métodos diagnósticos de legionelosis · en la conferencia anual del grupo europeo de estudios en...

Métodos diagnósticos de legionelosis

Madrid, 14 de febrero de 2019

Concepción Gimeno Cardona Consorcio Hospital General Universitario de Valencia

Facultad de Medicina. Universidad de Valencia

En la Conferencia Anual del Grupo Europeo de Estudios en Infecciones por Legionella (ESGLI) en Lyon (Francia), en 2018 9.032 casos de Enfermedad del Legionario durante 2017 en toda Europa. 1.- Incremento del 30 % sobre los datos del año 2016, con una incidencia de 1,8 /100.000 habitantes. 2-El 68 % de los casos se han declarado en sólo cuatro países: Francia, Italia, España y Alemania. 2-El 89 % de los enfermos tienen más de 45 años y un 8% de mortalidad 5-El 95 % de los casos están causados por Legionella pneumophila y de

ellos el 82 % de los casos están originados por Legionella pneumohila Sg. 1. 6-En España se declararon 1.488 casos de legionelosis en 2017.

Aumento de un 46 % respecto a los casos de 2016. Desde 2013, tendencia creciente de la legionelosis en España Rompe la bajada progresiva desde 2002.

Definición de caso

• Según el protocolo Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica,

legionelosis se clasifican en:

– 1) Caso confirmado: caso con clínica compatible y confirmado con alguna de las siguientes pruebas de laboratorio:

• Aislamiento de cualquier especie o serogrupo de Legionella a partir de secreciones respiratorias, tejido pulmonar o sangre.

• Demostración de antígeno de L. pneumophila serogrupo 1 en orina por IC o EIA.

• Seroconversión: aumento del título de anticuerpos en 4 veces o más, en sueros tomados en la fase aguda y convaleciente de la enfermedad, siempre que el título de la segunda muestra sea ≥ 1/128, frente a L. pneumophila serogrupo 1, por IFI.

La sospecha diagnóstica se basa, principalmente, en el contexto epidemiológico y en algunos datos clínicos. Resulta necesario recurrir a procedimientos

microbiológicos específicos

Definición de caso – 2) Caso sospechoso o probable: caso con clínica compatible y/o resultado

positivo en alguna de las siguientes pruebas de laboratorio consideradas presuntivas:

• Detección de antígeno específico de L.pneumophila en secreciones respiratorias tejido pulmonar, por inmunofluorescencia directa usando reactivos monoclonales frente a cualquier especie o serogrupo de Legionella, incluido el SG1.

• Detección de ácido nucleico de Legionella spp. en secreciones respiratorias, tejido pulmonar u otras muestras normalmente estériles.

• Título alto de anticuerpos (1>256) frente a L. pneumophila serogrupo 1 en

suero tomado en fase convaleciente.

• Seroconversión: aumento del título de anticuerpos en 4 veces o más, en sueros tomados en la fase aguda y convaleciente, siempre que el título de la segunda muestra sea 1≥128, frente a cualquier especie o serogrupo distinto de L.pneumophila distinto de SG1, por inmunofluorescencia indirecta.

Diagnóstico de legionelosis

Approach to testing

• The main testing options for Legionella infection include – Culture – Urine antigen tests – Nucleic acid detection

Gold standard ¡Producen escasa

expectoración!

Diagnóstico de legionelosis

Métodos diagnósticos

• Other testing methods – Direct fluorescent antibody (DFA) staining DFA

• Staining has poor sensitivity • Cross reacts with other respiratory pathogens

(Pseudomonas spp.)

– Serology • Collection of acute and convalescent samples spaced

four weeks apart, which is clinically impractical. • Used for retrospective diagnosis in epidemiologic

investigations.

Serología: detección anticuerpos IgG e IgM

Métodos: o Inmunofluorescencia indirecta (IFI) o Microaglutinación o Enzimoinmunoensayo (ELISA) o Hemaglutinación indirecta o Contrainmunoelectroforesis. La IFI ha sido el método diagnóstico más utilizado y el más evaluado para L.

pneumophila serogrupo 1.

Las pruebas de microaglutinación . Ventaja :un gran número de muestras a la vez (S=80%; E= 97 -99%.

También existen disponibles ensayos de ELISA para la detección de anticuerpos frente a Legionella, aunque éstos no han sido suficientemente evaluados.

Serología: detección anticuerpos IgG e IgM

SEROLOGÍA

Seroconversión Seroconversión en la que el segundo suero título ≥

1/128. Aparece en 70-80% de los casos confirmados con cultivo Puede aparecer en la primera semana tras el inicio de los

síntomas o requerir de 6 semanas a 2 meses en aparecer, e incluso no producirse.

Suero único Más compleja, ya que el nivel de anticuerpos basal varía y se

desconoce. Títulos ≥1/256 son sugerentes de enfermedad reciente o pasada,

pero títulos inferiores a este valor deben considerarse negativos. Detección de IgM (no fiable) Un resultado negativo no descarta la enfermedad, ya que en

ocasiones se han detectado fallos en la producción de anticuerpos.

Cultivo Método de referencia (diagnóstico de confirmación) Sensibilidad (20 - 80%) en función del tipo de muestra, Especificidad del 100%. Factores baja sensibilidad: Naturaleza bacteria (Dificultad crecimiento) Limitada supervivencia de la bacteria en las muestras

clínicas Terapia antibiótica previa a la toma de muestra Experiencia microbiológica requerida para su aislamiento.

Cultivo Tedioso e incluso de difícil realización¿? Recomendable su utilización de forma rutinaria Permite realizar posteriores estudios

Epidemiología detectar fuentes de infección ¿Estudios de sensibilidad frente a antimicrobianos?

Muestras: Secreciones respiratorias, tejido pulmonar y sangre: A) Secreciones respiratorias contaminadas: esputo expectorado y muestras del tracto respiratorio inferior contaminadas con microbiota del tracto respiratorio superior, como aspirados, lavados o cepillados bronquiales. B) Secreciones respiratorias no contaminadas: muestras del tracto respiratorio inferior no contaminadas, como las obtenidas con cepillo telescopado y por aspiración pulmonar transparietal. C) Tejidos: tejido pulmonar obtenido por biopsia o necropsia, o tejido de otros órganos. D) Otras muestras menos frecuentes, como líquido pleural, líquido cefalorraquídeo (LCR) o sangre

Cultivo BCYEα (buffered charcoal yeast extract suplementado con α-

cetoglutarato), que contiene los elementos requeridos por la bacteria, como hierro y cisteína,

Medio selectivo suplementado con antibióticos, BMPA (BCYEα suplementado con polimixina, cefamandol y anisomicina)

Incubación a 35-37ºC, aerobiosis y humedad Crecimiento empieza a ser visible a partir del 3er día de incubación Los cultivos se deben mantener 10- 12 días antes de considerarlos negativos

Pequeñas cantidades de CO2 (2,5-5%) favorecen algunas especies. Cuando se procesan muestras contaminadas (esputo) descontaminación:

Ayudan a eliminar la microbiota acompañante Favorecen el reconocimiento de las colonias de Legionella Los tratamientos utilizados son de 2 tipos:

Calor (50ºC 30 min) Tratamiento ácido (pH de 2,2 durante 5 min).

Cultivos con cefamandol pueden inhibir especies de Legionella no productoras de betalactamasas, como L.micdadei y L.bozemanii.

Identificación de especies de Legionella

Especies de Legionella pueden identificarse Inmunofluorescencia (IF) con anticuerpos poli o monoclonales Inmunocromatografía Aglutinación con partículas de látex Ensayos con anticuerpos géneroespecíficos mediante dot-blot Amplificación específica del ADN mediante técnicas de PCR. Pruebas bioquímicas, aunque no suelen ser muy útiles: resultados variables

Maldi

Detección de antígeno urinario • Legionella urinary antigen is the most commonly used test.

• The sensitivity > 80 percent and specificity approaches 100

percent in patients with Legionnaires' disease caused by L. pneumophila serotype 1.

• Legionella antigens can be detected in urine as early as one day after symptom onset and persist for days to weeks.

• The major disadvantage of the assay is that it only detects L. pneumophila serotype 1. (causes over 80 percent of cases)

Moderador

Notas de la presentación

En el transcurso de un episodio neumónico por L. pneumophila se libera antígeno específico que puede detectarse en la orina. La detección de este antígeno ofrece un diagnóstico rápido de confirmación de neumonía por L. pneumophila reciente o pasada, por lo que estos ensayos se deberán realizar únicamente en presencia de un cuadro clínico compatible, o con menor sospecha clínica en el caso de brotes hospitalarios.. El antígeno detectado es un componente soluble del lipopolisacárido (LPS) de la pared celular de Legionella, es termoestable, y es detectable desde el inicio de la sintomatología, y en algunos casos hasta muchos meses después (en algún caso hasta más de 1 año), resultados no influenciados por la administración previa de antibióticos. Estos antígenos se han detectado por varias técnicas, como aglutinación con partículas de látex, hemaglutinación pasiva y radioinmunoensayo (RIA). La primera técnica disponible comercialmente que demostró ser una técnica útil, sensible y específica, fue el RIA, que presentaba una sensibilidad del 60% en orina directa y del 80% en orina concentrada, siendo la especificidad en ambos casos del 100%. La utilización de la técnica del RIA exigía disponer de instalaciones adecuadas para trabajar con isótopos radioactivos, por lo que ha sido sustituida por técnicas de enzimoinmunoensayo (EIA) de similares características, que se han incorporado a muchos laboratorios. Existen varias técnicas de EIA comercializadas, siendo las de Binax, Biotest y Bartels las más utilizadas. La sensibilidad empleando orina concentrada es similar en los tres EIA (80-90%), con una especificidad del 98-100%, destacando la elevada sensiblidad del EIA de Bartels empleando orina directa (60-75%). Hoy día, la técnica más utilizada es la inmunocromatografía (ICT). Es más rápida, ya que ofrece resultados en 15 minutos o menos dependiendo de la concentración de antígeno en la orina. Es técnicamente menos compleja que las técnicas de EIA, no requiere equipamiento específico y se realiza de forma individualizada. Los resultados obtenidos son absolutamente equiparables con los de las técnicas de EIA en sensibilidad y especificidad, exhibiendo específicamente una concordancia global con el EIA de Binax del 98%. Todas las técnicas descritas detectan con una gran sensibilidad el antígeno de L. pneumophila serogrupo 1, siendo además capaces de detectar “in vitro” antígeno soluble de todos los serogrupos de L. pneumophila. El EIA de Biotest es el único que según el fabricante tiene capacidad para detectar todos los serogrupos de L. pneumophila, así como otras especies de Legionella, aunque no garantiza la misma sensibilidad para todos los serogrupos y especies. La capacidad de detectar antígeno de otros serogrupos está en función de las características propias de cada antígeno, como la capacidad de pasar a la orina, la cantidad excretada y su inmunogenicidad. Los antígenos de otros serogrupos de L. pneumophila podrían no excretarse por la orina, ya que pueden pasar a través de las paredes de los capilares glomerulares o no hacerlo, en función de su tamaño y de su carga. Es interesante destacar que el tratamiento térmico de la orina no supone la desaparición de la positividad y sí la eliminación de falsos positivos en muestras negativas. También es importante conocer que la concentración del antígeno presente en la orina por ultrafiltración selectiva incrementa significativamente la sensibilidad sin que se vea afectada la especificidad.

Detección de antígeno

La capacidad de detectar antígeno de otros serogrupos está en función características propias de cada antígeno como la capacidad de pasar a la orina la cantidad excretada su inmunogenicidad

Ag de otros serogrupos de L. pneumophila

podrían no excretarse por la orina (ya que pueden pasar a través de las paredes de los capilares glomerulares o no hacerlo, en función de su tamaño y de su carga)

Detección de antígeno urinario

Componente soluble del LPS de la pared celular de Legionella, es termoestable

Desde el inicio de la sintomatología, y en algunos casos hasta muchos meses después (en algún caso hasta más de 1 año)

Resultados NO influenciados por la administración previa de antibióticos.

Tratamiento térmico de la orina NO altera la positividad y sí la eliminación de falsos positivos en muestras negativas.

La concentración del antígeno presente en la orina por ultrafiltración selectiva incrementa la sensibilidad sin que se vea afectada la especificidad

Falsos positivos en pacientes con enfermedades séricas

Moderador


Con cual nos quedamos???

Detección de antígeno: variables con importancia diagnóstica

Sensibilidad y especificidad

Detección de antígeno de L.pneumophila 1 y /o otros serotipos NO 1

Necesidad de pretratamiento: calentamiento, concentración

Lectura objetiva

Detección conjunta con antígeno de neumococo

Moderador


Con cual nos quedamos???

Detección de Ag: BINAX

ALERE READER AUMENTA LA SENSIBILIDAD CLÍNICA Y ANALÍTICA DE LA TARJETA DE ANTÍGENO URINARIO ALERE BINAXNOW® LEGIONELLA.

• Ensayo rápido • Detectar cualitativamente el

antígeno del serogrupo 1 de L. pneumophila

• En orina de pacientes con síntomas de neumonía.

ALERE READER DEMOSTRÓ UNA SENSIBILIDAD GENERAL DEL 100

• De 49 muestras positivas, Alere Reader identificó correctamente las 49 muestras como positivas

• La interpretación visual solo identificó 41 muestras como positivas

Disminuye la subjetividad y aumenta la sensibilidad del ojo humano

Moderador


The urinary antigen enzyme immunoassay (EIA) (Binax Legionella Urinary Antigen EIA kit, Alere, Waltham, MA) is the primary method used for diagnosis of Legionella infections in the United States and the European Union, and a positive result using this method is widely considered confirmatory laboratory evidence for diagnosis of legionellosis A critical limitation of this method is that only the most prevalent species and serogroup of Legionella, L. pneumophila serogroup 1 (Lp1), is detected using this assay, thus precluding diagnosis of non-Lp1 and nonpneumophila LD cases

Detección de antígeno: SOFIA

• The Sofia Legionella Fluorescent Immunoassay (FIA) uses advanced immunofluorescence-based lateral-flow technology to detect Legionella pneumophila serogroup 1 antigen in human urine specimens and is designed to test specimens from patients with symptoms of pneumonia.

Legionella pneumophila serogroup 1 antigens, if present, bind to the detection particles.

When the sample migrates up the Test Strip to the Test Line, the antigen-conjugate complex is bound to the capture antibody, forming a fluorescent line.

If antigens are not present, the fluorescent microparticles will not be trapped by the capture antibodies nor detected by Sofia.

Sofia will scan the test strip and measure the immunofluorescent signal by processing the results using method-specific algorithms and display the test results (Positive, Negative, or Invalid) on its display screen. Hervir la orina

SD Standard Biosensor (Vircell)

CONCLUSIONES: The bioNexia Legionella test shows similar performance to the BinaxNOW Legionella test with nonconcentrated urine. The bioNexia test proved to be easier to use than BinaxNOW Legionella. • After urine concentration, the bioNexia Legionella test shows excellent sensitivity close to the sensitivity of the Sofia Legionella FIA test. The concentration step improves the sensitivity of bioNexia Legionella without any impact on specificity. bioNexia Legionella shows excellent specificity (100%) without heating the samples before testing, while urine heat treatment is recommended for the Sofia Legionella FIA test. • The performance observed makes this test suitable for the routine diagnosis of Legionella infection.

Detección de Antígeno


PERFORMANCE CHARACTERISTICS 1.- Analytical sensitivity (detection limit) Detection limit value of CerTest S. pneumoniae+Legionella is: • 0.25ng/mL of CWPS for strip A (S. pneumoniae) • 12.5ng/mL (pool of several serovars of Legionella pneumophila) for strip B

(Legionella). 2.- Clinical sensitivity and specificity Urine samples, CerTest S. pneumoniae+Legionella, CerTest versus BinaxNOW® Streptococcus pneumoniae Antigen Card, Alere for strip A.

• Seven rapid IC assays for the detection of Legionella pneumophila (LP) serogroup 1 soluble antigen in urine were

compared. Twenty four urine samples from different patients with culture confirmed LD due to LP serogroup 1 were obtained from six countries (positive controls). Two additional urine samples were from patients diagnosed by UA tests only. Negative control urines included 75 samples from healthy volunteers and two from culture confirmed cases that were not caused by LP serogroup 1. All 7 UA assays (BinaxNOW, V-Test, RapiCard, Uni-Gold, Xpect, SAS, Accusay) were tested simultaneously and interpreted by two technicians. Results: Sensitivity/specificity calculations for results from each kit were as follows:

.

• Conclusions: – The BinaxNOW and V-Test assays were similar in sensitivity/specificity

(100%/100% vs. 92% /100%). – Some UA test kits had unacceptably low sensitivity and specificity and we would

caution against their use.

• Conclusions: Legionella urinary antigen for serotype 1 appears to have excellent specificity, though modest sensitivity. However, the poor quality of the included studies and the presence of publication bias suggest an overestimation of test performance. High-quality studies are needed.


Todas las técnicas detectan con una gran sensibilidad el antígeno de L. pneumophila serogrupo 1

Siendo además capaces de detectar “in vitro” antígeno soluble de todos

los serogrupos de L. pneumophila.

El EIA de Biotest es el único que según el fabricante tiene capacidad para detectar todos los serogrupos de L. pneumophila, así como otras especies de Legionella, aunque no garantiza la misma sensibilidad para todos los serogrupos y especies.

En la actualidad existen varias técnicas de EIA comercializadas, siendo las de Binax, Biotest y Bartels las más utilizadas.

La sensibilidad empleando orina concentrada es similar en los tres EIA (80- 90%), con una especificidad del 98-100%, destacando la elevada sensiblidad del EIA de Bartels empleando orina directa (60-75%), que casi permite obviar la necesidad de concentrar la orina

PCR Can detects all clinically important Legionella species and

serotypes (PCR multiplex) The diagnostic accuracy of PCR appears to be high and exceeds

that of culture but is difficult to determine because there is no reliable reference standard.

The major limitation of PCR is the inability to obtain adequate sputum samples. – Inducing sputum for testing may enhance diagnostic yield. – Testing for upper respiratory samples by PCR is also an alternative;

however, the sensitivity is low – Menos útil y poco probado en muestras de suero, orina,

muestras leucocitaria • Fast results PCR Real Time (60-90min)

PCR is the preferred test for the diagnosis of Legionnaires' disease

Beneficio añadido del uso de técnicas moleculares para la detección de Legionella es ligeramente superior (alrededor del

11%) a la detección de antígeno urinario.

Aumenta diagnóstico de 18 a 30% PCR versus Antígeno

• Systematic PCR testing for Legionella species of all lower respiratory specimens from patients with pneumonia or immune compromised status

• Strategy will miss testing patients who could not expectorate sputum and when inadequate clinical information is written on laboratory requisition forms.

• To address this diagnostic gap we enhanced case detection by actively identifying patients CAP and by collecting induced sputum from those unable to expectorate voluntarily.

• In addition, evaluating throat swabs as an alternative specimen for PCR testing.

• Urine samples were tested for L. pneumophila serogroup 1. Antigen Card and BinaxNOW

• There were 22 (19%) cases of Legionnaires’ disease: 16 cases caused by L. longbeachae, three caused by L. pneumophila and three non-typable Legionella species. Of these, 21 were detected by sputum PCR, eight had positive sputum cultures (all PCR positive), and three had positive urinary antigen tests (two were also detected with sputum). The three non-typable Legionella species were all culture negative, urinary antigen negative and of insufficient copy number to type. Of the 114 patients, 17 (15%) had positive urinary antigen tests for S. pneumoniae and one (1%) patient had a positive blood culture for S. pneumoniae

• Designed a multiplex real-time PCR assay for detection of all Legionella spp. and simultaneous specific identification of four clinically-relevant Legionella species, L. anisa, L. bozemanii, L. longbeachae, and L. micdadei, using 5′-hydrolysis probe real-time PCR.

• The analytical sensitivity for detection of nucleic acid from each target species

was ≤50 fg per reaction. • Utility of this assay in spiked human sputum specimens. This assay could serve

as a tool for understanding the scope and impact of non-pneumophila Legionella species in human disease.

Moderador


PCR has been shown to be a rapid and reliable method for detection of Legionella in lower respiratory specimens and thus has emerged as a preferred diagnostic strategy (Diederen, 2008; Murdoch, 2003). One recent study demonstrated that systematic screening of respiratory specimens from patients with a clinical diagnosis of pneumonia improved case detection, particularly of milder cases (Murdoch et al., 2013). Still, PCR is not widely and systematically implemented for diagnostic testing, and detection of nucleic acid in a lower respiratory specimen has not yet been recognized as sufficient laboratory evidence for confirmation of a legionellosis case in the United States or Europe (Mercante and Winchell, 2015).

Moderador


Results of the multiplex PCR assay matched the species previously identified by sequencing the mip gene for all isolates

• Presence of pathogenic L. non-pneumophila species in environmental samples, which represents a risk factor for Legionella infections. In Spain, L. feeleii, L. anisa, L. donaldsonii, L. bozemanii, L. dumoffi and L. jordanis have been found in drinking water treatment plants, water distribution networks and cooling towers.

• Considering these evidences and the lack of routine diagnostic methods in hospitals to detect all L. pneumophila serogroups and L. non-pneumophila species responsible for cases of legionellosis

• Application of a PCR protocol to identify diverse Legionella species in urine samples from patients with respiratory symptoms.

• All samples were analyzed with Legionella Urinary Antigen Card (Alere BinaxNOW1, United States)

Moderador


A total of 210 urine samples from patients with a suspicion of pneumonia were analyzed using an immunochromatographic assay and molecular techniques to detect Legionella antigen and DNA, respectively (S1 Fig). The first method (urinary antigen test) proved 4 samples of 210 (1.9%) positive for L. pneumophila serogroup 1. Regarding the semi-nested PCR, 15 samples of 210 (7.1%) were positive for legionellosis with the following distribution: 4 cases were due to L. pneumophila (the same cases identified by immunochromatography), 1 case attributed to L. anisa and in the rest of positive samples (10 cases) the species of Legionella was not possible to identify (Table 1). These results show a significant difference (p < 0.05) between PCR and immunochromatography for the identification of Legionella in urine samples.

Paneles Sindrómicos

• Permite realizar hasta 96 tests diagnósticos (protocolos) diferentes al mismo tiempo. Cada posición está calibrada térmica y ópticamente, lo que permite realizar el mismo protocolo en las posiciones deseadas.

• El sistema Smartcycler es plug-and-play, y solo es necesaria una conexión USB para transformarlo en un equipo modular de hasta 6 x 16 = 96 posiciones.

• Rapidez de los ciclos de calentamiento y enfriamiento que permite la superficie plana de contacto de los irrompibles tubos plásticos especiales que utiliza el sistema.

• Los resultados históricos pueden ser consultados, impresos y validados en cualquier momento, aunque el equipo esté en uso..

Moderador


Multiplexing: Hay 4 LEDs y 4 detectores que optimizan la capacidad multiplex. Los filtros de longitud de onda en cada uno de los detectores impiden el riesgo de fluorescencia cruzada. La señal óptica se mide en un ángulo de 90º para minimizar el riesgo de interferencias Termociclado rápido: La placas cerámicas permiten una transmisión de calor muy rápida al tubo de reacción, y los ventiladores disminuyen el tiempo de enfriamiento, mejorando la velocidad de las rampas de amplificación. A su vez, es posible configurar diferentes velocidades de calentamiento/enfriamiento para optimizar ensayos.

• Ofrece una amplia gama de kits completos por PCR a tiempo real para la detección de patógenos respiratorios. El panel respiratorio MWS r-gene® permite la detección de múltiples patógenos de forma simultánea

• Posibilidad de elegir entre uno o más de 40 patógenos dependiendo de las combinaciones de kits elegidas.

• Diagnóstico «a la carta» gracias a un protocolo común para patógenos DNA o RNA, bacterias o virus.

• Resultados en menos de 1h45 después de la extracción.

• Posibilidad de realizar varios experimentos en el mismo día.

• Posibilidad de identificar virus y bacterias de forma simultánea.

CONCLUSION: • Multiplex Lightmix® RT-PCR provides a reliableool to overcome underdiagnosis of atypical pneumonia,

• The multiplex Lightmix® RT-PCR showed a good diagnostic performance that is comparable to singleplex in-

house RT-PCR assays with respect to specificity and sensitivity. • • We propose a diagnostic workflow with low per sample costs using an automated DNA extraction device

(e.g. QIASymphony) and multiplex Lightmix® RT-PCR detection.

• Up to 24 samples can be analysed in parallel in this workflow within less than 4 h. suitable for high-throughput routine screening of multiple important respiratory pathogens causing atypical pneumonia.

• Retrospective study, 368 clinical respiratory specimens, obtained from patients suffering from atypical pneumonia that

have been tested negative for the presence of common agents of pneumonia by culture and viral PCR

• Respiratory clinical specimens (including sputum, bronchoalveolar lavage, respiratory swabs, tracheal and nasopharyngeal secretions) from patients with symptoms of atypical pneumonia were sent to our diagnostic laboratory for analysis (N = 355)

• These clinical specimens have been previously characterized by singleplex RT-PCR assays in our diagnostic laboratory and were used to evaluate the diagnostic performance of the respiratory multiplex Lightmix® RT-PCR

• Multiplex RT-PCR showed identical performance characteristics with respect to specificity and sensitivity as in-house singleplex RT-PCRs for pathogen detection

• Lightmix® multiplex RT-PCR assay represents a low-cost, time-saving and accurate diagnostic tool with high throughput potential. The time-to-result using an automated DNA extraction device for respiratory specimens followed by multiplex RT-PCR detection was below 4 h, which is expected to significantly improve diagnostics for atypical pneumonia-associated bacterial pathogens.

All Legionella spp. analysed showed a positive amplification signal in the multiplex RT-PCR and could thereby be clearly identified as positive.

In melting curve analysis, all L. pneumophila serogroups showed a peak at 62 °C and enabled their unambiguous differentiation from other Legionella spp.

Different Legionella spp.

displayed either no peak or a peak between 48 °C and 55 °C respectively

What´s the best strategy?

• Determine the value of PCR for the diagnosis of LD in routine clinical practice. • Prospective study, from March 2007 to April 2010, the value of PCR on noninvasive respiratory

specimens (NIRS) was compared to those of the other available tools for LD diagnosis in patients hospitalized for pneumonia.

• Results: Among 254 consecutive cases of pneumonia included, 24 cases were LD (19 confirmed and 5 probable) representing the first documented microbiological etiology.

• Molecular diagnosis of LD was performed on NIRS by using 16S rRNA PCR, and secondarily mip PCR, with no discrepant results between the 2 methods: it was found positive in 14 cases and led to identify 2 supplementary probable cases of LD.

• Based on clinical and at least 2 positive LD tests, PCR yielded a better diagnostic value than antigen urinary test (BINAX) (12 vs 10 cases).

• Real-time PCRs Legionella DNA was detected on respiratory samples (sputum with or without induction, nasopharyngeal aspirates or nasopharyngeal wash samples in 93% of cases) by 2 different real-time (RT) PCRs. A dual-color 16S rRNA PCR was performed on a Lightcycler 1.0 instrument (Roche) using the 2 primers and 4 FRET probes described by Reischl et al.18 The method allows to detect all Legionella species and to differentiate L. pneumophila from other Legionella species by analyzing the melting curves of the amplicons.

• In addition, each PCR result was validated by the positive detection of a beta-globin gene control. During the study period, the efficiency of the 16S rRNA PCR was controlled by testing samples from the 2006e2007 QCMD panels. A mip PCR specific for L. pneumophila was done secondarily on a SmartCycler (Cepheid)

Moderador


Twenty-four cases, all due to L. pneumophila were considered as confirmed (19 cases) or probable (5 cases) (Table 1).15,16 Among them, only 12 cases were categorized as “proven” LD.17 Serogroups involved were serogroup 1 (n Z 16), serogroup 2 (n Z 1) and serogroup 6 (n Z 1). For the 6 remaining cases, the serogroup was not determined Tables 1 and 2 describe the concordance of the different tools used for the diagnosis of LD. Fourteen patients had a positive Legionella PCR on respiratory sample. There was no discordance between the 16S rRNA PCR and the mip PCR. Two patients were considered probable LD as only 16S rRNA and mip PCR assays were positive, other tests for LD were negative (cases no. 9 and 18 in Table 1).

• Low sensitivity of Legionella culture • Legionella serology did not exhibit

good diagnostic values • Urinary antigen testing exhibited a

better sensitivity than PCR in this work, probably due to the high rate of L. pneumophila serogroup 1 cases and community acquisition. However, 6 out of 24 LD cases reported here had only positive urinary antigens, being therefore considered as confirmed cases. Nevertheless as suggested by Chen et al., definition of LD based on a single laboratory test may be questioned When definition of “proven” LD was based on clinical and at least 2 positive LD tests, PCR yielded a better diagnostic value than antigen urinary test

CONCLUSION: This prospective study demonstrated that the performances of PCR assays on NIRS were near to those of urinary antigen testing, with a potentially larger panel of serogroups and species of Legionella detected, and were much better than those of culture and serology. In complement to urinary antigens, this tool should be used more in clinical practice in patients hospitalized with pneumonia. Medico-economic impact assessment of this strategy should be performed in further studies.

• Objectives: aim was to determine the utility of frontline L.pneumophila and Legionella species PCR in a severe respiratory infection algorithm.

• Methods:L.pneumophila and Legionella species duplex real-time PCR was carried out on 1944 specimens from hospitalised patients over a 4 year period in Edinburgh, UK.

• Results: L. pneumophila was detected by PCR in 49 (2.7%) specimens from 36 patients. During a LD outbreak, combined L. pneumophila respiratory PCR and urinary antigen testing had optimal sensitivity and specificity (92.6% and 98.3% respectively) for the detection of confirmed cases. Legionella species was detected by PCR in 16 (0.9%) specimens from 10 patients. The 5 confirmed and 1 probable cases of Legionella longbeachae LD were both PCR and antibody positive.

• Conclusions: Front-line L. pneumophila and

Legionella species PCR is a valuable addition to urinary antigen testing as part of a well-defined algorithm.

Cases of LD due to L. longbeachae might be considered laboratory-confirmed when there is a positive Legionella species PCR result and detection of L. longbeachae specific antibody response.

PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNÓSTICO

PCR on a lower respiratory tract sample (eg, sputum or

bronchoalveolar lavage specimen (IF POSITIVE CULTIVE)

If PCR is not available or if sputum cannot be

obtained,urine antigen testing is an acceptable alternative,

- L. pneumophila serogroup 1 - Rapid turnaround time and

high specificity

NEGATIVE BUT STILL SUSPECTED Send PCR or culture on a lower respiratory tract sample when

urine antigen assays are negative and Legionella infection is still

suspected

POSITIVE: also obtain a culture from the

lower respiratory tract for epidemiologic purposes

Moderador


When testing for Legionella in patients with pneumonia, we prefer to use PCR on a lower respiratory tract sample (eg, sputum or bronchoalveolar lavage specimen) because PCR has high diagnostic accuracy and detects all Legionella species and serogroups. If PCR is not available or if sputum cannot be obtained, urine antigen testing is an acceptable alternative, especially in regions such as the United States where the prevalence of L. pneumophila serogroup 1 is high. The main advantages of the urinary antigen test are its rapid turnaround time and high specificity. Because the urinary antigen test only detects L. pneumophila serotype 1, we generally send PCR or culture on a lower respiratory tract sample when urine antigen assays are negative and Legionella infection is still suspected. For patients with positive Legionella urinary antigen tests or PCR, we generally also obtain a culture from the lower respiratory tract for epidemiologic purposes (eg, comparison with isolates from other patients or potential sources).

No debe ser considerada herramienta diagnóstica primaria

• 82 unrelated patients with Legionnaire's disease from which 139 respiratory specimens were sampled during hospitalization and antibiotic therapy.

• Developed a real time PCR assay and used deep-sequencing approaches to detect antibiotic resistance mutations in L. pneumophila and follow their selection and fate in these samples.

• Identified the in vivo selection of fluoroquinolone resistance mutations in L. pneumophila in two infected patients treated with these antibiotics.

• Antibiotic resistance occurred during hospitalization most likely after fluoroquinolone treatment. Interpretation: In vivo selection of antibiotic resistances in L. pneumophila may be associated with treatment failures and poor prognosis. This hidden resistance must be carefully considered in the therapeutic management of legionellosis patients and in the control of the gradual loss of effectiveness of antibiotics.

CONCLUSIONES

• Con estos datos ¿podemos mantener a la PCR en la definición de caso probable?

• Consensuar protocolos de trabajo en sociedades

• Hacer estudios coste-beneficio • No sobreusar los métodos de diagnóstico • La clínica es fundamental

métodos diagnósticos de legionelosis · en la conferencia anual del grupo europeo de estudios en...

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