
Delia, tienen sus aberturas naturales muy reducidas
y una cabeza que se retrae en el protórax, lo que
puede disminuir la posibilidad de rutas de infección por
parte de los NE (Coaker y Finch 1971 en Willmott et
al. 2002).
Entre las especies de la familia Anthomyiidae,
el gusano de la col (Delia radicum) es en el que más
se han realizado estudios con NE, el nivel de control
obtenido con los NE ha sido variable y no muy
confiable desde el punto de vista comercial en
contraste con la efectividad de los plaguicidas
(Bélair et al. 2005). Las familias Steinernematidae y
Heterorhabditidae en dosis altas garantizan el
contacto de los NE con el huésped, por ejemplo
en una dosis de 40000 JI por planta se controlo
entre un 40% y 50% de las larvas de tercer instar
de Delia radicum, reduciendo significativamente la
cantidad de insectos luego de las aplicaciones
(Chen et al. 2003). Por otra parte la temperatura
adecuada para que los NE sean más efectivos en el
control del último estadio larval de Delia radicum
está entre los 15°C y 20°C (Chen et al. 2003).
Otros estudios sobre la susceptibilidad de
Delia radicum a NE muestran que en campo se
necesitan dosis muy altas (64000 JI/planta) para
obtener un control económicamente efectivo
(Simser 1992; Vanninen et al. 1999 en Willmott et
al. 2002). Un ejemplo de esto es el trabajo de
Welch y Briand (1961) quienes utilizaron dosis de
45000 JI de Steinernema carpocapsae por planta, por
su parte otros trabajos con especies de los géneros
Heterorhabditis y Steinernema en dosis de 30000 JI
por planta no obtuvieron ningún control sobre
Delia radicum, debido al uso de cepas no óptimas y
factores ambientales que pueden dificultar la infección
del hospedero (Steiner 1996 en Willmott et al. 2002).
á
tiene estrategias para limpiarse y de alimenta-
ción para reducir la posibilidad de ser parasita-
do Gaugler et al. (1994) en Ennis et al. (2010).
Otra razón en la diferencia en el tiempo de
muerte de las larvas, se puede atribuir a la morfología
de estas, el NE encuentra pocas rutas de acceso, es
el caso de los dípteros como lo menciona Coaker y
Finch 1971 en Willmott et al. (2002), esto podría
explicar por que Heterorhabditis bacteriophora
HNI0100 fue la especie que produjo más muertes
a las larvas de Delia platura, ya que si la larva no se
alimentaba o tenía sus entradas naturales cerradas
o reducidas evitó ser parasitada, Heterorhabditis
bacteriophora HNI0100 tiene una estrategia de forrajeo
la dosis de JI que produjo la mayor mortalidad es
alta, está a su vez es baja comparada con la aplicada
por Steiner (1996), y produce una mortalidad con-
siderable a las larvas de Delia platura.
El tiempo de mortalidad para las diferentes
dosis de JI de Heterorhabditis bacteriophora HNI0100,
muestra que todas las dosis tuvieron un tiempo
de mortalidad similar entre las 24 y 168 HDI, sin
embargo en este rango de tiempo, murieron más
larvas con la dosis de 7500 JI/larva (Fig. 10).
Fenton et al. (2001) y Sáenz (2005) plantean que
la muerte del hospedero infectado por NE se da
a las 48 HDI, no obstante, esto puede variar
por condiciones ambientales y/o que el hospedero
á á
Figura 6. Tiempo de mortalidad de Delia platura expuestas a cuatro especies de NE en una dosis de 2500 JI/larva.
de crucero para buscar su huésped y la posibilidad
de utilizar un diente para perforar la cutícula de su
huésped e infectarlo, mientras que los Steinerne-
matidos carecen de esta estructura (Sáenz 2005).
En general los resultados obtenidos en el
presente trabajo para Heterorhabditis bacteriophora
HNI0100 son positivos, teniendo en cuenta que
los dípteros no son el huésped por excelencia de
los NE (Bélair et al. 2005) y que la mayoría de
los trabajos realizados sobre dípteros utilizan
Steinernematidos con buenos resultados, como los
trabajos realizados por Harris et al. (1995) Jagdale et
al. (2004) y Simard (2006), entre otros.
á
Figura 7. Coloración en larvas afectadas por NE
a) Larva sana, b) Heterorhabditis bacteriophora
HNI0100, c) Heterorhabditis sp. SL0708, d) Steinerne-
ma colombiense SNI0198, e) Steinernema websteri
JCL006.
Figura 8. Larvas de tercer instar de Delia platura
evitando el contacto con los NE.
á á
Figura 9. Porcentaje de mortalidad de Delia platura expuestas a cinco dosis de JI de Heterorhabdi-tis bacteriophora HNI0100.
Figura 10. Tiempo de mortalidad de larvas de tercer instar de Delia platura expuestas a cinco dosis de JI de Heterorhabditis bacteriophora HNI0100.
á
Conclusiones y Recomendaciones Los NE colombianos de los géneros
Steinernema y Heterorhabditis si pueden infectar y matar las larvas de tercer instar de Delia platura y cumplen su ciclo de vida. Además,
Heterorhabditis bacteriophora HNI0100 fue la que mostro mejores resultados de mortalidad sobre larvas de tercer instar de Delia platura, con la dosis de 7500 JI/larva.
Se recomienda realizar la cría de Delia platura
sobre tubérculos de papa criolla, dada su facilidad
de consecución y palatabilidad para las larvas que
permiten el desarrollo del ciclo de vida completo
de la mosca.
Efectuar más estudios de susceptibilidad de
larvas de Delia platura con otras especies de NE.
Evaluar bioensayos para el control de la plaga
en cultivos de espinaca aplicando la mejor dosis de
Heterorhabditis bacteriophora HNI0100 en invernadero
y campo.
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á á
Control de la mosca de la semilla Delia platura con Steinernema sp3 JCL 027 en un cultivo comercial de espinaca
Introducción Introducción Control Biológico – Nematodos Entomopatógenos
Importancia del cultivo espinaca en Colombia
Cultivo y Manejo de la espinaca
Aspectos de la mosca de la semilla D. platura
Estudios con nematodos entompatógenos en Delia spp
Efecto de Steinernema sp3 sobre D. platura
Tiempo de aplicación de Steinernema sp3
Persistencia Steinernema sp3 Conclusión
Referencias Bibliográficas
Contenido del Capítulo
Carolina María Jaramillo1 y Adriana Sáenz Aponte2
Recientemente se han incorporado al estudio el uso de nemátodos entomopatògenos como una
alternativa para el control de diferentes especies de Delia spp (Nielsen 2003; Leger & Riga 2009; Celeita
2010). Ensayos en laboratorio han demostrado que diferentes dosis de Steinernema sp son eficientes en
un 40 a 60 % en el control de Delia radicum y Delia antiqua (especies hermanas de Delia platura). Sin
embargo, dicho control puede cambiar bajo condiciones de campo debido a que no siempre
se asegura un contacto entre el huésped y el enemigo natural. Bajo condiciones de laboratorio el contacto
entre el huésped y el enemigo natural es seguro debido a que las condiciones ambientales son óptimas y
no hay cambios comportamentales del hospedero que impidan ser parasitados (Nielsen 2003; Sáenz
2005).
1Estudiante. [email protected] 2 Profesor Asistente. Unidad de Ecología y Sistemática –UNESIS. Laboratorio de Control Biológico. [email protected] Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N°43-82, Edificio 54, Oficina 200. Bogotá, Colombia.
El municipio de Cota, Cundinamarca es el mayor productor de
espinaca (Spinacia oleracea L.) del país, produciendo anualmente 18 toneladas
por hectárea, que corresponde a más del 60% de la producción colombiana
(Agronet, 2008). La producción anual del municipio se ve afectada por
la mosca de la semilla, Delia platura, díptero de la familia Anthomyiidae
que afecta a más de 40 tipos de hortalizas (Capinera 2001; Valenciano et
al. 2004). Los principales daños están relacionados con la deformación de
las hojas durante la germinación y emergencia de las plántulas. Las larvas
destruyen el tallo y la raíz de la plántula cuando está próxima a la
cosecha, reduciendo la producción del cultivo entre 5 -30% por año
(Gouinguené & Städler 2006; Gil et al. 2007).
En Colombia aún prevalece el uso de productos químicos combinado
con prácticas orgánicas para el control de plagas y de enfermedades en
la espinaca (Gil et al. 2007; Niño et al. 2009). Diferentes métodos se han
propuesto para el control de Delia platura, los cuales están centrados en
la generación de nuevas variedades de Spinacea oleracea más resistentes,
aplicación de diferentes combinaciones de insecticidas, esterilización de
los adultos de Delia platura entre otros (Kim et al. 2001; Valenciano et al.
2004; Ellis & Scatcherd 2007).
El control biológico es hoy en día uno de
las componentes principales en la protección de
los cultivos en todo el mundo. De acuerdo a Sáenz
(2005) y Estrada (2008) se define como la acción
de los enemigos naturales que mantienen la población
de sus huéspedes a niveles bajos, los cuales se
incrementan en ausencia de los mismos. El
control biológico según Badii et al. (2010) se puede
entender de dos formas: como un fenómeno natural
donde todas las especies cuentan con enemigos
naturales que regulan sus poblaciones y como una
estrategia de control de plagas en la cual se
involucra la intervención del hombre para
incrementar la actividad de enemigos naturales.
Como estrategia de control de plagas los enemigos
naturales pueden entenderse como toda especie
(depredadores, parasitoides, entomopatógenos)
capaz de regular la densidad de población de una
plaga y mantenerla en niveles por debajo del
umbral económico (Sáenz 2005; Badii et al. 2010)
Dentro de los enemigos naturales más
promisorios para el control de plagas debido a su
alta resistencia a los agroquímicos y a las condiciones
ambientales adversas se encuentran los nemátodos
entomopatógenos (Sáenz 2005). Los nemátodos
entomopatógenos de las familias Steinernematidae
y Heterorhabditidae son patógenos obligados,
los cuales presentan relaciones mutualistas con
bacterias de la familia Enterorbacteriaceae del ge-
nero Xenorhabdus y Photorhabdus, transportadas por
vesículas en el intestino o en el tracto intestinal
del juvenil infectivo (Estrada 2008). Los juveniles
infectivos son el estadio libre (fuera del huésped) de
los nematodos, encargados de infectar diferentes
estadios de insectos huéspedes en el suelo. Se
caracterizan por no alimentarse y conserva la cutícula
del segundo estadio para protección del medio
ambiente (Sáenz 2005).
Los juveniles infectivos de los steinernematidos
están asociados a Xenorhabdus, bacterias facultativas
gran negativas, transportadas en una vesícula en la
parte anterior del intestino (Estrada 2008). Los
juveniles infectivos pueden ingresar a través de
cualquier abertura ya sea boca, ano y espiráculos.
Una vez que han ingresado al huésped la bacteria
se propaga produciendo sustancias toxicas, las
cuales causan septicemia y posterior muerte del
individuo (Nielsen 2003; Saenz 2005; Estrada 2008).
Los nematodos se desarrollan al interior del cadáver
alimentándose de los tejidos metabolizados por las
En un cultivo los hospederos desarrollan comportamientos
para reducir su descubrimiento y penetración de
los juveniles infectivos, como alta tasa de defecación
que impide la entrada del nemátodo por el ano,
baja tasa de CO2 minimizando las señales químicas,
reduciendo las posibilidades de contacto entre
hospedero y el enemigo natural (Sáenz 2005). La
información en Colombia sobre el manejo de
á á
enfermedades y plagas en espinaca es limitada.
Buscar nuevas alternativas para el control de Delia
platura es de gran importancia. En estudios de
laboratorio en la Universidad Javeriana se ha
demostrado que Heterorhabditis bacteriophora
HNI0100 genera un control de 68% y Steinernema
sp3 JCL 027 74% de control, haciendo posible su
uso como agentes de control para ser utilizados
Control Biológico – Nematodos Entomopatógenos
bacterias, en el caso de steinernematidos se re-
quiere la entrada de dos juveniles infectivos debi-
do a que su primera generación es sexual. De acuer-
do al recurso alimenticio se pueden desarrollar entre 1 a 3
generaciones de nematodos en un mismo huésped.
á
Una vez agotado el recurso emergen nuevos juve-
niles infectivos capaces de infectar nuevos indivi-
duos (Sáenz 2005; Estrada 2008).
Importancia del cultivo espinaca en Colombia.
En Colombia la
espinaca fue introducía
por lo colonos hace
aproximadamente 30
años, convirtiéndose en
una actividad económi-
ca importante para los
municipios hortícolas
(Jimenez & Gil 2008;
Morelock & Correll
2008). La espinaca es
cultivada en regiones de
clima frío a temperaturas
de 11° a 27°C donde se
destacan como principales
produc tores l o s
departamentos de
Cundinamarca con 9.532
ton anuales, seguido de
pequeñas áreas de siembra
los departamentos de
Antioquia 624 ton, Norte de Santander 303 ton
(Fig 1)(Agronet 2010).
La Sabana de Bogotá se destaca por ser el
mayor abastecedor local y regional de hortalizas
del país, debido a sus excelentes características
edafoclimaticas que permiten el establecimiento
de cultivos de alta calidad (Jimenez & Gil 2008).
Dentro de la producción hortícola de la Sabana,
la espinaca es uno de los cultivos
más importantes con 139.79 ha
sembradas anuales lo que
representa el 8.24% del país. Los
municipios reconocidos en la
región por la vocación hortícola
son Bojacá, Cajicá, Cota. Facatativa,
Funza, Madrid, Mosquera, Sibaté
y Soacha (DANE 2002; Chaverra
& Walteros 2004).
El cultivo de espinaca (Spinacia oleracea L.)
tiene una representación económica y social
importante para la región. En la Sabana el mayor
crecimiento lo presentan los municipios de Cota, se-
guido de Soacha y Chía (Fig 2). En el municipio de
Cota el cultivo de espinaca se ha convertido en su
F i g 1 . P r i n c i p a l e s departamentos productores de espinaca del país. Tomado de Agronet (2010).
Fig 2. Principales municipios productores de espinaca de la Sabana de Bogotá. Tomado de Agronet (20119
principal actividad agropecuaria de la cual
dependen más de 300 familias de productores
medianos y pequeños. Anualmente se siembran
140 ha con un rendimiento de 18ton/ha lo que
á á
corresponde a más del 77.8% de la producción del
país. La demanda al interior del país aumenta
volviéndolo un cultivo promisorio para el futuro
(Jimenez & Gil 2008).
Cultivo y Manejo de la espinaca. En Colombia la espinaca es cultivada en
regiones de clima frío a temperaturas de 11°
a 27°C, donde se destacan como principales
productores los departamentos de Cundinamarca
con 4.029 ton anuales (Jimenez & Gil 2008;
Morelock & Correll 2008). El cultivo de espinaca
(Spinacia oleracea L.) tiene una representación
económica y social importante en la Sabana de
Bogotá destacándose por ser el mayor abastecedor
local y regional de hortalizas del país. En la
Sabana el mayor crecimiento lo presenta el
municipio de Cota con 68%. En Cota, el cultivo
de espinaca se ha convertido en su principal
actividad agropecuaria de la cual dependen más de
300 familias de medianos y pequeños productores.
Anualmente s e s i embran 140 ha con un
rendimiento de 18ton/ha lo que corresponde a
más del 77.8% de la producción del país. La demanda
al interior del país aumenta volviéndolo un cultivo
promisorio para el futuro (Jiménez & Gil 2008).
El cultivo de espinaca se maneja con
métodos convencionales y alta mano de obra
debido a la falta de tecnificación. En Cota la
preparación del suelo se hace mediante arado
en disco y dos rastrillas para obtener terrenos
esponjosos, nivelados, al cual se le incorpora ma-
teria orgánica. Generalmente se aplica estiércol de
gallina (Gallinaza) como fuente orgánica de nitró-
geno, potasio y fosforo en dosis de 1 a 1.5 ton/
hectárea, ya que en climas fríos dichos nutrientes
son deficientes (Gil et al. 2007). Adicionalmente se
aplican fertilizantes foliares con alto contenido
de nitrógeno, favoreciendo en un 90% el porcentaje
foliar de cada planta de espinaca (CCI 2006).
Las semillas se siembra (18 kg/ ha), al
voleo en camas de 1.7m de ancho, separadas
cada una 25m, logrando así una densidad de 32
plantas /m2 es decir aproximadamente 400.000
plantas/ha (CCI 2006). La espinaca hibrida
sembrada en el municipio pertenece a la variedad
quinto, caracterizada por sus hojas lanceolada
grande de ciclo largo, su resistencia a mildeo raza
1-4 y su alto rendimiento en campo del cual se
pueden obtener 18 toneladas por hectárea anuales
(Gil et al. 2007).
En cuanto al control fitosanitario en el
municipio aún prevalece como principal méto-
do de manejo el uso de productos químicos
(79%), siendo los más usados los derivados de
organosulfurados (Tetradifon), Carbamatos
(Carbofuran), órganofosforados (clorpifidos,
Profenofos, metamidofos) y los piretroides
(Deltametrina) (Gil et al. 2007). Mientras que en un
18.55% combinan prácticas químicas /orgánicas
y sólo el 0.67% emplean prácticas orgánicas
(DANE 2002; CCI 2006; Agronet 2008).
Dichos insecticidas se aplican de manera
conjunta más de 6 veces en un cultivo de un ciclo
de 55 días. Al ser el método más utilizado, la
resistencia al insecticida por parte de la plaga ha ido
á
Mosca de la semilla Delia platura. Delia platura es una plaga importante con una
amplia distribución geográfica. Fue reportada por
primera vez en Estados Unidos distribuyéndose así
por todo el Sur –Norte de América y Europa
(Morelock & Correll 2008). La mosca de la
semilla es un díptero pequeño de la familia
Anthomyiidae. Cosmopolita que afecta a más de
40 plantas diferentes entre las cuales se encuentra
una gran variedad de hortalizas como espinaca,
alcachofa, remolacha, coles de brúcelas, repollo,
entre otras (Darvas & Szappanos 2003; Valenciano et
al. 2004). La larva de la mosca ataca durante la
germinación, reduciendo la emergencia de los
cotiledones, causando grandes pérdidas económicas a
los productores (Willmott et al. 2002; Gil et al. 2007).
El ciclo de vida de Delia platura esta
sincronizado con el periodo de siembra y
germinación de las plántulas de espinaca y puede
durar alrededor de 22 días. Las hembras (Fig 3a)
se ven atraídas por la materia orgánica y humedad
del suelo, ovipositando aproximadamente 100
huevos en el suelo cerca de las semillas recién
sembradas (Capinera 2001; Gouinguené & Städler
2006). Dependiendo de la temperatura se puede
demorar la eclosión. A temperaturas entre 5-7°
C la eclosión puede darse entre 7 a 9 días
mientras que a temperaturas de 15-28°C es de 2 a 3
días (Capinera 2001). Los huevos eclosionan y las
larvas penetran la testa cuando ésta se en-
cuentra dividida. A medida que las larvas (Fig
3b) minan, las raíces y tallos de la
planta presentan pudrición, la cual
viene acompañada de enfermedades
causadas por microorganismos del suelo
como hongos. Las plántulas se tornan
amarillas y mueren (Vea et al. 1975).
Mientras más largo sea el periodo
entre la siembra y germinación de las
plantas, mayor será la predisposición a
ataques severos. Ataques masivos in-
hiben por completo la germinación
(Valenciano et al. 2004).
Las larvas de D. platura presenta
tres instares, los cuales se pue-
den diferenciar dependiendo de su
cambiando con el tiempo, desarrollando resistencia al
insecticida. Al ser la plaga resistente a los productos
químicos, los agricultores se han visto en la obligación
de incrementar la dosis de aplicación y realizar
mezclas con más de dos insecticidas para una misma
aplicación (Valenciano et al. 2004; Ellis & Scat-
cherd 2006; Gil et al. 2007).
Fig. 3. Delia platura, Mosca de la semilla. A. Adulto B. Larva tercer
instar. C. Espiráculos caudales. D. pupa. Tomado de Capínera (2007)
longitud, presentando longitudes de 0.44, 0.80 a
1.24 mm respectivamente. Las larvas son blancas
y en la boca presentan ganchos negros (Capinera
2001). Detrás de la cabeza presentan espiráculos
parduscos (Fig 3c), divididos en aproximadamente
12 lóbulos. Las larvas se alimentan externamente e
á á
internamente de las raíces, tallos (1- 2 instar) y
cogollo (3 instar). Su desarrollo generalmente está
condicionado por las condiciones ambientales.
En condiciones de frio y cortos fotoperiodos
las larvas cortan el tiempo pasando a pupa (Fig
3d). En condiciones normales requieren de 18 a 22
Estudios con nematodos entompatógenos en Delia spp. Como una alternativa innovadora se han
incorporado a los estudios el uso de nemátodos
en tomopatógenos pa ra e l con t ro l de
diferentes especies de Delia spp, siendo la
especie más estudiadas D. radicum (plaga de cultivos
de Brassica). La susceptibilidad de Delia
radicum a nemátodos entomopatógenos
se ha estudiado desde 1989. Bracken
(1990) investigó la mortalidad de
larvas de p r imer in s t a r y
encontraron que las larvas son
susceptibles a medida que aumenta
el número de nemátodos pero la mortalidad no
excede del 40% en ninguna de las cepas estudiadas
(Steinernema sp & Heterorhabditis sp) (Nielsen 2003;
Leger & Riga 2009). Experimentos en campo con
larvas de primer instar en las cuales se les permitió
minar plantas de colinabo, la susceptibilidad a
nematodos entomopatógenos disminuyó
significativamente; de esta manera el éxito de los
estudios está dado por las condiciones experimen-
tales (Royer et al. 1996).
Estudios en cultivos de coliflor en el 2002
demostraron una vez más la susceptibilidad de D.
radicum a Steinernema sp y Herterorhabditis sp, sien-
do Steinernema affine la especie que ocasionó una
mortalidad de 46% en las larvas, seguido de S. feltiae,
contrario a las especies de Heterorhabditis sp las cuales
no generan ningún control (Wilmott et al. 2002).
En el 2003 se estudió la susceptibilidad de D.
radicum en todos sus estadios larvales a
especies de nematodos entomopatógenos del
género Steinernema sp del cual se
concluyó que la especie más eficiente
(46%) en el control de la plaga fue
S. feltiae, debido a la capacidad de
búsqueda que tiene el nematodo
(Nielsen 2003). Encontrando que en
el tercer instar larval es donde S.
feltiae ocasiona una mayor mortalidad (60%)
el tercer instar , debido al tamaño de la larva,
facilitando la entrada del nematodo y (Nielsen
2003).
Leger en el 2009, comprobó dichos resultados
en un cultivo de repollo en invernadero
determinando que la concentración óptima es de
invernadero las cuales se ven favorecidas con la
apli300 juveniles infectivos/larva para que se presente
un 30% de mortalidad bajo condiciones de cación de
extractos de caléndula , aumentando la mortalidad
en un 96%. Estudios recientes con D. platura
demostraron que las larvas de tercer instar son
susceptibles a Heterorhabditis bacteriophora HNI0100
en un 63% y a Steinernema sp3 JCL 027 en un 74%
Todos los estadíos larvales de D. radicum son susceptibles a S. feltiae, debido a la capacidad
de búsqueda que tiene el nematodo (Nielsen 2003).
á
Durante los meses de febrero – Abril se
llevó a cabo la aplicación de Steinernema sp3
JCL027, en la finca Alcalá Cota, Cundinamarca. El
lote de estudio de 0.5 ha (Fig 4), ubicado
a una altura de 2578 ± 7 m.s.n.m, se di-
vidió en camas de 1.7m de acho, en
los cuales se sembraron 18kg de
espinaca variedad Quinto por me-
tro cuadrado. Las plantas fueron
inoculadas con 500, 1000, 2000,
4000 y 8000 JIs/planta. Para cada
aplicación se utilizaron juveniles infectivos
de una semana de cosechados, los cuales
se obtuvieron mediante el cultivo in vivo de
Steinernema sp3 JCL027 utilizando la polilla mayor de
las colmenas Galleria mellonella (Fig 5). Así mismo se
tuvo en cuenta dos controles:
un absoluto (agua) y un relativo
(con insecticida usado por el
agricultor, Monitor, insecticida
de amplio espectro usado más
de tres veces en el cultivo). Para
un total de siete tratamientos
con 15 plantas cada uno, organizados
en un diseño de bloques al
azar.
La aplicación de Steinernema sp3
JCL027 durante todo el ciclo del
cultivo disminuye notoriamente
los daños de D. platura en las
plantas superando el control
químico (Fig 6). Los daños más altos
(67%) se encontraron
en el control
químico, el cual
se comporta
Efecto de Steinernema sp3 JCL027 sobre Delia platura
Fig. 4. Lote de estudio en la finca Alcalá, Cota, Cundinamarca.
Fig. 5. Cultivo in vivo
de Steinernema sp3 JCL027.
A. Trampas White modificadas
obtención de JIs B. larvas Galleria
mellonella infectadas con Steinernema sp3 JCL027.
de manera similar que el control con agua, debido
a que no hay un control significativo de la plaga
que reduzca los daños en un 40 a 50%. Willmont
et al. (2002) y Valenciano et al. (2004) atribuyen
este fenómeno probablemente a la resistencia que
ha generado la plaga al uso continuo de químicos
para su control. Al ser la plaga resistente a los
productos químicos, los agricultores se han visto
en la obligación de aumentar la dosis de aplicación e
inclusive utilizar productos de amplio espectro no
específicos para D. platura, con el fin de obtener al
menos un control mínimo (< 30%) de la plaga
(Valenciano et al. 2004; Ellis and Scatcherd 2007).
Contrario a lo que sucede con la aplicación
de nematodos entomopatógenos, Steinernema sp3
JCL027 (Fig 6). A partir de las dosis de 4000 y
8000 JIs /planta durante las tres aplicaciones, se
observa una reducción del 40-50% de los daños
á á
nuevos. Las plantas no presentaron daños en el
cogollo, son más frondosas, grandes y sus raíces
se encuentran completamente sanas. Comparado
con dosis inferiores a 2000JIs/planta donde la
reducción nueva es similar al control químico, las
plantas son pequeñas y presentan una reducción
en las hojas.
Un éxito limitado se ha logrado con los
nematodos entomopatógenos, para el control de pla-
gas en campo, debido a la temperatura del suelo,
actividad del nematodo e invasión del huésped
(Steiner, 1996). Por ello Estudios de susceptibili-
dad en poblaciones de Delia spp, sugieren usar
dosis altas de juveniles infectivos, para encontrar
un grado de éxito (≥30%) en el control de la plaga
(Simser, 1992). Willmont et al. (2002) sugieren con-
centraciones iguales o superiores a 1.6X104 JIs/
planta para lograr un control significativo de la
Fig. 6. Daños ocasionados por D. platura en la espinaca en cada una de los tratamientos durante las
tres etapas fenológicas del cultivo (Error estándar para la diferencia entre tratamientos).
plaga. En estudios recientes con Steinernema
feltiae sugieren concentraciones de 30.000JIs /
planta, reduciendo en 30% la plaga en el cultivo
(Leger y Riga, 2009). Sin embargo, aplicando
4000JIs/planta (=30JIs/cm2) y 8000 JIs/planta
(=60JIs/cm2) de Steinernema sp3 JCL 027, la re-
ducción de los daños es significativa (40 – 50%).
Dicho control puede estar explicado por la alta
patogenicidad, capacidad de búsqueda de los ne-
matodos pero en especial, por su adaptación a
las condiciones del suelo como textura y hume-
dad, relevantes para su supervivencia (Simser,
1992; Chen et al. 2003). Factores como la hume-
dad, se mantuvieron durante todo el ciclo del
cultivo, debido al riego y lluvias periódicas que
facilitaron la adaptación de Steinernema sp3 JCL 027
en el suelo y el éxito de los mismos.
á
Estudios de susceptibilidad en poblacio-
nes de Delia spp llevados a cabo en campo,
no tienen en cuenta las etapas fenológicas para
la aplicación de los nematodos (Simser, 1992; Chen
et al. 2003). Por ello, sugieren llevar a cabo dos
aplicaciones continuas de acuerdo a la detección
de plaga (Choo et al, 1988; Chen et al. 2003), para
encontrar un éxito del 30% (Chen et al. 2003).
Contrario a la mayoría de los estudios, en este
se tuvo en cuenta las etapas fenológicas para la
aplicación del nematodo entomopatógeno, Steinernema
sp3 JCL027. Para
ello se dividió el
cultivo de espina-
ca en tres etapas
siguiendo la escala
BBCH (código unifor-
me de estados de creci-
miento), propuesto
por Gil et al. (2007)
(Fig 7). La pri-
mera, germina-
ción: comprendió
desde la siembra
hasta tres hojas verdaderas (00-13 BBCH). La
segunda, desarrollo: desde la aparición de 4 hojas
verdaderas hasta el desarrollado de la roseta
foliar en un 70% de diámetro esperado (14-37
BBCH). La tercera, cosecha: comprendió desarrollo
de la roseta foliar con 70% de diámetro hasta su
desarrollo completo (38-39 BBCH). En cada una de
las etapas se aplicaron las dosis de los juveniles
infectivos.
Desde la primera aplicación con Steinernema
sp3 JCL027, se logró reducir entre un 40- 50% los
Tiempo de aplicación de Steinernema sp3 JCL027
Fig. 7. Etapas fenológicas del cultivo de espinaca. A. Etapa 1: Germinación (00-13
BBCH). B. Etapa 2: Desarrollo (14-37 BBCH). C. Etapa 3: Cosecha (38-39
daños en las plantas (Fig 8); siendo en la primera
y última etapa donde más se presentó la plaga,
encontrando de 1 a 2 individuos por planta. La
presencia de D. platura durante las tres etapas fue
completamente diferente, presentándose daños
distintivos en cada una de ellas. Durante la etapa
de germinación (Fig 9,10) las plantas presentaron
un tamaño relativamente pequeño en el cual los
individuos de D. platura no se encontraron en la
superficie de la planta (cogollo – hojas) sino en su
interior (raíz – tallo); siendo imposible llevar un
registro del número de individuos por plántulas. Sin embargo
se observaron plantas relativamente pequeñas con
ausencia de brotes (Fig 9d), reducción del número
de hojas verdaderas (Fig 9b) y deterioro en el
cogollo (Fig 9a), presentando un crecimiento lento
(Fig 9d).
á á
En la segunda etapa desarrollo (Fig 11,12) las
plantas presentaban de 1 a 3 adultos/planta. Se
observaron plantas muertas (Fig 11c), plantas con
un número reducido de hojas verdaderas (Fig 11b),
tamaños pequeños, presentando crecimiento lento
(Fig 11a). En la última etapa cosecha (Fig 13), las
plantas ya presentaban el 70% de su roseta fo-
liar desarrollada (Fig 14), encontrándose de 1 a
2 larvas tercer instar (Fig 13e) y pupas en los
cogollos y suelo de las plántulas, ratificando la
presencia de D. platura en campo. Al finalizar se
observaron plantas con el cogollo deteriorado (Fig
13a, b), las raíces de la mayoría de plantas minadas
(1 mina/planta)(Fig 13f), reducción en las hojas
verdaderas y longitud relativamente pequeña. La
reducción en las hojas verdaderas es un daño
característico de D. platura, las cuales al comparar
Fig. 8. Daños ocasionados por D. platura en la espinaca en cada una de los tratamientos durante las
tres etapas fenológicas del cultivo, después de las tres aplicaciones de Steinernema sp3 JCL027 (Error están-
con plántulas sanas (mayor de 20 hojas),
se observó que presentaban menos de
diez hojas verdaderas viables en dosis de
Steinernema sp3 JCL027donde la reducción
en los daños no fue significativa.
La presencia de los daños oca-
sionados por D. platura durante las
tres etapas fenológicas del cultivo fue
completamente diferente. Gil et al. (2007)
atribuye este fenómeno a la estimulación
en la oviposición al tener contacto con la gallinaza.
La oviposición de D. platura está influenciada por
la acción de microorganismos involucra-
dos en procesos de descomposición y se
estimula con la aplicación de fertilizantes
orgánicos (Goldstein and Bassler, 1988;
Gounguené and Ständler, 2006). Al inicio
del cultivo, la incorporación al suelo de
gallinaza en altas cantidades permitió el
establecimiento de la plaga durante la etapa de
germinación. En la segunda etapa (desarrollo), la
remoción del suelo es un proceso característico
durante la deshierba; dicho movimiento genera
un estímulo atractivo en las moscas para la oviposición
de los huevos en el suelo con o sin la presencia de
la planta (Goldstein, 1987), permitiendo la alta
persistencia de la plaga durante la etapa
cosecha.
La etapa fenológica de desarrollo de las hojas
(segunda etapa) es fundamental para la recuperación
de los daños, debido a la mínima presencia de D.
platura. En ataques bajos (un individuo /
planta) de D. platura las plantas pueden
recuperarse por completo del ataque (Capinera,
2001). Funderburk and Pedigo (1983) encontraron
á
Figura 9. Daños presentes en las espinacas durante la etapa de germinación. A. Cogollo deteriorado. B. Ausencia hojas ver-daderas. C. Ausencia brotes. D. no crecimiento de las plántulas
Figura 10. Planta de espinaca con cinco hojas verdaderas, brotes nuevos, cogollo sano
á á
Figura 12. Planta de espinaca con más de 10 hojas verdaderas, brotes nuevos y cogollo sano.
Figura 11. Daños presentes en las espinacas durante la etapa desa-rrollo. A y B. Plantas recuperadas. C. Planta muerta. D. Cogollo deteriorado
Figura 13. Daños en las espinacas durante la etapa de cosecha. a.b.c.d. Daño en el cogollo. e. Larva dañando el cogollo. f. Raíz minada
Figura 14. Planta de espinaca con más de 20 hojas verdaderas, cogollo sano y brotes nuevo.
á
Fig. 15. Proceso de recuperación de las plantas de espinaca. A y B. plantas con daño apical durante la etapa de germinación. C. plantas recuperadas, desarrollo lateral. D. resultado de las plantas durante la etapa de cosecha. E. plantas recuperadas. f. plantas sanas.
que las plantas de frijol se recuperaban a ataques de
D. platura, disminuyendo el número de vainas por
planta e incrementando el número de granos en
las mismas. Las plantas de espinaca se recuperan
del daño, reduciendo el número de brotes e
inhibiendo el crecimiento apical, pero desarrollan
el crecimiento lateral de sus hojas verdaderas
(Goldstein and Hess, 1984; Nielsen and Orcutt
2000). Al desarrollar el crecimiento lateral, el número
de hojas verdaderas se mantiene y su longitud es
relativamente inferior a 30cm debido a que no hay
desarrollo de brotes (Retuerto et al. 2003). Son
á á
plantas que mantienen durante la segunda etapa
hasta la cosecha, el mismo número de hojas y su
tamaño es pequeño a lo que se espera de una planta
sana (Fig 15)
Persistencia Steinernema sp3 JCL 027 en el Cultivo. Muchos factores abióticos pueden afectar
la ocurrencia y la persistencia de los nematodos,
tales como factores naturales y químicos, los cuales
resultan de las actividades humanas (Stuart et al.
2006). Estudios en campo evidencian que la
mayoría de los nematodos recuperados del suelo
se reducen rápidamente en un periodo corto de
aplicación (Griffin et al. 2005). Después de las tres
aplicaciones de Steinernema sp3 JCL027 al cultivo
de espinaca, se logra encontrar el 10 al 20% de
las dosis totales. Encontrando que el número de
juveniles infectivos varía de acuerdo a las dosis
aplicadas. A partir de las dosis de 4000 y 8000
JIs/planta, se recuperan del suelo en promedio
de 800 a 1600 JIs/ planta. En dosis inferiores a
2000 JIs/planta, el número de juveniles infectivos
es menor (50 a 100 JIs/planta).
El hecho no de no encontrar más del 20%
de JI en el sustrato, se debe al ambiente hostil del
sustrato en el cual los juveniles infectivos llegan a
experimentar condiciones de estrés como
deshidratación, depredación, enfermedades entre
otras (Griffin et al. 2005). La textura y la humedad
del suelo juegan un papel importante en la persistencia
de los Juveniles infectivos en el cultivo. Por un
lado, la textura del suelo determina en gran medida
el movimiento del agua, aire y presencia del
organismo (Stuart et al. 2006). En el caso de los
NEPs el movimiento esta limitado por el tamaño
del poro, en suelos con poros restrictivos (suelos
pesados, muy compactos) el movimiento es más
restringido que en suelos con una estructura más
porosa, como la incorporación de materia orgánica
al suelo (Kung et al. 1990; Barbercheck 1992). Sin duda
la humedad es el factor más crítico que afecta a los
nematodos en el suelo. Los NEPs requieren
películas de agua de un espesor suficiente y
continuidad para permitir el movimiento
(Shapiro Ilan et al. 2002). En suelos muy húmedos o
saturados el oxígeno puede limitar el movimiento
y los nematodos se pueden restringir debido a la
falta de tensión superficial, afectando la virulencia de
los nematodos (Shapiro et al. 2000; Shapiro Ilan et
al. 2002; Stuart et al. 2006).
En la agricultura la condición de la superficie
después de la aplicación y la intensidad de labranza,
entendida como la remoción del suelo, son factores
influyentes para la persistencia de los JI en campo
(Gaugler et al. 1997; Susurluk and Ehlers 2008).
La labranza es perjudicial tanto para el medio
ambiente del suelo como para la persistencia de los
NEPs. Bajo labranzas continuas, la superficie del
suelo tiende a tener mayor fluctuación en la
temperatura y humedad (Stinner et al. 1988). Los
nemátodos a menudo son más frecuentes en los
regímenes de menos labranza debido a que las
condiciones del suelo se mantienen estables en
cuanto a humedad y temperatura (Susurluk and
Ehlers 2008). La actividad de labranza más utilizada
en los cultivos de espinaca es el deshierbe durante
la segunda etapa fenológica, en el cual se genera
una gran remoción de tierra lo cual pudo influir
en la persistencia de los nematodos al finalizar el
estudio.
á
Conclusión Con la creciente preocupación ambiental
sobre el uso de agroquímicos, los nematodos
entomopatógenos son agentes de control alternativo.
El uso de Steinernema sp3 JCL 027 es una alternativa
innovadora para control de Delia platura, reduce
los daños en las plantas de espinaca a un nivel aceptable
para los productores de Cota, Cundinamarca.
Además, permitiría diseñar estrategias de manejo
integrado efectivas en campo que posiblemente
disminuirían la aplicación de agroquímicos; igualmente
estimularía a los agricultores a incrementar el
empleo de controladores biológicos y el uso
racional y seguro de productos químicos en los
cultivos de espinaca .
Los retos en el cultivo de espinaca son diversos,
esto incluye estudios más detallados sobre el
control que ejerce Steinernema sp3 JCL027 en campo,
métodos de aplicación del nematodo, probar otras
especies de nematodos que tengan potencial para
el control de la mosca de la semilla y puedan ser
aplicados en mezcla con Steinernema sp3 JCL027,
mejorando así la eficiencia del control, evaluar los
costó de la utilización de nematodos entomopatógenos
en el cultivo. Así mismo, realizar trabajos con los
agricultores de espinaca para incentivar la utilización
de este agente controlador y diseñar un plan de
manejo integrado para el control de D. platura en
Colombia.
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á
Control del picudo de la guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae) con nematodos entomopatógenos en Colombia.
Introducción
Introducción
El cultivo de guayaba
El Picudo de la Guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae)
Control del Picudo de la Guayaba
Referencias Bibliográficas
Contenido del Capítulo
Delgado-Ochica, C. 1 y Adriana Sáenz Aponte2
Entre las investigaciones realizadas sobre el conocimiento del picudo de la guayaba, presentes en los
cultivos en Suramérica se destacan los trabajos de Monrroy e Insuasty (2006) en el que describen su ciclo
de vida en Barbosa-Santander; Boscán y Cásares (1980) quienes evaluaron los daños del picudo en
Venezuela y en 1981, determinaron las épocas del año en que se encuentran las diferentes fases del insecto
en el campo. Brito et al. (2008) probaron la aplicación de aceites vegetales, imidaclopril con Beauveria bassia-
na y Metarhizium anisopliae. Del Valle et al. (2005, 2008) y Dolinski et al. (2007), evaluaron la eficacia de
los nematodos entomopatógenos sobre el picudo bajo laboratorio, invernadero y campo en Brasil,
con porcentajes de mortalidad entre 70-95%. Aunque se ha demostrado la alta eficacia de nematodos entomopatógenos
para el control del cuarto instar larval del picudo por encontrarse en el suelo, este tipo de estudios no se
1Estudiante. 2 Profesor Asistente. Unidad de Ecología y Sistemática –UNESIS. Laboratorio de Control Biológico. [email protected] Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N°43-82, Edificio 54, Oficina 200. Bogotá, Colombia.
El cultivo del guayabo en Colombia se conoce como cultivo de
potrero, barranco, de camino o de patio casero, en la cual no se ha aplicado
tecnología alguna en el 90% de los casos. En el país hay sembradas 79.423
ha de guayaba entre árboles en sistema disperso, mixto, solo e intercalado
(Mapamir, 2003). La mano de obra ocupada en la recolección y empaque
de la guayaba en Colombia se estima en 1’140.000 jornales/año, donde
participan más de 9.000 familias y generan una producción cuyo valor
anual se puede estimar entre U$14 a U$20 millones (Anónimo 2006).
El picudo de la guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera:
Curculionidae) es la principal plaga del cultivo en la región de Santander,
el cual ha venido ocasionando pérdidas de hasta el 80% de la producción
desde el 2007 (Com. Personal. Hernández y Pinzón, 2011). El daño lo
ocasionan las larvas al alimentarse de las semillas y la pulpa produciendo
un ennegrecimiento y endurecimiento de la parte afectada. Las excretas de
la larva en el interior de la guayaba ocasionan petrificación del fruto,
maduración prematura y caída del mismo (Insuasty et al. 2007). El daño
hace al fruto inservible para cualquier forma de consumo ó utilización.
Actualmente esta plaga parece estar fuera de control en el área guayabera
Santandereana.
han realizado en el país, ni se han evaluado las
especies o cepas de nematodos entomopatógenos
disponibles en Colombia para el control de ésta
plaga.
El control biológico es una herramienta que
está siendo utilizada para el control de organismos
plagas como una opción de bajo impacto ambiental
(Alomar y Albajes 2005, Nichols-Estrada 2008, Grewal
et al. 2005). En el grupo de entomopatógenos, los
nematodos han sido de gran interés por reproducirse
en el insecto-plaga produciendo nuevas generaciones
que van a infectar nuevos individuos huésped,
matan rápidamente a su hospedero, tienen un
tercer estadío ó Juvenil Infectivo (JI) que no se
alimenta, está adaptado a sobrevivir en el suelo
dependiendo de sus reservas hasta encontrar a su
huésped, además tienen la capacidad para buscar
activamente a su hospedero. Por otra parte, tienen
desventajas como amplio rango de hospederos,
limitada ,tiempo corto de almacenamiento, pobre
persistencia en campo y altos costos en comparación
con los pesticidas químicos (Grewal et al. 2005, Kaya
y Gaugler 1993, Merino y France 2009).
á á
La atención de los investigadores se ha
centrado especialmente en los nematodos de las
familias Steinernematidae y Heterorhabditidae
(Grewal et al. 2005), donde cada especie es específica
ó puede infectar un pequeño número de especies
(no se han registrado efectos negativos en huéspedes
no blanco). En el presente estudio se realizará la
aplicación de NEP mediante la técnica de cadáveres,
la cual ha demostrado una mayor dispersión en el
suelo e infectividad y supervivencia en comparación
con la suspensión acuosa (Shapiro- Ilan et al. 2003).
Teniendo en cuenta la importancia del
cultivo, los problemas para el control del picudo
de la guayaba y las características de los nematodos
entomopatógenos, se platea evaluar la virulencia de
especies ó cepas de nematodos entomopatógenos
sobre larvas de cuarto instar del picudo de la
guayaba bajo condiciones de laboratorio, invernadero y
campo, y su persistencia en el suelo; para generar
una propuesta de control biológico para el manejo
con del picudo de la guayaba.
El cultivo de Guayaba Psidium guajava Linneo (1753) (Rosales: Myrtaceae)
conocida como guayaba, es nativa de los trópicos
de América, pero hoy se encuentra en todas las
regiones tropicales y subtropicales del mundo
dentro de los 35° latitud norte y 35° latitud sur
(Raga et al. 2006, Tong et al. 1991). La guayaba es
una fruta de aroma fuerte inconfundible, sabor
cautivador, considerada la reina de las frutas
además por su contenido de minerales, vitaminas,
principalmente vitamina C (10 veces más que la
naranja), también contiene aminoácidos como lisina
y triptófano tan importantes en la alimentación de
los niños en los primeros cinco años de vida para
el desarrollo normal del cerebro (Lozano et al.
2002, Perales et al. 2005).
En general, el guayabo muestra mucha
diversidad en tamaño de la fruta, forma, cantidad
de semilla, tamaño y dureza de la misma, sabor de
la pulpa, textura, color, aroma, contenido de
ácido ascórbico, acidez; susceptibilidad a plagas
y enfermedades, a cuarteamiento del fruto;
rendimiento, hábito de crecimiento, vigor, tiempo
de floración entre cosecha y vida de estante del
fruto (Lozano et al. 2002).
En Colombia se puede encontrar
silvestre, cultivada sin ningún cuidado y
en cultivos a gran escala. La principal
región agroindustrial de la guayaba y
de bocadillo en el país es la provincia
de Vélez (Santander), allí los guayabales
son principalmente silvestres o se
encuentran asociados a sistemas
silvopastoriles (Figura 1); bajo estas
condiciones naturales, la guayaba
inicia brotes al principio del periodo
lluvioso y las hojas maduras son
sustituidas por brotes nuevos, por lo
cual la producción y cosecha es
periódica (Morales y Melgarejo 2010).
En la provincia de Vélez se
presentan dos cosechas en el año, una
en la primera mitad del año llamada “cosecha
de mitaca” ó pequeña producción. La segunda
producción al final del año conocida como cosecha
principal. Sin embargo, se han registrado alteraciones
en el ciclo de producción debido posiblemente a
factores climáticas como altas precipitaciones
(ausencia de veranillo) (Lozano et al. 2002).
Mercadeo y oportunidades: P. guajava es un
cultivo importante en una gran cantidad de países
de las zonas tropicales. Entre los principales países
productores están India, Pakistan, México y
Hawaii; Venezuela y Brasil en su mayoría la
industrializan y derivan sub-productos para la
exportación (Cordero et al. 2003, Anónimo 2007).
En Colombia la guayaba se encuentra en sistema sil-
vopastoril- grama natural ó rumiante, esta situación
es propicia ahora cuando el mundo moderno quiere
y demanda productos limpios y libres de
á
agroquímicos principalmente (Lozano et al. 2002).
La mayor producción de guayaba en Colombia
se encuentra en el departamento de Santander con
49.800 toneladas (34%) de 145.665 toneladas a
nivel nacional, seguido por Boyacá (20%), y Tolima
(12.3%). Los productores a nivel regional son una
población rural en un 99% de economía campesina,
con un sistema de explotación agropastoril
(Anónimo 2006).
La principal agroindustria rural derivada de
esta fruta en Colombia se concentra en la provincia
de Vélez (Santander), donde se desarrolla en más
de 130 fábricas de Bocadillo, cuya producción
anual se valora en US$24 millones. A pesar de su
importancia socioeconómica, el cultivo y la agroindustria
de la guayaba presentan aun un marcado retraso
tecnológico que afecta su competitividad en los
Figura1. Cultivo de guayaba común (Psidium guajava) asociado a
un sistema silvopastoril en la provincia de Vélez, Municipio Puente
Nacional – Santander (Colombia).
mercados y se refleja en bajos rendimientos del
cultivo, altos costos de producción, deficiencias de
calidad y en la inestabilidad de la oferta, los precios
de la fruta y sus productos procesados (Anónimo
2007).
En relación con el comercio exterior, la
guayaba procesada como bocadillo, jalea, mermelada,
compota, pulpa, néctar y jugo tiene una proyección
amplia y creciente por las características o propiedades
ya anotadas. Teniendo que desarrollar tecnologías
que mejoren la productividad y competitividad con
los mercados internacionales (Perales et al. 2005).
Para el consumo de frutos se prefieren frutos
entre 200 y 400 gramos, en cambio para la industria,
el tamaño de la fruta no es importante. Aquí lo
importante es que en ambos casos la fruta esté
entera o completa y sin daños aparentes que la
hagan rechazable por los consumidores o los
industriales. Contrario a lo que se cree, el tamaño
no tiene que ver con la calidad; y que la industria
recibe cualquier calidad, pero en realidad no es así,
la industria prefiere fruta excelente no excedentes
(Cordero et al. 2003, Lozano et al. 2002).
Aspectos agroecológicos: El guayabo se
adapta con facilidad a distintas condiciones climáticas
pese a su origen tropical. El mejor clima para el
guayabo es el templado, en sitios con temperatura
promedio entre los 15 y 30°C, desde secos a húmedos,
con un suplemento anual de agua de 1000-
2000m3/ha por año y se encuentra en una amplia
variedad de climas (Chacón y Cuenca 1998, Mata y
Rodríguez 1990, Salazar et al. 2006).
Desde el punto de vista fitosanitario este
cultivo afronta una serie de problemas asociados
con el ataque de plagas y enfermedades en donde
se destacan: ataques de la mosca de la fruta del
á á
género Anastrepha (Diptera: Tephritidae), el picudo
de la guayaba C. psidii (Coleoptera: Curculionidae)
y la enfermedad de la costra o clavo de la guayaba
(Pestalotia versicolor Speg.), este hongo es favorecido
por condiciones de alta humedad relativa y
especialmente por exceso de follaje en la planta.
En la región de Santander sobresale el picudo de la
guayaba por el alto impacto económico que genera,
ya que su daño no permite el uso de la fruta en la
preparación de subproductos y ha llegado a afectar
hasta el 80% de la producción (Anónimo 2010,
Insuasty et al. 2007, Perales et al.2005).
Tanto la fruta como sus productos procesados,
son la principal fuente de ingresos para la población
de la provincia de Vélez, por lo que el problema
con el picudo, genera pérdidas en los ingresos de
las familias de la región y elevados costos en la
producción de bocadillo al tener que importar la
fruta desde otras regiones para suplir los requerimientos de
las fábricas (Com. personal Hernández y Pinzón
2011).
Por el sistema de cultivo de guayabales silvestres,
no se realizan aplicaciones de agroquímicos, ni
embolse del fruto para el control de plagas y
enfermedades del fruto de guayaba. Específicamente
para el picudo de la guayaba no se han desarrollado
atrayentes ni feromonas eficaces para su
implementación en manejo integrado de ésta plaga;
tampoco se han realizado estudios de cultivares
que sean resistentes o poco susceptibles (Insuasty
et al. 2007). Prácticas culturales como recolección y
eliminación de frutas afectadas es poco aplicada en
la región por la extensión de los cultivos y por el
aumento en la mano de obra; en los sistemas
silvopastoriles esta labor es realizada en gran medida
por el ganado, sin embargo, la fruta afectada por el
El picudo de la guayaba es una de las principales
plagas de la guayaba en Colombia, afectando tanto
la producción como la calidad de los frutos,
generando grandes pérdidas económicas. Llega a
petrificar hasta el 100% del fruto y si no se le
controla, ocasiona pérdidas del 60 al 100% de la
producción (Insuasty et al. 2007). En la provincia
de Vélez se ha incrementado significativamente las
pérdidas causadas por el picudo, donde se estima
que la producción de la guayaba ha bajado un 80%
(Com. personal Hernández y Pinzón, 2010).
El picudo de la guayaba (C.psidii) es un
escarabajo Curculionidae (Coleoptera) de
á
aproximadamente 6 mm de largo y 4 mm de
ancho. Las hembras generalmente ovipositan un
huevo por fruto de 30 a 90 días de edad; los
huevos son blanquecinos y con longitud promedio
de 1 mm. La larva es ápoda de color amarillo con
cabeza café, con longitudes entre 1,2 y 1,5 mm en
las primeras semanas y entre 10 y 12 mm en la sexta
semana. La pupa es de tipo exarata, amarilla clara y
de 7,5 mm de longitud. El adulto es café oscuro
con piezas bucales cilíndricas y alargadas. Después
de la eclosión del huevo, la larva penetra en el fruto
donde se alimenta de la pulpa y de las semillas. Las
larvas se desarrollan dentro del fruto pasando por
cuatro instares. Los frutos se madura, caen y las
larvas de cuarto instar del picudo migran al suelo,
donde se transforman en pupa, después surgen los
adultos, abandonan el suelo iniciando un nuevo
ciclo. El ciclo total dura 199 días distribuido así:
huevo, 4 a 7 días; larva en el fruto, 42 a 56 días;
larva en suelo, 90 días; pupa en el suelo, 30 a 60
días. Los adultos emergen entre a los 20 y 30 días y
lo hacen durante la época seca, en la cual se pueden
colectar adultos asociados a hojas y flores
(Anónimo 2010, Boscán y
Cásares 1981, Monrroy e
Insuasty 2006).
En la provincia de Vélez
los adultos emergen con la
aparición de las primeras lluvias
de marzo, incrementando
significativamente su población
en el mes de mayo. En
cuanto a la infestación en
los frutos por parte de las
larvas, se ha observado el
valor más alto durante la
cosecha, que va desde
El Picudo de la Guayaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae)
Figura 2. Fruto de gua-
yaba (P. guajava) de 40 días.
A. daño externo generado
por la hembra del picudo de
la guayaba (C. psidii) al ovi-
positar, malformación y
maduración prematura. B.
Daño interno (petrificación)
generado por larvas.
A
B
inicios de septiembre hasta diciembre (Anónimo
2010, Boscán y Cásares 1980, 1981).
El daño ocasionado por el picudo es provocado
por la larva al alimentarse de la pulpa y la semilla,
produciendo un ennegrecimiento, endurecimiento
de la parte afectada, maduración prematura y caída
del fruto. En la medida en que la larva se desarrolla
en el interior del fruto, éste adquiere una forma
á á
arriñonada y el agujero de oviposición se torna más
grande y de color oscuro, a las cuatro semanas de
la oviposición los frutos se petrifican y su interior
toma una apariencia totalmente oscura (Figura 2)
(Insuasty el al. 2010). Un fruto en éstas condiciones
es inservible y no se puede consumir en fresco ni
utilizar en la fabricación de pulpas o jaleas.
Control del Picudo de la Guayaba Dentro de las estrategias de manejo se
encuentra el embolsado de frutos, red de golpe,
eliminación de frutos infestados, selección de árboles
trampa, desfase de cosecha. Sin embargo, estas
prácticas requieren que los árboles sean manejados
técnicamente, para evitar dificultades desde el punto
de vista operativo y altos costos (Monroy e Insuasty
2006). El control se complementa con la colecta y
quema de los frutos dañados en el árbol antes de
que la larva abandone el fruto (Anónimo 2007,
Perales et al. 2005).
La plaga en su estadío larval es difícil de
controlar con métodos químico debido a su
localización dentro del fruto en su estadío de larva1-
4 y su posterior localización en el suelo en su
estadío 4; aunado a ésto se encuentra la carencia de
productos químicos específicos para el control del
picudo. El picudo es capaz de causar daños del 60-
100% de los frutos y hasta del 100% de la producción
total de guayaba si no se controla a tiempo (Boscán
y Cásares 1980).
Éstas medidas de control han resultado
ineficientes por las dificultades que acarrea el sistema
silvestre haciendo que las pérdidas de producción
de la guayaba continúen empeorando. Es por ello
que se hace necesario una estrategia de control que
sea autosostenible y que presente mejores resultados
para el control del picudo. Una alternativa es la
aplicación de estrategias de control biológico
para mantener un equilibrio en los ecosistemas,
no obstante, falta estudiarse con mayor detalle para
su implementación (Insuasty et al. 2007, Perales et
al. 2005).
El control biológico inició en 1889 definido
por de Bach (1964) como la acción de parásitos,
predadores o patógenos que mantienen una
población hospedera a niveles más bajos de los que
se encontraría en ausencia de ese enemigo natural
(Altieri et al. 1997). Está dividido en control
biológico natural en el que los enemigos naturales
nativos o coevolucionados controlan artrópodos
nativos y el control biológico aplicado en el que el
hombre interviene para mejorar la acción de los
enemigos naturales presentes (Hazir et al. 2004).
A través de los tiempos, organismos como
bacterias, virus, hongos y nematodos han sido
utilizados como controladores de insectos plaga en
proporciones muy pequeñas comparado con el uso
abundante de plaguicidas químicos. Poco a poco la
necesidad de implementar técnicas que no causen
daño al medio ambiente y que cumplan con las
normas de sanidad vegetal han llevado al progresivo
aumento del uso de controladores biológicos, la
búsqueda de otras opciones como parasitoides o
depredadores y el estudio sobre las aplicaciones de
los controladores (Carballo et al. 2004, Hazir et al.
2004) como lo son los nematodos entomopatógenos
(Grewal et al. 2005).
Nematodos entomopatógenos: Los
nematodos entomopatógenos son parásitos obligados
de insectos; son invertebrados diversos y abundantes
en diferentes sistemas en donde la humedad y la
disponibilidad de alimento son factores importantes,
por ello se desarrollan en ambientes crípticos
como el suelo (Leguízamo y Parada 2008). Los
estudios con nematodos entomopatógenos se han
incrementado en las últimas dos décadas haciendo
énfasis en el potencial infectivo de diferentes
hospederos (Grewal et al. 2005).
Los nematodos entomopatógenos pertenecen
al orden Rhabditida (Nematoda), los nematodos
entomopatógenos que han mostrado mejores
resultados en el control biológico de plagas pertenecen
a las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae
(Sáenz 2005). Están asociadas a bacterias mutualistas
del género Xenorhabdus para Steinernematidae y
Photorhabdus para Heterorhabditidae, (Burnell y
Stock 2000, Gaugler 2002, Morton y Garcia-del-
Pino 2010) y que les son útiles cuando ingresan al
hospedero. La bacteria mata al insecto por septicemia,
facilitando la degradación de los tejidos para que el
nematodo se pueda alimentar junto con su descendencia.
La asociación nematodo-bacteria es la que permite
la efectividad y selectividad de estos controladores,
razón por la cual se realizan gran variedad de
ensayos en laboratorio para establecer la patogenicidad
á
de cada especie ante una determinada plaga (Hazir
et al. 2004, Sáenz 2005).
Las estrategias de los JIs para encontrar a su
hospedero es variable entre las distintas especies de
nematodos entomopatógenos, se puede clasificar co-
mo “emboscadores” y “cruceros”. Los nematodos
entomopatógenos “emboscadores” esperan a su
hospedero para saltar en dirección a su hospedero
cuando éste se aproxima. Los nematodos
entomopatógenos con estrategia “crucero” buscan
activamente sus hospederos moviéndose en el suelo,
probablemente atraídos por el dióxido de carbono
ú otras sustancias liberadas por los hospederos.
Los nematodos entomopatógenos con estrategia
de “crucero” son más efectivos para insectos con
poca movilidad en la capa del suelo, mientras que
los “emboscadores” son más efectivos para
hospederos móviles; existen adicionalmente,
algunas especies con comportamientos intermedios,
donde por un periodo son “emboscadores” y
después son buscadores activos (Gaugler 2002,
Hazir et al. 2004, Klein 1990, Kaya y Gaugler
1993).
La eficacia del control de insectos plagas
con nematodos entomopatógenos depende de la
temperatura ambiental en la cual ellos son liberados
al suelo. La temperatura influye en muchos procesos
y en la producción de reservas alimenticias como
lípidos, proteínas y carbohidratos, que son utilizados
por los nematodos para su movilidad, sobrevivencia,
infectividad y reproducción. En general, la actividad
insecticida de los nematodos entomopatógenos
son más efectivos entre las temperaturas de 18-
28°C, con excepción de algunas especies que son
más efectivas en temperaturas extremas (Hazir et
al. 2004, Kaya y Gaugler 1993).
Control del picudo con nematodos
entomopatógenos: En Colombia no se han
reportado estudios con nematodos entomopatógenos
para el control del picudo de la guayaba, la información
existente y cercana ha sido desarrollada en Brasil,
donde se ha demostrado en laboratorio e invernadero
la eficacia de nematodos entomopatógenos para el
control del picudo de la guayaba (Dolinski et al.
2006, Del valle et al. 2005, 2008, Shapiro et al.
2008).
Nematodos entomopatógenos de los generos
Heterorhabditis y Steinernema (Rhabditida) pueden ser
usados como agentes de control biológico contra
los estados del picudo de la guayaba que viven en
el suelo (cuarto estadío larval, prepupa y pupa).
Estudios realizados por Del Valle et al. (2005,
2008) y Dolinski et al. (2006) demostraron la alta
susceptibilidad del cuarto instar larval del picudo
de la guayaba por parte de Heterorhabditis baujardii
LPP7 (patogenicidad 80%) y Heterorhabditis indica
Hom1 (patogenicidad 85%) en experimentos de
laboratorio e invernadero a una concentración de
100 nemátodos por larva del gorgojo de la guayaba
(Dolinski et al. 2006; Del valle et al. 2005, 2008).
Cuando fueron evaluados en columnas de arena,
estos nematodos se mostraron eficientes en encontrar
las larvas del gorgojo, causando mortalidad del
70% bajo una dosis de 500 nematodos por larva;
se realizaron algunas pruebas con nematodos en
campo, demostrándose la eficacia y la persistencia
de los nematodos en campo (Del Valle et al. 2008;
Dolinski 2009).
En campo un método alternativo para la
aplicación de los nematodos entomopatógenos, es
el uso de cadáveres. La técnica del cadáver, consiste
en infectar larvas de último instar de Galeria mellonella
á á
con nematodos entomopatógenos, dejar que los
nematodos se desarrollen dentro del huésped y
posteriormente (entre los cinco y los siete días-
dependiendo de la especie de nematodo), aplicar
los cadáveres infectados (Figura 3); una vez entra
en contacto con el sustrato, los nematodos
entomopatógenos emergen de la larva aplicada en
busca de un nuevo huésped. La técnica del
cadáver es un método que ha mostrado mejores
resultados que la aplicación de JI en suspensión en
cuanto a características como dispersión, infectividad
y sobrevivencia (Shapiro y Glazer 1996, Shapiro y
Lewis 1999).
Ésta forma de aplicación de cadáveres-
infectados es más sencilla y demanda menos tecnología
tanto de almacenamiento, mantenimiento como de
aplicación. Las larvas de G. melonella pueden ser
Figura 3. Larvas de último instar de Galeria mellonella
después de seis días de infección con nematodos
entomopatógenos de la familia Heterorhabditidae,
para ser aplicados como cadáver.
Shapiro y Lewis 1999).
La técnica de aplicación de cadáveres infecta-
dos no se ha implementado en el país para el con-
trol de plagas. Esta técnica se va a evaluar en
condiciones de campo para el control del picudo
de la guayaba teniendo en cuenta su factibilidad en
la aplicación por parte de los agricultores, por el
tipo de manejo que se le da a los guayabales, con lo
cual se espera disminuir las poblaciones del picudo
de guayaba y a su vez, generar nuevos nematodos
entomopatógenos (Del Valle et al. 2008)
Las especies de nematodos entomopatógenos
a evaluar para el control del picudo de la guayaba en
Colombia, pertenecen a las familias Steinernematidae
y Heterorhabditidae, las especies obtenidas por
criadas, infectadas y aplicadas por los productores
gracias a su fácil y agradable producción y manejo.
Los cadáveres infectados de G. melonella se ponen a
unos dos centímetros de la superficie del suelo, los
JI del cadáver migran a la lámina de suelo a los 3-5
días después de la aplicación y se desplazan en
suelo en búsqueda de su hospedero (plaga objeti-
vo) para completar su ciclo de vida y generar
nuevos JI. La distancia del desplazamiento, la
profundidad y la persistencia que puedan alcanzar
los nematodos va a depender de las condiciones
ambientales como temperatura y humedad; de las
condiciones bióticas como depredadores y de las
características de cada especie como lo es su
estrategia de forrajeo, tolerancia a las condiciones
ambientales, entre otras (Shapiro y Glazer 1996,
á
No. Género Especie Cepa Mpio/Depto. Unidad de Paisaje
1 Steinernema websteri JCL006 Chinchiná-Caldas Bosque
2 Steinernema sp 1 JCL024 Buenavista-Quindio Cafetal
3 Steinernema sp 2 JCL007 Chinchiná-Caldas Cafetal
4 Steinernema sp 3 JCL027 Sasaima-Cundinam. Plátano
5 Steinernema colombiense SNI0198 Quimbaya-Quindio Cafetal
6 Heterorhabditis bacteriophora HNI0100 Fresno-Tolima
7 Heterorhabditis sp1 SL0708 Alcalá-Valle del Cauca Guadual
Tabla 1: Especies de nematodos entomopatógenos a evaluar para el control del picudo de la guayaba C.
psidii. De la 1ª a la 6ª especies entregadas a la Pontificia Universidad Javeriana por Cenicafé con el conve-
nio No. 182 de 2009. La 7 obtenida por la universidad.
Cenicafé (acuerdo 181) y un aislamiento de la
Pontificia Universidad Javeriana
(Heterorhabditis sp. SL0708), (Tabla 1). Para la
producción de JI, se multiplicaron sobre larvas de
último instar de G. mellonella siguiendo las
recomendaciones de López (2001), Acevedo y
López (2001), Sáenz y Olivares (2008) y Del Valle
et al. (2008).
á á
Se encontró que el picudo de la guayaba es
susceptible a las siete especies de nematodos
entomopatógenos evaluadas en las primeras 48
horas. Las larvas de cuarto instar del picudo de la
guayaba infectados desarrollaron diferentes síntomas
(Figura 4), producciones de JI/ larva y porcentajes
de mortalidad. Este método de control biológico
no genera resultados a corto plazo, sino que es una
alternativa viable que pretende reducir a mediano
Figura 4. Larvas de cuarto instar del picudo de la guayaba C. psidii A. Larva viva. B. infectada con nematodos entomopatógenos de la familia Steinernematidae. C-D larvas infectadas con Heterorhabditidae. E. Larva disetada para corroborar la muerte por nematodos entomopatógenos.
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1Instituto Biológico/Apta/CEIB, C.P. 70, Campinas, SP, 13001-970; [email protected]
Aplicação de nematóides entomopatogênicos e resultados de programas na américa latina
Os nematóides úteis ao controle de insetos e outros artrópodes tidos
como pragas estão reunidos nas famílias Mermithidae (Mermithida),
Phaenopsitylenchidae (Tylenchida) e, principalmente, em Heterorhabditidae
e Steinernematidae (Rhabditida) (Ferraz et al., 2008). Nestas duas últimas,
incluem-se as espécies dos gêneros Heterorhabditis e Steinernema que
têm sido mais intensivamente pesquisadas com vistas ao emprego comercial,
conhecendo-se bem os aspectos relativos à ecologia, às estratégias de ação
sobre a praga-alvo, à produção em larga escala e às condições de aplicação
para que se tenha alta eficiência no controle. Esses nematóides são também
chamados de entomopatogênicos (NEPs). De outra parte, por
diversas razões, os nematóides mermitídeos e fenopsitilenquídeos vêm
despertando bem menor interesse do ponto de vista de controle de pragas,
embora existam casos isolados de grande sucesso na utilização de tais
formas para o controle de algumas pragas urbanas. Esses são
chamados de entomofílicos.
Na América Latina, de modo geral, o emprego de nematóides
entomopatogênicos (Nemata: Steinernematidae, Heterorhabditidae)
vem crescendo, mas ainda é incipiente. E, paradoxalmente, os dois relatos de
utilização bem sucedida em escala mais ampla referem-se justamente a
espécies filiadas às famílias Mermithidae e Phaenopsitylenchidae .
Introdução
Famílias Heterorhabditidae e Steinernematidae (Rhabditida)
Aplicação
Pesquisas com Steinernematidae e Heterorhabditidae e utilização prática como bioinseticidas na América Latina
Considerações finais
Referências Bibliográficas
Contenido del Capítulo
Luis G. Leite1
Famílias Heterorhabditidae e Steinernematidae (Rhabditida): Aspectos gerais
Dentre os heterorabditídeos, conhecem-se 11
espécies válidas no gênero Heterorhabditis,
enquanto na família Steinernematidae há 44
espécies em Steinernema e uma única em
Neosteinernema (Adams et al., 2006). Os membros
dessas famílias apresentam evidentes semelhanças
na biologia e ciclos de vida. É importante ressaltar,
contudo, que tal semelhança é decorrente de
perdem a cutícula extra e defecam, liberando as
bactérias (Poinar, 1966; Sicard et al., 2004). Estas se
multiplicam rapidamente, sintetizam toxinas e
outros compostos e, após curto período (no geral
inferior a 48 horas), causam septicemia no
hospedeiro (Jarosz et al., 1991; Ffrench-Constant &
Bowen, 1999).
O cadáver torna-se uma verdadeira “sopa
bacteriana”, ou seja, um meio rico em nutrientes
constituído pelas bactérias e por tecidos já
desorganizados do inseto, a partir do qual os
nematóides alimentam-se e desenvolvem-se,
passando para o último estádio juvenil (J4) e
formando os adultos da primeira geração, machos
e fêmeas. Os juvenis originados por
tais adultos ainda possuem à sua
disposição apreciável quantidade de
alimento, conseguindo completar o
ciclo e formar os adultos da segunda
geração dentro do cadáver do inseto.
Tal fato ocorre porque a decomposição
do cadáver é retardada, principalmente pela produção
de antibióticos pela bactéria (Forst & Clarke,
2002). Outras gerações completas do nematóide
podem ocorrer no cadáver do inseto, mas isso é
relativamente raro. A duração do ciclo do nematóide
no hospedeiro depende de vários fatores, dentre
esses: a espécie do inseto-hospedeiro, o tamanho
do JI, a temperatura ambiente, a quantidade de JIs
que penetraram no inseto (Boff et al., 2000).
Os juvenis originados pelos adultos da segunda
geração encontram baixa quantidade disponível de
bactérias e o grau de decomposição do cadáver
avançado. A falta de alimento no cadáver é percebida
pelos juvenis como um sinal para deixar o cadáver
e buscar novos hospedeiros (Prancha Vd). Assim,
desenvolvimentos paralelos convergentes e não de
relacionamento filogenético entre os representantes
de ambos os gêneros. Na verdade, os ancestrais de
ambos os grupos são bem distintos, tendo Steinernema
em ambiente tipicamente terrestre, ao passo que
Heterorhabditis o fez em habitat de costa marinha
(Poinar, 1990; Blaxter et al., 1998).
As espécies de Steinernema e Heterorhabditis estão
associadas de maneira mutualística a bactérias dos gêneros
Xenorhabdus e Photorhabdus, respectivamente. Tais
bactérias não formam esporos e, portanto,
não estágios resistentes, sendo encontradas
em geral nos nematóides infectantes ou nos
cadáveres de insetos infectados. Na associação,
os nematóides contribuem oferecendo
proteção à bactéria fora do cor-
po do artrópode hospedeiro e
atuando como transportadores da
bactéria do cadáver de um inseto ao
hemoceloma de outro vivo. Por
outro lado, as bactérias servem de
alimento aos nematóides, provendo-lhes meio nutriti-
vo adequado ao desenvolvimento e à reprodução,
sendo, portanto, considerados bacteriófagos
(Poinar, 1990; Dowds & Peters, 2002).
O ciclo de vida em Steinernema começa quando
juvenis de terceiro estádio (J3), também chamados
infectantes (JIs), carregando células da bactéria
Xenorhabdus sp. em uma vesícula localizada na
região anterior do intestino, penetram no corpo do
hospedeiro através de suas aberturas naturais
(boca, ânus, espiráculos). Esses juvenis são
morfologicamente adaptados à permanência no
solo, pois retêm a cutícula do segundo estádio, e
possuem o ânus e a boca fechados. Dentro do
hospedeiro, migram para o hemoceloma, onde
á
A falta de alimento no cadáver é percebida pelos juvenis como um sinal para deivar o cadáver e buscar novos hospedeiros
(Prancha Vd).
passam ao terceiro estádio retendo a cutícula do
segundo estádio, apreendem certa quantidade de
células bacterianas e migram para o ambiente
externo. Nesta forma de JIs, conseguem persistir
por meses no solo até a localização e penetração
em novos insetos hospedeiros, fechando o ciclo
(Patel et al., 1997) (Fig. 1).
Em Heterorhabditis, o ciclo biológico é
bastante semelhante ao de Steinernema, com a
diferença básica de que os adultos da primeira
geração reproduzem-se por hermafroditismo e os
da segunda por anfimixia (Poinar, 1990). Outra
diferença entre os dois gêneros está na localização
da bactéria simbionte, que em Heterorhabditis se
encontra espalhada na parte anterior do intestino.
Ao adentrar no hemoceloma, os JIs regurgitam as
células bacterianas ao invés de defecá-las (Ciche &
Ensign, 2003).
A recomendação de uso de algumas espécies
de Steinernema e Heterorhabditis como bioinseticidas
é resultante de uma intensiva fase de avaliação por
meio de estudos experimentais em laboratório,
micro-parcelas e áreas de campo, principalmente
durante as décadas de 1970 e 1980.
Tais pesquisas indicaram
claramente o potencial desses
nematóides no combate a
diferentes espécies de insetos
consideradas pragas de solo, em
especial lepidópteros, coleópteros
e dípteros. Também espécies que
vivem no interior de galerias formadas
em órgãos aéreos das plantas infestadas,
como as chamadas “brocas”, podem
ser eficientemente controladas por
tais nematóides. Entretanto, pragas
filófagas (comedoras de folhas)
como gafanhotos e vários tipos de
lagartas, em geral não são bem
controladas por tal método, devido à
grande susceptibilidade dos JIs à
dessecação (Lello et al., 1996).
Técnicas para a produção em larga escala de
Steinernematidae e Heterorhabditidae in vivo e
principalmente in vitro foram desenvolvidas e
possibilitaram a redução dos custos envolvidos a
níveis compatíveis com a produção comercial
(Ehlers, 2001) (Prancha VIg-m). Vários produtos
formulados à base desses nematóides encontram-se
disponíveis no mercado internacional atualmente
(Tabela 2), constituindo alternativa adicional e
viável ao público na área de bioinseticidas,
particularmente na América do Norte, Japão e
áçã ó ê
Figura 1. Ciclo de vida dos nematóides dos gêneros Heterorhabditis e Steinernema. Ferrraz et al. (2008).
Espécie Produto Comercial Empresa produtora / País
S. carpocapsae
Biosafe Ortho Monsanto/EUA, SDS Biotech /Japão,
Rhone Paulenc/Itália, Thermo Trilogy/EUA
Exhibit Ciba Geigy/EUA-Canadá-Europa
Boden-Nutzlinge Celaflor/Alemanha-Áustria
Sanoplant R. Maag/Suiça
Trigger // Helix Ciba Geigy/Canadá
Vector T&L Lesco UHS/EUA
Interrupt Farman/EUA
Defend Pitman-Moore/EUA
Vector PCO V.W. & Rogers/EUA
BioFlea Halt Farman/EUA
Bio Vector // Vector TL Thermo Trilogy/EUA
(sem nome) Andermatt Biocontrol AG/Suiça
S. feltiae
Nemasys Agric. Genetics Co./Reino Unido,
Magnet Thermo Trilogy/EUA
Stealth Ciba Geigy/Reino Unido
Entonem // Scia-Rid Koppert Biol. Systems B.V./Holanda
X-Gnat Thermo Trilogy/EUA
Traunen Andermatt Biocontrol AG/Suiça
Nema-plus e-nema GmbH/Alemanha
S. glaseri Vector WG Lesco UHS/EUA
S. scapterisci ProAct Biocontrol/EUA
S. riobrave
Devour-MC Thermo Trilogy/EUA
Vector-MC Lesco UHS/EUA e Thermo Trilogy/EUA
Bio Vector 355 Thermo Trilogy/EUA
H. bacteriophora
Otinem // Cruiser1 Ecogen/EUA
Nema-Top // Nemagreen e-nema GmbH/Alemanha
Probione Probioma/Bolivia
H. megidis
Larvanem Koppert Biol. Systems B.V./Holanda
Nemasys-H Agr. Genetics Co./Reino Unido
Dickmaulrüssnematoden Andermatt Biocontrol AG/Suiça
Heterorhabditis e
Steinernema spp.
Scanmask // Ecomask //
Heteromask BioLogic Company/EUA
Tabela 2. Produtos à base de Steinernema e Heterorhabditis disponibilizados a pesquisadores ou encontrados no mercado durante a década de 1990 e destinados ao controle de insetos em gramados, plantas ornamentais, horticultura e agricultura em geral.*
* elaborado a partir de Georgis et al. (1995) e www.sipweb.org/directorymcp/nematodes.htm
1. disponível apenas a pesquisadores na formulação WP.
á
Entre as vantagens de tais produtos,
destacam-se: a) juvenis infectantes podem ser
produzidos de maneira barata em insetos
hospedeiros ou em meios artificiais (Bedding,
1981); b) podem ser armazenados (Bedding, 1984);
c) são facilmente aplicados a campo na água de
irrigação ou pulverizados (Cabanillas & Raulston,
1996); d) possuem a habilidade de buscar o
hospedeiro (Lewis et al., 1993); e) são compatíveis
com a maioria dos pesticidas (Forschler et al., 1990;
Rovesti & Deseo, 1990; 1991); f) são seguros a
invertebrados e vertebrados (Akhurst & Smith,
2002); g) reproduzem-se no hospedeiro produzindo
novas gerações (Wouts, 1991); e h) possuem estreito
espectro de hospedeiros, sendo muitas vezes
bastante específicos, não causando portanto
mortalidade indiscriminada (Peters, 1996).
A ausência de riscos ao homem e animais
domésticos tem isentado esses produtos à base de
nematóides entomopatogênicos da obrigatoriedade
do registro junto a Environmental Protection
Agency (EPA) nos Estados Unidos e a órgãos
semelhantes em outros países, proporcionando aos
fabricantes apreciável economia em termos de
investimento e tempo para o lançamento no
mercado (Jansson, 1993; Elhers, 1996). No Brasil,
nova regulamentação sobre o registro desses
nematóides nativos e exóticos para o controle de
pragas foi recentemente publicada e comentada
(Dolinski & Moino Jr., 2007).
Aplicação Os nematóides podem ser aplicados por
sistemas convencionais, como os usados para
defensivos químicos e fertilizantes, e por sistemas
de irrigação (Grewal, 2002). No controle de pragas
subterrâneas, a aplicação deve ser realizada logo
após a irrigação ou em períodos chuvosos, quando
o solo apresenta umidade favorável à atuação do
nematóide, sendo recomendada vazão de 750 a
1890 litros/ha, embora a maioria dos pulverizadores
seja projetada para volumes de 200 a 400 litros/ha.
Os pulverizadores de baixo volume também
podem ser utilizados para aplicação de nematóides,
porém a deposição dos agentes no solo deve ser
auxiliada com uma irrigação da área tratada logo
após a pulverização (Georgis et al., 1995; Grewal,
2002).
Para a aplicação dos nematóides, devem ser
removidos os filtros e telas dos pulverizadores,
pois podem dificultar e até impedir a passagem
deles, particularmente nos casos das espécies
maiores, como S. glaseri, cujos juvenis ficam retidos
até mesmo em telas de malha 100. Esses nematóides
toleram altas pressões durante a pulverização,
porém a pressão não deve exceder 300 psi (2070
kPa). Também deve ser evitada a reciclagem excessiva do
nematóide de volta para o sistema de bombeamento
dos pulverizadores (Grewal, 2002).
A sobrevivência e a eficácia na atuação dos
nematóides após a aplicação podem ser afetadas
pelo tipo, umidade e temperatura do solo. Em
geral, os nematóides são mais ativos e persistem
por mais tempo em solos arenosos do que em
solos argilosos (Kaya, 1990). Necessitam de umidade
no solo para movimentação e sobrevivência, mas
são inviabilizados em solos encharcados. A faixa
de temperatura do solo favorável à atuação dos
áçã ó ê
nematóides entomopatogênicos é a de 12 a 28◦C,
sendo que as temperaturas muito elevadas
reduzem sensivelmente as chances de sobrevivência e
as excessivamente baixas limitam tanto a atividade
como a infectividade.
Os juvenis infectivos são compatíveis com a
maioria dos defensivos químicos quando expostos a
eles por curtos períodos (Ishibashi, 1993),
o que possibilita o emprego dos nematóides
entomopatogênicos em misturas com herbicidas,
fungicidas, acaricidas e inseticidas. No entanto,
alguns defensivos podem reduzir a infectividade e
sobrevivência dos nematóides (Grewal et al., 1998),
sendo os heterorrabditídeos geralmente mais afetados
que os esteinernematídeos (Grewal, 2002). Algunos
inseticidas atuam sinergìsticamente com nematóides
entomopatogênicos, aumentando a eficácia desses
organismos em aplicações inundativas
(Koppenhofer & Kaya, 1998; Nishimatsu & Jackson,
1998). Os nematóides entomopatogênicos são
também compatíveis com a maioria dos
fertilizantes inorgânicos em misturas de tanque,
mas populações naturais são negativamente
afetadas por eles (Bednarek & Gaugler, 1997).
Pesquisas com Steinernematidae e Heterorhabditidae e utilização prática como bioinseticidas na América Latina
Estudos básicos relativos a Steinernema e
Heterorhabditis na América Latina, tratando
especialmente da descrição de espécies, caracterização
de isolados, levantamentos de ocorrência,
multiplicação em larga escala e avaliação da ação
patogênica têm sido desenvolvidos na Argentina,
Brasil, Colômbia, Cuba, México e Venezuela
(Stock, 2002).
Descrição de espécies e caracterização de
isolados: Entre as espécies descritas da Argentina,
destacam-se S. rarum de Doucet, 1986, S. ritteri de
Doucet & Doucet, 1990 e H. argentiniensis Stock,
1993, além de populações locais com características
especiais, ou isolados, como de S. carpocapsae, S.
feltiae, S. scapterisci e H. bacteriophora (Stock, 2002).
Em relação a Cuba, tem-se a descrição de S.
cubanum e a caracterização de isolados locais de
H. bacteriophora e H. indica (Mracek et al., 1994). A
espécie S. scapterisci, embora descrita nos Estados
Unidos, foi originalmente obtida durante levantamento
de nematóides entomopatogênicos realizado no
Uruguai, sabendo-se hoje ocorrer também na
Argentina (Stock, 1992).
Mais recentemente, pelo menos mais 4 novas
espécies de nematóides entomopatogênicos foram
descritos em toda America latina: Heterorhabditis
mexicana (Nguyen et al.2004) encontrado na região
de Tamaulipas, Mexico, S. costaricense e S. puntauvense
(Uribe-Lorío et al. 2007) encontrados em Costa
Rica, e Steinernema colombiense (Lópes-Núñes et al.,
2008) descrito na Colombia.
No Brasil, foram feitas as descrições de duas
novas espécies: Heterorhabditis amazonensis (Andaló
et al. 2006) encontrado na região Amazônica, e
Steinernema brazilense (Nguyen et al. 2010) isolado de
solo coletado no estado do Mato Grosso do Sul.
á
Levantamentos de ocorrência: Levantamento de
ocorrência de nematóides entomopatogênicos em
solos da região dos Pampas na Argentina revelou
grande diversidade em termos de composição
da nematofauna e confirmou o potencial desses
organismos no controle natural de certas pragas,
particularmente as de solo. Espécies de Steinernema
(S. carpocapsae, S. feltiae e S. scapterisci) e
Heterorhabditis (H. bacteriophora e H. argentiniensis)
foram encontradas com freqüência, sendo observadas
parasitando larvas de diferentes coleópteros e ninfas
da paquinha, Scapteriscus borelli, entre outros
insetos daninhos à agricultura. Estudos semelhantes
realizados em outras regiões do país evidenciaram
que H. bacteriophora tinha grande potencial
como agente biocontrolador de pragas (Stock,
1992).
No Brasil, há registros de encontro em
condições naturais de S. glaseri associado a ovos de
Migdolus fryanus, conhecida praga de solo de
cana-de-açúcar no estado de São Paulo (Pizano et
al., 1985). Além disso, há o relato pioneiro (Pereira,
1937) de associação de um heterorabditídeo, na
época identificado como Rhabditis hambletoni, com a
broca do algodoeiro, Eutinobothrus brasiliensis, o qual
constituiria o primeiro Heterorhabditis encontrado,
contudo não reconhecido (Georgis & Hom, 1992).
Amostragens de solo e isolamentos de
nematóides entomopatogênicos foram realizados
nos estados de Rondônia (Machado & Dolinski,
2004), Amazonas (Andaló et al., 2006), Minas
Gerais (Acevedo et al., 2005), Rio de Janeiro
(C. Dolinski, Uenf, comunicação pessoal, 2007) e
São Paulo (Fowler, 1988; L.G. Leite, Ceib, comunicação
pessoal, 2007), sendo que a maioria dos isolados
obtidos foi identificada como pertencente ao gênero
Heterorhabditis.
Na Colômbia, H. bacteriophora foi encontrado
durante levantamento de campo utilizando larvas
de Galleria mellonella como iscas; o nematóide
apareceu associado mais comumente ao percevejo
de solo Cyrtomenus bergi (Caicedo & Bellotti, 1996).
Em Cuba, mediante a utilização de larvas de
G. mellonella como iscas em solo de pomares cítricos,
foi possível a coleta de população de espécie de
nematóide filiada a Steinernema identificada como
nova para a ciência, posteriormente descrita como
S. cubanum. Dois isolados de H. bacteriophora,
denominados Tetuan e P2M, foram identificados a
partir de amostras de solo parasitando, respectivamente, os
coleópteros Cylas formicarius e Pachnaeus litus. Em
outro levantamento em áreas cultivadas da
província de Havana, verificou-se que,
dentre os nematóides encontrados incluíam-se
pelo menos três populações de H. bacteriophora
(Rodriguez et al., 1996).
No México, levantamento de campo foi
desenvolvido para a identificação dos diferentes
tipos de agentes de biocontrole de Spodoptera frugiperda
que ocorrem em áreas de cultivo de milho e sorgo
nos estados de Jalisco, Colima, Michoacan e
Tamaulipas. Entre os entomopatógenos encontrados,
estavam espécies de Steinernema e Heterorhabditis
obtidas com iscas de G. mellonella em solo de cinco
das dezenove áreas amostradas. Bacillus thuringiensis
e Steinernema spp. foram considerados os
entomopatógenos de solo de mais ampla distribuição
na Costa Oeste do México (Lezama-Gutierrez et
al., 2001).
áçã ó ê
Na Venezuela, diferentes populações de
H. indica e Heterorhabditis spp. foram obtidas de
amostras de solo durante levantamento nos
estados de Aragua e Miranda, possivelmente
ocorrendo em associação com a broca-da-
bananeira, Cosmopolites sordidus (Rosales & Suarez,
1998).
Produção em larga escala: Um dos fatores mais
importantes a ser considerado no desenvolvimento
de um bioinseticida à base de nematóides é a
possibilidade de produzir tais agentes a um custo
aceitável e em quantidade suficiente para permitir a
comercialização do produto (Georgis & Hom, 1992).
Dentro desse contexto, espécies de Steinernema e
Heterorhabditis têm sido multiplicadas in vivo e in
vitro, sendo a primeira forma empregada para
pequena e média escala de produção, visando a
manutenção do nematóide em laboratório ,
realização de bioensaios e aplicação no campo na
forma de cadáveres, e a segunda para escala mais
ampla, onde os JIs são aplicados pelo sistema de
irrigação ou são formulados.
O cultivo in vivo possui uma série de
vantagens dentre elas a simplicidade, o baixo custo
da matéria prima e dos equipamentos empregados,
e a não necessidade de mão-de-obra especializada.
Na prática, o maior gasto nesse sistema está na
criação das larvas, cuja dieta corrobora com a maior
parcela dos custos na criação. Nesse tipo de produção,
em geral utilizam-se larvas de G. mellonella como
inseto-hospedeiro, sendo a mais empregada no
mundo, inclusive como inseto padrão nos testes de
patogenicidade e na descrição taxonômica das
espécies. A dieta para criação desse inseto está em
constante aprimoramento, objetivando-se baratear
o custo. Esta dieta vem sendo modificada com
sucesso, substituindo-se ingredientes mais caros
por mais baratos, tornando a multiplicação dos
nematóides mais viável (C. Dolinski, Uenf,
comunicação pessoal, 2007). A seqüência de criação
das larvas e infecção dos nematóides é ilustrada na
Fig. 2. Além de larvas de G. mellonella, vêm sendo
testados outros hospedeiros como Diatraea saccharalis,
Spodoptera frugiperda, Bombyx mori, Tenebrio molitor e
Cylas formicarius, porém todos os hospedeiros testados
produzem menos JIs do que larvas de G. mellonella
(Folegatti et al., 1988; Jansson, 1996; Molina et al.,
2004).
No Brasil, iniciativas no sentido do
desenvolvimento de um produto comercial à base
de nematóides entomopatogênicos vêm ganhando
destaque nos últimos anos. Leite et al. (2005)
destacam o desenvolvimento de meios para cultivo
in vitro de nematóides e técnicas de produção
massal. Um meio à base de fígado bovino, encharcado
em esponja, proporcionou produção bastante
elevada do nematóide Heterorhabditis sp., com
rendimento de até 180.000 juvenis por mL de
meio. Também foi desenvolvida uma formulação
pó-molhável que permite a preservação do
nematóide por um período de até 2 meses em
prateleira (25oC) e 7 dias a 35oC. O nematóide não
tolerou a temperatura de 5oC, sendo rapidamente
inviabilizado. Essas pesquisas são apoiadas pelo
Programa de Inovação Tecnológica em Pequenas
Empresas (Pipe/Fapesp) e pela empresa
BioControle Métodos de Controle de Pragas Ltda.
Também a produção in vivo tem sido focada,
num projeto em andamento no Programa de
Incentivo à Inovação (PII), desenvolvido na
á
Universidade Federal de Lavras, MG (Ufla),
financiado pela Secretaria Estadual de Ciência e
Tecnologia de Minas Gerais, SEBRAE e Prefeitura
Municipal de Lavras (A. Moino Jr., Ufla, comunicação
pessoal, 2007).
No México, a produção massal “in vitro” pelo
processo fermentativo tem sido o foco das
pesquisas e estudos avançados vem sendo
realizados visando estabelecer as melhores
condições para transferência de oxigênio ao meio
líquido na produção de Steinernema carpocapsae
CABA01 isolado do estado de Hidalgo (Maciel-
Vergara, 2010).
Avaliação da ação patogênica:
Devido ao grande interesse despertado
pelos nematóides dos gêneros
Steinernema e Heterorhabditis
como importantes agentes
biocontroladores de insetos-praga
em todo o mundo, a partir da década
de 1980 intensificaram-se também
na América Latina as pesquisas
objetivando a adequada caracterização
das populações locais e de isolados estrangeiros
quanto à patogenicidade a insetos-praga em
diferentes culturas.
As cigarrinhas são importantes para cana-de-
açúcar e pastagens em países como Argentina,
Brasil, Venezuela, México e vários outros da
América Central. As ninfas atacam as raízes e são
de difícil controle por meio de inseticidas químicos.
Assim, nematóides filiados a Steinernematidae e
Heterorhabditidae aparecem como candidatos
naturais ao combate dessas pragas porque esses
insetos na fase ninfal vivem em ambiente úmido
(quase na superfície do solo, sob a palhada), propício
a sobrevivência e alta atividade dos nematóides; e
vivem próximas umas das outras, comumente
formando colônias, o que pode favorecer a
ocorrência de epizootia. Resultados experimentais
preliminares (Georgis & Hom, 1992) indicaram
que S. carpocapsae Mexicana mostrou alta
patogenicidade a ninfas e adultos de cigarrinhas da
cana, Aeneolamia spp., sobrevivendo bem em areia
por mais de quatro semanas e migrando a mais de
10 cm de distância para alcançar a presa em solo
argiloso relativamente compactado. Ferrer et al.
(2004) avaliaram H. bacteriophora contra A. varia em
campo de cana-de-açúcar na Venezuela e obtiveram
75% de controle na dose de 1 x 108
JI /ha.
Outros estudos têm indicado que
também ninfas da espécie
Mahanarva fimbriolata, de ocorrência
freqüente no Brasil, são bastante
suscetíveis a certas espécies de
Steinernema (S. glaseri, por exemplo)
e Heterorhabditis (Grewal et al., 2001).
Leite et al. (2006) avaliaram H.
indica contra M. fimbriolata em cana-de-açúcar,
obtendo 66-73% de controle nas doses de 6,6 x
107 a 3,3 x 109 JI/ha, resultados semelhantes aos
obtidos por Ferrer et al. (2004).
Segundo Leite et al. (2006), o Instituto
Biológico de São Paulo, em colaboração com o
Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) e a
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar/
CCA) vem desenvolvendo pesquisas procurando
avaliar nematóides entomopatogênicos para o
controle de Sphenophorus levis na cultura da cana
áçã ó ê
Pesquisadores vem desenvolvendo trabalhos procurando avaliar
nematóides entomopatogênicos para o controle de
Sphenophorus levis na cultura da cana-de-açúcar
(Prancha Ve-f).
-de-açúcar (Prancha Ve-f). Em testes de
laboratório, o nematóide Steinernema sp.
(IBCB-n6) mostrou-se mais eficiente que
Heterorhabdidits indica (IBCB-n5), proporcionando
mortalidade de 70% na concentração de 2,4 JI/cm2
(equivalente a 1x108 JI/ha). Também foi avaliada a
utilização conjunta dos nematóides com inseticidas
químicos em subdosagem, com resultados
interessantes com relação aos insetos adultos, na
associação Steinernema sp. (1x108 JI/ha) +
thiamethoxam 250WG (250 g p.c/ha), com
mortalidade acima de 70%. Em teste de campo, o
uso dos nematóides isoladamente proporcionou
ganhos de 16 e 10 t/ha na produção da cana,
respectivamente para Steinernema sp. e Heterorhabditis
indica, e a mistura de Steinernema sp. com
thiamethoxam na concentração de 500 g p.c./ha
causou incremento na produção de cana de até 28
ton./ha. Em outros dois testes de campo, o
nematóide Steinernema sp. IBCB-n6 proporcionou
ganhos na produção de colmos de até 17 t/ha,
semelhante àquele obtido com o inseticida fipronil
800WG 250 g/ha (21 t/ha). Atualmente, o Instituto
Biológico vem procurando implementar o uso do
nematóide Steinernema sp. na cultura da cana-de-
açúcar visando o controle do S. levis. Para isso, o
nematóide é produzido in vitro pelo processo da
esponja, sendo já fornecido para o tratamento de
50 hectares de cana-de-açúcar do grupo Dedini,
em São João da Boa Vista, SP. A aplicação em área
descoberta de palha vem sendo realizada através de
pulverizações tratorizadas com bicos tipo leque ou
jato, dirigidas para dentro da faixa de 25 cm de cada
lado das linhas da cultura.
Ainda em relação à cana-de-açúcar,
desenvolveram-se testes preliminares de campo no
Brasil visando avaliação da eficiência de dois
isolados norte-americanos de S. carpocapsae no
controle de M. fryanus, espécie de coleóptero tida
como das mais importantes pragas de solo da
cultura (Arrigoni et al., 1986). Aplicações de
suspensão dos nematóides por pulverização ao lado
das linhas de plantio, em concentrações de até
100000 juvenis/m2, foram seguidas de pesada irrigação,
para favorecer a sobrevivência e atividade dos
parasitos no solo. Os níveis de parasitismo de
larvas da praga coletadas após 4, 14 e 18 dias do
tratamento variaram de 1,7 a 9,2%, sendo considerados
muito baixos. A reduzida eficácia da técnica foi
atribuída a diversos fatores, entre os quais: a) seleção
de isolados pouco ou não adaptados ao combate
do coleóptero; b) condições e doses inadequadas
de aplicação do bioinseticida; c) dificuldades devidas
ao hábito da praga de aprofundar-se muito no solo,
freqüentemente escapando ao raio de ação do
parasito. Esse trabalho demonstra a importância de
se conhecer a praga que se pretende controlar e os
nematóides entomopatogênicos, lembrando a
importância de se buscar NEPs nativos já adaptados
às condições locais (Dolinski & Moino Jr., 2007).
Outra praga que vem sendo alvo de estudos
visando o controle por nematóides entomopatogênicos
é a broca-da-bananeira, C. sordidus, problema
tanto em países produtores da América do Sul
como Central e região caribenha. Abrindo galerias
no rizoma da planta, esse coleóptero favorece
infecções secundárias por fungos altamente
fitopatogênicos bem como concorre ao tombamento
pela ação de ventos. Testes em laboratório vêm
demonstrando a atividade larvicida de vários NEPs
contra esta praga. No Brasil, na região produtora
do Vale do Ribeira (Estado de São Paulo),
á
empregando-se os isolados All e UK de
S. carpocapsae, realizaram-se aplicações do
nematóide com pulverizadores manuais, à dose de
5 x 106 espécimes/m2 por 0,4 L de água, dirigidas
ao solo e a iscas preparadas com pseudocaule de
bananeira, atrativas a adultos do inseto. Foram
obtidos índices de mortalidade variáveis de 51% a
70% para adultos coletados após sete dias do
tratamento, e de 22 a 40% para adultos coletados
aos 21 dias do tratamento. Tais dados indicaram a
possibilidade de obter controle de C. sordidus pela
aplicação do nematóide sobre as iscas ou pela
distribuição das iscas sobre solo tratado com o
nematóide (Schmitt et al., 1992).
Figueroa (1990) avaliou S. carpocapsae, S. glaseri
e S. feltiae contra C. sordidus em casa-de-vegetação
em Porto Rico. Os nematóides, nas concentrações
de 400, 4000 e 40.000 JIs/plantas de 4 meses,
reduziram significativamente o número de túneis
feitos pelas larvas. Nas duas concentrações maiores,
100% de mortalidade das larvas foi alcançada.
Treverrow & Bedding (1993) testaram 32 linhagens e
espécies de Steinernema e Heterorhabditis contra larvas
e adultos de C. sordidus e relataram a alta atividade
da linhagem BW de S. carpocapsae contra adultos.
Treverrow et al. (1991) também conseguiram alto
controle de larvas de C. sordidus nos rizomas,
aplicando S. carpocapsae com emulsificante em orifícios
feitos em rizomas para descarte. Kermarrec &
Maulon (1989) demonstraram o sinergismo entre
inseticidas e S. carpocapsae no controle de C. sordidus.
Em Guadalupe e na Martinica, foram feitas
pulverizações de suspensões de nematóides no
solo ao redor do pseudocaule das plantas, com
resultados bem inferiores aos proporcionados pelo
uso de inseticidas. Todavia, a colocação de larvas
de G. mellonella previamente inoculadas com os
isolados e substituídas semanalmente, junto a iscas
com feromônio, tem resultado comparável ou até
superior ao obtido mediante duas aplicações de
inseticidas ao ano (Chabrier et al., 2003).
O percevejo Cyrtomenus bergi inclui-se entre as
pragas mais importantes da cultura da mandioca na
Colômbia; alimentando-se nas raízes da planta,
facilita o acesso de patógenos secundários, que
aceleram o apodrecimento do sistema radicular.
Como típica praga de solo, oferece condições
aparentemente favoráveis ao controle por meio
de nematóides entomopatogênicos. Em vista disso,
desenvolveu-se estudo em laboratório (Barberena
& Bellotti, 1998) para avaliar o potencial de
dois isolados de H. bacteriophora, LFR 92 e SQC
92, como possíveis agentes de biocontrole do percevejo.
Verificou-se que ambos os isolados
proporcionaram alta mortalidade da praga, sendo
o quinto ínstar ninfal considerado o estágio mais
suscetível.
Na cultura da batata, ocorrem pragas de interesse
econômico que poderiam ser controladas com
nematóides. São exemplos Premnotrypes vorax
(“Andean weevil” ou “Gusano blanco de la papa”)
na Colômbia, e Tecia solanivora (“Polilla guatemalteca
de la papa”) na Venezuela. No primeiro caso, avaliou-
se, em laboratório, o potencial de um isolado colombiano
de Steinernema sp., em comparação ao isolado co-
mercial Exhibit® de S. carpocapsae (Tab. 2). Ambos
os isolados causaram a morte de P. vorax, mas o
Exhibit® mostrou-se bem mais agressivo
(Garzon et al., 1996). Em estudo semelhante,
larvas de T. solanivora revelaram-se bastante susce-
tível a um isolado de S. feltiae e a uma população
áçã ó ê
venezuelana de Heterorhabditis sp. (Het 1). As taxas
de mortalidade variaram de 70 a 100% no caso do
isolado Het 1, aumentando com o nível inicial de
inóculo; S. feltiae foi mais virulento, obtendo-se
100% de mortalidade com apenas 53 nematóides
por larva do inseto (Fan et al., 2000).
Em café, uma das principais pragas é a broca
-do-cafeeiro, Hypothenemus hampei, pois causa
sérias perdas devido à destruição e queda dos frutos
infestados. No México, em estudos de laboratório,
uma espécie nativa de Heterorhabditis mostrou-se
capaz de penetrar nos frutos atacados e causar elevada
mortalidade em larvas e adultos do inseto.
Na Colombia, a broca é
considerada a praga mais importante
na cultura do cafeeiro, por atacar
diretamente o fruto, causando perdas
de peso, depreciação do grão e perda
na qualidade da bebida (Bustillo,
1999). Estudos realizados no Centro
Nacional de Investigaciones de Café
(Cenicafé) demonstraram que a broca
permanece nos frutos que caem ao
solo, funcionando como fonte de incre-
mento populacional da broca, com a emergência de
adultos e sua dispersão na lavoura (Baker et al.,
1994).
Assim, nematóides entomopatogênicos têm
sido considerados inimigos naturais da praga (Baker,
1999; Commonwealth Institute of Biological Control,
1990; Georgis & Hom, 1992), e vários estudos têm
sido realizados, avaliando a patogenicidade e
virulência de Steinernematidae e Heterorhabditidae
aplicados em diferentes estágios biológicos da broca
(Allard & Moore, 1989; Georgis & Hom, 1992;
Castillo, 1995), com destaque para Heterorhabditis
bacteriophora e Steinernema feltiae com mortalidades
superiores a 85%.
Pesquisas em laboratório vêm sendo
desenvolvidas com o objetivo de selecionar
isolados de nematóides capazes de causar mortalidade
à cochonilha Dysmicoccus texensis em plantas de
café. Andaló et al. (2004a) selecionaram o nematóide
Steinernema carpocapsae, causando cerca de 78 %
de controle na concentração de 25 nematóides/
cochonilha. Alves (2006) continuou e aprofundou
os estudos com o uso de nematóides entomopatogênicos
para o controle da cochonilha-da-raiz-do-cafeeiro,
verificando que todos os isolados testados foram
patogênicos à praga. Os isolados
pertencentes ao gênero Steinernema
foram menos virulentos do que os
do gênero Heterorhabditis. A
porcentagem máxima de mortalidade
alcançada pelos isolados do gênero
Steinernema foi de 33%. Por
outro lado, os isolados do gênero
Heterorhabditis alcançaram valores
de até 100% de mortalidade. Em
experimentos realizados no campo, a aplicação do
isolado JPM3 de Heterorhabdtitis pelo método de
suspensão aquosa, e do inseticida tiametoxam, usado
como padrão de comparação, apresentaram 65 e
81%, de eficiência de controle, respectivamente.
Esses resultados indicam o isolado JPM3 como um
agente promissor no controle de D. texensis,
entretanto, testes mais detalhados ainda são necessários
para a validação dos dados obtidos em campo,
inclusive com a determinação de dosagens e métodos
de aplicação mais adequados, porém, o indicativo é
positivo.
á
Nove diferentes linhagens de NEPs nativos e evóticos foram testados contra as larvas no quarto instar do Conotrachelus psidii proporcionaram 30% e 58% de mortalidade nas duas
maiores concentrações (Dolinski et al., 2006).
Também na cultura do cafeeiro, estudos
preliminares para avaliação da patogenicidade de
NEPs sobre ninfas da cigarra-do-cafeeiro Quesada
gigas têm sido realizados, sendo selecionados dois
isolados de Heterorhabditis sp. e S. riobrave como os
mais virulentos, e também verificando a eficiência dos
nematóides selecionados no deslocamento vertical
em coluna de solo, visando maior eficácia no
controle das ninfas móveis com aplicações no solo,
o que será alvo de estudos futuros (Silva, 2007).
Em relação aos insetos sociais considerados
pragas, comumente subterrâneos, a exemplo de
cupins, alguns trabalhos foram desenvolvidos. Em
estudo de laboratório no Brasil (Passos et al.,
1995), aplicações da formulação Exhibit® de S.
carpocapsae sobre folhas que serviram de alimento à saúva
-limão, Atta sexdens rubropilosa, proporcionaram taxas
de mortalidade de 27, 90 e 97% para as castas de
jardineiras, operárias e soldados, respectivamente.
Confirmada a patogenicidade, realizaram-se aplicações
do nematóide à razão de 1.000 JIs/cm2 de folha
em dois ninhos artificiais verificando-se que as
operárias não cortaram as folhas inoculadas, mas
contaminaram-se durante sua movimentação,
transportando o parasito para o interior do sauveiro,
inclusive à câmara em que se encontrava a rainha.
Observou-se esforço no sentido de descartar as
formigas doentes e de isolar o fungo contaminado
nas “panelas” de lixo. Houve morte de exemplares
das diferentes castas e redução no volume de fungo usado
como alimento.
O mesmo isolado de S. carpocapsae foi avaliado
em outro estudo preliminar, também em laboratório,
frente ao cupim Heterotermes tenuis (Passos & Alves,
1995; Rosa et al., 2008). Embora altos índices de
mortalidade fossem obtidos para operários e soldados
mediante a aplicação de 75 JIs/cm2 do substrato
usado como isca (papel corrugado), os resultados
não foram conclusivos porque se verificou que a
substância ativadora dos nematóides contida no
produto comercial exerceu certa toxicidade
sobre os cupins. Quando se empregaram
níveis mais elevados, como 1.000 JIs/cm2, os
nematóides foram detectados e mostraram
aparente efeito repelente, sendo evitados pelos
cupins.
Uma importante praga em goiabeira, o gorgulho-
da-goiabeira, Conotrachelus psidii vem sendo alvo de
estudo no Estado do Rio de Janeiro. Essa praga
possui o quarto instar e a pupa no solo, o que favorece
o controle por NEPs. Nove diferentes linhagens
de NEPs nativos e exóticos foram testados contra as
larvas no quarto instar desse inseto em laboratório.
Experimentos em casa-de-vegetação em potes de
20 L com 10 larvas do gorgulho e JIs de H. baujardi
LPP7 nas concentrações de 500, 1000 e 2000 IJs,
proporcionaram 30% e 58% de mortalidade nas
duas maiores concentrações (Dolinski et al., 2006).
Além do gorgulho, outra praga da goiaba que vem
sendo alvo em testes com NEPs é a mosca-do-
mediterrâneo, Ceratitis capitata. Rohde (2007) verificou a
patogenicidade de diversos isolados de nematóides
entomopatogênicos a C. capitata, sendo que S.
carpocapsae e Heterorhabditis sp. (RSC01) causaram
mortalidade superior a 85% para a fase larval e
Heterorhabditis sp. PI, Heterorhabditis sp. JPM4, H.
bacteriophora HP88, S. feltiae e S. glaseri foram os mais
eficientes para a fase de pupa, com a mortalidade variando
entre 35 e 44 %. Segundo Silva et al. (2009), o
nematóide H. indica IBCB n5 aplicado em cultivo
de goiaba, nas doses de 1 e 10 JI / cm², foi mais
áçã ó ê
eficiente contra a mosca-do-Mediterrâneo
(mortalidades de 66 e 93 %) que para o gorgulho
da goiaba (33 e 50 %), ambos os insetos liberados
sobre o solo na fase de pré-pupa.
Nematóides vêm sendo avaliados também
contra a broca das raízes do dendê, Sagalassa valida.
Aponte & Olivares avaliaram o nematóide Steinernema
sp. SNIO198 em coluna de areia e constataram
eficiência de busca do hospedeiro estando os insetos
fora ou dentro das raízes.
Uso comercial: Apesar do grande destaque que os
nematóides entomopatogênicos vem ganhando
como agentes potenciais para o controle de pragas
na America Latina, o uso comercial ainda está
restrito a poucos países, sendo o produto obtido
de importação ou de processo de produção in “in
vivo” usando larvas de Galleria mellonella.
No Chile, o nematóide usado, S. carpocapsae, é
produzido na Espanha e formulado em uma
mistura de juvenis infectivos mais quitosam
(quitina). Esse produto é recomendado contra
diversos insetos de diferentes ordens, apresentando
efeito sinergistico contra Rhincophorus ferruiginea,
importante praga em palmeiras. Para esse inseto, o
produto é recomendado na dose de 5 – 10 milhões
de JI/palmeira + quitossam (10%), apresentando
eficiência quando usado como curativo ou preventivo,
aplicado na coroa da planta. O quitossam protege e
ativa os nematóides além de fortalecer as palmeiras,
bioestimulando os mecanismos de defesa.
Na Bolivia, H. bacteriophora vem sendo produ-
zido comercialmente por um processo “in vivo”
desenvolvendo e divulgando essa nova técnica,
faltam empresas idôneas interessadas em produzi-los e
distribuí-los. O mercado de bioinseticidas formulados
à base de nematóides é quase inexistente. A exceção é
o México, devido à sua proximidade geográfica em
relação aos Estados Unidos, mas existe uma
tendência de maior popularização de tal método de
controle na América Latina, ainda que de forma
lenta e gradativa.
Um ponto importante para o sucesso dos
NEPs é a escolha do nematóide, que deve ser feita
com critério e parcimônia. Nematóides nativos
devem ter prioridade sobre os exóticos, pois estão
adaptados às condições climáticas como também à
entomofauna local. Nematóides entomopatogênicos
devem ser devidamente identificados ao nível de
Apesar dos trabalhos já desenvolvidos e das
condições climáticas favoráveis à implementação
do controle de pragas agrícolas por nematóides
entomopatogênicos das famílias Steinernematidae
e Heterorhabditidae, tal prática ainda não vem sendo
feita comercialmente na América Latina. Há grande
número de pragas economicamente importantes,
típicas das regiões tropical e subtropical, que,
teoricamente, poderiam ser bem controladas por
tais grupos de nematóides (Georgis & Hom, 1992),
porém o método persiste até o momento apenas
como alternativa promissora. Ainda há muito
mercado e espaço para o s n e m a t ó i d e s
entomopatogênicos, pois mais e mais os produtores
estão buscando alternativas aos pesticidas tradicionais.
Pesquisadores vêm fazendo sua parte
Considerações finais
á
espécie e ter a biologia definida antes de serem
usados a campo.
O sistema de multiplicação de nematóides
deve ser escolhido de acordo com a necessidade
e a disponibilidade de espaço e investimento. A pro-
dução in vivo pode ser uma boa alternativa em laborató-
rios, para associações ou pequenas empresas. Este tipo
de produção favorece a formulação em cadáveres. A
desvantagem deste método seria a impossibilidade
de se aumentar a produção (“scale-up”), pois
demanda muito espaço e mão-de-obra. A produção in
vitro em meio sólido, também parece ser uma boa
alternativa para pequenos mercados em franca
expansão. A multiplicação em meio líquido precisa
ser estudada com mais afinco antes de ser implementada,
para que não haja perda da confiabilidade nos
nematóides entomopatogênicos pelo mercado. Por
ser um método mais elaborado, deve-se fazer
uma boa pesquisa de mercado para constatar a
real necessidade de se produzir tão grande quantidade
de juvenis infectantes e aplicar tantos recursos.
Este tipo de produção deve estar associado à
formulação em pó-molhável ou em grânulos, para
que possa atingir grandes mercados. Produtos
biológicos não deveriam chegar ao mercado com
preços mais elevados do que produtos químicos já
estabelecidos. Por isso o custo de produção precisa
ser baixo e o produto de alta qualidade.
Outro ponto que se deve manter em mente é
que uma espécie de NEPs não deve e não pode
ser utilizada para o controle de todas as pragas;
portanto, quando se almeja produzir várias espécies
ao mesmo tempo, deve-se focar no cultivo in vivo
ou in vitro em meio sólido.
De fato, do que foi aqui exposto, verificou-se
o grande potencial dos nematóides entomofílicos e
entomopatogênicos no controle biológico de
pragas agrícolas e urbanas. Mais pesquisas são
necessárias, contudo já se vislumbra um futuro
promissor na utilização desses agentes do controle
biológico no Brasil e na América Latina.
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áçã ó ê
1 Investigador PhD Corpoica C.I Turipaná. Km 13 vía Cereté. Email.
Experiencias con nematodos entomopatógenos en Brasil y en la costa caribe
Introducción
Juan Pablo Molina Acevedo
Los nematodos entomopatógenos (NEPs), son organismos filiformes
no segmentados pertenecientes al género Nematoda. Actualmente son
encontradas más de 30 familias asociadas a insectos, incluyendo aquellos
nematodos que usan plantas como hospederos y animales como vectores,
determinando, así, diferentes asociaciones con insectos, como foréticas
que usan los insectos para transporte y de parasitismo facultativo y
obligatorio, que usan el insecto exclusivamente para multiplicarse, como
es el caso de los denominados NEPs (Kaya y Stock, 1997).
En las últimas décadas los NEPs vienen adquiriendo gran importancia
en programas de control biológico de plagas como agentes microbianos,
evitando parcialmente el uso indiscriminado de insecticidas. Su introducción
junto a otros enemigos naturales constituye una herramienta efectiva en
programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP).
De acuerdo con Georgis y Hom (1992) y Ricci et al. (1996), viene
donde realizados estudios a fin de determinar la biología, epidemiología,
producción, formulación y efectividad de liberación en el campo, de las
familias que han presentado cierta potencialidad como agentes de control
biológico, entre las cuales se destacan: Allantonematidae, Mermithidae,
Steinernematidae y Heterorhabditidae.
Contenido del Capítulo
Con base en calidades con alta virulencia, buenas condiciones de producción
y un número importante de hospederos, las familias que presentan mayor
perspectiva para ser incorporadas en programas de MIP, son Steinernematidae y Heterorhabditidae, las
cuales son utilizadas especialmente para plagas del solo (Poinar, 1990).
En cuanto a la producción masiva de nematodos in vivo e in vitro, en los últimos años, fueron
conquistados avances significativos con relación a la producción en escala comercial de estos nematodos
de tal forma que, actualmente, ya son competitivos con los insecticidas en el control de plagas en cultivos
de medio y alto valor (Gaugler y Han, 2002).
Según Gaugler y Han (2002), para producción in vivo convencionalmente son utilizadas larvas de
Galleria mellonella (Fabricius) (Lepidoptera: Pyralidae). Este hospedero ofrece elevada producción de juveniles
Introducción Aislamiento e identificación de
nematodos entomopatógenos nativos - Muestreo de campo y procesamiento de las muestras
Biología y patogenicidad de aislamientos nativos de NEPs en larvas de Galleria mellonella
Identificación preliminar de aislamientos de nematodos
Producción in vivo de nematodos entomopatógenos en diferentes insectos hospederos
Interacción entre dos aislamientos de Metarhizium anisopliae y el nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora JPM4 durante la infección de
Trabajos preliminares con Nematodos entomopatógenos en ejecución por Corpoica C.I Turipaná.
Conclusiones generales de los trabajos descritos Referencias Bibliográficas
á
aplicados en altas dosis, también fue evidenciado
efecto aditivo en la mortalidad de larvas de Curculio
caryae (Coleoptera: Curculionidae). De la misma
forma Ansari et al. 2004, comprueban la existencia
de interacción entre M. anisopliae aislado CLO53
con los nematodos Heterorhabditis megidis y Steinernema
glaseri, cuando fueron aplicados juntos en altas
concentraciones de inoculo, presentándose una alta
mortalidad aditiva en el tiempo, en larvas de Hoplia
philanthus (Coleoptera: Scarabaeidae).
Por otro lado, las asociaciones de agentes
entomopatógenos, pueden presentar un efecto
antagonista. Shapiro et al, (2004), afirman que
todas las combinaciones entre los nematodos H.
indica, S. carpocapsae con el hongo Paecilomyces
fumosoroseus y la bacteria Serratia marcescens presentaron
antagonismo en la mortalidad de C. caryae. De la
misma forma Lacey et al. (2003) afirman que el uso
simultáneo de los ectoparasitóides Mastrus ridibundus
y Liotryphon caudatus (Hymenoptera: Ichneumonidae)
y Steinernema carpocapsae producen una interacción
antagónica entre los dos grupos, que resulta en la
muerte de las larvas de los parasitoides.
De ese modo, la exploración de nuevos aislados
de NEPs con características deseables (virulentos y
tolerantes al medio ambiente), que potencialmente
existan en Brasil, Colombia y en la región, posibilitarán
el desarrollo de investigaciones referente a la
biología, identificación taxonómica, evaluación de
sistemas de producción y evaluación de diferentes
especies nativas y exóticas, incluso aplicados con
otros microorganismos en insectos plaga de
importancia económica. A continuación se citan
los siguientes trabajos:
infectivos (JIs) (>1 x 105 JIs/larva) y puede ser
usado en la multiplicación de la mayoría de las
especies de NEPs de los géneros Steinernema y
Heterorhabditis. La Promedio de producción, en
ese hospedero, está entre 30.000 a 50.000 JIs por
larva (Poinar 1979), pudiendo llegar hasta 200.000
JIs (Dutky et al. 1964). Otros hospederos alternativos
son conocidos para este fin, entre ellos Spodoptera
frugiperda (Smith), (Lepidoptera: Noctuidae), Amyelios
transitella (Walker) y Tenebrio spp. (Coleoptera:
Tenebrionidae), donde ambos criados fácilmente a
bajo costo (Sirjusingh, 1990; Blinova y Ivanova,
1987 citados por Gaugler y Han, 2002).
Otro problema referente a la producción in
vivo de nematodos es la falta de estandarización en
las técnicas de producción, impidiendo así, que los
NEPs sean incorporados en programas de control
biológico. De esa manera, es necesario buscar
opciones para la producción in vivo, estandarizándolas
y/o mejorando los actuales métodos (Flanders et
al., 1996; Molina y López, 2001).
Por otra parte, trabajos de interacción entre
NEPs y otros organismos como hongos, se han
realizando con relativo efecto controlador en
plagas de importancia económica. Barberchek y
Kaya (1991), evidenciaron que la interacción entre
Heterorhabditis bacteriophora y Beauveria bassiana,
presentó alta mortalidad en larvas de Spodoptera
exigua (Lepidoptera: Noctidae), donde superior a la
presentada por los mismos agentes entomopatógenos
actuando por aislamiento. Shapiro et al, (2004),
afirman que el uso combinado de Heterorhabditis
indica con Metarhizium anisopliae aplicados en bajas
dosis y Steinernema. Carpocapsae con B. bassiana
Aislamiento e identificación de nematodos entomopatógenos nativos - Muestreo de campo y procesamiento de las muestras
Muestras de solo para aislamiento de
nematodos fueron colectadas en el Campus
Universitario de la UFLA y llevadas al laboratorio.
Las muestras fueron sacadas de 11 diferentes áreas
á
de cultivo del Campus de la UFLA como fréjol
(AF), maíz (AM), yuca (Am), frutales (Afr),
forestales (AFl), café (AC), Huerto de Plantas
Medicinales, con diferentes cultivos como coliflor
(AHco), brocolis (AHbr), calabaza (AHbo) y plantas
dañinas (AHpd); y de una área sin cultivo alrededor
de la laguna de la UFLA (ASC).
Cada área muestreada fue de 4m² y fueron
colectadas muestras de suelo entre 15-20 cm de
profundidas, retiradas con pala o cavador. Por área
evaluada fueron sacadas 4 muestras de suelo,
donde cada una de estas compuesta por 4
sub-muestras de 250g, sacadas aleatoriamente de la
área, las cuales fueron mezcladas hasta completar
aproximadamente 1kg de suelo, sumando 44
muestras. En el laboratorio, cada muestra fue
procesada simultáneamente con dos técnicas
diferentes de aislamiento de nematodos: insecto
trampa y embudo de Baermann. La eficiencia de
cada procedimiento también fue evaluada.
- Técnica de insecto trampa: Tomando
como referencia la metodología citada por Kaya y
Stock (1997) y Stock (1998), fueron colocados en
un recipiente plástico (14 x 14 x 7 cm) aproximadamente
200 g de solo, quiénes fueron humectados con
agua destilada esterilizada (ADE) a 15%. Fueron
colocadas 10 larvas de último instar de Galleria mellonella
(Linnaeus) (Lepidoptera: Pyralidae) sobre el suelo
humedecido. Los recipientes fueron incubados a
25 ± 2ºC en fotoperiodo de 24 horas por 3 a 4
días. Las larvas muertas y con síntomas de infección
fueron lavadas con solución de Ringer y colocadas
según la metodología de Molina y López (2001), en
Cámara seca (placa de Petri de 9 cm diámetro con
papel filtro) por más 5 días, en incubadora a 25 ±
2ºC. Despues ese tiempo las larvas fueron colocadas
en trampas de White para que los juveniles infectivos
(JIs) fueran colectados.
- Técnica de embudo de Baermann: Fueron
colocados 100g de solo encima de un embudo con
doble papel filtro. En la parte inferior del embudo,
fue colocada una manguera de 15 cm, cerrada en el
final con una pinza de Mohr. El embudo fue rellenado
con agua hasta saturar la muestra de solo,
permaneciendo así por un período de 24 horas,
cuando fue abierta la pinza de Mohr, colectándose
aproximadamente 10 mL de agua con los nematodos
(Kaya y Stock, 1997). Una alícuota de 2 mL de la
suspensión fue recogida y aplicada en una placa de
Petri de 9 cm de diámetro, conteniendo 5 larvas de
G. mellonella para recobrar JIs y adultos, aplicándose
la misma metodología utilizada en la técnica de
insecto trampa para purificación del inóculo.
Una vez aislados los nematodos, fue estimado
el porcentaje de nematodos aislados por área
(PNEPsAr), por la relación entre el número de muestras
positivas con nematodos entomopatógenos en la
área y el número total de muestras de la área.
PNEPsAr=
Finalmente fue estimado el porcentaje total
de aislamiento (PTNEPsAr), a través la relación
entre el número de muestras positivas con nematodos
en todas las áreas y el número total de muestras
empleadas.
PTNEPsAr =
Resultados: De las 44 muestras de solo
colectadas en once áreas del Campus de la UFLA,
100 área del muestras de totalNº
oaislamient de áreaen NEPscon positivas muestras de Nº
100 muestras de totalNº
áreas las de NEPscon positivas muestras de Nº
á
humedad de las muestras del suelo limita la
supervivencia de los nematodos, como lo que puede
haber ocurrido en la área de cultivo de floresta,
donde fueron encontrados aislados de nematodos
aparentemente entomopatógenos por la morfología
exterior de los especímenes (JPM0, JPM0.1 y
JPM0.2), que no consiguieron sobrevivir quizá por
la baja humedad, coincidiendo con el período seco,
obteniendo poco inóculo vivo para la multiplicación
en el laboratorio. Christopher y Womersley (1990)
y Kung et al. (1990), afirman que suelos con bajo
contenido de humedad, inactivan los JI, estimulando
procesos de quiescencia y anhidrobiosis, donde el
JI reduce su metabolismo llegando incluso a la
muerte, si permanece por un período de tiempo
muy prolongado.
La textura del suelo también puede haber
influenciado en la supervivencia de los NEPs en
las áreas muestreadas. Puede si observar en la
Tabla 1, las áreas pertenecientes al Huerto de
Plantas Medicinales, tienen suelos clasificados
como Oxisol rojo amarillo (L.V), cuya proporción
de arena es mayor que las proporciones de arcilla y
silice, textura que puede haber presentado mejores
condiciones para el desplazamiento de los nematodos
aislados con relación a otros suelos en las otras
áreas de estudio. Por el contrario suelos con alto
contenido de arcilla como los encontrados en las
diferentes áreas como Oxisol (syn. Latosol en Brasil)
púrpura (L.R), Oxisol rojo oscuro (L.E) y Podzólico
rojo amarillo (P.V), por su alta proporción de arcilla
(TABLA 1), pueden ha influenciado el desplazamiento
de los nematodos, ya que las muestras analizadas
no presentaron respuesta positiva para aislamiento
de NEPs (TABLA 1). Estudios hechos por
Barbercheck (1992), Kung et al. (1990) y Portillo et
6,8% del total fueron positivas para NEPs, donde
que todas las muestras positivas estaban localizadas
en el área del Huerto de Plantas Medicinales. Los
aislados recuperados fueron denominados como:
JPM3, JPM3.1 y JPM4 (Tabla 1).
Existen varias condiciones favorables que
pueden haber facilitado la supervivencia de los
NEPs en las áreas positivas de aislamiento, como
el contenido de materia orgánica, la humedad, la
textura del suelo y las cultivos asociadas a las
prácticas agronómicas (fertilización, pesticidas,
etc.). El alto contenido de materia orgánica (M.O)
y el uso de fertilización orgánica pueden haber
contribuido favorablemente para la permanencia
de los nematodos en la mayoría de las áreas del
Huerto de Plantas Medicinales de la UFLA (Tabla
1), lo que demuestra que suelos con alta proporción
de arena y MO y/o fertilización orgánico son
favorables para el establecimiento de poblaciones
de nematodos. En general, en suelos orgánicos, de
texturas arenosas y franco arenosas, la supervivencia
y el desplazamiento son mayores que en suelos
arcillosos (Kaya, 1990; Barbercheck y Kaya, 1991;
Barbercheck 1992; Portillo et al. 2000; Molina y
López, 2002).
Otra característica importante, que posiblemente
fue limitante para el aislamiento de los nematodos,
fue la humedad de las muestras. En la mayoría de
las áreas evaluadas la humedad del suelo era baja,
donde que, en estas áreas, no fue posible aislar
nematodos, coincidiendo con una época seca del
año. Por el contrario, las áreas de aislamiento
positivas, en el Huerto de Plantas Medicinales, por
la constante irrigación, tenían alta humedad en el
perfil del suelo y fue posible el aislamiento de los
NEPs. Según Barbercheck (1992), una baja
á
al. (2000), demuestran que a mayor la proporción
de arcilla, menor es el desplazamiento de diferentes
especies de NEPs, con relación a suelos con texturas
arenosas.
Biología y patogenicidad de aislamientos nativos de NEPs en larvas de Galleria mellonella
Para determinar el ciclo de vida general de los
aislamientos nativos y a fin de confirmar la presencia
de los ciclos corto y largo, 200 larvas de G. mellonella
fueron expuestas a dos concentraciones (40.000 y
500 JIs respectivamente), en 10 placas de Petri (100
X 15 mm) a 25 ± 2°C con papel filtro humectado, cada
placa conteniendo 10 larvas. Las larvas fueron
disecadas diariamente hasta que el ciclo de los
nematodos fuese completado. Larvas infectadas
con alta concentración de inóculo fueron usadas
para establecer el ciclo de vida corto y las larvas
infectadas con a baja concentración de inóculo
fueron usadas para establecer el ciclo de vida largo.
Las larvas fueron disecadas en placas de Petri (60
X 15mm) en solución de Ringer, en mayor aumento
de 400X Leica, con agujas de acero en diferentes
tiempos 6, 12, 24, 36 48 horas y a partir de allí a
cada 24 horas, hasta el nematodo desarrollar todo
el ciclo y agotar completamente el hospedero. Para
cada tiempo, fueron disecadas 10 larvas para
confirmar la presencia de cada fase de desarrollo.
Resultados
- Biología de los aislamientos nativos: A
pesar del complejo ciclo de vida de los cepas, la
formación de las diferentes fases de desarrollo y
estadios fue determinada en horas de acuerdo con
los tiempos fijados en la metodología (Tabla 2).
Una aproximación general en días de cada fase y
estadio, la duración del ciclo corto y largo y el
número de generaciones son presentadas en la
figura 1.
El ciclo de vida de los aislamientos incluye
3 fases de desarrollo: huevo, juvenil y adulto, en
que la fase juvenil posee cuatro estadios
morfológicamente distintos (J1, J2, J3 o JI y J4).
En la fase adulta la primera generación es
compuesta por hembras hermafroditas y la
segunda generación por hembras y machos
anfimicticos. El ciclo de vida puede ser también
largo (2 generaciones definidas con posibilidad de
una tercera) o corto (una generación).
El ciclo fue evaluado hasta un tiempo total
de 456 horas (19 días) desde el inicio de la infección
hasta el agotamiento total del hospedero, determinando
tres generaciones (Figura 1).
Algunos JIs se acumulan en la cápsula cefálica
y en la parte posterior del intestino de la larva.
Estando el JI en el interior de la larva, éste libera
sus células bacterianas, causando septicemia y
llevando el insecto a muerte 48 horas después de la
penetración inicial del JI. En el caso del ciclo de
JPM4, las primeras larvas de G. mellonella muertas
fueron encontradas entre las 24 36 horas después
la inoculación.
Los JIs alcanzan el hemocele del hospedero,
y 48 horas después se inicia el proceso de ecdisis,
con el crecimiento del nematodo y posterior
rompimiento de la cutícula, cuando el nematodo
abandona la cutícula vieja.
á
Tabla 1. Lista de aislamientos de NEPs encontrados en las diferentes áreas de muestreo.
Área No.A T. aislamiento P. NEPs N. Is Textura Fertilización
AF 1-4 Baermann Negativa - LE Químico
PNEPsAr: 0%
AM 1-4 Baermann Negativa - LE Químico
PNEPsAr: 0%
Am 1-4 Baermann Negativa - LE Químico
PNEPsAr: 0%
Afr 1-4 Baermann Negativa - Cd Químico
PNEPsAr: 0%
Afl 1 Baermann Negativa JPM0.1(p) PV M. O. D.
Afl 2 Baermann Negativa JPM0.2(p) PV M. O. D.
Afl 3 Baermann Negativa JPM0 (p) PV M. O. D.
Afl 4 Baermann Negativa - PV M. O. D.
PNEPsAr: 0%
AC 1-4 Baermann Negativa - LE Químico
PNEPsAr: 0%
Ahco 1 Baermann Negativa - LV Orgânico
Ahco 2 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM1 (p) LV Orgânico
Ahco 3 Baermann Negativa - LV Orgânico
Ahco 4 Baermann Negativa - LV Orgânico
PNEPsAr: 0%
Ahbr 1 Baermann Negativa - LV Orgânico
Ahbr 2 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM2 (p) LV Orgânico
Ahbr 3 Baermann Negativa - LV Orgânico
Ahbr 4 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM2.1(p) LV Orgânico
PNEPsAr: 0%
Ahbo 1 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM3 ®/(p) LV Orgânico
Ahbo 2 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM3.1 ®/(p) LV Orgânico
Ahbo 3 Baermann Negativa - LV Orgânico
Ahbo 4 Baermann Negativa - LV Orgânico
PNEPsAr: 50% (Insecto trampa)
Ahpd 1 Baermann Negativa - LV Orgânico
Ahpd 2 Baermann Negativa - LV Orgânico
Ahpd 3 Ins.Arm/Baerm Positiva JPM4 ®/(p) LV Orgânico
Ahpd 4 Ins.Arm/Baerm Positiva - LV Orgânico
PNEPsAr: 25% (Insecto trampa)
ASC 1-4 Baermann Negativa - LR M. O. D.
PNEPsAr: 0%
PTNEPsAr: 6,8%
No.A= Número de muestra; T = Técnica; P.NEPs = Presencia de NEPs; N.Is = Nomenclatura del aislamiento; PNEPsAr
= Porcentaje de nematodos aislados por área; PTNEPsAr = Porcentaje total de nematodos aislados en todas las áreas. In-
s.Arm=Insecto trampa; Baerm=Baermann ® = aislado recuperado; (p) = aislado perdido; AF = Área frijol; AM= Área maíz;
Am= Área yuca; Afr = Área frutales; Afl = Área forestal; AC = Área café; Ahco = Área coliflor; Ahbr = Área brocolis; Ah-
bo = Área calabaza; Ahpd = Área plantas dañinas; ASC = Área sin cultivo; M. O. D.: Materia orgánica en descomposición.
L.R = .Oxisol Púrpúra; L.E = Oxisol Rojo Oscuro; L.V =.Oxisol Rojo Amarillo; P.V.= Podzólico Rojo Amarillo; C.d*.=
Cambissolo distrófico
á
Entre 48 y 72 horas
después la infección se forman
los primeros J4 “pre-adultos”,
quiénes se vuelven hembras
hermafroditas al final de las 72
horas después de la infección.
Éstas van aumentando de
tamaño dependiendo del
espacio y del alimento
disponible. Los huevos son
fecundatos y eclocionan
internamente, iniciando el
proceso de alimentación de
los J1s; otras hermafroditas
desarrollan tardíamente sus
huevos y este proceso dura
hasta 94 horas.
Noventa y cuatro hasta
120 horas después, algunos J1
se transformaron en J2,
rompiendo la cutícula de la
madre hermafrodita, y cerca de las 144 horas, éstos se vuelven J3. En el ciclo corto, éstos J3s conservan
la cutícula del estadio anterior, el
J2, y dejan el cadáver, yendo para
el solo. En este caso específico son
denominados de juveniles infectivos,
poseen el ano y la boca cerrados y
cargan células de bacteria simbionte
(Figura 1).
En cuanto al ciclo largo, éste es
igual hasta la formación de los
primeros J3, sin embargo éstos no
salen del hospedero, y después un
tiempo de 144 hasta 168 horas se
vuelven J4 o pre adultos (Tabla 2).
La segunda generación de adultos
Figura 1. Ciclo de vida del aislamiento JPM04 presentando los diferentes
estadios: J1 = juvenil de primer estadio; J2 = juvenil de según estadio; J3 =
juvenil de tercer estadio no infectante; JI = juvenil infectante de tercer
estadio; J4 = juvenil de cuarto estadio.
Tabla 2. Duración en horas de cada estadio o fase del desarrollo de
los aislamientos en larvas de último instar de Galleria mellonella.
Fases de desarrollo Generaciones en horas (h)
Primera Segunda Tercera
J4 36-48 168 312
Hermafroditas 72
Hermafroditas +
huevos/J1 94
Hermafroditas + J2 120
J3/JI 144-216
Machos y hembras 192 360
Hembras + hue-
vos/J1 216
Hembras +J2 240-264
J3/JI 288-456
á
De acuerdo con Poinar (1976), el ciclo
descrito para Heterorhabditis bacteriophora presentó
un ciclo corto y un ciclo largo con dos generaciones.
Los aislamientos también presentaron un ciclo de
vida corto y un ciclo de vida largo, posiblemente
con tres generaciones, por la prolongada emergencia
desde JIs hasta un poco más de 21 días y por la
formación de adultos de tamaño menor encontrados
en algunas larvas. Los datos concuerdan con Kaya
y Stock (1997), según quiénes en la obtención de
adultos de primera o segunda generación en
heterorhabditídeos la recuperación es hecha de 3 a
4 días después la infección para la primera
generación, de 6 a 9 días para la segunda
generación y 15 o más días para lograr la tercera
generación.
- Patogenicidad: No
fueron verif icadas
diferencias significativas
(P<0,05) entre las pruebas
de patogenicidad en G.
mellonella de los tres
aislamientos nativos
(JPM3.1, JPM4 y JPM3),
donde que entre 24 y 72 horas, fue verificada la
mortalidad total a eso de 90% todos los aislamientos
(Tabla 3). De esta forma, los aislamientos causaron
mortalidad superior al 89%.
La sintomatología exhibida en larvas de G.
mellonella, para los tres aislamientos fue semejante,
con coloración rojo oscuro que, de acuerdo con las
descripciones del género, es característica para
Heterorhabditis, de acuerdo a la descripción de la
sintomatología descrita por Boemare (2002), según
la cual insectos parasitados por heterorhabditídeos
exhiben, en la cutícula, colores rojizos.
con hembras y machos anfimicticos ocurre a las
192 horas aproximadamente. Estos son menores
que las hembras hermafroditas de la primera
generación. Las hembras anfimicticas, entonces,
desarrollan en su interior los huevos, y a las 216
horas se forman los primeros J1, que alteran a J2 a
las 240 horas, y finalmente se forman los J3 a las
288 horas, quienes conservan la cutícula del J2 y
pueden o no abandonar el cadáver. Los J3 que
continuan el ciclo pasan a J4 a las 312 horas y entre
las 336 y las 360 horas se forman los adultos
anfimicticos de tercera generación (TABLA 8).
Finalmente la emergencia de JIs por la falta de
recursos en el hospedero ocurre en un tiempo final
de 456 horas, concluyendo una tercera generación.
Los ciclos de vida de los aislamientos de
NEPs, dependieron de la cantidad del inóculo
empleado, donde que las larvas tratadas con la
concentración baja (500 JIs/200 larvas) y con la
concentración alta (40.000 JIs/200 larvas)
presentaron ciclo de vida largo y corto, respectivamente,
respuesta posiblemente influenciada por la
concentración de nematodo usada, directamente
proporcional a la cantidad de recurso ofrecido por
el hospedero. Adams y Nguyen (2002) afirman que
el ciclo y el número de generaciones de un nematodo
dependen de la disponibilidad de alimento y del
tamaño del hospedero.
Aislamientos de NEPs PMC*
JPM3.1 100,00 ± 0,00 a
JPM4 94,74 ± 1,87 a
JPM3 89,47 ± 1,13 a
CV (%) 4,397
Tabla 3. Porcentaje de mortalidad corregida de larvas de G. mellonella, infectadas
con los aislamientos nativos de nematodos entomopatógenos.
Promedios seguidas por letras distintas difieren entre sí por la prueba de Tukey
(P<0,05) *M ± EP(M)
á
En el ensayo de patogenicidad las 1:1 fue
observada la misma sintomatología rojiza. Fueron
verificadas diferencias significativas (P<0,05) de
mortalidad entre los aislamientos nativos JPM4 y
JPM3.1 con relación al aislamiento JPM3 (Tabla 4),
donde JPM3 fue menos virulento que los
otros aislamientos. Con relación a los
aislamientos JPM4 y JPM3.1, presentaron
mortalidades superiores a JPM3, sin
embargo el porcentaje de mortalidad fue
relativamente bajo, posiblemente por la
infección realizada por un JI, y diferentes
factores del medio, del nematodo y/o del
hospedero, que pudieron interferir en el
proceso de infección. Las larvas infectadas
con los aislamientos de nematodos fueron disecadas
y a las 120 horas ya fue posible ver hembras
hermafroditas de primera generación en su interior
pero no se observó presencia de adultos anfimicticos.
Tabla 4. Porcentaje de mortalidad corregida de larvas de G. mellonella, infectadas con los aislamientos nativos de nematodo ensayo las 1:1.
Promedios seguidas por letras distintas difieren entre sí por la
prueba de Tukey (P<0,05) *M ± EP(M)
Aislamientos de NEPs PMC*
JPM4 60 4,456 a
JPM3.1 53,33 5,87 a
JPM3 30,33 6,13 b
CV (%) 31,74
Identificación preliminar de aislamientos de nematodos entomo-patógenos nativos.
La identificación fue morfométrica, con
medición de las diferentes estructuras del cuerpo
de los nematodos, las cuales fueron comparadas
Promedionte llaves taxonómicas con otras especies
calidad (Kaya y Stock, 1997; Stock, 1998) y
Nguyen (2004), en que caracteres morfológicos
son observados en JI y adultos anfimicticos de
segunda generación (Poinar, 1990; Stock et al.,
1996). En los JIs las medidas tomadas fueron: L =
Largura total del cuerpo; w = Anchura total del
cuerpo; EP = Distancia de la extremidad anterior
al poro excretor; Es = Largura del esófago; EP =
Distancia de la extremidad anterior al poro excretor;
NR = Distancia de la extremidad anterior al anillo
nervioso y los Índices como: Índice la = (L/W);
Índice b = (L/ES); Índice c = (L/T); Índice D (%)
= (EP/ES); Índice Y (%) = (EP/T), donde que
todas las medidas fueron expresas en micrómetros
(µm). Para la medición de los JI en lámina, fue
utilizado un microscopio de contraste de fase Leica
DM LES (HCL3TP), localizado en el Laboratorio
de la Empresa de Investigación Agropecuaria del
Estado de Minas Gerais (EPAMIG).
De los aislamientos nativos multiplicados y
purificados (JPM3, JPM3.1 y JPM4), se determinó
que todos corresponden posiblemente a cepas
geográficos de la especie Heterohabditis bacteriophora,
del municipio de Lavras, Brasil.
Los aislamientos nativos presentan alta
semejanza morfológica entre sí, utilizando como
calidad de comparación todas las medidas
morfométricas determinadas para JIs citadas por
Nguyen (2004), con especial énfasis en el largo
total del cuerpo y la cola de los juveniles infectivos.
Así, estos aislamientos (JPM3, JPM3.1 y JPM4)
hacen parte posiblemente de una misma especie H.
bacteriophora, por la alta semejanza en todos los
11 caracteres determinados con la especie tipo
á
Género Heterohab-
ditis (Poinar, 1976)
H. bacteriophora
(Poinar, 1976)
Cepas JPM3,
JPM3.1 y JPM4
En cuanto al
diagnóstico por
caracterización
morfológica de los
aislamientos JPM3,
JPM3.1 y JPM4,
para confirmar
concluyentemente
su semejanza, es
necesario hacer
otras mediciones,
principalmente en
machos y adicionalmente pueden ser consideradas
mediciones en hembras hermafroditas y anfimicticas
de segunda generación. La ident i f icac ión
morfométrica puede ser finalmente confirmada,
contrastándola con la identificación mediante el
uso de técnicas moleculares.
identificada por Poinar en 1976 (Tablas 5, 6 y 7).
En cuanto a los JIs de los asilamientos, se
destacan como caracteres morfológicos diagnóstico,
que permitió definir el género, la presencia del
diente quitinoso en la extremidad anterior; y para la
identificación preliminar hasta especie, las medidas
de estructuras realizadas sobre los JI.
Aislamiento JPM3 morfométrica H. bacteriophora (Poinar, 1976)
Medida Promedio Desviación
Estandar Min. - Max.
Promedio Min. - Max.
L (µm) 584 20.63 518-617 588 512-670
w (µm) 23.3 2.47 18-28 23 18-31
EP (µm) 106 2.9 97-108 103 87-110
NR(µm) 85 5.88 71-92 85 72-93
ES (µm) 121 6,92 106-139 125 100-139
T(µm) 96 5.62 88-114 98 83-112
a (µm) 25.0 2.74 20-31 25 17-30
b (µm) 4.82 0.35 3.7-5.9 4.5 4-5.1
c (µm) 6.1 0.41 4.6-6.8 6.2 5.5-7
D (%) 0.88 5.38 74-99 0.84 0.76-0.92
E (%) 1.10 6.34 94-123 1.12 1.03-1.30
Tabla 5. Medidas de juveniles (n=30) del aislamiento denominado JPM3.
Producción in vivo de nematodos entomopatógenos en diferentes insec-tos hospederos
El trabajo fue evaluado en el Laboratorio
de Patología de Insectos del Departamento de
Entomología de la Universidad Federal de Lavras.
Material biológico
-Nematodos entomopatógenos: Fueron utilizadas
tres especies de nematodos del género Steinernema:
Steinernema carpocapsae Weiser (1955), Steinernema
glaseri Steiner (1929) Steinernema anomali Kozodor
(1982),
-Insectos hospederos: Para la producción y
mantenimiento de estas especies de nematodos
fueron utilizadas cuatro especies de insectos logradas
de la creación en el laboratorio de Biología de
Insectos del Departamento de Entomología-
UFLA: larvas de último ínstar de Galleria mellonella
(Fabricius) (Lepidoptera: Pyralidae), Tenebrio molitor
á
(Linnaeus) (Coleoptera:
Tenebrionidae), Spodopte-
ra frugiperda (Smith)
(Lepidoptera: Noctuidae)
y Bombyx mori (Linnaeus)
(Lepidoptera: Bombyci-
dae).
Sistemas de infección
En la infección fueron
utilizados tres sistemas:
Topical compuesta
(ToC): Cada especie de
nematodo fue aplicada
en la concentración de
100 ± 10 JIs diluida en
0,5 mL de ADE;
enseguida, se transfirie-
ron 5 larvas de cada hospedero para las placas de
Petri conteniendo papel filtro Whatman # 1
humectado con 1 mL de ADE y el inóculo.
Topical simple: (ToS): Cada especie de
nematodo fue aplicada en la concentración de 20 ±
5 JIs diluida en 0,5 mL de ADE, en placas de Petri
de 5 cm con papel filtro Whatman # 1, donde
enseguida fueron colocadas
las larvas de cada hospedero
individualizadas.
- Inyección (Iny):
Utilizando una jeringa de
insulina de 1 mL fue
inyectada una concentración
de 20 ± 5 JIs diluida en
20 µl de ADE, aplicados
por hospedero, en los
últimos segmentos de la
región posterior ventral
de las larvas (FIGURA
2D). Todas las larvas,
una vez infectadas, fue-
Tabla 6. Medidas de juveniles (n=30) aislamiento JPM3.1).
Aislamiento JPM3.1 morfométrica H. bacteriophora (Poinar, 1976)
Medida Promedio Desviación
Estándar Min. - Max.
Promedio Min. - Max.
L (µm) 591 20,6 570-620 588 512-670
w (µm) 25 5,31 21-30 23 18-31
EP (µm) 107 2,9 92-105 103 87-110
NR(µm) 87 3,78 76-95 85 72-93
ES (µm) 124 6,75 103-138 125 100-139
T(µm) 97 5,8 91-108 98 83-112
a (µm) 23,64 3,14 17-31 25 17-30
b (µm) 4,77 0,36 3.5-6.1 4.5 4-5.1
c (µm) 6,09 0,49 4.2-7 6.2 5.5-7
D (%) 0,86 7,4 0.8-0.96 0.84 0.76-0.92
E (%) 1,1 0,36 1.01-1.29 1.12 1.03-1.30
Tabla 7. Medidas em micrômetros de juveniles (n=30) aislamiento JPM4.
Aislamiento JPM4 morfométrica H. bacteriophora (Poinar, 1976)
Medida Promedio Desviación
Estándar Min. - Max. Promedio Min. - Max.
L (µm) 587 26,27 560-630 588 512-670
w (µm) 23.33 2,69 20-27 23 18-31
EP (µm) 108.2 6,13 97-106 103 87-110
NR(µm) 85 8,49 73-94 85 72-93
ES (µm) 124 5,56 102-141 125 100-139
T(µm) 95 8,29 91-113 98 83-112
a (µm) 25,15 3,03 19-29 25 17-30
b (µm) 4,73 0,32 3.5-6.4 4.5 4-5.1
c (µm) 6,17 0,57 4.3-7.1 6.2 5.5-7
D (%) 0,87 5,84 0.81-0.94 0.84 0.76-0.92
E (%) 1,14 4,21 1.06-1.25 1.12 1.03-1.30
á
pasó principalmente con el sistema de infección
topical simple en G. mellonella, destacándose las
producciones logradas para S. carpocapsae con
302.124 JIs (nuevo registro) para S. glaseri, 132.025
JIs; y para S. anomali, con 149.212 JIs. Como
hospederos alternativos, pueden ser empleados B.
mori con el sistema de infección topical simple para
multiplicar S. carpocapsae con una producción de
128.923 JIs, y T. molitor con el sistema topical
compuesta, con 103.059 JIs.
Estos resultados registran producciones
aproximadas a las encontradas por Dutky et al.
(1964), con 160.000 JIs para S. carpocapsae Mexican
strain en larvas de G. mellonella, y con las registradas
por Molina y López (2001), para S. carpocapsae, con
149.258 JIs/larva. En cuanto a las altas producciones
acumuladas, solamente estaban registradas para
heterorhabditídeos en G. mellonella, como es
presentado en diversos trabajos como Jansson
(1996) que logró para Heterorhabditis Bacardis y
FL2122, una producción de 137.229 y 238.692 JIs/
larva en G. mellonella respectivamente, y Ozer y
Unlu (2003), que lograron, para H. bacteriophora,
141.562 hasta 271.593 JIs, incluso llegando a alcanzar
la producción de 350.000 JIs para esta especie en
G. mellonella (Woodring y Kaya, 1988).
También es importante resaltar, que el tamaño
del hospedero no fue determinante en la producción
lograda por G. mellonella, donde un hospedero
menor (1/9) con relación a B. mori, logró las
mayores producciones del experimento. Por el
contrario, Adams y Nguyen (2002) y Ozer y Unlu
(2003), afirman que la producción es dependiente
del tamaño del cuerpo del hospedero; así, a mayor
tamaño de la larva producen un mayor número de
JIs y vice-versa.
ron mantenidas a 25 ± 2°C y oscuridad constante
durante 48 horas, de acuerdo con metodología de
Taylor y Shields (1990). Se evaluó en todos los
sistemas de infección la producción acumulada de
JIs.
Resultados
Producción acumulada de nematodos entomopatógenos:
Para la especie S. carpocapsae, el sistema de
infección topical simple presentó diferencias (Scott
-Knott P<0,05) con relación a los otros sistemas
empleados, en la mayoría de los hospederos, aparte
S. frugiperda, que no presentó diferencias. En
cuanto al hospedero, principalmente en el sistema
topical simple, G. mellonella fue diferente (Scott-
Knott P<0,05) de los otros hospederos, presentando
la mayor producción del experimento con 302.124
JIs en B. mori (Tabla 8).
Para la especie S. glaseri solo hubo producción
con infección topical simple y compuesta en G.
mellonella, con 132.025 y 125.672 JIs (Tabla 9).
Finalmente, para S. anomali el sistema de
infección topical simple presentó diferencias (Scott
-Knott P<0,05) con relación a los otros sistemas
empleados, con excepción de T. molitor el cual
presentó diferencias a favor del sistema topical
compuesta. En cuanto al hospedero G. mellonella,
hubo diferencias en producción con el sistema
topical simple con 149.212 JIs y T. molitor fue
diferente (Scott-Knott P<0,05) en producción con
el sistema topical compuesta con 103.059 JIs
(Tabla 10).
Por otro lado, las mayores producciones
acumuladas de las especies de nematodos evaluadas
estuvieron determinadas significativamente por la
interacción sistema de infección y hospedero, qué
á
Tabla 8. Producción Promedio diaria para S. carpocapsae.
(Desdoblamiento de la interacción Hospedero x Infección).
Hospedero Sistema de iinfección
Iny ToC ToS
B. mori 0 a A 86.012 c B 128.923 c C
G. mellonella 0 a A 79.607 c B 302.124 d C
S. frugiperda 0 a A 3.418 a A 4.231 a A
T. molitor 0 a A 48.134 b B 33.471 b B
Promedios seguidos de misma letra minúscula en la columna
e mayúscula en la línea no difieren entre si por Scott-Knott
(p0,05)
Tabla 9. Producción Promedio diaria para S. glaseri.
(Interacción Hospedero x infección).
Hospedero Sistema de infección
Iny ToC ToS
B. mori 0 a A 0 a A 0 a A
G. mellonella 0 a A 126.672 b B 132.025 b B
S. frugiperda 0 a A 0 a A 0 a A
T. molitor 0 a A 0 a A 0 a A
Promedios seguidas de misma letra minúscula en la columna e
mayúscula en la línea no difieren entre si por Scott-Knott
Tabla 10. Producción Promedio diaria para S. anomali.
(Interacción Hospedero x infección).
Hospedero Sistema de Infección
Iny ToC ToS
B. mori 0 a A 35.281 b B 53.265 b C
G. mellonella 1.076 a A 51.624 c B 149.212 d C
S. frugiperda 0 a A 0 a A 0 a A
T. molitor 0 a A 103.059 d B 81.460 c C
Promedios seguidas de misma letra minúscula en la columna e
mayúscula en la línea no difieren entre si por Scott-Knott
(p0,05)
De esta forma, puede si concluir que
los sistemas de infección más efectivos
para la multiplicación de todas las especies
de nematodos en orden de importancia
fueron topical simple y compuesta, donde
los mejores sistemas para continuar trabajos
en producción in vivo de otros nematodos.
G. mellonella es el hospedero más efectivo
para producción in vivo para todas las
especies, pero los hospederos B. mori para
la especie S. carpocapsae y T. molitor para la
especie S. anomali presentan óptimas
posibilidades como hospederos alternativos.
Las colectas de NEPs pueden ser hechas
en los cuatro primeros días, ya que del
cuarto día hasta el décimo la producción
decrece, con el riesgo de lograr JIs con
baja virulencia.
á
Interacción entre dos aislamientos de Metarhizium anisopliae y el nematodo entomopatógeno Heterorhabditis bacteriophora JPM4 durante la infección de larvas de la broca de la carrizo Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae).
aplicado en el mismo tiempo, las larvas fueron
infectadas por inmersión con hongos, donde
colocadas en placas de Petri con arena estéril con
la concentración del nematodo. Cuando el hongo
fue aplicado 48 horas antes del nematodo, las
larvas fueron inmersas en la suspensión del hongo
y posteriormente transferidas en las placas de Petri
con arena; después de 24 horas en la arena de las
placas de Petri fue inoculado el nematodo. Cuando
el nematodo fue aplicado 48 horas antes del hongo,
fueron inoculados los JIs en las placas de Petri con
arena, 24 horas después de fueron sacadas las larvas
para ser infectadas por inmersión en los ependorfs
con las suspensiones de los hongos.
Diseño experimental y variables evaluadas:
Como unidad experimental (U.E), fue una
placa de Petri estéril (Diámetro=4.5cm) con 20 g
de arena estéril, 2 mL de ADE y una larva de D.
saccharalis. Fue usado un diseño completamente
aleatorio, con análisis de variancia (P<0,05). En
total fueron constituidos diez tratamientos, cada
uno de los cuales contó con 10 repeticiones. Los
tratamientos fueron: T1=Testigo (aplicación de
100 uL de ADE en la UE); T2=Fmv; T3=Fav;
T4=NEP; T5= Fmv+NEP; T6=Fav+NEP;
T7=Fav+48h NEP; T8=NEP+48h Fav;
T9=Fmv+48h NEP; T10=NEP+48hFmv.
Nota: Las convenciones usadas fueron:
T=Tratamiento; Fmv=Hongo de media virulencia;
Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la
acción individual y conjunta de dos tipos de agentes
entomopatógenos: el nematodo H. bacteriophora
aislamiento JPM4 (Rhabditida Heterorhabditidae) y
dos aislamientos de M. anisopliae LPP45 y LPP39,
de alta y Promedio virulencia respectivamente, en
la mortalidad de larvas de D. saccharalis (Fabr.)
(Lepidoptera: Pyralidae).
El experimento fue realizado en el Laboratorio
de Protección de Plantas, Universidad Estadual del
Norte Fluminense (UENF), Campos,Rio de Janeiro,
Brasil. .
- Hospedero: Como insecto modelo, fueron usadas
larvas del cuarto ínstar de D. saccharalis (Fabr.)
(Lepidoptera: Pyralidae) con peso medio de 0,19 ±
0,03g,
- Nematodos entomopatógenos: Fueron utilizados
juveniles infectivos (JIs) de Heterorhabditis bacteriophora
JPM4 (Rhabditida:Heterorhabditidae), aislamiento
nativo de Lavras MG (Molina, 2004)..
- Hongos entomopatógenos: Fueron usados dos
aislamientos nativos del hongo entomopatógeno
Metarhizium anisopliae aislamientos LPP45 y LPP39
(Deuteromycotina: Hypomycetes), procedentes de
Montenegro – Rondônia Brasil.
Los tratamientos combinados hongo/
nematodo y vice-versa en los diferentes tiempos de
inoculación, fueron evaluados en las siguientes
condiciones: Cuando hongo y nematodo fueron
á
Fav=Hongo de alta virulencia; +48h=agente
entomopatógeno aplicado 48 horas después. Las
variables evaluadas fueron:
- Mortalidad de larvas: Las larvas fueron
observadas cada 24 horas apos infección hasta
confirmar mortalidad. El tiempo final de evaluación
fue hasta cuando todas las larvas murieron. Para
esta variable fue hecho un análisis Probit,
estimando el Tiempo Letal 50 95 (TL50 y TL95).
- Producción de JIs: Variable evaluada para los
tratamientos donde fueron aplicados nematodos.
Así, será contabilizada la producción acumulada de
JIs en trampas de White (1927) hasta el agotamiento
total del hospedero en la multiplicación del NEP.
- Producción de esporas: Variable evaluada para
los tratamientos donde se aplicó el hongo,
determinándose el número total de esporas producidas
por larva. Para esto, después de la esporulación
inicial, las larvas fueron colocadas individualmente
en placas de Petri (D=4,5cm) con papel filtro estéril
por dos semanas, tiempo en el cual se estimó la
máxima esporulación. Posteriormente cada larva
fue colocada en un ependorf con 1mL con ADE,
agitado en vórtex por 30 segundos a 2000 RPM.
Así fue sacada una alícuota de 15ml, donde realizada
la conteo de las esporas en las cámaras de Neubauer.
Para las variables, producción de JIs y de esporas,
fue hecha una prueba de comparación de Promedios
aplicando la prueba de Tukey (P<0,05).
Resultados
-Mortalidad de larvas: Para los agentes entomopatógenos
evaluados en forma individual, se presentaron diferencias
en mortalidad. El hongo de alta virulencia M.
anisopliae LPP45 presentó una mortalidad del 100%
en cinco días, en comparación con el de media
virulencia M. anisopliae LPP39, el cual alcanzó una
mortalidad del 60% en nueve días (Figura 2A). El
nematodo H. bacteriophora JPM4, logró una mortalidad
del 100% en larvas de D. saccharalis, en menor
tiempo con relación a los hongos evaluados. En el
caso del hongo M. anisopliae LPP39 aplicado
simultáneamente con el nematodo, resultó en un
100% mortalidad en D. saccharalis solo en cuatro
días, superior a los agentes entomopatógenos
aplicados, determinando una acción aditiva en la
mortalidad (Figura 2A).
En el caso del hongo de alta virulencia (M.
anisopliae LPP45) aplicado junto con el nematodo
en el mismo tiempo, se presentó una reducción
favorable en el tiempo de mortalidad de D. saccharalis
cuando comparado a la acción individual del hongo,
obteniendo 100% de mortalidad en seis días
(Figura 2A).
Cuando fue aplicado el hongo de media
virulencia 48 horas antes que el nematodo, resultó
un incremento del 30% en la mortalidad de D.
saccharalis con relación a lo hongo aplicado
individualmente, pero esta alta mortalidad del 90%
fue lograda en un mayor tiempo (nueve días) con
relación a la mortalidad presentada por la
aplicación individual del nematodo (5 días) (Figura
2B).
Por lo contrario cuando fue aplicado el
nematodo 48 horas antes del hongo de Promedio
virulencia, la mortalidad alcanzó 100% en los
primeros 6 días, aconteciendo un incremento en la
mortalidad con relación a lo hongo aplicado solo,
sin superar la alta mortalidad acontecida por los
tratamientos hongo y nematodo y nematodo solo
(Figura 2B). Asimismo, cuando fue aplicado el
nematodo 48 horas antes del hongo de alta virulencia,
á
asociación, por el cual no existió evidencia de
efecto aditivo. En el caso del hongo de media
virulencia aplicado 48 horas antes del nematodo,
presentó TL50 y TL95 de 5,2 11,5, reduciendo el
tiempo de mortalidad con relación a lo hongo
aplicado solo. La respuesta lograda en el TL50 y
TL95 por el efecto combinado del nematodo H.
fue alcanzado un 100% de mortalidad en D. sacharalis
en el octavo día, donde más lenta ésta acción
conjunta, que del hongo y nematodo cuando
fueron aplicados individualmente (Figura 2B).
De acuerdo con el análisis Probit, en cuanto
a la estimación del TL50 y TL95, fueron
confirmadas diferencias en la respuesta en mortalidad
de los agentes entomopatógenos
en el tiempo, donde fue evidente
el efecto aditivo por la acción
combinada de los agentes entomopatógenos
(Tabla 11). Cuando fueron
aplicados el hongo de media
virulencia con el nematodo
simultáneamente, fueron logrados
promedios de TL50 y TL95 de
1,8 y 2,8 respectivamente,
confirmando el efecto aditivo de la
asociación de estos agentes
entomopatógenos. De la misma
forma la asociación del hongo de
alta virulencia con H. bacteriophora
JPM4, presentaron bajos valores
de TL50 y TL95 con 2,4 4,4 días
respectivamente, indicando de la
misma forma que esta asociación
propició una reducción en el tiempo
de mortalidad, donde superior al
efecto presentado por el hongo
aplicado individualmente. En los
tratamientos donde fueron aplicados
los hongos 48 horas antes que el
nematodo, los promedios de TL50
y TL95 con 4,8 8,6 respectivamente,
fueron superiores a las encontradas
con relación al mismo hongo sin
Figura 2. A. B. Mortalidad evaluada en días de los tratamientos
individuas hongos y nematodo y los tratamientos combinados hongo
con nematodo. Convenciones usadas: Fmv=Hongo de medía viru-
lencia; Fav=Hongo de alta virulencia; NEP=Nematodo entomopató-
á
bacteriophora JPM4 aplicado 48 horas antes con los
dos hongos, fueron los tratamientos que presenta-
ron menor tiempo de mortalidad con relación a la
TL50 y TL95 presentada por los hongos cuan-
do fueron aplicados individualmente.
-Producción de JIs: En cuanto a la pro-
ducción de H. bacteriophora JPM4, solamente se
confirmó emergencia de JIs en cuatro trata-
mientos, presentándose diferencias significati-
vas (P<0,05). La mayor producción de nema-
todos se presentó en los tratamientos donde
fue el nematodo fue aplicado individualmente y
junto con el hongo de Promedio virulencia,
con producciones de 71383 ± 8.155 y 59455 ±
6243 JIs/larva respectivamente, donde diferentes
con relación a los tratamientos hongo de Promedio
virulencia aplicado 48 horas antes
del nematodo y nematodo aplicado
48 horas después del hongo de alta
virulencia, con 28403±2407JIs y
8592±291 respectivamente (Tabla
12).
Producción de esporas: Fueron
observadas diferencias significativas
(P<0,05) entre los diferentes
tratamientos donde resultó a
esporulación. El tratamiento que
presentó la mayor esporulación, fue
del hongo de alta virulencia con
1,46 x 108±1,2 5x107 esporas/ml, donde estadísticamente
diferente a la presentado con el hongo de Promedio
virulencia y el hongo de alta virulencia con el
nematodo. En este último caso, junto con todos
los tratamientos que tuvo el nematodo, a esporulación
estuvo inhibida por la alta virulencia del
nematodo adentro del insecto, donde una vez
más se confirma que la concurrencia entre éstos
dos agentes entomopatógenos limita la tasa
reproductiva de los mismos (Tabla 13).
Discusión
Éste es el primer estudio donde es evaluado
Tabla 12. Promedio de producción acumulada de JI.
Tratamiento Prod. Acum. ± E.E
NEP 71383 ± 8155 A
NEP+48h Fmv 59455 ± 6243 AB
Fmv+48h NEP 28403 ± 2407 C
NEP+48h Fav 8592 ± 291 D
Promedios seguidos por letras diferentes, son diferen-
tes significativamente, Tukey (p0,05)
Tabla 13. Promedio de número de esporas por larva.
Tratamiento Prod. Acum. ± E.E
Fav 1,46 x 108±1,25x 107 A
Fmv 3,23 x 107± 3,56 x 106 B
Fav+48h NEP 2,14 x 107± 2,23 x 106 B
Promedios seguidas por letras diferentes, são diferen-
tes significativamente, Tukey (p0,05)
Tabla 11. TL50 e TL95 de los tratamientos evaluados.
Tratamientos TL50 TL95
Días LI LS Días LI LS
Fmv 7,44 6,27 9,28 - - -
Fav 4,02 3,41 4,61 6,40 5,62 7,89
NEP 2,15 1,31 2,73 4,38 3,62 6,24
Fmv e JPM4 1,85 1,35 2,24 2,85 2,41 4,05
Fav e JPM4 2,43 1,74 2,97 4,44 3,75 5,94
Fav + 48h NEP 4,81 3,01 6,22 8,60 6,97 13,37
NEP + 48h Fav 3,22 2,25 3,97 6,89 5,85 8,91
Fmv + 48h NEP 5,26 4,10 6,35 11,54 9,59 15,79
NEP + 48h Fmv 3,17 2,46 3,79 5,80 4,94 7,55
á
nematodo, ya que por sintomatología y desarrollo
adentro del insecto, es el agente entomopatógeno
que consigue colonizar y finalmente si reproducir.
Ansari et al.2004, sugieren que el hongo
M.anisopliae posiblemente tuvo un papel estresante
en H. philanthus reduciendo la capacidad de
consumo alimenticio del insecto, teniendo como
consecuencia una homeostasis interna totalmente
alterada, quedándose el hospedero debilitado y
quisquilloso a la infección de los nematodos.
Un aspecto importante en la interacción H.
bacteriophora JPM4 y los hongos evaluados, fue la
capacidad reproductiva de los agentes
entomopatógenos. Cuando fueron combinados el
hongo de Promedio virulencia con el nematodo
aplicado simultáneamente y 48 horas después,
resultó una total inhibición en la producción de
esporas pero no en la multiplicación del nematodo,
obteniendo altas producciones de 59455 28403
JIs/larva, próximas a la producción lograda en el
tratamiento individual con H. bacteriophora JPM4.
Resultados semejantes fueron registrados por
Ansari et al. (2004), quiénes afirman que en la
interacción entre S. glaseri con M. anisopliae se logró
una producción de 30000 a 40000 JIs/larva a cual
no fue diferente con producción individual del
nematodo. De acuerdo con Molina y López (2001),
el promedio de producción de JIs de Steinernematidos
y Heterorhabditidos está en el rango de 30000 a
50000 JIs/larva, por el cual las producciones
logradas en este experimento producto de la
interacción entre los agentes entomopatógenos
está en el rango de multiplicación estandar de los
NEPs.
Ansari et al.(2004), encontraron al aplicar la mayor
concentración de M. anisopliae (1x108 conidias/g), con H.
el efecto combinado de aislamientos de hongos de
diferente virulencia con un nematodo entomopatógeno.
Todos los agentes entomopatógenos utilizados en
este experimento, fueron aislamientos nativos
teniendo como objetivo su posterior uso en el
control biológico de D. saccharalis y otras plagas de
importancia económica de la región. Existen algunos
trabajos de interacción de nematodos con agentes
entomopatógenos como hongos y bacterias
(Barberchek y kaya, 1990; Barberchek y kaya, 1991;
Koppenhofer y Kaya, 1997; Koppenhofer et al.
1999; Ansari et al., 2004; Shapiro et al, 2004).
Estos resultados mostraron un efecto aditivo
en la mortalidad en D. saccharalis cuando específicamente
el hongo de media virulencia (Metarhizium anisopliae
LPP39) fue combinado simultáneamente con H.
bacteriophora JPM4 presentando la mayor mortalidad y
un tiempo letal de infección menor con relación a
los agentes entomopatógenos por aislamiento,
donde el mejor tratamiento del experimento.
Barberchek y Kaya (1991) encontraron que
Heterorhabditis bacteriophora y B. bassiana, presentaron
alta mortalidad en larvas de Spodoptera exigua
(Lepidoptera: Noctidae), con efecto aditivo con
relación a los agentes entomopatógenos separadamente.
Shapiro et al. (2004), encontraron que la mayoría
de las interacciones entre patógenos en la mortalidad
de Curculio caryae (Coleoptera: Curculionidae
ocurrió antagonismo y pocas interacciones
presentaron algún efecto de sinergismo.
Una posible explicación de la eficiencia en
mortalidad y en la reducción del tiempo letal de
infección de la combinación simultánea y anticipada
del hongo de Promedio virulencia con el nematodo,
es el papel supresor que desempeña el hongo colocando
más vulnerable el insecto a la infección del
á
Actualmente se está trabajando con dos aislamientos
nativos de NEP aisladas por Corpoica, la cual se
encontró parasitando naturalmente a Compsus n sp
(Coleoptera: Curculionidae), se purificó el
aislamiento y fue reinoculado en pruebas de
patogenicidad, en larvas y adultos de Compsus, con
100% de mortalidad, donde solo en los adultos se
multiplicaron en bajo volumen. Para confirmar la
patogenicidad por nematodos entomopatógenos,
se utilizó como hospedero alternativo, larvas de
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae).
Fueron obtenidas dos cepas, pertenecientes al
género Steinernema, denominadas Steinernema sp.
CLS2 y Steinernema sp. CLS1, con mortalidades del
95,4 y 89,7% en S. frugiperda y con multiplicación
de 63.784±5.863 y 46.357±9.843 juveniles/larva
respectivamente. Así se confirmó el aislamiento de
dos cepas nativas de Steinernema, de alta multiplicación,
para ser utilizados en trabajos para el control de
Compsus n.sp.. Recientemente, se realizó un convenio
interinstitucional entre Cenicafé y Corpoica C.I
Turipaná, donde especies nativas de estos nematodos
entomopatógenos, caracterizadas en un estudio de
reconocimiento de su diversidad en la región Andina
(López et al., 2007), se evaluaran como potencial
herramienta de control de plagas de importancia
económica en Colombia como, S frugiperda y Aeno-
lamia reducta (Hemiptera: Cercopidae).
megidis, el número de nematodos producidos por
larva decreció significativamente. En cuanto la
producción de esporas por los hongos en los
tratamientos combinados con Heterorhabditis bacteriophora
JPM4, la esporulación siempre estuvo restricta
por la alta virulencia del nematodo dentro del
insecto, donde una vez más se confirma que la
competencia entre éstos dos agentes entomopatógenos,
limita la tasa reproductiva de los hongos. Con
relación a lo efecto antibiótico de los nematodos
entomopatógenos, la bacteria simbiótica puede
estar suprimiendo la acción antibiótica del hongo
para su total desarrollo en D. saccharalis.
Hu y Webster (2000), afirman que durante
las primeras 24 horas del inicio de la infección, la
población de Photorhabdus luminescens C9, bacteria
simbiótica del nematodo H. megidis, aumenta
totalmente produciendo antibióticos aproximadamente
durante 21 días, con la hipótesis que éstos minimizan
la competición de otros microorganismos que
intentan invadir el mismo hospedero. Isaacson y
Webster (2002), afirman que la bacteria simbiótica
Xenorhabdus sp. del nematodo Steinernema riobrave
presenta actividad antibiótica y antimicótica
siguiendo una calidad semejante al de la curva de
crecimiento de la fase estacionaria de la bacteria,
donde que la actividad antimicótica estaba
compuesta de exo y endoquitinasas, proteinasas y
un poco de combinaciones moleculares.
Trabajos preliminares con Nematodos entomopatógenos en ejecución por Corpoica C.I Turipaná.
á
Conclusiones generales de los trabajos descritos En el muestreo de nematodos entomopatógenos
nativos, fueron logrados 6,8% de recuperación de
aislamientos positivos con nematodos
entomopatógenos principalmente la localizada en
el área de plantas dañinas de las 11 áreas evaluadas,
por presentar las mejores condiciones para la
supervivencia y el aislamiento de nematodos, como
poca disturbación del suelo, buena humedad y
poca aplicación de agroquímicos.
La mejor técnica de aislamiento de nematodos
entomopatógenos nativos fue de insecto trampa,
técnica por la cual fueron separadas 100% de las
muestras recobradas con nematodos, con una
eficiencia del 50%. La técnica del embudo de Baermann
no presentó eficiencia, donde poco selectiva para
el aislamiento de nematodos entomopatógenos.
Por identificación morfométrica, los tres
aislamientos fueron considerados cepas de Heteror-
habditis bacteriophora Poinar, (1976). JPM3, 3.1 y 4.
Dichas cepas presentan un ciclo de vida corto
completado en 9 días y largo con tres generaciones
completado en 19 días.
Los sistemas de infección más efectivos para
la multiplicación de todas las especies de nematodos
en orden de importancia fueron topical simple y
compuesta, donde los mejores sistemas para continuar
trabajos en producción in vivo de otros nematodos.
G. mellonella es el hospedero más efectivo
para producción in vivo para todas las especies,
pero los hospederos B. mori para la especie S. carpocapsae
y T. molitor para la especie S. anomali presentan
óptimas posibilidades como hospederos alternativos.
La combinación entre el nematodo H.
bacteriophora JPM4 y hongo de media virulencia M.
anisopliae LPP39, presenta un efecto aditivo en la
mortalidad de larvas de D. saccharalis e se incrementa
la eficiencia de los dos agentes entomopatógenos.
En los trabajos ha ser realizados en el caribe
Colombiano, debe caracterizar inicialmente NEPs
nativos con alta virulencia, resistencia a altas
temperaturas y alta multiplicación, en las plagas de
importancia económica para la región. Aun
los trabajos están en fase exploratoria.
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Campinas, SP, 13001-970;
No Brasil, com a expansão de áreas cultivadas e uma exploração
agrícola cada vez mais intensa e menos diversificada, tem sido notado ao
longo dos anos um aumento significativo no número de pragas de solo,
deixando os agricultores na dependência muitas vezes do controle químico.
Tal prática, ao longo do tempo, pode trazer conseqüências indesejáveis
ao meio ambiente e à saúde humana, além de que nem sempre tem
proporcionado resultados de controle plenamente satisfatórios. Em nível
mundial, o panorama pouco diverge e, em razão disso, o controle biológico
de pragas de solo, que já tem sido bastante estudado há mais de 60 anos,
buscou tornar-se alternativa viável aos produtores rurais; nessa linha, o
emprego mais intensivo de nematóides entomopatogênicos constitui
técnica de adoção relativamente recente e ainda em fase de expansão em
muitos países, inclusive no Brasil.
Introdução
Ciclo de vida
Histórico no Brasil
Pesquisas realizadas pelo Instituto Biológico
Considerações Finais
Referências Bibliográficas
O juvenil de terceiro estágio (infectivos)
(Figura 1) dos nematóides esteinernematídeos e
heterorhabditideos não se alimenta e carrega suas
bactérias mutualisticas específicas no intestino
(Leite et al. 2006). Os juvenis infectivos (JI)
entram em seus insetos hospedeiros através das
aberturas naturais (boca, ânus e espiráculos) e
penetram no hemocele. No caso específico do
gênero Heterorhabditis, os juvenis infectivos podem
penetrar também diretamente pelo tegumento.
Dentro do hemocele, os juvenis liberam células
da bactéria que se propaga e mata o hospedeiro em
48 horas. Os nematóides se alimentam da bactéria e tecido hospedeiro, se reproduzem por 2 a 3 gerações
e emergem dos cadáveres como juvenis infectivos para a procura de novos hospedeiros (Figura 2).
Figura 1. Juvenis infectivos do nematóide
Steinernema sp.
No Brasil, Lauro Travassos foi o grande pioneiro
no campo da Helmintologia e várias de suas
publicações, principalmente a partir da década de
1920, contribuíram decisivamente ao conhecimento
dos nematóides das famílias Oxyuridae e Thelastomatidae,
parasitos de miriápodos e insetos. Ressalta-se o
trabalho de 1927, em que transferiu a espécie Aplectana
kraussei para um novo gênero por ele denominado
Steinernema, hoje um dos mais importantes, senão o
principal, no âmbito da Nematologia de Insetos
(Wouts et al., 1982). Outro registro histórico significativo
foi o relato, também no Brasil, por C. Pereira em
1937, de um nematóide encontrado associado a
Eutinobothrus brasiliensis, a broca do algodoeiro, por
ele nomeado Rhabditis hambletoni. Quase 40 anos
depois, com a criação do gênero Heterorhabditis,
essa espécie foi transferida para ele, resultando o
novo nome Heterorhabditis hambletoni (Poinar, 1979).
á
Figura 2 – Ciclo biológico dos nematóides dos gêneros Steinernema e Heterorhabditis (Leite et al. 2006).
Essa foi, portanto, ao que tudo indica, a primeira
espécie conhecida do gênero Heterorhabditis, embora
muitos a considerem ainda hoje como species
inquirenda.
Os trabalhos nacionais tratando de associações
entre nematóides e insetos resumiram-se por muito
tempo aos estudos pioneiros, já citados no item 2,
realizados por L. Travassos na primeira metade do
século passado, além do relato também significativo,
mas isolado, de R. Pereira, datado de 1937. Em
termos práticos, somente são retomados a partir da dé-
cada de 1980, quando Pizano et al. (1985) relataram o
parasitismo de S. glaseri sobre ovos de Migdolus
fryanus, um coleóptero-praga da cana-de-açúcar
no interior paulista, e com Arrigoni et al. (1986),
que realizaram estudo de campo com população
importada de S. carpocapsae visando a avaliar a sua
eficiência no controle de larvas dessa mesma praga,
mas com resultados inconclusivos.
Nessa ocasião, dentro de publicação mais ampla
que tratava do controle microbiano de pragas no País,
Ferraz (1986), teve a oportunidade de incluir um
primeiro capítulo abordando, de forma geral, o
tema „Nematóides Entomopatogênicos‟, buscando
assim divulgar melhor o assunto bem como alertar os
pesquisadores nacionais sobre a sua importância.
Ferraz & Monteiro (1987) relataram o parasitis-
mo de diferentes insetos considerados pragas de
interesse no Brasil por nematóides mermitídeos do
gênero Hexamermis. Nos anos seguintes, Follegati
et al. (1988) estudaram a produção in vivo de S.
carpocapsae usando larvas de Diatraea sacharalis, a
broca da cana-de-açúcar, e Leite et al. (1990)
verificaram que a produção de S. glaseri sobre lagartas
de G. mellonella, mortas por aquecimento ou
á
congelamento, pode ser três ou quatro vezes mais
elevada do que sobre lagartas vivas. Schmitt et al.
(1992) conduziram ensaios de campo com dois
isolados de S. carpocapsae, aplicados sobre pseudocaules
partidos, para o controle de adultos do coleóptero
Cosmopolites sordidus o “moleque” ou broca da
bananeira, com resultados bastante satisfatórios
e superiores aos obtidos mediante liberação dos
nematóides no solo ao redor das plantas. Aguillera
& Smart (1993) estudaram o desenvolvimento,
a reprodução e a patogenicidade de S. scap-
terisci , parasito de paquinhas , em cul turas
monoxênicas com diferentes espécies de bactérias;
o nematóide desenvolveu-se bem e multiplicou-se
sobre Xenorhabdus nematophilus e X. bovienii, entre
outras bactérias, situando-se as dosagens letais para os
insetos testados entre 1000 e 4000 juvenis infectivos.
Passos Jr. et al. (1995) e Passos Jr. & Alves (1995)
avaliaram o potencial de S. carpocapsae, isolado
Exhibit, para o controle da saúva-limão, Atta
sexdens rubropilosa, e do cupim Heterotermis tenuis sob
condição de laboratório. O nematóide, aplicado à
dose de 1000 juvenis infectivos/cm2 de superfície
foliar, acabou contaminando formigas operárias
durante a movimentação destas, embora elas
aparentemente não cortassem as folhas tratadas;
com isso, o nematóide acabou sendo introduzido
no sauveiro, inclusive na câmara em que estava a
rainha, tendo causado mortalidade de exemplares
do inseto de diferentes castas (27,3; 90,7; e 96,4% para
jardineiras, operárias e soldados, respectivamente) e
reduzido o volume do fungo utilizado pela colônia
como alimento. No caso dos cupins, os resultados,
embora promissores, foram inconclusivos porque
o composto químico utilizado com o propósito
de simples reativação dos nematóides infectivos
mostrou-se também tóxico ao inseto-teste. Alves et
al. (1998), Ferraz (1998) e Neves et al. (1998), em um
mesmo livro-texto, publicaram novos capítulos
enfocando diferentes aspectos relacionados ao uso
dos nematóides entomopatogênicos.
Embora não envolvendo uma espécie tipicamente
classificada como nematóide entomopatogênico, há de se
lembrar o bem sucedido programa de controle da
vespa da madeira dos pinheiros nos estados do Sul
pelo neotilenquídeo Beddingia siricidicola, implementado
pela EMBRAPA/CNPF a partir da década de
1990 até o presente.
A partir do ano 2000, esse campo de estudo
começou a ganhar destaque no País, com a realização
de um primeiro Workshop sobre o assunto em
Araras (SP), do qual resultou um artigo relevante
(Grewal et al., 2001) em que se ressaltava o potencial
de uso dos nematóides entomopatogênicos no
Brasil e na América Latina; em 2001
e 2003, outros importantes eventos,
que contaram com a participação
de vários especialistas estrangeiros,
foram promovidos em Campos do
Goytacazes (RJ). A partir daí, grupos
de pesquisas foram estabelecidos
principalmente em Lavras (UFLA-MG), em
Campos dos Goytacazes (UENF-RJ) e em Campinas
(Instituto Biológico-SP), além de vários outros,
emergentes ou já pré-existentes, em Araras, Botucatu,
Jaboticabal, Piracicaba e São Paulo.
No Estado de São Paulo, nematóides estão
sendo avaliados para o controle da mosca dos
fungos (fungus gnat), Bradysia sp. (Diptera: Sciaridae),
em viveiros de mudas e em cultivos de cogumelo;
bicudo da cana-de-açúcar, Sphenophorus levis
(Coleoptera: Curculionidae); cigarrinha da raiz da
cana-de-açúcar, Mahanarva fimbriolata (Hemiptera:
Cercopidae); broca do rizoma da cana-de-açúcar,
Migdolus fryanus; larvas de escarabeídeos também
em cultivos de cana-de-açúcar; traça Opogona sachari,
em cultivos de cogumelo shiitake; besouro
“cascudinho”, Alphitobius diaperinus, em aviários;
“bicho furão” do citros, Echiditolopha aurantiana; e
mosca das frutas, Ceratitis capitata. Testes avançados
de campo já evidenciaram a eficácia e viabilidade
de uso de nematóides para o controle de S. levis, da
mosca dos fungos e da traça O. sachari, esta em
cultivo do cogumelo shiitake (Leite et al., 2005).
Ainda em São Paulo, em condições de laboratório,
altas taxas de mortalidade foram obtidas mediante
inoculações de adultos e ninfas do percevejo castanho
(Scaptocoris castanea) e de operárias e soldados do
cupim de montículo Cornitermes cumulans com S.
carpocapsae à razão de 1000 juvenis/
inseto; no caso dos cupins, S. glaseri
também foi testado, mas mostrou-se
menos eficaz (Rosa et al., 2003 a,b).
No Estado do Rio de Janeiro, numa
primeira fase, estudos básicos sobre a
biologia e embriologia de nematóides
entomopatogênicos, bem como sobre a histopatologia
de insetos por eles parasitados, têm sido desenvolvidos.
Além disso, nematóides oriundos de solo amostrado
em diferentes regiões do País têm sido avaliados
quanto à eficiência como agentes do biocontrole
de pragas, principalmente para o controle do
gorgulho da goiaba, Conotrachelus sp., muito
importante nas áreas de produção do Noroeste do
Rio de Janeiro. Os estudos iniciais mostraram que,
dentre nove linhagens testadas, Heterorhabditis indica
„Hom 1‟ e H. baujardi „LPP7‟ apresentaram taxas de
á
Múltiplos aspectos da utilização dos nematóides entomopatogênicos começam a se tornar freqüentes no País, indicando o crescente
interesse de jovens pesquisadores
mortalidade do inseto superiores a 80% em placas
de Petri com areia, no laboratório, à razão de 100
juvenis infectivos/placa; quando testados em
coluna de areia, ambos foram eficientes em
encontrar larvas do besouro, com mortalidade da
ordem de 70% à concentração de 500 juvenis/
coluna. No campo, os ensaios realizados, pelos
quais lagartas mortas de G. mellonella infectadas por H.
baujardi „LPP7‟ criadas pelos próprios agricultores
foram distribuídas no solo ao redor de goiabeiras
atacadas, ofereceram resultados preliminares
alentadores, com diminuição em relação à testemunha
de quase 90% na população de adultos da praga.
Melhoramento dos nematóides visando melhor
adaptação às temperaturas elevadas da região vem
sendo conduzido, tendo já sido obtida a linhagem
LPP728 de H. baujardi, tolerante a até 34C e com
a mesma virulência da linhagem original, mas 50%
menos prolífica (Dolinski, 2005).
Em Minas Gerais, além de pesquisas básicas em
que se busca a seleção de populações autóctones
com bom potencial ao emprego no biocontrole,
novas técnicas de produção massal in vivo e melhorias
nas condições de armazenamento dos nematóides
á
entomopatogênicos já disponíveis para uso, estudos
vêm sendo desenvolvidos visando ao controle da
cochonilha rosada em cultivo de café, de tripes em
cultivos protegidos e de carrapatos de importância
veterinária (Moino Jr. & Furlong, 2005). No Mato
Grosso do Sul, há estudos relativos ao controle do
percevejo castanho (Scaptocoris castanea) e, no
Maranhão, contra a broca gigante da cana-de-
açúcar, Castnia licus (Arruda et al., 2004; Vivan,
2005).
Dissertações de mestrado e teses de doutorado
envolvendo múltiplos aspectos da utilização dos
nematóides entomopatogênicos começam a se
tornar freqüentes no País, indicando o crescente
interesse de jovens pesquisadores pelo assunto.
Tal fato, aliado à realização de estudos e projetos
cooperativos entre diferentes instituições nacionais,
oficiais ou privadas, permitem antever que o uso
comercial dos nematóides entomopatogênicos no
Brasil, como já ocorre em outros países, deverá
tornar-se realidade e estar consolidado em futuro
próximo.
O Instituto Biológico (IB), em parceria com
a empresa Bio Controle Métodos de Controle
de Pragas Ltda, vem estudando nematóides
entomopatogênicos para o controle biológico
de pragas com financiamento da Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo -
Fapesp, dentro do Programa de Inovação Tecno-
lógica em Pequenas Empresas - PIPE (Fase I e II)
(Leite et al. 2006).
O primeiro passo da pesquisa foi estabelecer
uma coleção de nematóides entomopatogênicos
procurando-se explorar a biodiversidade desses
organismos existente no país. O IB vem avaliando
esses agentes para o controle de diversas pragas, e
alguns nematóides, como o H. indica IBCB-n5 e
Steinernema sp. IBCB-n6, tem se mostrado bastante
promissor.
O Instituto Biológico vem estudando a produção
“in vitro” de nematóides entomopatogênicos,
procurando adaptar os processos da esponja e de
fermentação para as condições do Brasil. Até o
momento tem sido estudado apenas o processo da
esponja, sendo já desenvolvido um meio de cultura
a base de fígado
bovino, o qual
permite produções
de até 180.000 JI/
mL para H. indica
IBCB-n5 e até
200.000 JI/mL para
Steinernema sp.
IBCB-n6 (Figura 3).
Uma formulação pó
-molhavel de H.
indica e outra em esponja de Steinernema sp. foram
desenvolvidas, permitindo a preservação desses
nematóides por dois meses nas temperaturas de
15º e 24ºC, e uma semana na temperatura de 35ºC.
Nematóides entomopatogênicos têm sido
avaliados para o controle de diversos insetos pragas,
apresentando-se bastante promissor para o controle
de fungus gnat, Bradysia sp. (Diptera: Sciaridae),
que é praga em viveiros de mudas e cultivos de
cogumelos; e contra o bicudo da cana-de-açúcar,
Sphenophorus levis (Coleoptera: Curculionidae).
Fungus gnat: “Fungus gnats” são moscas
pequenas do gênero Bradysia, consideradas
importantes pragas em cultivos de cogumelos e
viveiros de mudas, atacando citros, fumo,
ornamentais, e diversas outras plantas de importância
econômica. As larvas do inseto se alimentam de
fungos, algas e matéria orgânica em decomposição,
vivendo em ambientes úmidos e escuros. Todavia
quando se estabelecem, as larvas
passam a se alimentar das raízes das plantas,
principalmente as raízes mais finas, com túneis nas
raízes mais grossas, provocando danos de grande
importância, principalmente em mudinhas em fase
de germinação, e a morte das plantas em casos de
infestação pesada. Além disso, esses danos podem
contribuir para a infecção das plantas por fungos
fitopatogênicos dos gêneros Pythium, Botrytis,
Verticillium, Fusarium, Thielaviopsis, Cylindrocladium e
Sclerotinia.
Até 1966, esta mosca não era considerada praga
nos EUA, sendo sua presença apenas inconveniente.
Atualmente é uma praga mundial e no Brasil, nos
últimos anos, tornou-se uma importante praga,
sendo disseminada de Norte a Sul, e desconhecida
pela grande maioria dos viveiristas e produtores
em estufas. Estima-se que existem no país mais de
15.000 estufas com mudas de plantas, as quais po-
dem estar infestadas com a mosca dos fungos.
á
Figura 3. Nematóides Steinerne-
ma sp. (A) e Heterorhabditis indi-
ca (A) cultivados pelo processo
de esponja
A
B
Não existe nenhum inseticida registrado para o
controle desse inseto no Brasil. Nos EUA, Europa
e outros países, um método bastante conhecido e
utilizado com eficiência é o controle biológico por
meio do nematóide Steinernema feltiae. O ambiente
úmido e sombreado predominante em áreas de
propagação de mudas favorece o nematóide que
ataca tanto a larva como a pupa do inseto. O IB
vem avaliando nematóides para o controle da mosca
dos fungos, tendo selecionado em laboratório a
espécie H. indica IBCB-n5 como a mais virulenta,
proporcionando nível de mortalidade do inseto na
dosagem de 10 JI/cm2 (89%) semelhante ao obtido
com a espécie S. feltiae (84%) (Leite et al. 2006).
Cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar:
Cigarrinhas representam um dos grupos de insetos
mais importantes para a cana-de-açúcar em vários
países da América Latina, como no Brasil, Argentina,
Venezuela, México, América Central e Trinidad
Tobago. A cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar,
Mahanarva. fimbriolata (Stal, 1854), tornou-se uma
das principais pragas da cultura no Estado de São
Paulo com a expansão do sistema de colheita
mecanizada (cana-crua). As ninfas (Figura 4)
atacam a raiz, reduzindo a produção em até 40%.
No manejo integrado da cigarrinha da raiz, o con-
trole biológico tem ocupado posição de destaque
pelo uso do fungo Metarhizium anisopliae, agente
que ocorre naturalmente na população desse inseto.
O fungo tem sido usado em larga escala no controle
desse inseto, podendo ter um grande aliado com a
implementação do uso de nematóides entomopatogênicos
para o controle de pragas de solo em cana-de-
açúcar.
á
Os nematóides entomopatogênicos dos gêneros
Steinernema e Heterorhabditis têm sido citados desde
1981 como agentes potenciais para o controle de
cigarrinhas pragas da cana-de-açúcar. Em teste de
laboratório realizado no Instituto Biológico, avaliando
diferentes nematóides entomopatogênicos contra
ninfas de M. fimbriolata, foi possível selecionar um iso-
lado de Heterorhabditis sp. (CB-n5) proporcionando
100% de mortalidade do inseto.
Esse nematóide tem sido produzido "in vitro" e
avaliado em condições de campo contra a cigarrinha
da raiz além de outras pragas da cana-de-açúcar
(Leite et al. . Em um dos testes, o nematóide foi
aplicado sobre a palhada e sobre o solo (retirando
temporariamente a palhada) nas dosagens de 6,6
x 107, 3,3 x 108, 6,6 x 108 e 3,3 x 109 JI/ha.
Todas as dosagens proporcionaram níveis de
controle semelhantes, independentemente da data
de avaliação, reduzindo a população de ninfas no
12 dia em 56 a 67% para o nematóide aplicado
sobre a palhada, e 66 a 73% quando aplicado no
solo, retirando-se temporariamente a palhada. Esse
estudo mostra que a palhada não afeta a eficiência
Figura 4. Ninfas de Mahanarva fimbriolata
do nematóide, permitindo alcançar o solo e encontrar
o hospedeiro.
O nematóide aplicado nessa dosagem manteve
níveis de controle da cigarrinha acima de 50% por
até 82 dias (Figura 5). Ao longo do experimento
foram encontradas algumas ninfas da cigarrinha
mortas pelo nematóide, apresentando o sintoma
característico de coloração avermelhada (Figura 6).
Bicudo da cana-de-açúcar: O bicudo da
cana-de-açúcar, Sphenophorus levis, é uma im-
portante praga dos canaviais no estado de São
á
Figura 6. Ninfa de Mahanarva fimbriolata morta pelo
nematóide Heterorhabditis sp.
Figura 5. Flutuação populacional de ninfas de Mahanarva fimbriolata nas parcelas tratadas com o nematóide
Heterorhabditis sp. na dosagem de 6,6 x 107 JI/ha. Testemunha = ______. Nematóide = ______.
Paulo. As larvas desse inseto destroem rizoma da
planta, causando prejuízos da ordem de 30 toneladas
de cana por hectare, além de reduzir a longevidade
do canavial.
A importância de S. levis como praga da
cana-de-açúcar no Brasil somente foi conhecida a
partir de 1977, sendo que 1989 o inseto foi detectado
em 14 municípios ao redor de Piracicaba causando
a morte de 50-60% dos perfilhos ainda na fase de
cana-planta, com cinco a sete meses de
á
crescimento. Atualmente, S. levis encontra-se
distribuído em mais de 70 municípios, estando portanto
em quase todas as regiões de cultivos de cana-de-açúcar
do estado de São Paulo e em outros estados.
Nos EUA e Japão, algumas espécies de Sphenophorus
são pragas importantes em gramados, sendo
eficientemente controladas pelo uso dos nematóides
H. bacteriophora e S. carpocapsae. Esses nematóides
foram eficientes no controle de S. purvulus e S. vena-
Figura 7. Mortalidade de larvas de Sphenophorus levis tratadas com os nematóides Steinernema sp. (S) e
Heterorhabditis indica (H) nas dosagens de 2,4; 12 e 60 JI/cm2. Dados corrigidos pela formula de Abbott.
tus em testes de campo realizados nos EUA para a
primeira espécie, e no Japão para a segunda. O
nematóide S. carpocapsae na dosagen de 2,5 x 109
JI/ha proporcionou níveis de controle variáveis de
70,4 a 91,2% contra S. purvulus, e de 77,3 a 96,2%
contra S. venatus. Já H. bacteriophora testado na mesma
dosagem, foi pouco menos eficiente contra S.
purvulus, proporcionando níveis de controle variáveis
de 67,0 a 84,1%. Todos os estágios imaturos
desses insetos são susceptíveis a nematóides
entomopatogênicos, sendo que os adultos da espécie
S. venatus são suscetíveis também ao nematóide S.
carpocapsae (Smith 2005).
Inicialmente, foi realizado um teste de laboratório
para avaliar a susceptibilidade de larvas de S. levis
aos nematóides Heterorhabditis indica (isolado IBCB-
n5) e Steinernema sp. (IBCB-n6). Esse estudo
demonstrou que as larvas são susceptíveis a esses
agentes, o que motivou a instalação de um
segundo ensaio, em casa de vegetação, para comparar a
eficiência desses dois nematóides contra larvas de
S. levis alojadas dentro do rizoma da planta,
em condições de ambiente mais próximos
das condições de campo (Tavares et al. 2007). O
nematóide Steinernema sp. apresentou-se mais eficiente
que H. indica, proporcionando mortalidade do inseto de
70% quando avaliado já na menor dosagem de 2,4
JI/cm2, equivalente a 1 x 108 JI/ha (Figura 7).
Todas as larvas mortas do inseto encontravam-se
dentro dos canais construídos no rizoma da planta
(Figura 8), alojadas em distâncias de até 4 cm a
partir da abertura do canal, o que demonstra a
capacidade desses dois nematóides para a localização e
busca do hospedeiro, locomovendo-se inicialmente
pelo solo e, em seguida, pelo canal até alcançar o
inseto.
Em outros ensaios, os nematóides H. indica e
Steinernema sp. foram avaliados em associação
com subdosagens de inseticidas químicos quanto
a mortalidade de larvas e adultos de S. levis em con-
dições de laboratório (Tavares et al. 2009). Nos
testes com larvas, as combinações nematóide-
inseticida não proporcionaram nenhuma contribui-
ção para o incremento na mortalidade do inseto.
Porém, nos testes com adultos, ocorreu um efeito
de sinergismo para várias combinações entre os
nematóide e os inseticidas, principalmente para a
mistura Steinernema sp. (1 x 108 JI/ha) + thiametho-
xam 250 WG (250 g p.c./ha), com níveis de mor-
talidade de adultos acima de 70% (Figura 9). Os
nematóides H. indica e Steinernema sp. se reproduziram
dentro dos adultos de S. levis mortos nas diferentes
combinações nematóides-inseticidas (Figura 10), o
que destaca essa fase do inseto como importante fon-
te de inóculo para a reciclagem desses nematóides no
ambiente, principalmente em áreas tratadas com a
mistura de Steinernema sp. + thiamethoxam.
Figura 8. Larva de Sphenophorus levis infectada pelo
nematóide Heterorhabditis sp., dentro do rizoma da
cana-de-açúcar.
á
Finalmente, foi feito um teste de campo
procurando avaliar a eficiência desses nematóides
contra o bicudo da cana-de-açúcar, e o efeito da
associação desses agentes na dosagem de 1 x 108
JI/ha, com subdosagens do thiamethoxam 250
WG. O experimento foi instalado no início de
fevereiro de 2004, em período chuvoso, quando o
solo apresentava umidade favorável para ação
dos entomopatógenos. Os nematóideSteinernema sp.,
testados isoladamente, proporcionaram ganhos na
produção de 10 e 15 t/ha, s H. indica e respectivamente,
quando comparados a testemunha com rendimento
á
de 101 t/ha (Figura 6). O melhor tratamento foi a mistura do
nematóide Steinernema sp. com o inseticida na subdo-
sagem de 500 g p.c./ha, proporcionando um incre-
mento na produção de cana de até 28 t/ha.
Escarabeídeos: Diversas espécies de insetos da
família Scarabaeidae ocorrem na cultura da cana-
de-açúcar. São considerados de menor importância
que S. levis, no entanto, estão mais distribuídos
nos canaviais paulistas, podendo alcançar níveis de
infestação de até 76 insetos em uma área de 4 m2
por 0,3 m de profundidade.
Figura 9. Mortalidade de adultos de Sphenophorus levis tratados com os nematóides Heterorhabditis indica e
Steinernema sp. nas dosagens de 2,4; 12 e 60 JI/cm2, em diferentes combinações com subdosagens dos in-
seticidas fipronil 800 WG (62,5 g p.c./ha), e thiamethoxam 250 WG (250 g p.c./ha).
No mane-
jo inte-
grado
de besouros
escarabeídeos tem sido recomendado o uso de ne-
matóides entomopatogênicos como alternativa de
controle do inseto. Em teste de laboratório realiza-
do no Instituto Biológico os nematóides S. glaseri
(CCA), Heterorhabditis sp. (CB-n5) e S. carpocapsae
(CCA) foram avaliados contra larvas de escarabeí-
deos, na dosagem de 200 JI/inseto, proporcionan-
do mortalidades do inseto de 80,0%, 63,3% e
16,6%, respectivamente. O nematóide Heterorhabdi-
tis sp. (CB-n5) foi testado em campo de cana-de-
açúcar (cana-planta), proporcionando níveis de
controle das larvas de escarabeídeos de 67 e 89%
nas dosagens de 5 x 107 e 5 x 108 JI/ha, respectiva-
mente, em avaliação feita 52 dias após a aplicação.
Traça Opogona sacchari : A traça Opogona sac-
chari é uma praga de ampla distribuição geográfica
tendo sido constatada em várias culturas no estado
de São Paulo, incluindo cultivos do cogumelo shii-
take.
O cogumelo shiitake Lentinula edodes, é um fungo
aeróbico decompositor da madeira, tradicionalmente
cultivado em toras de carvalho em vários países e
no Brasil é cultivado em toras de Eucaliptus spp., arvo-
re abundante e de baixo custo. Para a produção do
shiitake, a umidade relativa deve ser elevada e as
toras inoculadas irrigadas diariamente, as quais são
geralmente mantidas sob módulos de sombrite.
Esta condição de umidade e penumbra favorece a
presença e proliferação da
Nas toras de eucalipto, as larvas da traça abri-
gam-se embaixo da casca, alimentando-se da mes-
ma e do micélio do fungo previamente inoculado,
comprometendo a produção. O controle químico
deste inseto é dificultado por este comportamento,
devido à barreira imposta pela camada suberina. Além dis-
so, o cogumelo shiitake é um produto comercializado
como orgânico ou de agricultura natural,
inviabilizando o uso de defensivos químicos
tradicionais.
Em contrapartida, nematóides entomopatogênicos
possuem grande potencial para o controle desse
inseto, pois apresentam comportamento de busca
do hospedeiro e locomovem-se facilmente em
ambientes crípticos, sendo bastante favorecidos
pelo ambiente de cultivo do cogumelo, com
sombreamento e alta umidade.
O IB desenvolveu algumas pesquisas nesse
assunto, tendo inicialmente comparado a eficiência
de 3 espécies de nematóides no controle desse
inseto em condições de telado (Leite et al. 2006).
Para isso os nematóides foram aplicados nas toras
de eucalipto, fixando em cada tora 4 larvas de G. mel-
lonella previamente infectadas com os nematóides
á
Figura 10. Juvenis infectivos do nematóide Steiner-
nema sp. emergindo do adulto de Sphenophorus levis
morto pela combinação nematóide-thiamethoxam.
á
Figura 11. Larvas vivas e mortas de Opogona sacchari em toras de eucaliptus tratadas com os nematóide Stei-nernema feltiae, S. glaseri e Heterorhabditis indica.
Figura 12. População de larvas de Opogona sacchari em toras de eucaliptus tratadas com 3 dosagens do nematóide Steinernema feltiae aplicado juntamente com larvas infectadas de Galleria mellonella.
para servirem como fonte de inoculo para a liberação
desses organismo no ambiente infestado com larvas
de O. sacchari. O nematóide S. feltiae foi o mais
eficiente com 74% de controle do inseto 20 dias
após a aplicação, seguido do H. indica com 50,5 %
e do S.glaseri com 32,7% (Figura 11).Em seguida, o
nematóide S. feltiae foi avaliado em diferentes dosagens
em condições de telado, variando-se o número
de larvas infectadas de G. mellonella por tora de
eucalipto. A dosagem de duas larvas infectad-
as/tora apresentou-se como a mais adequada, com
65,6% de controle 30 dias após a aplicação, não
diferenciando significativamente da maior dosagem
(70,5%) mas diferenciando menor (23,3%) (Figura
12).
Finalmente, foi realizado outro teste em telado
comparando-se dois métodos de aplicação de S.
feltiae sobre as toras de eucalipto: fixando 2
larvas de G. mellonella infectadas/tora e pulverizando
uma suspensão aquosa do nematóide em dosagem
equivalente a 2 larvas infectadas/tora (40.000 JI/-
tora). A pulverização apresentou-se como a forma
mais adequada para aplicação do nematóide, com
92,3% de controle já aos 20 dias da aplicação,
diferindo significativamente da fixação de larvas
infectadas com 51,2%. Aos 40 dias, os níveis de
á
Figura 13. População de larvas de Opogona sacchari em toras de eucaliptus tratadas o nematóide Steinernema
feltiae aplicado através de dois métodos diferentes: 1) fixando 2 larvas de Galleria mellonella infectadas /tora;
2) pulverizando o nematóide em dosagem equivalente a 2 larvas infectadas /tora.
infecção aumentaram alcançando 87,2% para a
aplicação com larvas infectadas e 99,4% para a
pulverização, não havendo diferença significativa
entre esses tratamentos (Figura 13).
Outros insetos pragas: Considerada como
praga de importância econômica para a cana-de-
açúcar, a broca-gigante (Castnia licus), vem causando
perdas significativas em canaviais nas regiões Norte e
Nordeste do Brasil. As larvas desse inseto
broqueiam o rizoma da planta, podendo causar a sua
morte. O comportamento desse inseto, atacando as
partes subterrâneas da planta, sugere a possibilidade
de uso de nematóides entomopatogênicos como
alternativa eficaz de controle. Em teste de laboratório
avaliando o nematóide Steinernema sp. (CB-n6) contra
larvas de C. licus, obteve-se 74% de mortalidade do
inseto.
O Instituto Biológico vem ainda colaborando
com a Universidade Federal da Grande Dourados,
Dourados, MT, com a Comissão Executiva do
Plano da Lavoura Cacaueira - CEPLAC, Ouro Preto
do Oeste, RO, e com várias outras instituições para
á
a avaliação de nematóides no controle do gorgulho
da goiaba Conotrachelus psidii, coleóbroca do fruto-do-
cacau, C. humeropictus, broca-da-coroa-foliar, E. cy-
parissiass, em cultivo de dendê, dentre outros inse-
tos.
Outros insetos vêm sendo alvos de estudos para
avaliação de nematóides entomopatogênicos,
apresentando-se, entretanto, pouco suscetíveis ou
vulneráveis para a ação desses agentes. Assim,
estudos vem sendo conduzidos visando avaliar a
patogenicidade de nematóides para a pérola-da-
terra, , importante praga de videira no Brasil, tendo
os resultados evidenciados alta resistência do estágio
de cisto amarelo, considerado como principal alvo
no controle da praga (Soria & Gallotti 1986, Gullan
& Kosztarab 1997, Foldi 1997; Hickel & Schimitt
1997; Schmidt, 2011).
Ainda, estudos realizados para avaliar a virulência
de nematóides entomopatogênicos para a mosca-das-
frutas, Ceratitis capitata, evidenciaram menor ou bai-
xa susceptibilidade da fase de pupa, principal alvo
no solo, comparado a fase de larva e pré-pupa do
O sucesso dos programas com nematóides
entomopatogênicos no Brasil vai depender de se
encontrar os nematóides adequados para cada
inseto alvo, que tenham boa persistência em condições
de campo; sejam virulentos e tenham comportamento
favorável à busca do hospedeiro; e proporcionem
bom rendimento na produção massal, quer seja “in
vivo” ou “in vitro”.
O mercado para uso de nematóides no Brasil é
imenso, existindo uma grande necessidade para
técnicas alternativas aos inseticidas químicos no
controle de pragas de solo. Nematóides entomopatogênicos
possuem grande potencial para o controle de
diversas pragas em diferentes culturas e ambientes,
incluindo cana-de-açúcar. Nessa cultura, nematóides
podem se constituir em uma importante alternativa
considerando o hábito subterrâneo da maioria dos
insetos pragas, e as condições bastante favoráveis e
estáveis oferecidas pela cultura, especialmente em á-
reas de colheita mecanizada, onde o solo permanece
coberto com palhada.
Isso tem motivado a formação de grupos de pesquisas
para atuação nesse campo de estudo no Brasil e,
conseqüentemente, promovido um grande avanço
nas pesquisas com nematóides entomopatogênicos,
principalmente nos últimos 10 anos.
á
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á
á
á
á
con compuestos naturales y las civilizaciones griega y romana utilizaban una variedad de fumigantes, acei-
tes y arsénico como insecticidas. Entre los siglos XVI y XVII surgió la era de los compuestos naturales
como la nicotina y el óxido de mercurio, mientras que el éxito de los pesticidas sintéticos tuvo lugar en
1939 cuando Paul Muller descubrió el DDT (difenildiclorotrietano), compuesto usado en sus inicios para
combatir los mosquitos causantes de la propagación de la malaria y posteriormente en los cultivos agríco-
las. A esto siguió la fabricación de compuestos organofosforados y organoclorados con mayor potencial
destructivo, algunos de los cuales se encuentran todavía en uso (Pretty y Hine, 2005).
La finalidad del uso de pesticidas es eliminar plagas interfiriendo con algunos procesos bioquímicos
y fisiológicos vitales. Las diferencias entre los pesticidas son básicamente su persistencia en el ambiente,
toxicidad y sobre todo el espectro que tienen para actuar contra especies sensibles a ellos; sin embargo su
uso causa inevitablemente daños en menor o mayor medida (Bro-Rassmunsen, 1996). Los efectos del uso
Cuerpo Académico de Biotecnología Agroalimentaria. Instituto de Ciencias Agropecuarias. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, México. E-mail: [email protected]
Producción de nematodos entomopatógenos por métodos in vitro
Introducción
Norberto Chavarría Hernández, Gabriela Maciel Vergara y Adriana Inés Rodríguez Hernández
Contenido del Capítulo
Introducción Control Biológico Nematodos como agentes de control biológico
Producción masiva de nematodos entomopatógenos
Un Método para producir nematodos entomopatógenos
Referencias Bibliográficas
Desde la antigüedad la agricultura ha sido la base de la humanidad,
pero fue hasta los años 1900‟s que comenzó a constituirse como una acti-
vidad industrial con la introducción de mecanizaciones y nuevas técnicas
en las labores de cultivo. Paralelamente a este hecho, surgió el uso de sus-
tancias químicas en práctica agrícolas, incluyendo específicamente el uso
de pesticidas químicos (Harwood, 1990) “justificándose” esto por razones
como las siguientes: a) los rendimientos en los cultivos eran mayores, b)
la eliminación de plagas era rápida y poco costosa, y c) controlaban agen-
tes que causaban enfermedades infecciosas que posteriormente podían
convertirse en epidemias (Ecobichon, 2001). Estas ventajas hicieron que
su uso se intensificara sin una evaluación de las consecuencias y riesgos a
futuro.
El uso de pesticidas se remonta a tiempos anteriores a la era cristia-
na con los sumerios (2500 A. de C.) quienes utilizaban compuestos sulfu-
rados para el control de insectos, los granjeros chinos trataban las semillas
á
millones de libras (Cuadro 1). Los pesticidas utili-
zados se concentran solamente en algunos cultivos
de frutas y vegetales, arroz, maíz, algodón, trigo,
cebada y soya, siendo los países industrializados los
mayores consumidores, aunque la demanda crece
también en los países en desarrollo, con algunas
desventajas como:
baja tecnificación para la aplicación de quí-
micos, falta de información sobre el uso correcto y
riesgos, y sobre todo el uso ilegal o bien el uso de
productos que actualmente están prohibidos.
De ahí que cada vez son más frecuentes los
reportes sobre trabajadores intoxicados por la ex-
posición a productos químicos en países donde
aún no hay una regulación adecuada para el uso de
de pesticidas quí-
micos no tienen la
misma intensidad
en todos los eco-
sistemas y se pre-
sentan de diversas
formas:
alterando las
cadenas tróficas
debido a la muerte
de uno o más or-
ganismos que son
fuente de alimento
para otros.
generando
daños al ambiente
(i.e. dañando la
capa de ozono,
contaminando los
mantos acuíferos,
la lluvia, el aire y el suelo entre otros) provocando
enfermedades debido a su acumulación en los teji-
dos adiposos de animales.
Este último punto ha sido motivo de estu-
dios recientes por las evidencias encontradas de
efectos secundarios que causa la acumulación, que
varían desde ligeras molestias hasta la muerte por
intoxicación, cáncer o deficiencias en los sistemas y
tejidos. Paradójicamente, la demanda y uso de pes-
ticidas a nivel mundial en los últimos cincuenta
años se incrementó en gran medida con ventas de
hasta 25 mil millones de dólares anuales en lo que
va de este siglo (Pretty y Hine, 2005). De entre
éstos, los herbicidas acumularon 36% de las ven-
tas, mientras que los insecticidas y funguicidas sólo
el 25% y 10% respectivamente de un total de 5,351
Tabla 1. Uso de Pesticidas (ingredientes activos) en EUA y a nivel mundial (Kiely et al., 2004)
Mundial EUA
Tipo
Millones kg
(ingredientes acti-
vos)
%
Millones kg
(ingredientes acti-
vos)
%
Relación de % utilizado en
EUA y % utilizado a nivel
mundial
2010
Herbicidas (1) 883 36% 542 44% 28%
Insecticidas 615 25% 122 10% 9%
Fungicidas 234.264 10% 74 6% 14%
Otros (2) 697 29% 496 40% 32%
Total 2,429 100% 1,234 100% 23%
Año 2001
Herbicidas (1) 849 37% 553 46% 30%
Insecticidas 559 24% 105 9% 9%
Fungicidas 215.65 9% 73 6% 15%
Otros (2) 667 29% 472 39% 32%
Total 2,291 100% 1,203 100% 24%
(1) "Herbicidas" incluye herbicidas y reguladores de crecimiento.
(2) "Otros" incluye nematicidas, fumigantes, rodenticidas, molusquicidas, pesticidas para peces y aves y algu-
nos otros pesticidas convencionales además de químicos como azufre y petróleo, en ocasiones utilizados co-
mo pesticidas.
áó ó
pesticidas químicos (Ecobichon, 2001).
En México, la situación no es muy
distinta a la del resto del mundo, puesto que
según datos de la Asociación Mexicana de la
Industria de Plaguicidas y Fertilizantes
(AMIPFAC), en 1995 el monto de plaguici-
das utilizados fue de 54,678.96 Ton, de las
cuales una parte sustancial correspondió a
insecticidas y herbicidas con 47% y 29%
respectivamente (Figura 1). Los cultivos en que se
utilizaron las cantidades mayores de estos produc-
tos fueron en maíz, hortalizas, caña y algodón
(SNIARN, 2008).
Si bien es cierto que después de 1950 se in-
crementó el uso de pesticidas en el mundo y en
general no había una conciencia sobre los daños
causados por su uso, cabe aclarar que algunos años
antes ya se tenía la idea de desarrollar una “nueva”
agricultura con prácticas que aseguraran cierta esta-
bilidad, lo cual dio lugar al término “agricultura
sustentable” que fue usado por primera vez en la
década de 1980‟s bajo dos principios clave:
La disminución del uso de pesticidas quími-
cos y la concepción de la agricultura como un pro-
ceso biológico y un sistema integral donde el ma-
nejo debería ser responsable.
Debido a que dentro de la idea de sustentabi-
lidad el suelo es considerado como un sistema vi-
vo, se desarrollaron algunas prácticas agrícolas con
enfoque en la dinámica poblacional para el manejo
de la compleja interacción huésped-plaga-predador
evitando la alteración del ecosistema. Así se creó
un nuevo concepto que determinó las prácticas
para el control de plagas basadas en la interacción
ecológica: el manejo integral de plagas (MIP). El
MIP es un conjunto de estrategias que reúne facto-
res económicos, ecológicos, culturales y biológicos
donde los productos químicos solamente son utili-
zados como último recurso, evitando al máximo el
daño al ambiente. Dentro del MIP, además de las
prácticas culturales como la rotación de cultivos y
la planeación de la siembra-cosecha, existen otras
estrategias que resultan eficientes como el llamado
control biológico de plagas (Harwood, 1990).
Control Biológico Una de las definiciones tradicionales del con-
trol biológico es “la manipulación de parásitos,
predadores y patógenos para mantener las pobla-
ciones plaga en niveles donde no haya un daño
económico” (Harwood, 1990), sin embargo los
avances biotecnológicos de los últimos años han
permitido la inclusión de nuevos términos, por lo
cual existen otras definiciones como la de Gnana-
manickam et al (2002): “el uso de organismos natu-
rales o modificados, genes o productos genéticos
para reducir los efectos de organismos indeseables
y favorecer a organismos deseables como insectos
benéficos y algunos microorganismos”. Muy rela-
cionada con la definición anterior, es la dictada por
Figura 1. Volumen de pesticidas usados en México en 1995
(SNIARN, 2008)
á
la Oficina de Asesoría Tecnológica del Congreso
Estadounidense en 1995, la cual hace referencia a
las “tecnologías basadas en la biotecnología para el
control de plagas” (BBT‟s por sus siglas en
inglés), las cuales comprenden el uso de predado-
res, patógenos, feromonas, derivados naturales de
plantas, reguladores del crecimiento en insectos e
insectos estériles como agentes de control biológi-
co (Hagler, 2000). Aunque los inicios del control
biológico datan de varios siglos atrás, la era moder-
na comenzó en 1888 cuando se importaron enemi-
gos naturales del insecto causante del algodoncillo
desde Australia hasta California, en la mayor pérdi-
da económica reportada en la industria de los cítri-
cos causada por una plaga. Desde entonces, el con-
trol biológico ha sido utilizado algunas veces con
éxito y otras veces sin él, en diferentes cultivos y
contra diversas plagas en donde factores como las
condiciones climáticas, la adaptación de los enemi-
gos naturales al ecosistema (si son introducidos), el
estado del cultivo, la afinidad plaga-predador y el
tipo de control biológico aplicado tienen influencia
directa en los resultados que se obtienen. En Méxi-
co, éste comenzó en 1940 y se dio con la introduc-
ción de enemigos naturales para combatir plagas
como la escama algodonosa de los cítricos, la esca-
Tabla 2. Características y ejemplos de los agentes de control biológico según Hagler (2000)
Característica Predador Parasitoide Patógeno Pesticida Quí-
mico (PQ)
Espectro contra plaga Moderado Reducido Reducido Amplio
Disponibilidad comercial Baja Baja Media Alta
Vida de anaquel Corta (días) Corta (días)
Corta / Modera-
da Larga (Años)
Costo Alto Alto Medio Bajo
Aplicación Difícil Difícil Fácil Fácil
Efectividad Baja Baja / moderada Baja / moderada Alta
Compatibilidad con PQ Baja Baja Alta -
Impacto ambiental Bajo Bajo Bajo Muy alto
Resistencia por parte de la
plaga Nula Nula Bajo Alta
Ejemplo
Orden Coleoptera Diptera
DDT
Familia Carabidae Phoridae Enterobacteriaceae
Nombre común/científico
escarabajo de
tierra/
Scarabaeidae sp.
Bt/Bacillus thurin-
giensis
Presa
orugas, hueveci-
llos de insecto e
insectos de
cuerpo suave
hormigas, termitas,
catarinas, moscas,
etc.
larvas de insectos
pertenecientes al
orden Lepidoptera
todo tipo de
insectos e inclu-
so algunas es-
pecies de peces
y aves
áó ó
ma purpúrea, las moscas de la fruta y el pulgón
manchado de la alfalfa, ente otras (Barrera, 2002).
Tipos de Control Biológico
Existen tres tipos de control biológico: con-
servativo, introductivo y aumentativo. El primero
favorece la preservación del ambiente para que los
enemigos naturales presentes puedan actuar como
agentes de control biológico (ACB). Algunas es-
trategias empleadas en este tipo de control son el
establecimiento de cultivos “refugio” (extensiones
pequeñas de cultivo donde no se esparcen pestici-
das químicos), la provisión de alimento y la dismi-
nución del uso de pesticidas químicos de amplio
espectro. El control introductivo se denomina
también “control biológico clásico”, puesto que
se introduce accidental o intencionalmente un
ACB foráneo a un área nueva, donde éste se desa-
rrolla y controla a la plaga existente en el lugar.
Son muchas las desventajas que algunos críticos
encuentran en este tipo de control, puesto que
además de que se altera el ecosistema original,
existe la posibilidad de efectos letales en organis-
mos benéficos y sobre todo la amenaza de que el
organismo introducido pueda convertirse en plaga
por no tener enemigos naturales en el lugar donde
se usa. Todo esto puede suceder si no se estudia
con detalle la dinámica que se utilizará a la hora
de aplicar el control. A pesar de ello, también
existen algunas ventajas que permiten que actual-
mente todavía esté en uso este tipo de estrategia.
El tercer tipo de control es el aumentativo,
que consiste en la “liberación” de ACB estudiados
y producidos masivamente en laboratorio para la
supresión de la plaga. Es equivalente a la utiliza-
ción de productos químicos, pero sin dañar al am-
biente y puede realizarse por inoculación o bien
por inundación. La inoculación se vale solo de
pequeñas cantidades del ACB, que sobreviven y
se mantienen gracias a la presencia del insecto pla-
ga al cual eliminan gradualmente; mientras que en
el método por inundación, se aplican grandes can-
tidades de ACB para asegurar el exterminio casi
inmediato de la plaga, aun cuando el ACB no per-
dure por mucho tiempo en el cultivo (Hagler,
2000).
Agentes de Control Biológico
Existen varias clasificaciones de los enemi-
gos naturales, sin embargo una conveniente es la
propuesta por Hagler (2000) de acuerdo al modo
de acción sobre la plaga y algunas otras caracterís-
ticas en su desempeño como ACB (Cuadro 2).
Los predadores y los parasitoides son agentes ma-
crobiológicos mientras que los patógenos se con-
sideran agentes microbiológicos. Recientemente,
un cuarto grupo ha sido añadido y en él se inclu-
yen los agentes parabiológicos de control como
son las hormonas, los insectos estériles y los regu-
ladores de crecimiento. Entre los patógenos se
encuentran varios agentes de control biológico
que actualmente están disponibles en el mercado,
estos agentes son aplicados con el equipo conven-
cional para la aplicación de pesticidas químicos o
bien en los sistemas de irrigación y su disponibili-
dad comercial se debe en gran parte a la facilidad
de producirlos en laboratorio y a su inocuidad con
relación al ambiente y a otros organismos benéfi-
cos. Las desventajas de estos ACB son: a) su espe-
cificidad para infectar ciertas plagas y la resisten-
cia de éstas después de una aplicación prolongada,
b) corta vida de anaquel y en el campo, y c) sobre
todo las dificultades para su regulación como pro-
ductos pesticidas. Es por ello que las investigacio-
á
Nematodos como agentes de control biológico
para que su uso dentro del manejo integral de pla-
gas sea más intensivo.
nes hoy en día se desarrollan para maximizar el
desempeño general de estos agentes y sobre todo
Existen siete familias de nematodos con po-
tencial biocontrolador: Mermitidae, Tetradonematidae,
Allantonematidae, Phaenopsitylenchidae, Sphaerularidae,
Steinernematidae y Heterorhabditidae; sin embargo, sólo
las dos últimas se han estudiado con más detalle
(Lacey et al., 2001) y se han producido comercial-
mente alcanzando ventas de hasta 10 millones USD
(en 1998) (Samish y Glazer, 2001). Los nemátodos
entomopatógenos (NEP) pertenecientes a los géne-
ros Steinernema y Heterorhabditis poseen receptores
químicos para la búsqueda de insectos huésped y se
encuentran asociados simbióticamente con entero-
bacterias, Xenorhabdus sp. para Steinernema y Photor-
habdus luminiscens para Heterorhabditis. Los NEP son
gusanos redondos no segmentados con sistema res-
piratorio, reproductor y digestivo, además son pató-
genos obligados en la naturaleza y han sido utiliza-
dos para controlar un amplio número de insectos
plaga (Cuadro 3; Figura 2) mediante inundación en
el control aumentativo.
Cabe mencionar que la eficacia de los NEP ha
sido comprobada en plagas cuyo estado larvario se
desarrolla en la tierra (principalmente especies de
los géneros Lepidoptera y Coleoptera), aun cuando
también se han utilizado en plagas cuya ovoposición
y/o estado larvario se desarrollan en troncos o en
las hojas de los árboles (Schroer y Ehlers, 2005). El
usarlos como agentes de control biológico no repre-
senta riesgo para los vertebrados, insectos benéficos
y en general para el medio ambiente; pueden produ-
cirse in vivo e in vitro y son aplicados fácilmente con
equipo convencional, buscan a su presa y la matan
rápidamente (en un lapso entre 24 y 48 h), pueden
Tabla 3. Plagas susceptibles al biocontrol mediante NEP.
Familia Nombre científico Agrocultivo País
Especie
NEP
Referencias
Lepidoptera
Pyralidae Tryporyza incertulas Arroz India Sc Kaya et al., 2006
Noctuidae Spodoptera depravata Césped Japón Sg, Sc Kaya et al., 2006
Glyphipteridae Sagalassa valida Palma Colombia Sc Kaya et al., 2006
Coleoptera
Curculionidae Aristobia testudo Litchi China Sc Kaya et al., 2006
Cosmopolites sordidus Plátano Brasil Sc Kaya et al., 2006
Scarabaeidae Epicometis hirta
Vid y otros
frutos Turquía Hb Hazir et al., 2004
Diptera
Sciaride Lycoriella mali Setas Corea Sc, Hb Kaya et al., 2006
Sc = Steinernema carpocapsae, Sg = Steinernema glaseri, Hb = Heterorhabditis bacteriophora
áó ó
reciclarse en el ambiente y son compatibles
con algunos productos químicos y otros
pesticidas biológicos, además de que están
exentos de registro como pesticidas en algu-
nos países (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002;
Hazir et al., 2004; Shapiro-Ilan et al., 2006).
En contraparte, las razones por las que su
uso todavía no tiene gran impacto son: a) su
reducido rango de acción contra los insec-
tos, b) la poca tolerancia a condiciones es-
tresantes de humedad, radiación y tempera-
tura, c) corta vida de anaquel, y d) la dife-
rencia de su precio con relación a los pro-
ductos químicos.
Ciclo de vida de los NEP
Tanto los steinernemátidos como los
heterorhabdítidos tienen un ciclo de vida que inclu-
ye huevo, cuatro etapas juveniles (J1 a J4) y una fase
adulta. Bajo ciertas condiciones, la fase J3 se con-
vierte en infectivo juvenil (IJ), única fase que sobre-
vive fuera del insecto huésped y puede mantenerse
en búsqueda de un nuevo insecto, al cual penetra a
través de sus aberturas naturales (boca, ano, espirá-
culos) liberando la bacteria simbionte, quien infecta
los tejidos del insecto y éste muere por septicemia
en las siguientes 24 a 48 h. Los IJ se alimentan de
los tejidos del insecto colonizados por la bacteria y
se convierten en adultos de primera generación,
mismos que posterior a la fertilización dan lugar a
huevos que se desarrollan a nematodos J1 y así su-
cesivamente hasta otra generación de adultos. Este
ciclo ocurre hasta que los nutrimentos se agotan,
momento en el que los IJ de nueva
inducción comienzan a emerger del
cadáver para continuar buscando
otros huéspedes (Figura 3) (Neves et
al., 2001; Chavarría-Hernández y de
la Torre, 2001; Serwe-Rodriguez et
al., 2004). Esta sucesión de estadios
también se puede observar en culti-
vos in vitro, ya sea sólidos o líquidos,
donde el ciclo puede comenzar con
la inoculación de IJ en un medio
previamente inoculado e incubado
con la respectiva bacteria simbionte.
Figura 2. Insectos plaga susceptibles al control biológico
usando NEP. A) Hypera postica Gyllenahl, B) Phyllophaga, C)
Icerya purchasi, D) Noctuidae.
Figura 3. Ciclo de vida de Steinernema sp.
á
La diferencia en-
tre steinernemá-
tidos y heteror-
habdítidos es su
modo de repro-
ducción, ya que
mientras los
adultos de los
primeros son
machos y hem-
bras en todas las
generaciones con
capacidad de
producir proge-
nie, los adultos
heterorhabdíti-
dos de la primera
generación son hermafroditas y los adultos de las
generaciones subsecuentes son anfimíticos, pero
incapaces de reproducirse (Ehlers y Shapiro-Ilan,
2005). Con relación a la bacteria simbionte, aun
cuando Xenorhabdus y Photorhabdus tienen diferen-
cias entre sí como su localización dentro del nema-
todo IJ (Figura 4), el mecanismo mediante el cual
son liberadas dentro del insecto huésped y la pro-
piedad de bioluminiscencia, exhiben similitudes en
algunas características ya que ambas pertenecen a
la familia Enterobacteriaceae, son móviles (poseen
flagelos perítricos), Gram-negativas, aerobias facul-
tativas y no forman esporas. Sin embargo, las dos
características más importantes que tienen en
común, son a) la variación fenotípica y b) la pro-
ducción de inclusiones proteínicas cristalinas.
La relación entre los NEP y su bacteria sim-
bionte es esencialmente mutualista y puede ser di-
vidida en tres fases (Ciche et al., 2006):
Forética. Fase en la que tanto la bacteria co-
mo el nematodo se encuentran fuera del huésped;
es decir, el nematodo se encuentra en busca de ali-
mento y al mismo tiempo sirve como vector a la
bacteria y como su protección contra el medio am-
biente. No existen reportes de que la bacteria haya
sido encontrada en forma libre, sino solamente en
el intestino de los IJ y en insectos huésped que han
sido infectados por NEP. El mecanismo de coloni-
zación del intestino de las fases IJ por la bacteria es
aún poco conocido, sin embargo existen dos teor-
ías acerca de ello; la primera es que debido a un
agotamiento en las fuentes de nutrimentos, los J2
disminuyen su función digestiva y por lo tanto en
lugar de digerir a la bacteria, la retienen dentro. La
segunda teoría se basa en la afinidad de los IJ por
su bacteria simbionte y esto sucede porque si la
bacteria presente en el insecto huésped no es la
simbionte especifica del nematodo, éste no la retie-
ne.
Patógena. En esta fase, el complejo nemato-
do-bacteria es directamente responsable de la
muerte del insecto huésped, que es infectado debi-
do a la introducción de la bacteria, llevada a cabo
por los IJ. Una vez dentro, la bacteria invade y
afecta el sistema inmunológico del insecto, que en
condiciones naturales impediría la acción de agen-
tes externos por procesos como melanización o
encapsulación (Hazir et al., 2004), mientras que el
nematodo también contribuye inhibiendo los me-
canismos enzimáticos del insecto plaga para reco-
nocer a sus invasores, de ahí que la relación nema-
todo-bacteria sea mutualista porque ambos orga-
nismos necesitan uno del otro para sobrevivir.
Saprófita. Sucede una vez que el insecto ha
muerto; la bacteria y el nematodo se alimentan de
Figura 4. Localización de la
vesícula bacterial en la parte an-
terior del intestino de Steinerne-
ma spp. (vista lateral). En el ca-
so de Heterorhabditis spp., la bac-
teria se encuentra dispersa en
todo el tracto gastrointestinal
(Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005)
áó ó
Actualmente existen tres métodos para la
producción masiva de NEP: in vivo, in vitro sólido e
in vitro líquido los cuales se explican brevemente a
continuación.
Cultivo In vivo
En este método, insectos huésped son inocu-
lados con fases IJ, las cuales se desarrollan y com-
pletan su ciclo de vida durante dos a tres genera-
ciones, después de unos días, cuando los nuevos IJ
comienzan a dejar el cadáver, se procede a las ope-
raciones de cosecha, sanitización, formulación y
almacenamiento de los mismos. La cosecha se rea-
liza en dispositivos denominados “trampa de Whi-
te” que constan de una caja Petri donde existe una
zona elevada (i.e., vidrio de reloj invertido) cubierta
por papel filtro y rodeada por agua (Woodring y
Kaya, 1988; Hazir et al., 2004). Una vez infectadas,
las larvas se colocan en el papel filtro y cuando los
IJ emergen se dirigen hacia el agua donde son co-
sechados fácilmente evitando contaminaciones.
Los IJ así cosechados pueden pasar a una etapa de
concentración para eliminar el agua excedente y
posteriormente ser sanitizados con distintas solu-
ciones comerciales, la concentración puede hacerse
mediante sedimentación y posterior decantación o
bien mediante centrifugación (Shapiro-Ilan y Gau-
gler, 2002). La formulación implica procedimientos
que permiten a los NEP reducir su actividad me-
tabólica y entrar en un estado de deshidratación
(anhidrobiosis parcial) debido a la baja humedad
relativa de los agentes inertes usados como el
carbón activado, vermiculita, alginatos, caolín y
poliacrilamida. Estos agentes propician un menor
costo en el almacenamiento y transporte del pro-
ducto, un mejor manejo y mayor vida de anaquel.
Los NEP también pueden formularse en solucio-
nes acuosas pero esto no es muy conveniente por-
que deben mantenerse en refrigeración y con agita-
ción moderada, además de que hay un mayor ries-
go de contaminación. En la actualidad, se pueden
formular en gránulos dispersables en agua (WDG,
por sus siglas en inglés), método que presenta las
mismas ventajas de los agentes inertes en cuanto a
costo y facilidad de operación y además asegura
una mayor vida de anaquel. Para optimizar el pro-
ceso de producción in vivo de NEP, hace algunos
años se propuso un sistema denominado LOTEK
construido con bandejas y repisas. No obstante
que se requiere de poca experiencia para el método
Producción Masiva de Nematodos Entomopatogenos
los tejidos del hospedero. La bacteria entra en un
estado estacionario de crecimiento y el nematodo
desarrolla su ciclo de vida. Diversos estudios se
han realizado ya que aparentemente la diferencia-
ción sexual y el proceso de fertilización y liberación
de los huevos tienen que ver con la concentración
de bacteria y nutrientes en esta fase de la relación
nematodo-bacteria (por lo menos en Heterorhabdi-
tis). Aquí también ocurre la migración de los IJ fue-
ra del cadáver una vez que se han agotado las fuen-
tes de nutrientes.
Las fases mencionadas anteriormente tam-
bién tienen lugar cuando se cultiva a los NEP en
medios artificiales, donde la recuperación e induc-
ción de los IJ se debe aparentemente a señalizacio-
nes químicas que la bacteria simbionte produce en
el medio (Johnigk y Ehlers., 1999).
á
in vivo, las desventajas son el costo de los hospede-
ros y el equipo, cuya inversión no es fácil de recu-
perar a partir de las ganancias obtenidas, además
la concentración final de IJ en un cultivo in vivo,
depende de factores como el tamaño del insecto
huésped, el tamaño del inóculo de IJ, la forma en
que son inoculados (en suspensión acuosa o in-
cluidos en la comida del insecto huésped) y la afi-
nidad con el huésped, así como condiciones de
humedad y temperatura (Shapiro-Ilan y Gaugler,
2002). Los IJ obtenidos por este método pueden
aplicarse dentro del cadáver del insecto huésped,
colocándolo en los cultivos y protegiendo así a los
NEP del medio ambiente mientras encuentran
un nuevo huésped.
Cultivo Sólido in vitro
Inicialmente el cultivo sólido se desarrolló
axénicamente (i.e., cultivo puro de nematodos) sin
embargo, se encontró que la inclusión de la bacte-
ria simbionte en el cultivo se traducía en mejores
resultados. Los primeros cultivos sólidos se desa-
rrollaron en cajas Petri con medios con sangre de
becerro, alimento para perro y extracto de riñón
porcino entre otros ingredientes. En este sistema
bidimensional se inoculaban fases IJ sanitizadas.
Actualmente este procedimiento sigue utilizándo-
se. En 1960, Bedding diseñó un sistema tridimen-
sional para la producción de NEP que actualmen-
te se utiliza en algunas empresas pequeñas, donde
el medio líquido se esteriliza junto con placas de
espuma de poliuretano como agente inerte en ma-
traces, bolsas de plástico o recipientes de vidrio,
suministrándoles aire mediante bombeo o bien
empleando un dispositivo permeable al aire que
evita la convección forzada de aire. En este méto-
do, también se inocula la bacteria y después de
Tabla 4. Compañías productoras de nematodos entomopatógenos en
Estados Unidos de América y la Comunidad Europea (Kaya et al.,
2006)
Compañía Especie a Formulación Mercado
Andermatt Bio-
control, Grossdiet-
wil, Suiza
Sc, Sf, Hm Barro
Invernadero,
jardinería
doméstica
Asa Jung Labora-
tory, Oakland,
California, EUA
Sc, Sf Barro Variado
BioLogic Willow
Hill, Pennsylvania,
EUA
Suspensión,
gránulos disper-
sables en agua,
esponja
Variado
Bionema, Umea,
Suecia Sc, Sf Polímero
Jardinería
doméstica
Becker Under-
wood Ames, Iowa,
EUA
Sc, Sf,
Sg,Sk, Ss,
Hm
Spray, gránulos
dispersables en
agua
Invernadero,
hongos comesti-
bles
Certis b Columbia,
Maryland, EUA Sc, Sf, Sr
Suspensión,
gránulos dis-
persable en agua
Variado
e-nema GmbH,
Raisdorf, Alemania Sc, Sf, Hb Barro, polímero
Invernadero,
vivero, hongos
comestibles y
jardinería
doméstica Hydrogardens,
Colorado Springs,
Colorado, EUA
Sc, H sp Esponja Invernadero
Integrated Biocon-
trol, Greendale,
Indiana, EUA
Hb, Hi-
,Hmar Pasta, esponja Cítricos, césped
Koppert, Berkel en
Rodenrijs, Sf, Hb Barro
Invernadero,
césped
M & R Durango,
BayWeld, Colora-
do, EUA
Sc, Sf, Hb Esponja Variado
Nematec, San Ra-
mon, California,
EUA
Hb “Wool nematode” N/A c
Owiplant, Owijska,
K/Poznania, Polo-
nia
Barro
Invernadero,
hongos comesti-
bles a Sc, Steinernema carpocapsae; Sf, S. feltiae; Sg, S. glaseri; Sk, S. kraussei; Sr,
S. riobrave; Ss, S. scapterisci; Hb, Heterorhabditis bacteriophora;Hi, H. indica;
Hm, H. megidis; Hmar, H. marelatus; H sp., Heterorhabditis species.
b En 2005, Certis vendió el área productora de nematodos a Becker
Underwood.
c N/A, No disponible
áó ó
algunas horas de incubación se inoculan los IJ. La
recuperación del producto se realiza “lavando” la
espuma de poliuretano hasta que todos los IJ
hayan migrado o bien por centrifugación, la cual, al
igual que en el cultivo in vivo, incrementa el costo
del producto. Las desventajas de este método son
que el escalamiento afecta directamente el desarro-
llo de los cultivos, ya que se dificulta la medición
en línea de parámetros como el pH y el oxígeno
disuelto a la vez que el muestreo no es representa-
tivo debido a la poca uniformidad en la distribu-
ción de los NEP (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005).
Cultivo líquido in vitro
El cultivo en medio líquido ha sido hasta
ahora la forma más conveniente para la produc-
ción de NEP a gran escala, llevada a cabo comer-
cialmente en la actualidad por compañías en Esta-
dos Unidos de América y algunos países de la Co-
munidad Europea, principalmente (Cuadro 4). En
México, existen pocas compañías productoras de
NEP como agentes de control biológico y los
métodos que utilizan para producirlos son confi-
denciales (Cuadro 5).
Al igual que en el cultivo sólido, el cultivo
líquido se desarrolló inicialmente de forma axénica
en matraces y posteriormente de forma monoxéni-
ca, al cultivar ambos organismos juntos. El primer
experimento con biorreactor se patentó en Estados
Unidos de América por Pace et al. (1986) y desde
entonces, diversos trabajos se han desarrollado pa-
ra la mejor adaptación del cultivo líquido de NEP
en biorreactores. Este proceso no resulta tan senci-
llo como lo es el cultivo in vivo, ya que dentro del
biorreactor los NEP se encuentran en un medio
junto con burbujas y partículas, inmersos en un
proceso de mezclado que se relaciona directamente
con su desarrollo, alimentación y cópula, cuya fi-
nalidad es obtener la mayor concentración de fases
IJ. Uno de los factores que afectan el cultivo líqui-
do es la viscosidad del medio, por lo que algunos
de los retos más importantes en este sistema son a)
proveer suficiente oxígeno para ambos microorga-
nismos sin dañarlos, b) evitar al máximo el estrés
hidrodinámico, c) reducir la espuma generada por
la agitación y/o aireación, y d) incrementar la
Tabla 5. Instituciones públicas y privadas productoras de nematodos entomopatógenos para el control
de insectos plaga en México reportadas en 1999 (Taméz-Guerra et al., 2001)
Entidad Fe-
derativa Compañía Especie a
Sinaloa Biosol S.A. de C.V. (Culiacán, Sinaloa) Sf
Agrobiosol de México S.A. de C.V (Culiacán, Sinaloa) Sc
D.F. Koppert de México S.A de C.V (México, DF) Sf
Chiapas Laboratorio de producción de OB, CIICA (Chiapas) Sg, Sf
a Sf= Steinernema feltiae, Sc=Steinernema carpocapsae, Sg= Steinernema glaseri
á
cópula (para el caso específico de Steinernema spp.)
Estos problemas se han minimizado mediante el
diseño y mejora de los biorreactores utilizados,
además de la investigación detallada sobre el ciclo
de vida de los NEP en cultivo líquido (Shapiro-
Ilan y Gaugler, 2002). Durante el cultivo líquido,
que puede durar desde dos hasta cuatro semanas,
es imprescindible mantener condiciones de riguro-
sa asepsia ya que cualquier contaminación puede
ser catastrófica para el proceso. Tanto la composi-
ción del medio como la cantidad de bacteria pre-
sente son factores que influyen en el cultivo líqui-
do. Se han usado diversos medios de producción
que incluyen una fuente de carbono (i.e., glicerol o
glucosa), proteínas animales o vegetales, extracto
de levadura y una fuente de grasas.
Entre los diferentes ingredientes usados para
la formulación de medios se encuentran harina de
soya, yema de huevo, leche en polvo, extracto de
hígado, aceite de maíz, aceite de canola y manteca,
y más recientemente algunos ingredientes no con-
vencionales como lactosuero y aguamiel, entre
otros (Pace et al., 1986; Friedman et al., 1991; Islas-
López et al., 2005; Espino-García, 2005). El tipo y
cantidad de la fuente lipídica utilizada parece ser un
componente clave en el desarrollo y virulencia de
los NEP, por lo que un incremento en la concen-
tración de este componente se relaciona con un
mayor rendimiento, probablemente debido a la ne-
cesidad nutrimental de esteroles en los NEP (Abu-
Hatab y Gaugler, 2001; Yoo y Gaugler, 2000).
Existen reportes de que Steinernema no es capaz de
desarrollarse en medios sin lípidos, mientras que
en el caso de Heterorhabditis, su bacteria simbionte
es capaz de proveerle todos los nutrimentos. En
general se recomienda la adición de lípidos en cual-
quier cultivo de NEP (sea sólido o líquido).
Por otra parte, la cantidad del inóculo tanto
Figura 5. Variables implicadas en el cultivo monoxénico líquido de NEP.
áó ó
bacteriano como de fases IJ puede ser variable. Pa-
ra las especies de Heterorhabditis, el inóculo de ne-
matodos es alto debido a que únicamente los adul-
tos hermafroditas de primera generación son los
que procrean a los individuos que al final del culti-
vo serán IJ, mientras que los adultos unisexuales
no producen progenie, al menos en cultivo líquido.
Entre los parámetros que favorecen al cultivo
líquido de los NEP están el pH, la concentración
de CO2, la temperatura y la agitación/aireación,
aun cuando no se ha logrado la total comprensión
de la interacción de estos parámetros para la ob-
tención de cultivos líquidos exitosos (Figura 5).
El pH inicial del medio varía entre 5.5 y 7
pero algunos autores recomiendan ajustarlo a 8.
Una vez que se inicia el cultivo es perjudicial tratar
de ajustar el pH, puesto que la bacteria es capaz de
mantenerlo superior a 7 hasta que finalice el culti-
vo (un valor de pH inferior a 6.5 puede ser dañino
para los nematodos). El pH puede variar con la
concentración de dióxido de carbono, y aunque
este efecto no se ha reportado porque la medición
de CO2 disuelto no es frecuente durante los culti-
vos, se ha encontrado que a mayores concentracio-
nes de este gas al inicio del cultivo monoxénico, se
incrementa el porcentaje de recuperación de las
fases IJ (Gaugler y Han, 2000). La temperatura de
incubación de la bacteria se hace entre los 28 y 30°
C y el desarrollo del cultivo monoxénico, entre los
22 y 25°C.
Cultivo de NEP en biorreactor
Los biorreactores utilizados para este fin, son
los convencionalmente usados en la industria o
bien con algunas modificaciones o rediseño para
un mejor desarrollo del cultivo, bajo esfuerzo de
corte y sobre todo para un suministro adecuado de
oxígeno; la agitación y aireación son de suma im-
portancia y junto con la geometría del biorreactor
determinan la disponibilidad de los nutrientes y
oxígeno para ambos microorganismos así como las
condiciones para la cópula y desarrollo de los
NEP. En steinernemátidos, la cópula se realiza, si
el macho que es de menor tamaño que la hembra
se enrolla alrededor de ella y este evento determi-
na, junto con otros factores ya mencionados, el
rendimiento final del cultivo. Aunque la agitación
con impulsores de paletas o propelas, provee un
mezclado eficiente para procesos en la industria
química o en cultivos de células bacterias y hongos,
se ha reportado que en el cultivo de NEP las hem-
bras pueden sufrir ruptura mecánica si la velocidad
en la punta del impulsor excede de 1 m s-1 (Pace et
al., 1986). Para la velocidad de aireación, se han
probado diferentes condiciones que van desde 0.05
volúmenes de aire volumen de medio minuto
(vvm) hasta 1 vvm en reactores de diferentes tama-
ños, buscando que al momento de la inoculación
de fases IJ la concentración de oxígeno sea al me-
nos del 20% de saturación. Una aireación excesiva
a menudo provoca gran producción de espuma, lo
cual puede controlarse adicionando antiespuman-
tes convenientes.
Autores como Pace et al. (1986) y Ehlers
(2001) han reportado concentraciones desde
23,000 hasta 95,000 IJ/mL (Cuadro 6) en reactores
agitados mecánicamente, sin embargo debido a los
esfuerzos cortantes imperantes en estos sistemas,
se ha optado por usar reactores con agitación
neumática, principalmente de los llamados Air-lift.
La Figura 6 muestra algunos de los diferentes tipos
de reactores Air-lift utilizados para el cultivo mo-
noxénico de NEP. Las concentraciones logradas
á
este último caso (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005) no
se menciona el tipo de agitación ni la concentra-
ción inicial de nemátodos empleada.
con estos sistemas van desde 40,000 hasta más de
200,000 IJ/mL para Steinernema carpocapsae mientras
que para Heterorhabditis indica se han alcanzado con-
centraciones de 500,000 IJ/mL; sin embargo, en
Algunos Aspectos de Ingeniería Básica
de Reactores Air-Lift
Las columnas de burbujeo o reactores Air-lift,
patentados por Lefrancois, Mariller y Mejane en
1955, son un diseño alternativo a los tanques con
agitación mecánica, los cuales se han usado duran-
te años en diferentes procesos industriales (Znád et
al., 2004). Los Air-lift no incluyen partes móviles y
la alimentación de aire se hace desde la base de una
columna delgada que constituye el “cuerpo” del
tanque, algunas veces se utiliza una sección cónica
en la parte superior de esta columna, que incre-
menta el área de intercambio del gas. En estos re-
actores, los sensores se colocan en a) la tapa, b) en
donde termina la sección cónica, o c) en un anillo
situado en la parte inferior del tanque (Allman,
1999). Los Air-lift involucran cuatro zonas durante
su operación: en la zona de ascenso o “riser”, tiene
lugar la mayor cantidad de transferencia de masa
gas-líquido y es donde el líquido aireado fluye en el
mismo sentido de la inyección del gas. Al término
de esta zona, se encuentra la zona de desacelera-
ción o separador de gas, porque es aquí donde el
gas sube y sale por el venteo del tanque mientras
que el líquido, ya sin burbujas de gas o con baja
concentración de éstas, fluye a contracorriente del
gas por la zona de descenso o “downcomer”, para
ser aireado nuevamente en la zona inferior (Znád et
Figura 6. Distintos diseños de reactores Air-lift utilizados para la producción de NEP a nivel laboratorio.
Los reactores i) a iii) (VL=0.5 L) han sido reportados por Neves et al. (2001), mientras que iv) se trabajó a
VL=4.4 L y probando dos
áó óC
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Dat
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no
rep
ort
ado
s
á
al. 2004). Estos sistemas se han utilizado en el tra-
tamiento de aguas residuales, en la producción de
biomateriales y en fermentaciones de células sensi-
bles al estrés hidrodinámico. Las ventajas de su uso
son el bajo consumo de energía, facilidad de cons-
trucción, operación y mantenimiento, permiten
conservar condiciones asépticas por largo tiempo y
las características hidrodinámicas imperantes pue-
den modificarse en función de cambios en su geo-
metría (i.e., tipo de recirculación, tipo del draft, ac-
cesorios adicionales, modo de operación, tipo del
difusor, etc.).
Algunos de los parámetros que describen
tanto la hidrodinámica como el funcionamiento de
los reactores tipo Air-lift son el hold-up (i.e., frac-
ción de retención de gas), la velocidad del líquido
en cada zona del reactor y el coeficiente volumétri-
co de transferencia de oxígeno (kLa) (Wen et al.,
2005), los cuales se explican a continuación.
Hold up (fracción de retención de gas). Es el
aumento del volumen en la fase líquida en proceso
a causa de la inyección de gas, introducción de un
sólido o ambas; este parámetro es de suma impor-
tancia para el diseño del reactor ya que determina
la altura del mismo y consecuentemente el máximo
volumen de trabajo, así como el tiempo de residen-
cia del gas en el líquido, que en combinación con el
tamaño de burbuja, determina el área interfacial
gas-líquido disponible para la transferencia de ma-
sa. El valor del hold up, varía en las distintas zonas
del reactor como consecuencia del proceso de
mezclado donde tienen lugar la ruptura y coales-
cencia de las burbujas. El hold up puede determi-
narse por varios métodos (los más comunes son
expansión de volumen y conductancia) y tanto en
la fase sólida como en la líquida o ambas. En la
literatura se han reportado algunas correlaciones
para determinar el hold up total en un reactor Air-
lift, entre ellas la de Molina-Grima et al. (1997):
Donde,
εg = Hold up total
Ar = Área sección transversal del riser
εgr = Hold up en el riser
Ad = Área sección transversal del downcomer
εgd = Hold up en el downcomer
Velocidad del líquido: Determina el tiempo
de mezclado (i.e., lapso de tiempo que transcurre
hasta que las condiciones en el reactor se vuelvan
estables a partir de un cambio en la alimentación),
reflejado en variables de respuesta como son pH,
temperatura, coloración y conductancia. Una vez
medida experimentalmente la velocidad del líquido
y obtenido el valor del hold up, es posible calcular
la velocidad superficial del líquido, la cual a su vez
permite determinar la pérdida de energía por fric-
ción del medio con las paredes mediante la Ecua-
ción 2 (Molina-Grima et al., 1997):
Donde,
Ef = Pérdida de energía por fricción
Cr = factor de fricción
hD = altura de la dispersión
Ar = Área sección transversal del riser
ULr =Velocidad superficial del líquido
Ugr = Velocidad superficial del gas
dr = diámetro del riser
dr
gddgrr
gAA
AA
(1)
)()(2 rLr
r
grLrLr AUd
hDUUCrUEf
(2)
áó ó
El factor de fricción Cr se puede deducir a
partir de la ecuación de Blasius (Ecuación 3 para
downcomer y riser; Ecuación 4, para riser sola-
mente) (Wen et al., 2005; Molina-Grima et al.,
1997):
Donde el número de Reynolds está definido como:
Donde,
i = cada una de las zonas del reactor (i.e. riser,
downcomer)
ρHi,, ρL= densidad promedio del líquido (kg/m3)
VLi, ULr= velocidad del líquido en cada una de las
zonas i del reactor (m/s)
Di, dr= diámetro en cada una de las zonas i del re-
actor (m)
μHi, μL= viscosidad promedio (Pa s)
El número de Reynolds es la relación entre
las fuerzas de inercia y las fuerzas viscosas
(Ecuaciones 6 y 7), por lo que expresa la magnitud
de los factores que favorecen el flujo de un fluido y
de aquellos que se oponen a éste (Mataix, 1982).
Por lo tanto:
Así, valores altos de Re indican que la visco-
sidad no es un factor limitante, mientras que valo-
res pequeños indican lo contrario. Por otra parte,
este parámetro puede utilizarse como criterio para
el escalamiento de procesos donde la viscosidad
juega un papel determinante en las transferencias
de masa, oxígeno y/o momento.
Coeficiente volumétrico de transferencia
de masa (kLa). Es quizá el parámetro más impor-
tante en una fermentación aerobia (sin importar el
tipo de aireación), puesto que determina la capaci-
dad del sistema para transferir oxígeno a los micro-
organismos (Quintero, 1990). La Ecuación 8 des-
cribe el flux de transferencia de oxígeno en proce-
sos de este tipo.
Donde,
Na = Flux de transferencia de O2
kL = Coeficiente de transferencia de O2 en la fase
líquida
a = área interfacial por unidad de volumen
C* = Concentración de saturación de O2
CL = Concentración de O2 en el seno del líquido
El kLa puede variar durante el transcurso de
cada fermentación y puede ser determinado experi-
mentalmente por diferentes métodos: a) método
dinámico, b) oxidación de sulfito, y c) consumo
biológico del oxígeno. Específicamente hablando
del kLa en reactores Air-lift, Znád et al. (2004) pro-
pusieron la Ecuación 9 para calcular el coeficiente
global de transferencia de oxígeno.
25.0Re0791.0
HiCr
Hi
iLiHi
Hi
DV
Re
(3)
(4)
(5)
25.0
))--1(0792.0
Lsrgr
rLrLdU
Cr
LL
idadvis
inercia
cos (6)
(7)
LRe
)( *
LL CCakNa
á
Donde,
PG = Potencia debida a la aeración
VL = Volumen de trabajo del reactor
ρL = densidad del líquido
g = aceleración de la gravedad
Los tres parámetros hidrodinámicos anterior-
mente descritos, están directamente relacionados
con las condiciones de operación, la geometría del
reactor y con las propiedades fisicoquímicas del
medio líquido, de las cuales, la viscosidad es una de
las más importantes. Ésta última es la propiedad
física de los fluidos de “resistirse a fluir” (Bird et
al., 1987) y constituye la constante de proporciona-
lidad µ entre el esfuerzo unitario cortante y la va-
riación de la velocidad de cizalla en las capas de un
fluido (Ecuación 11)
La Ecuación 11 (ecuación de Newton para la
viscosidad) es generalizada y se cumple en los flui-
dos donde el esfuerzo cortante es proporcional al
gradiente de velocidad; sin embargo, existen flui-
dos en donde la relación esfuerzo cortante–
gradiente de velocidad no es proporcional por lo
cual se denominan no Newtonianos (Figura 7).
La mayoría de los fluidos líquidos utilizados
industrialmente son no Newtonianos y los caldos
de fermentación incubados en biorreactores no
son la excepción, además de que la viscosidad de
éstos a menudo es importante y cambia con el
tiempo debido a las complejas reacciones bioquí-
micas que tienen lugar durante estos procesos
(López y López et al., 2000). Por otra parte, la reo-
logía -„„ciencia que estudia el flujo y la
deformación‟‟- se encarga de estudiar a los fluidos
no Newtonianos, entre otros sistemas, de manera
tal que es posible inferir cuál es el comportamiento
de estos fluidos bajo diversas condiciones de pro-
ceso, ajustando los datos obtenidos en pruebas ex-
perimentales a modelos reológicos que relacionen
las variables involucradas (i.e. velocidad de cizalla,
esfuerzo de corte). Uno de los modelos más usa-
dos para describir el comportamiento de los flui-
dos no Newtonianos es el de Ostwald de Waele o
Ley de la Potencia (Ecuación 12) ya que es sencillo
(9) 925.0
41027.1
L
G
LV
Pxak
)/(1 rd
grL
L
G
AA
gU
V
P
(10)
dy
d
(11)
Figura 7. Curvas de flujo típicas de algunos mate-
riales.
. γ
áó ó
días hasta el momento de su utilización. Se estrían
cajas de NBTA con suspensión de NEP para des-
cartar presencia de microorganismos contaminan-
tes.
Bacteria simbionte. La bacteria simbionte se ais-
la fragmentando fases IJ de Steinernema spp. recién
recuperadas de trampa de White, en 10 mL de me-
dio STB (Caldo de soya tripticaseina) previa saniti-
zación superficial con hipoclorito de sodio al 7%.
Esto se hace por duplicado en cajas Petri (D=5
cm) las cuales se incuban a 28°C, y después de 48
h, se estrían cajas de NBTA (Agar Azul de Bromo-
timol - Cloruro de Trifeniltetrazolio) que se incu-
ban a 28°C durante 48 h más. Posteriormente se
selecciona una colonia aislada de color azul que es
Un Método para Producir NEP Mediante Cultivo Sumergido en Biorreactor Air-lift
y se aplica tanto en análisis teóricos como en cálcu-
los de ingeniería aun cuando solamente describe la
zona lineal del comportamiento reológico, motivo
por el cual es necesario manejar con cautela las ex-
trapolaciones que puedan hacerse del ajuste con
este modelo (Barnes et al., 1999).
Donde,
Donde,
η= viscosidad
K=índice de consistencia
n=índice de comportamiento al flujo
= cizalla
1
n
K
Reología en caldos de fermentación para la
producción de NEP
Referente al cultivo de NEP, poco se ha in-
vestigado con respecto a condiciones hidrodinámi-
cas, parámetros reológicos y viscosidad en los cal-
dos de fermentación involucrados. Sin embargo,
algunos autores han evaluado el comportamiento
reológico del cultivo monoxénico en matraz agita-
do y en biorreactor Air-lift (Chavarría-Hernández et
al., 2003; Sanjuan-Galindo, 2006) usando precisa-
mente el modelo de Ostwald de Waele. La deter-
minación de la viscosidad y su evolución en siste-
mas biológicos es muy importante porque afecta
directamente las condiciones hidrodinámicas y de
oxigenación imperantes en el reactor. Por lo tanto,
la viscosidad es un parámetro que debe considerar-
se durante el diseño de procesos y la elección de
las condiciones de operación para lograr producti-
vidades convenientes.
(12)
Materiales y método sugeridos.
Especímenes
NEP. Fases IJ de Steinernema spp. se propa-
gan en cultivo in vivo, usando larvas de Galleria
mellonella o en cultivo in vitro líquido (medio de
producción para NEP, MA-10) a nivel frasco agita-
do orbitalmente. Los IJ obtenidos, se lavan y sani-
tizan con solución 0.2 % v/v Thimerosal para lue-
go enjuagarse 3 veces con agua destilada estéril.
Las fases IJ así sanitizadas se mantienen en suspen-
sión acuosa (200,000 IJ/mL) en botellas para culti-
vo de tejidos (Área=90 cm2, VT=250 mL y VL=30
mL) con tapa permeable al aire a temperatura am-
biente y agitación de 80 rpm durante 2 h cada 8
á
inoculada en 75 mL de medio STB (matraz Erlen-
meyer, VT=0.5 L) que se incuba a 30°C y 150 rpm
en una incubadora con agitación orbital (SEV-
INO 650V, México) durante 30 h. Transcurrido
este tiempo y luego de verificar que el pH del culti-
vo bacteriano es entre 8 y 9, se agrega 25% v/v
glicerol estéril para preparar viales de conservación
(1.5 mL) acondicionados posteriormente a su pre-
paración con 1 h de refrigeración a -4°C, seguida
de 1 h en congelación a -18°C para luego mante-
nerlos en ultracongelación a -80°C, manteniéndo-
los así hasta su uso (previa verificación de que la
bacteria se encuentra en fase I).
Medios de Cultivo
STB (Medio de producción bacteriano)
(Buecher y Propiel, 1989). 3% p/v caldo de
soya tripticasa y 0.5% p/v extracto de levadura.
pH de 7.
Agar NBTA (Medio selectivo y diferencial
para bacteria simbionte) (Akhurst, 1980). 2.3%
p/v agar nutritivo, 0.0375 % p/v azul de bro-
motimol y 0.004 % v/v TTC (cloruro de trife-
nil tetrazolio). pH de 8.5.
MA-10 (Medio de producción para los ne-
matodos). 10% v/v aguamiel estéril, 2% v/v
aceite de maíz, 1% p/v yema de huevo des-
hidratada, 0.5% p/v NaCl, 1% de extracto de
levadura. Incluye 0.3 mL de antiespumante A
[100% base silicón] (SIGMA-Aldrich) por cada
litro de medio. pH de 7.5.
NOTA: Todos los medios se preparan con
agua desionizada, el pH de se ajusta con 40%
p/p hidróxido de sodio y se esterilizan a 15
lbf/in2 durante 15 min en autoclave, con ex-
cepción del medio MA-10 para el cultivo en
biorreactor.
Fermentadores
Se utilizan dos configuraciones de reactor Air
-lift con recirculación interna: un MTB (Modular
Tower Bioreactor 3.4 L - Applikon, The Nether-
lands) acoplado a la consola ADI 1030 y controla-
dor ADI 1031 de la misma marca, y un reactor Air
-lift con tubo draft liso (Sanjuan-Galindo, 2006)
(SEV, México) que se identificarán como Reactor
A y Reactor S, respectivamente. El aspecto, dimen-
siones y geometría de cada reactor se muestran en
la Figura 8 y Cuadro 7. El volumen de trabajo de
ambos biorreactores es el mismo, siendo las dife-
rencias principales, la forma del tanque y la presen-
Figura 8. i) Reactor S (SEV, México); ii) Filtro y humidi-
ficador de aire; iii) sedimentador de acero inoxidable aco-
plado a la tapa del reactor A; iv) Reactor A acoplado a
consola ADI 1031 y controlador ADI 1030 (Applikon,
The Netherlands ).
áó ó
cia de un sedimenta-
dor de acero inoxida-
ble en el reactor A,
que tiene la finalidad
de disminuir la veloci-
dad de flujo en el co-
mienzo de la zona de
descenso (i.e., downco-
mer).
Cultivo monoxénico
en biorreactor con
agitación neumática.
Inóculo bacteriano
Un volumen de
420 mL de medio STB
(Matraz Erlenmeyer
VT=2 L) se inocula con
un vial de conservación
de X. nematophila y se
incuba a 30°C durante
48 h. Se verifica el pH
cercano a 8 y se estrían
muestras en NBTA.
Los electrodos de pH y
temperatura se insertan
en los reactores así como
el puerto para toma de
muestra y electrodo de
oxígeno. Se conectan a
cada reactor, previa este-
rilización (40 min a 15 lbf/in2), un filtro de aire acceso-
rio relleno de algodón (construido con una botella de
vidrio con diámetro y volumen variables) y en la salida
de un filtro PTFE (d=4.5 cm, corte de 0.2 μm) unido a
un humidificador (d=15 cm, VT=3.8 L con 3 L de agua
desionizada), así como una trampa de gases en el venteo
(salida del tanque) (Figura 9). Cada biorreactor se esteri-
liza in situ, suministrando vapor a 13-15 lbf/in2 durante
50 min al tanque completo y 20 min a cada entrada-
salida haciendo las conexiones necesarias (i.e., filtros de
aire -humidificador, botella con MA-10, etc.).
Cuadro 7. Medidas principales de los reactores A y S utilizados para la producción de NEP.
Representación Magnitud
Reactor A Reactor S
Volumen total de trabajo VT 4.2 L 4.2 L
Radio interno mayor del reactor Rcolumna 6.5 cm 5.5 cm
Radio interno menor de reactor rcolumna 3.125 cm 4.75 cm
Longitud axial máxima de operación Hcolumna 54 cm 51 cm
Área transversal máxima del reactor Acolumna 132.73 cm2 95.03 cm2
Área transversal de la corona 1 en la zona
del downcomer
ADWN(1) 109.83 cm2 71.27 cm2
Área transversal de la corona 2 en la zona
del downcomer
aDWN(2) 15.47 cm2 47.12 cm2
Separación del tubo draft con la base del
fermentador
hbottom 2.0 cm 2.0 cm
Radio interno del tubo draft rint draft 2.58 cm 2.5 cm
Radio interno del sedimentador [a] rint [a] 5.0 cm -
Radio interno del sedimentador [b] rint [b] 6.5 cm -
Grosor de pared en tubo draft y sedimen-
tador
epared 0.2 cm 0.25 cm
Área transversal interna del tubo draft
(zona de ascenso, riser)
aint draft 12.56 cm2 19.63 cm2
Área transversal interna del sedimentador
[a] (zona de ascenso, riser)
a int [a] 33.18 cm2 -
Área transversal interna del sedimentador
[b] (zona de ascenso, riser)
a int [b] 19.63 cm2 -
Longitud del tubo draft hdraft 33.3 cm 27.5 cm
Volumen en el interior del tubo draft V int draft 693.53 cm3 579.23 cm3
Diámetro del difusor d difusor 4.0 cm 2.5 cm
Capacidad de suministro de aire del com-
presor
Q 1-10 lpm 1-10 lpm
Sistema de enfriamiento Chaqueta Chaqueta
á
Cultivo monoxénico
Un volumen de 3.8 L de
MA-10 se esteriliza para cada
reactor en botellas de vidrio
(d=20 mm y VT=9.7 L) a 15
lbf/in2 durante 40 min. Una vez
que baja la temperatura de los
reactores, se llena la chaqueta
de enfriamiento y se bombea el
medio de producción MA-10
estéril a cada tanque. Se man-
tienen con una aireación de 2
vvm durante 18 h, tiempo al
cual se bombea el inóculo bac-
teriano (previamente calibrado
el electrodo de O2 disuelto), en
una proporción del 10% del to-
tal de volumen de trabajo. Se
ajusta la temperatura de trabajo
a 30°C, misma que se mantiene durante 48 h con
una aireación de 1.5 vvm en cada fermentación
realizada. Una vez cumplidas las 48 h, se inoculan
fases IJ de NEP a los reactores para alcanzar una
concentración aproximada de 1000 IJ/mL, cam-
biándose la temperatura a 23°C con un régimen de
aireación variable (1 a 1.5 vvm) hasta el término
del proceso.
Muestreo durante el cultivo
El muestreo durante el cultivo se hace cada
2 d involucrándose los siguientes volúmenes de
caldo de fermentación extraídos de los biorreacto-
res:
Purga, 10 mL
Conteo de NEP, 10 mL
Determinaciones reológicas, 30 mL (cada 4 d)
En cada muestreo se estría una placa de
NBTA para revisar el estado de la bacteria y se fo-
tografían los diferentes estadios de desarrollo de
los NEP en un microscopio de campo claro
(Eclipse 80i, Nikkon, Japan) con una cámara digi-
tal. Cuando se hace reometría, NEP se fotografían
antes y después del cizallamiento en el reómetro.
Conteo de NEP viables
De los 10 mL de caldo de fermentación des-
tinados al conteo de NEP, se toman alícuotas de
100 µL y se hacen diluciones hasta 10-3
(dependiendo de la concentración total de NEP en
el reactor) usando agua desionizada de forma que
se puedan contar los NEP bajo el microscopio
usando magnificaciones de 40× a 400×. El recuen-
to se hace por triplicado.
Determinaciones reológicas
Figura 9. Esquema de filtrado y alimentación de aire en los biorreacto-
res Air-lift, así como ubicación del puerto para toma de muestra y elec-
trodos. Clave: C=compresor de aire, FP=filtro PTFE 0.2 µm, F=filtro
de algodón, H=humidificador, Tm (A, S)=toma-muestra en el Reactor
A o S respectivamente, TG=trampa de gases y E= electrodos.
áó ó
Muestras de 30 mL de caldo de fermentación
son cizalladas en un reómetro de esfuerzo contro-
lado (AR-2000; TA Instruments, USA) usando la
geometría de paletas o “vane rotor” en un interva-
lo de velocidad de cizalla de 50 s–1 a 600 s–1 y vice-
versa con una etapa de pre-cizallamiento con la
finalidad de suspender las partículas del medio y
por supuesto, los nematodos, así como descartar
posible dependencia de las propiedades reológicas
con el tiempo. Todas las muestras son cizalladas a
25°C durante 37 min, obteniéndose las curvas de
flujo correspondientes.
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