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MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLIFOSATO EN MATRICES
AMBIENTALES
DIANNY JESMID BOHÓRQUEZ VIVAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
BOGOTÁ, D.C.
2020
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLIFOSATO EN MATRICES
AMBIENTALES
DIANNY JESMID BOHÓRQUEZ VIVAS
Trabajo de grado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias-Química
Director (a)
María José Martínez Cordón PhD
Grupo de Investigación:
Residualidad y Destino ambiental de plaguicidas en sistemas agrícolas
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
BOGOTÁ, D.C.
2020
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por conceder los anhelos de mi corazón. Por ser luz y guía en mi camino.
A la Universidad Nacional de Colombia por darme la oportunidad de crecer, ser más fuerte y constante en mi proceso de aprendizaje.
A la profesora María José Martínez Cordón, por darme ese voto de confianza y su apoyo incondicional no sólo en el aspecto académico sino personal.
A la profesora Zuly Jenny Rivera Monroy por asesorarme en la redacción de este documento.
A mi familia por ser una compañía constante…
“Familia es familia y cariño es cariño”.
A mis amigos por ser tan especiales, por estar presente en las alegrías y adversidades de la vida, para ustedes mis más sinceros agradecimientos.
A todos los que hicieron posible el desarrollo y culminación de este trabajo.
Mereces lo que sueñas…
Gustavo Cerati
Resumen
El glifosato es el herbicida más utilizado y comercializado a nivel mundial usado
principalmente para el control de malezas. El uso excesivo y su impacto en el medio
ambiente, ha promovido el análisis químico del glifosato en el agua, el suelo y alimentos.
Debido a la complejidad y características específicas de la molécula para ser analizada, es
necesario implementar e introducir mejoras en las metodologías que permitan realizar
procedimientos de detección a niveles de trazas. El glifosato es un compuesto que no
contiene una estructura química compleja, pero al tener cuatro grupos altamente polares,
dificulta el análisis por métodos convencionales. Para la química, sigue siendo un desafío
desarrollar técnicas que arrojen resultados confiables en tiempos cortos, teniendo en cuenta
cada uno de los parámetros para que, en el momento de realizar la operación, el método
elegido sea óptimo, confiable, eficaz y no se presenten errores en los procedimientos que
pueden generar resultados incorrectos.
Este trabajo se realiza a fin de recopilar las técnicas analíticas instrumentales usadas en la
actualidad para la cuantificación y detección de glifosato. Se describen los parámetros que
deben ser relevantes para la determinación de glifosato y su metabolito principal AMPA
(ácido aminometilfosfónico) y procesos asociados a técnicas cromatográficas, que van
desde rutas de degradación del contaminante, procedimientos de tratamiento de las
muestras, reacciones de derivatización química, uso de columnas y detectores. Así mismo,
se presentan metodologías de análisis que involucran otras técnicas más avanzadas siendo
estas, una alternativa favorable para la detección de este herbicida.
Palabras clave: Herbicida, Glifosato, AMPA, cromatografía, derivatización.
Abstract
Glyphosate is the most widely used and marketed herbicide worldwide used primarily for
weed control. Excessive use and its impact on the environment has promoted the chemical
analysis of glyphosate in water, soil and food. Due to the complexity and specific
characteristics of the molecule to be analyzed, it is necessary to implement and introduce
improvements in the methodologies that allow detection procedures at trace levels.
Glyphosate is a compound that does not contain a complex chemical structure, but having
four highly polar groups makes analysis by conventional methods difficult. For chemistry, it
is still a challenge to develop techniques that yield reliable results in short times, taking into
account each of the parameters so that, at the time of performing the operation, the chosen
method is optimal, reliable, efficient and not present Errors in procedures that may generate
incorrect results.
This work is done in order to compile the instrumental analytical techniques currently used
for the quantification and detection of glyphosate. The parameters that should be relevant
for the determination of glyphosate and its main metabolite AMPA (aminomethylphosphonic
acid) and processes associated with chromatographic techniques, ranging from routes of
contaminant degradation, sample treatment procedures, chemical derivatization reactions,
are described. use of columns and detectors. Likewise, analysis methodologies are
presented that involve other more advanced techniques, these being a favorable alternative
for the detection of this herbicide.
Keywords: Herbicide, Glyphosate, AMPA, chromatography, derivatization.
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS
LISTA DE GRÁFICAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1
2. CARACTERIZACION DE GLIFOSATO ................................................................. 3 2.1 Plaguicidas ........................................................................................................... 3
2.2 Glifosato ............................................................................................................... 3
2.2.1 Propiedades físicas y químicas del Glifosato ..................................................... 6
2.2.2 Toxicología ........................................................................................................ 7
2.2.3 Formulaciones ................................................................................................... 8
2.2.3.1 ROUNDUP® ................................................................................................. 10
2.3 Ácido aminometilfosfónico (AMPA) ..................................................................... 11
2.4 Modo de acción de glifosato en las plantas ......................................................... 11
3. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA DE INVESTIGACIONES SOBRE GLIFOSATO ...... 14
4. GLIFOSATO EN MATRICES AMBIENTALES ..................................................... 16 4.1 Glifosato en agua ................................................................................................ 16
4.2 Glifosato en suelo ............................................................................................... 16
4.2.1. Degradación de glifosato en suelos ................................................................ 17
4.3 Glifosato en aire .................................................................................................. 18
4.4 Glifosato en alimentos ........................................................................................ 18
5. METODOS ANALÍTICOS PARA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE GLIFOSATO ...................................................................................................... 20
5.1 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA ANÁLISIS ................................... 20 5.1.1 Extración con bases ......................................................................................... 20
5.1.2 Extracción en Fase Sólida (SPE) ..................................................................... 20
5.1.3 Microextracción en fase sólida (SPME) ............................................................ 24
5.1.4 Extracción líquido-líquido (LLE) ....................................................................... 25
5.1.5 Derivatización .................................................................................................. 27
5.1.5 .1 Derivatización para Cromatografía de Gases ............................................... 27
5.1.5.2 Derivatización para Cromatografía Líquida ................................................... 29
5.4.3 Derivatización para Electroforesis Capilar ........................................................ 33
5.2. COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS ................................................................. 35
5.3. DETECTORES ................................................................................................. 38 5.3.1 Detector de ionización de llama (FID) .............................................................. 38
5.3.2 Detector de ionización Nitrógeno-Fósforo (NPD) ............................................. 39
5.3.3 Detector fotométrico de llama (FPD) ................................................................ 39
5.3.4. Detector de captura de electrones (ECD)........................................................ 39
5.3.5. Detector UV-Visible ......................................................................................... 40
5.3.6. Detector de Fluorescencia (FLD) .................................................................... 40
5.3.7. Detector de masas .......................................................................................... 41
6. MÉTODOS ANÁLITICOS INSTRUMENTALES ................................................... 42 6.1. Cromatografía de Gases .................................................................................... 42
6.2. Cromatografía Líquida. ...................................................................................... 44
6.3. Cromatografía Iónica (IC) ................................................................................... 50
6.4 Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas ............................. 50
6.5 Cromatografía Líquida con Ionización por Electrospray y Detección en Masas Tándem (LC-ESI/MS/MS) ......................................................................................... 51
6.6 Cromatografía Líquida de alta eficiencia con Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente (HPLC-ICP-MS/MS) ......................................................... 52
6.7 Cromatografía Líquida de alto rendimiento con Detector de Arreglo de Diodos (DAD/HPLC) ............................................................................................................. 55
6.8 Electroforesis Capilar (CE) .................................................................................. 56
6.8.1 Electroforesis de Microchips ............................................................................ 57
6.9 ELISA ................................................................................................................. 58
6.10 Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ............................................................. 59
6.11 Espectroscopía Raman ..................................................................................... 63
7. CONCLUSIONES ................................................................................................ 67
8. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 69
9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………..…70
LISTA DE TABLAS
Tabla 1:Propiedades químicas y físicas del Glifosato. ....................................................... 6
Tabla 2: Marcas comerciales que contienen como ingrediente activo glifosato registradas
en Colombia. ..................................................................................................................... 8
Tabla 3: Propiedades de tres formulaciones comerciales de glifosato de Monsanto. ....... 10
Tabla 4: LMR en alimentos para consumo humano, piensos y forrajes. .......................... 19
Tabla 5: Tratamiento de muestras para análisis de glifosato. ........................................... 26
Tabla 6:Parámetros analíticos en HPLC .......................................................................... 49
Tabla 7:Asignaciones de señales específicas de la estructura del glifosato. .................... 65
LISTA DE GRÁFICAS
Gráfica 1: Número de publicaciones que involucran métodos de análisis instrumental en los
últimos 10 años sobre glifosato en la base de datos Science Direct. ............................ 14
Gráfica 2:Porcentaje de publicaciones de matrices de análisis de glifosato en publicaciones
de Science Direct. ............................................................................................................ 14
Gráfica 3:Número de publicaciones en los últimos 10 años sobre glifosato en la base de
datos Springer. ................................................................................................................ 15
Gráfica 4:Porcentaje de publicaciones de matrices de análisis de glifosato en publicaciones
de Springer. ..................................................................................................................... 15
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estructura química de glifosato. .......................................................................... 5
Figura 2:Equilibrios ácido-base del Glifosato con sus pKa correspondientes ..................... 5
Figura 3: Estructura química del ácido aminometilfosfónico (AMPA). .............................. 11
Figura 4: Equilibrios ácido-base del AMPA y sus pka correspondientes. ......................... 11
Figura 5: Inhibición de la enzima 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfatosintasa por glifosato. .. 13
Figura 6: Mecanismo de degradación de glifosato: Ruta de la Sarcosina. ....................... 17
Figura 7: Mecanismo de degradación de glifosato: Ruta del AMPA ................................. 18
Figura 8:Etapas del proceso de Extracción en Fase Sólida (SPE) ................................... 22
Figura 9: Proceso de Microextracción en Fase Sólida (MPSE) ........................................ 25
Figura 10: Reacción de derivatización de glifosato con TFAA,TFA y TMCA .................... 28
Figura 11: Reacción de derivatización de glifosato con IPCF…………………………..……28
Figura 12: Reacción de derivatización de glifosato con TFA, TEE.....................................29
Figura 13: Reacción de derivatización de Glifosato con OPA-MERC ............................... 30
Figura 14: Reacción de derivatización de Glifosato y AMPA con FMOC-Cl ..................... 31
Figura 15:Reacción de derivatización de Glifosato con DMOSC.……………………………31
Figura 16:Reacción de derivatización de Glifosato con CNBF………………………………32
Figura 17:Reacción de derivatización de Glifosato y AMPA con NBD-Cl ......................... 32
Figura 18: Reacción de derivatización de Glifosato y AMPA con AQC……………………. 33
Figura 19: Reacción de derivatización de glifosato y AMPA con PITC)…………………….33
Figura 20: Reacción de derivatización de glifosato con FITC ........................................... 34
Figura 21: Cromatogramas de derivados de GLYP y AMPA ........................................... 44
Figura 22:Diagrama de procedimiento según el método 991.08 AOAC para la determinación
de GLYP y AMPA en aguas. ............................................................................................ 45
Figura 23: Cromatograma de GLYP y AMPA según método AOAC 991.08. .................... 45
Figura 24: Diagrama de procedimiento según el método EPA 547 para la determinación de
GLYP y AMPA en aguas. ................................................................................................. 47
Figura 25:Cromatograma de GLYP analizado por HPLC-UV con derivatización con
DMOSC. .......................................................................................................................... 48
Figura 26: Esquema de sistema de detección ICP/MS/MS. ............................................. 54
Figura 27: Cromatogramas de análisis de GLY y AMPA por ICP/MS-MS. ....................... 54
Figura 28: Electroferograma de GLYP y AMPA. .............................................................. 56
Figura 29: Esquema prueba ELISA directa. ..................................................................... 58
Figura 30: Estructura del glifosato unido a BSA. .............................................................. 59
Figura 31: Espectro 1H 300.09 MHz muestra de suero. ................................................... 61
Figura 32: Espectro 1H 300.09 MHz muestra de orina ..................................................... 61
Figura 33:Espectro 1H 300.09 MHz muestra líquido gástrico. .......................................... 61
Figura 34: Espectro de RMN 31P (1H desacoplado) a 121,48 MHz glifosato en orina ..... 62
Figura 35: Diagrama de Espectroscopía Raman. ............................................................. 63
Figura 36: Espectro UV de derivado de glifosato ............................................................. 64
Figura 37: Asignaciones de señales de glifosato en espectro RAMAN ............................ 65
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
Abreviatura Término
AMPA Ácido aminometilfosfónico AOAC Asociación de Químicos Agrícolas Oficiales AQC 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato CE Electroforesis capilar C-N Enlace Carbono – Nitrógeno
CNBF 4-cloro-3,5-dinitrobenzotrifluoruro C-P Enlace Carbono – Fósforo DL50 Dosis Letal 50
DMOSC Cloruro de 2,5-dimetoxibencenosulfonilo DTFA 5-(4, ECD Detector de captura electrónica
ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas EPSPS 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfatosintasa
ESI Ionización por electrospray FAD Flavina adenina dinucleótido FAO Organización de Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación FID Detector de ionización de llama
FITC Isotiocianato de Fluoresceina FLD Detector de fluorescencia
FMOC-Cl Cloruro de 9 - fluorenilmetiloxicarbonilo FMOC-OH Hidroxi fluorenilmetiloxicarbonilo
FPD Detector fotométrico de llama GC Cromatografía de Gases
GC - MS Cromatografía de gases acoplada con espectrometría de masas GLYP Glifosato HPLC Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia HRAC Comité de acción de resistencia a los herbicidas IARC Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer ICA Instituto Colombiano Agropecuario IDA Ingesta Diaria Aceptable IC Cromatografía Iónica
IPA Sal isopropilamina
isoPCF Isopropilcloroformiato
IUPAC Unión Internacional de Química Pura y Aplicada
Kd Coeficiente de distribución suelo/agua Koc Coeficiente de partición carbono orgánico/agua
Kow Coeficiente de partición octanol/agua LC-FLD Cromatografía líquida con detector fluorescencia
LC–MS/MS Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem LC-UV Cromatografía líquida con detector ultravioleta
LIF Fluorescencia inducida por láser LLE Extracción líquido-liquido LMR Límite Máximo de Residuos LOD Límite de detección LOQ Límite de cuantificación
MOBS-F Fluoruro de 4-metoxibencensulfonilo
NBC-Cl 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazol NPD Detector de Nitrógeno-Fósforo OMS Organización Mundial de la Salud OPA o-ftalaldehído
OPA-MERC o-ftalaldehído en presencia de 2-mercaptoetanol PEP Fosfoenolpiruvato Pi Punto isoeléctrico
PICT Fenilisotiocianato Pka -Logaritmo de la constante de ionización ácida
PLAL Ablación con láser pulsada en líquidos POEA polioxietilenamina
POSTC Derivatización post-columna PREC Derivatización post-columna PUF Espumas de poliuretano RMN Resonancia magnética nuclear RP Fase reversa
SAX Trimetilaminopropilo SERS Espectroscopía Raman de superficie mejorada SPE Extracción en Fase Sólida
SPME Microextracción en Fase Sólida TFA Ácido Trifluoroacético
TFAA Anhidrido Trifluoroacético TFE Trifluoroetanol
TFMA Ortoformiato de trimetilo TSP Sólidos totales suspendidos
US-EPA Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos UV-VIS Ultravioleta – Visible
1
1. INTRODUCCIÓN
Desde su descubrimiento en el año 1974 [1]–[4], el glifosato sigue siendo el herbicida más
utilizado en todo el mundo. El glifosato, es un herbicida sistémico de amplio espectro, post-
emergente, no selectivo, que mata o suprime de manera efectiva todos los tipos de plantas,
incluidas las gramíneas, plantas perennes, enredaderas, arbustos y árboles [5]. Cuando se
aplica a tasas más bajas, el glifosato es un regulador del crecimiento de las plantas [6].
El glifosato es considerado el herbicida de amplio espectro más vendido a nivel mundial.
Este es fabricado por al menos 91 productores en 20 países. Se ha usado para eliminar
malezas en pre-emergencia en cultivos de: arroz, papa, maíz y para control de malezas en
post-emergencia en cultivos de: palma africana, banano, plátano, cítricos y aguacate. Se
aplica ampliamente en la industria agrícola debido a su baja toxicidad para los animales
mamíferos en comparación con otros herbicidas. Además, desde el año 1978,
Colombia empezó a fumigar sus tierras con glifosato, con el fin de erradicar los cultivos de
uso ilícito como coca, amapola y marihuana generando una disminución de las actividades
mecánicas [7], lo que ha generado un mayor temor a la presencia de residuos del mismo
frente a otros países donde su uso es meramente agrícola.
La evaluación de riesgos del uso de glifosato para la salud humana integra varios aspectos.
Primero, la identificación del perfil toxicológico de la sustancia: establecer el tipo de efectos
en la salud que se espera que produzca en los humanos según el nivel de exposición y los
valores toxicológicos de referencia que se utilizarán en la evaluación de riesgos. Su
distribución por el ecosistema es alta, al encontrarse disponible en diferentes matrices
ambientales (aire, suelo, agua, biota). La Agencia Internacional para la Investigación del
Cáncer (IARC) ha clasificado recientemente al glifosato como un "probablemente
carcinogénico para los humanos" [2], [8]–[12]. Debido a esta clasificación carcinogénica y
al debate internacional resultante, existe una mayor demanda de estudios que evalúen la
presencia, exposición y efectos del glifosato.
Desde el punto de vista de la seguridad alimentaria, es muy importante evaluar las
concentraciones de glifosato en los alimentos debido a que se ha evidenciado presencia
del herbicida en cáscaras y material foliar externo [12]–[14]. Por esta razón, existe la
2
necesidad de establecer metodologías analíticas óptimas que presenten límites de
detección bajos para poder evaluar la presencia de este compuesto. Debido a las
características mencionadas, es difícil su detección teniendo en cuenta que el glifosato
presenta un carácter anfotérico, alta polaridad, volatilidad nula y falta de grupos cromóforos
en su estructura química [5], [12], [15]. Se ha encontrado en la actualidad el uso de la
cromatografía acoplada a otras técnicas de análisis para la determinación de glifosato:
Cromatografía de Gases acoplada con Espectrometría de Masas (GC-MS) [12], [16], [17],
Cromatografía Líquida con detectores de Fluorescencia (LC-FLD) [11], [18]–[23] o
Ultravioleta (LC-UV) [5]–[10], [24] y Espectrometría de masas (LC– MS) [12], [25], [26],
Cromatografía Líquida-Espectrometría de Masas en tándem (LC–MS/MS) [27]–[31],
métodos que en la mayoría de los casos requieren de procesos de derivatización para
realizar la detección [15], [19], [20], haciendo más complejo y demorado el proceso de
análisis. Por esta razón se plantea realizar una revisión bibliográfica a fin de analizar los
procesos de detección de glifosato realizados hasta el momento teniendo en cuenta los
procedimientos de preparación de la muestra dependiendo de la matriz ambiental en la cual
se encuentre, procesos de derivatización y análisis instrumental.
3
2. CARACTERIZACION DE GLIFOSATO
2.1 Plaguicidas Según la Organización de Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) un
plaguicida es: “Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir, destruir
o controlar cualquier plaga, incluyendo los vectores de enfermedades humanas o de los
animales, las especies no deseadas de plantas o animales que causan perjuicio o que
interfieren de cualquier forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o
comercialización de alimentos, productos agrícolas, maderas y sus productos o alimentos
para animales, o que pueden administrarse a los animales para combatir insectos,
arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos" [32]. Esta definición incluye las sustancias
destinadas a usarse como reguladoras del crecimiento de las plantas, defoliantes,
desecantes, agentes para reducir la densidad de frutas o agentes para evitar la caída
prematura de la fruta y las sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha
para proteger el producto del deterioro, durante el almacenamiento y transporte [33].
Actualmente, existen diversas clasificaciones para los plaguicidas. Estos, se clasifican
según su acción específica sobre la especie como: Insecticidas, herbicidas, fungicidas,
nematicidas, rodenticidas o acaricidas [34]. De acuerdo a su toxicidad, los plaguicidas
pueden ser extremadamente, altamente, moderadamente y ligeramente peligrosos. Según
su vida media, pueden ser permanentes, persistentes, moderadamente persistentes y no
persistentes. Dada su estructura química, se clasifican en diversas familias, como
organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides [13].
2.2 Glifosato
El glifosato es un herbicida de contacto, no selectivo, con un amplio espectro de
aplicaciones en la agricultura [10],[35],[36],[37], viticultura, huertos forestales, cultivos de
plantaciones, jardinería doméstica e invernaderos para el control de hierbas anuales,
perennes y malezas de hoja ancha. Además, se utiliza para el control de malezas en áreas
acuáticas, e industriales no cultivadas [38].
Según la nomenclatura IUPAC su nombre químico es N-(fosfonometil)glicina, de fórmula
empírica C3H8NO5P (Figura 1) [34]. Según la clasificación HRAC (Comité de Acción de
Resistencia a los Herbicidas) Pertenece al grupo G de las glicinas, conformado por glifosato
4
y sulfonato al ser inhibidores de la 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfatosintasa (EPSPS) y la
biosíntesis de aminoácidos aromáticos en las células vegetales[17], [39].
Henri Martin, científico de la compañía farmacéutica suiza Cilag, es considerado el
sintetizador de la molécula [14],[40]. La actividad herbicida del glifosato, fue analizada por
el químico John E. Franz de la compañía Monsanto en 1970 y esta fue probada en un
invernadero en julio de ese año [15][16][41]. El glifosato fue patentado por primera vez por
la compañía estadounidense Stauffer Chemical [7]. Este fue utilizado como un quelante
para la limpieza y descalcificación de calderas comerciales y tuberías eliminado metales
como calcio, magnesio, manganeso, cobre y zinc [17],[41]. En 1974, fue patentado como
herbicida por la multinacional Monsanto, quien lo registró con el nombre comercial de
Roundup® [14],[41],[39]. Roundup® se vendió por primera vez en Malasia para cultivos de
caucho y en el Reino Unido para uso en cultivos de trigo [7]. En Estados Unidos,
inicialmente su uso fue industrial. Así mismo, contribuye con la eliminación de malezas no
deseadas en el sector agrícola y forestal [42],[43]. La patente adquirida por la multinacional
Monsanto expiró en el año 2000, año desde el cual, se han registrado más de 50
formulaciones genéricas de diferentes marcas que lo contienen como ingrediente activo en
el mundo [6],[17].
El glifosato es comercializado por más de 91 empresas bajo una diversidad de marcas
como Roundup®, Rodeo®, Bronco®, Landmaster®, Ranger®, Accord® (Monsanto, Inc.),
Rattler® (Helena Inc.), Silhouette®(Cenex, Land O’Lakes)[44] entre otras y está
ampliamente registrado en todos los países de la Unión Europea. En la actualidad hay más
de 2000 productos para la protección de plantas que contienen glifosato autorizados en
Europa para uso en tierras cultivables. Su eficacia y el fácil control de las malezas lo han
convertido en uno de los herbicidas más populares en la agricultura, para los jardines y en
las áreas no cultivadas [45].
Glifosato es el nombre común de un ácido orgánico débil que consiste en la unión entre el
aminoácido glicina y un resto fosfonometilo [42], [46],[47]. En la estructura química, el ácido
carboxílico y el ácido fosfónico pueden ionizarse y el grupo amina puede protonarse en
medios acuosos [48]. El glifosato es de baja toxicidad y se considera menos dañino para el
ambiente que otros herbicidas [8]. Sin embargo, las amplias aplicaciones de glifosato y su
vida media relativamente larga (7- 315 días, más comúnmente 45-60 días) pueden conducir
5
a su acumulación y persistencia en las aguas costeras [49]. El glifosato comercializa
usualmente como una sal del ácido desprotonado de glifosato y un catión de isopropilamina
o trimetilsulfonio [50] .
Figura 1: Estructura química de glifosato.
El glifosato puede existir como diferentes especies iónicas dependiendo del pH. Es un
compuesto muy polar por la presencia de grupos hidroxilo y amino en su estructura química
que, en solución acuosa, forma puentes de hidrógeno con el agua, aumentando su
solubilidad y carácter anfotérico[51]. Es posible encontrarlo formando compuestos iónicos
diversos en función del pH del medio, debido al carácter hidrofílico que presenta. El glifosato
es un ácido débil que presenta cuatro constantes de acidez: pKa1 < 2,0; pKa2= 2,2; pKa3
=5,4 y pKa4 =10,1[15], [52], [53]. La ionización del glifosato se produce según las reacciones
que se muestran en la Figura 2 [33]:
Figura 2:Equilibrios ácido-base del Glifosato con sus pKa correspondientes
Este herbicida es una molécula zwiteriónica que tiene la capacidad de formar quelatos y
estructuras de puente con iones metálicos. Las estructuras de los complejos
metálicos comúnmente consisten en dos anillos quelantes donde la fosfonometilglicina,
se coordina a través del grupo fosfónico, amina y carboxilo de la estructura del glifosato
[54], [55].
6
2.2.1 Propiedades físicas y químicas del Glifosato La Tabla 1 recopila las principales propiedades fisicoquímicas de glifosato. Debido a su alta
polaridad es prácticamente insoluble en etanol, acetona y benceno. La pureza del glifosato
de grado técnico es generalmente superior al 90% y presenta presión de vapor muy baja
[6]. Es una solución líquida, clara, viscosa y de color ámbar y un ligero olor a amina [56].
Tabla 1:Propiedades químicas y físicas del Glifosato.
PROPIEDAD CARACTERISTICA
Formula Molécular C3H8NO5P
Masa Molecular 169,1 g/mol
Estado físico Polvo cristalino
Color Blanco
Olor Ninguno
Punto de fusión 184,5ºC
Descomposición a 187 ºC
Presión de Vapor 1,84 x 10-7 mmHg a 45°C
Punto de ebullición n.a
Densidad específica 1,704 g/mL 20ºC
Solubilidad en agua 12.000 ppm a 25°C 20ºC
Estabilidad 32 dias 25oC a pH 5,7 o 9
Tensión superficial 0,072 N/m
Absortividad molar 0,086 mol/L
Coeficiente de partición octanol/agua Kow
-0,7 pH 1 -1,15 pH 3 -1,30 pH 5 -2,9 pH 7
3,05 pH 7,5 -1,90 pH 9
-0,80 pH 11
Coeficiente de partición carbono orgánico/agua Koc 21.699 mL/g
Coeficiente de distribución suelo/agua Kd 61 g/m3
Constate de Henry 5, 36x10-15 atm-m3/mol (25oC)
Inflamabilidad No inflamable
Explosividad No explosivo
pH 2,5 compuesto puro
1% solución
7
Presenta un coeficiente de partición carbono orgánico/agua Koc=21.699 mL/g lo cual indica
que una pequeña cantidad del compuesto es transportada hacia los cuerpos de agua ya
que se fija fuertemente en los suelos [53], [56]. La alta afinidad del glifosato por el agua se
representa por los coeficientes de partición Octanol/agua que son negativos y dependen de
su estado de ionización y su alta solubilidad en agua a pesar de ser un compuesto orgánico
[15],[54].
2.2.2 Toxicología
Según la organización mundial de la salud (OMS) el glifosato se encuentra en la
clasificación 2A como probable carcinógeno para humanos [44],[57]. Los plaguicidas que
contienen glifosato están registrados en Colombia en la clase toxicológica IV, levemente
tóxicos, basados en la DL50 oral a ratas del ingrediente activo, considerada mayor de 5.000
mg/kg. La EPA clasifica al glifosato como un sustrato "menos tóxico" (categoría IV) para
animales [58],[42],[59], esto debido al modo de acción único del glifosato que se limita a
una pequeña gama de organismos, principalmente plantas verdes [60]. La vida media del
glifosato y su metabolito principal, AMPA, puede prolongarse, entre 10-98 días,
dependiendo de las propiedades quimicas del suelo y condiciones ambientales [58].
En varios estudios con conejos fue calificado como "fuertemente" irritante o
"extremadamente" irritante en tejidos blandos [8]. Se ha demostrado que glifosato, asi
como los productos que lo contienen, son más tóxicos por vía dérmica e inhalatoria que por
ingestión [2],[61],[62],[63]. Existe además preocupación respecto a los efectos adversos
potenciales en la salud humana por exposición crónica, ya que el contacto más posible es
por medio de alimentos fumigados o aguas contaminadas. Algunos estudios relacionan el
desarrollo de Linfoma no Hodgkin en personas que han estado expuestas a glifosato [64].
Sin embargo, no se encuentra certeza en la relación del uso del glifosato con la incidencia
global de cáncer o con la mayoría de los subtipos de cáncer estudiados [65].
La ingestión de una cantidad suficiente de glifosato puede llevar a la muerte, con letalidad
del 3 a 30% de la población, con resultados clínicos que varían desde toxicidad de múltiples
órganos, con nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, gastrointestinal, cardiovascular y efectos
respiratorios [65].
8
Según la FAO y la OMS el AMPA y el Glifosato tienen perfiles toxicológicos similares. La
ingesta diaria aceptada en humanos se estableció en 0,3 mg/kg de peso corporal según las
evaluaciones toxicológicas [21].
2.2.3 Formulaciones
Actualmente en Colombia existen 75 marcas comerciales registradas por el Instituto
Colombiano Agropecuario (ICA) (Tabla 2) que distribuyen glifosato a nivel nacional para
diferentes tipos de cultivos:
Tabla 2: Marcas comerciales que contienen como ingrediente activo glifosato registradas en Colombia.[66].
NOMBRE COMERCIAL CONCENTRACIÓN REGISTRO ICA
GLYFOAICA SL 480 g/L 0032
GRANTIK SL 480 g/L 0040
GLIFOSATO AGROGEN 747 SG 747 g/Kg 0043
GLIFOGEN 648 SL 680 g/L 0056
BROKER 480 SL 480 g/L 0079
ESTELAR 648 SL 648 g/L 0120
TOUCHDOWN® IQ SL 500g/L 0140
GLIFOGEN 480 SL 480 g/L 0144
GLIFOSATO VECOL 480 SL 356g/L 0188
ROUNDUP TRANSORB BRIO 540 g/L como ácido 662 g/L como sal 0299
ROUNDUP TRANSORB ACTIVO 480 g/L 0300
GEOX 480 SL 480 g/L 0330
FOSSEL® 480 SL 480 g/L 0361
PANZER 648 SL 480 g/L 0364
GLYFOSAN 648 SL 648 g/L 0419
CORTADOR® 480 SL 480 g/L 0424
GLYPHONEX® 480 SL 360g/L 0425
GLYFOS 486 SL 360g/L 0451
ROUNDUP ACTIVO 363g/L 0470
GLYFOS 607 SL 450 g/L 0483
GLYFOS® 768 SG 737.5 g/Kg 0486
GLIFOGEN 747 SG 680 g/kg 0512
KALACH 480 SL
480 g/L Equivalente a 356 g/L en forma de sal
0516
DOGO 480 SL-DVA
356 g/L Equivalente a 480g en forma de sal
0526
GLIFOSATO WOHL 480 SL
356 g/L Equivalente a 480g en forma de sal
0545
RAZOR 480 SL 356g/L equivalente a 480 g/L en forma de sal
0566
GLIFOCIDA 480 SL
355 g/L equivalente a 480g/L en forma de sal
0635
ROKO 480 SL 480 g/L 0671
ATILA 747 SG
680 g/kg equivalente a 747 g/L en forma de sal
0677
GLIFOSATO INPRO SL 355,6 g/L 80 g/L 0692
9
GLIFOSELL 480 SL 480 g/L 0785
GLIFOMAX 480 SL 355.6 g/L 0820
PANZER®747 WG 747 g/kg 0874
CREDIT® 747 SG 680 g/Kg 0886
GLIFOSATO YASER 480 SL 480 g/L 0891
GLIFOSATO SHARDA 480 SL 481.5 g/L 0920
GLIFOXIL 48 SL 360 g/L 0942
ESKOBA AMONIO SL 400 g/L 0956
GLIFOSOL®GREEN 480 g/L 1057
KALACH®GREEN 368 g/L 1061
BROKER 747 SG 747g/Kg 1110
GLIFOCAFE®GREEN 480 g/L 1127
VICTORIUS 48 SL 480 g/L 1151
ESTELAR™ 1280 SL 608 g/L 1200
GLYFOSAN FORTE SL 648g/L 1267
GLIFOSATO 480 SL AGRIMOR 355.6 g/L 1401
ABROAD®EW 12 g/L 444.6 g/L 1602
GLIFOSATO RAINBOW 480 SL 356g/L 1608
GLIFOSATO CRL 480 SL 482 g/L 1612
GLIFOSATO RAINBOW®747 SG 680 g/Kg 1616
GLIFOSATO DEL MONTE ®480 SL 480 g/L 1732
CREDIT MULTI® 540 g/L 1747
ARRASADOR INTEROC CUSTER 757 g/Kg 1756
GLIFOSATO 480 SL MEZFER 480 g/L 1761
GLIFOSATO DEL MONTE® 747 SG
757 g/Kg 1773
GENGLIX 480 SL 360 g/L 1779
GENGLIX® 747 SG 757 g/Kg 1788
PANZER® EKO SL 360 g/L 1809
DOGO 75.7 SG-DVA 730 g/Kg 1813
PANZER® K SL 360 g/L 1840
GLIFOSATO NUFARM 747 SG 680 g/L 1878
FANATIC®SL 480 g/L 1967
GLIFOSATO 757 WG BIESTERFELD
757 g/Kg 1972
KAISER 480 SL 256g/L 1973
GLIFOSATO DICSAS 75.7 SG 757 g/Kg 1997
GLYFOLASER 480 SL 480 g/L 2059
GLIFOSATO GOOD HARVEST 747 SG
757 g/Kg 2136
GLIFOSATO NEW COMBATE 480 g/L 2177
GLIFOSATO GOOD HARVEST 480 SL
360 g/L 2199
EMBLEMA 757 SG 480 g/L 2201
CANDELA 480 SL 480 g/L 2205
GLYPHOGAN 480 SL 480 g/L 2209
GLIFOSATO AGOCONSULTORIA 75.7 SG
730 g/L 2277
PILARSATO SL 480 g/L 2280
HELOSATE 480 SL 480 g/L 2284
10
El glifosato se comercializa en la forma de concentrados solubles de la sal
isopropanolamina del N-fosfonometilglicina, en los cuales se integran el glifosato y los
ingredientes inertes requeridos para cada tipo de formulación comercial [44]. Aunque la
forma de comercialización más común son los concentrados solubles en agua, también es
posible tener acceso a las siguientes preparaciones para uso específicos [41]:
Reactivo de grado químicamente puro (Para uso de laboratorio)
Reactivo de grado técnico.
Concentrados emulsionables.
Concentrados solubles en agua de diferente concentración.
Polvos solubles en agua para espolvoreo y formulaciones fumigantes.
Formulaciones granulares y encapsuladas.
Las formulaciones siempre se componen de una sal de glifosato mezclada con diferentes
coformulantes, que se requieren para estabilizar y permitir penetración en las plantas [41].
Algunos surfactantes usados son los responsables de la toxicidad de las formulaciones de
glifosato como el polioxietilenamina (POEA), siendo este un surfactante no iónico derivado
de grasas animales. El uso de POEA en plaguicidas ha sido prohibido en la Unión Europea
debido a su alto daño en la salud humana [41].
2.2.3.1 ROUNDUP®
Es el principal producto comercial de glifosato que contiene sal isopropilamina (IPA) y como
surfactante, amina de polioxietileno (POEA), como se observa en la Tabla 3. La formulación
de Monsanto, Rodeo®, contiene la sal isopropilamina de glifosato sin el surfactante que,
ayuda en la penetración de superficies vegetales y mejorando su efectividad [67]. Es
principalmente usado para controlar malezas acuáticas en algunos países [68]. Rodeo® y
Roundup® son manufacturados por Monsanto Co. (St. Louis, MO, USA) mientras que
Roundup Biactive® es producido por Monsanto Co. (Melbourne, Australia) [66], [67], [69].
Tabla 3: Propiedades de tres formulaciones comerciales de glifosato de Monsanto.
Parámetros Rodeo® Roundup® RoundupBiactive®
Sal IPA de glifosato 53,8% Aprox. 41% Aprox. 41%
Surfactante - 10 - 20% POEA 10 – 20% (sin revelar)
Apariencia Solucion incolora Solución clara, viscosa, ambar Solución verdosa.
Olor Inodoro Inodoro Terroso
Gravedad específica 1.22 – 1.25 1.17 1.17
pH (1%solución en agua)
4.6 -4.8 4.7 4.6
11
2.3 Ácido aminometilfosfónico (AMPA)
El ácido aminometilfosfónico (AMPA), cuya fórmula estructural es CH6NO3P (Figura 3), es
un producto de degradación del glifosato y su principal metabolito [19], [20], [29], [70]–
[72],[73]. La ruta principal de desactivación del glifosato es la hidrólisis al ácido
aminometilfosfónico (AMPA). Este compuesto presenta un ácido orgánico débil de baja
toxicidad con un grupo de ácido fosfórico [74]. Este presenta un carácter polar y alta
solubilidad en agua. Su periodo de vida media es de aproximadamente 3 años. El AMPA
fue descubierto en lechuga y cebada cultivadas en un año tras el tratamiento del suelo con
glifosato [75].
Figura 3: Estructura química del ácido aminometilfosfónico (AMPA).
Es un compuesto anfotérico (Figura 4) con valores de pKa1 = 0,9; pKa2= 5.6; pKa3 = 10,2
[33].
Figura 4: Equilibrios ácido-base del AMPA y sus pka correspondientes.
2.4 Modo de acción de glifosato en las plantas
El efecto del herbicida sobre las plantas se basa en la inhibición de la enzima shikimato 5-
enolpiruvilshikimico-ácido-3-fosfatosintasa (que participa en la síntesis de los aminoácidos
aromáticos) (EPSPS) [58],[76], ya que el glifosato compite con el fosfoenolpiruvato (PEP)
por su sitio específico de unión a la EPSPS, debido a que la estructura de PEP y del glifosato
son muy similares [39]. De esta forma, el glifosato actúa como inhibidor competitivo y se
une fuertemente al complejo formado por el shikimato y la EPSPS [77] interrumpiendo el
metabolismo de los microorganismos que degradan el glifosato [78]. El glifosato se
transporta simplásticamente hacia los meristemas de la planta en crecimiento y, al actuar
como inhibidor competitivo de la EPSPS [17], [56],[79],[80] resulta en la acumulación de
12
shikimato y el bloqueo de la síntesis de los aminoácidos aromáticos esenciales: fenilalanina,
tirosina y triptófano [37],[81],[80] como se observa en la Figura 5. Estos aminoácidos
aromáticos son los precursores de numerosos productos secundarios en la planta, como
antocianinas, lignina [78], promotores e inhibidores del crecimiento (hormonas) y fenoles,
así como de la producción de proteínas [17] [3], [81]. Así mismo, entre el 20% y el 35% del
carbono fijado por la fotosíntesis se utiliza en esta ruta. Por lo tanto, la aplicación de glifosato
con frecuencia induce la acumulación intracelular de shikimato, que se puede usar como
un indicador fisiológico sensible para la toxicidad del glifosato [17], [36]. En razón a que esta
vía biológica específica sólo funciona en plantas y microorganismos, se considera que el
mecanismo no es un riesgo para los seres humanos [64]. La degradación del glifosato en
el suelo es principalmente un proceso microbiológico [36].
A su vez, el glifosato puede inhibir la síntesis del ácido indolacético (hormona involucrada
en el crecimiento celular), la clorofila y las proteínas involucradas en la síntesis de azúcares
y en la desintoxicación de la planta [36],[81]. Como resultado, se presenta un lento proceso
de muerte de la planta, que inicia con una suspensión del crecimiento, seguida de un
proceso de clorosis y finalmente necrosis de los tejidos [82].
13
Figura 5: Inhibición de la enzima 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfatosintasa por glifosato. [17], [67], [69].
14
3. REVISIÓN BIBLIOGRAFÍCA DE INVESTIGACIONES SOBRE GLIFOSATO
La recopilación de la información se realizó a partir de la búsqueda en recursos
especializados en el área de ciencias como: Science Direct, Springer, y teniendo en cuentas
publicaciones nacionales e internacionales. Según las estadísticas, en la base de datos de
Science Direct se encuentra un total de 1.236 publicaciones que incluyen la palabra
glifosato entre los años 2.009 y 2.019 (Gráfica 1), las cuales corresponden a artículos de
investigación que relacionan procesos de análisis, eficacia, resistencia en plantas. Para la
elaboración de la monografía se tiene en cuenta aquellas que relacionan métodos de
análisis instrumental:
Gráfica 1: Número de publicaciones que involucran métodos de análisis instrumental en los últimos 10 años sobre glifosato en la base de datos Science Direct.
Así mismo, para Science Direct se encuentra que el mayor número de publicaciones
relacionadas con el análisis de glifosato se han elaborado en matriz agua, seguido de matriz
suelo y aire como se observa en la Gráfica 2:
Gráfica 2:Porcentaje de publicaciones de matrices de análisis de glifosato en publicaciones de Science Direct.
0
50
100
150
200
250
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019
Nú
me
ro d
e p
ub
licac
ion
es
Año
Documentos publicados por año
37%
28%20%
15%
Tipos de matrices
Agua Suelo Alimentos Aire
15
En la base de datos de revistas científicas Springer se evidencia un total de 2.767
publicaciones de artículos sobre el glifosato entre los años 2.009 y 2.019 (Gráfica 3). Así
mismo, se observa que desde el año 2.009 hasta la fecha, se han publicado investigaciones
de manera exponencial, encontrándose el mayor número de artículos (378) en el año 2.019.
Gráfica 3: Número de publicaciones en los últimos 10 años sobre glifosato en la base de datos Springer.
Del mismo modo, se observan 2.391 publicaciones referente a investigaciones de glifosato
en matriz agua, 2.025 publicaciones asocian presencia de glifosato en suelo, 1.191 artículos
registran glifosato en aire y 1.570 adicionales, relacionan contenido de glifosato en
alimentos (Gráfica 4).
Gráfica 4:Porcentaje de publicaciones de matrices de análisis de glifosato en publicaciones de Springer.
0
100
200
300
400
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019Nú
me
ro d
e p
ub
licac
ion
es
Año
Documentos Publicados por año
Agua33%
Suelo28%
Alimentos22%
Aire17%
Tipos de matrices
Agua Suelo Alimentos Aire
16
4. GLIFOSATO EN MATRICES AMBIENTALES
4.1 Glifosato en agua
Con una solubilidad en agua de 10.000 mg/L a 15.700 mg/L entre 1°C a 25°C, el glifosato
se disuelve y dispersa fácilmente en ambientes acuáticos [83],[84]. Pero debido a que la
molécula se une fuertemente a las partículas de suelo [35], es poco probable que ingrese
a las aguas. Su unión a suelo es tan fuerte que incluso puede ocurrir que no se encuentre
disponible para las plantas. La mayoría de glifosato que se encuentra en el agua se debe a
la escorrentía de las superficies de vegetación, a la deriva de la pulverización y la aspersión
directa intencional o no intencional [56]. Los residuos son adsorbidos en partículas
coloidales del suelo que viajan suspendidas y que precipitan en los sedimentos del fondo
de los cuerpos de agua, donde pueden persistir hasta que se degradan microbianamente
con una vida media que oscila entre 12 días a 10 semanas [75]. Según la Agencia de
Protección Ambiental de los Estados Unidos (US-EPA), glifosato tiene una vida media de
35 a 63 días en el medio ambiente acuático [85]. Para todos los sistemas acuáticos, los
sedimentos parecen ser el principal sumidero de residuos de glifosato [80]. El análisis de
las aguas para este producto químico está limitado por la necesidad de métodos
especializados de derivatización y medición que pueden ser tediosos y prolongados [28].
4.2 Glifosato en suelo
El suelo condiciona el comportamiento y dispersión en el ambiente de las sustancias
quimicas contaminantes [35]. El glifosato es un herbicida sistémico que se absorbe por el
follaje y luego se transporta por toda la planta a través del floema hasta los sumideros
metabólicos, como los meristemas y las raíces de las plantas [86]. Cuando se realiza la
aplicación foliar a la planta, parte del glifosato alcanzará directamente la superficie del
suelo, además, del que puede escurrir por lavado (lluvia) de las hojas tratadas. A pesar de
ser muy soluble, tiene reducida movilidad hacia sistemas acuaticos debido a su alta afinidad
por las partículas del suelo [35],[87]. Se ha demostrado repetidamente que el fosfato
procedente de los fertilizantes organofosforados y el herbicida glifosato compiten por los
sitios de adsorción en los suelos [77]. Dependiendo de las condiciones del suelo, la
concentración de fosfato es el factor más importante que determina la cantidad de glifosato
adsorbido, y en algunos casos, se encuentra la desorción completa del glifosato fijada a la
matriz del suelo por aplicaciones de fosfato [6],[36],[37].
17
4.2.1. Degradación de glifosato en suelos
Los microorganismos degradan el glifosato a través de dos vías:
Vía de la Sarcosina (Figura 6): El paso inicial es la escisión del enlace C-P por la C-Pliasa,
produciendo fosfato y sarcosina. La sarcosina se degrada a glicina y formaldehído por la
sarcosinaoxidasa [88]. El formaldehído ingresa a la vía dirigida por el tetrahidrofolato y la
glicina se metaboliza por las vías estándar [72],[87]. Finalmente se forma dióxido de
carbono y el ión amonio.
Figura 6: Mecanismo de degradación de glifosato: Ruta de la Sarcosina.
Vía del AMPA (Figura 7): Inicia el proceso por la ruptura del enlace C-N por la enzima
glifosato oxidorreductasa, produciendo AMPA y glioxilato. La glifosato oxidorreductasa es
una flavoproteína que emplea FAD como cofactor, y el mecanismo probablemente implica
la reducción de FAD en el sitio activo por glifosato [73], [89]. En condiciones aeróbicas, el
oxígeno se utiliza como cofactor, mientras que en condiciones anaeróbicas, compuestos
como el metosulfato de fenazina y la ubiquinona actúan como aceptores de electrones [90].
La enzima glifosato oxidorreductasa se ha insertado en diferentes genomas de plantas,
generando la resistencia al glifosato en presentaciones como Roundup Ready cultivos. El
glioxilato se metaboliza a través del ciclo del glioxilato. Posteriormente, el AMPA se escinde
para producir fosfato inorgánico y metilamina, que finalmente se mineraliza a dióxido de
carbono y amoniaco. La enzima C-Pliasa es responsable de la división de AMPA [73], [91].
18
Figura 7: Mecanismo de degradación de glifosato: Ruta del AMPA. [73]
4.3 Glifosato en aire La presencia de glifosato en el aire puede ocurrir por efecto de transporte durante un corto
periodo de tiempo o despues de la aplicación. La mezcla de surfactantes especializados y
aceite mineral, le da mayor peso a las gotas de glifosato asperjadas con el fin de disminuir
el “efecto deriva” (la desviación de la aspersión como consecuencia del viento) [56]. La
volatilizacion en el periodo de post- aplicación no reporta ser una fuente significativa de
contaminacion debido a que su presion de vapor se registra como 1,84 x 10-7 mmHg a 45°C
y 5,0 x 10-5 mmHg a 25°C [44], [87]. La presion de vapor del glifosato es muy baja, ya que
se mantiene como lìquido y no pasa facilmente a la fase vapor, por lo tanto se reporta poco
peligro para causar problemas toxicológicos por las vías respiratorias [56]. Se han
encontrado residuos en el aire en material particulado [36], lo que indica que el transporte
aéreo es a través de partículas con deposición en polvo y no en vapor.
4.4 Glifosato en alimentos
El glifosato al distribuirse por toda la planta, es posible hallarlo como trazas del compuesto
ya sea provenientes del propio tratamiento del cultivo para los que están autorizados los
usos (maíz, trigo, soja, frutas y hortalizas) como por contaminación indirecta de vegetales
que están cercanos a zonas de tratamiento [87].
La Comisión Europea ha establecido Límites Máximos de Residuos (LMR) para el glifosato
[92]. El LMR es la concentracion máxima de residuos de un plaguicida o sus productos de
degradacion (metabolitos) que se pueden tolerar en los alimentos, sin esperar riesgos
directos en la salud de los consumidores [93]. Según la Resolución 2.906 de 2.007 del
Ministerio de la Protección Social de Colombia, por la cual se establecen los LMR en
19
alimentos para consumo humano y en piensos o forrajes como se evidencia en la Tabla 4,
los rangos permitidos son:
Tabla 4: LMR en alimentos para consumo humano, piensos y forrajes.
ALIMENTO
LMR
(mg/kg) ALIMENTO LMR (mg/kg)
Banano 0,05 Semillas de algodón 40,0
Carne de mamíferos 0,05 Semillas de girasol 7,0
Carne de aves 0,05 Semillas de colza 20,0
Caña de azúcar 2,0 Soja seca 20,0
Cereal en grano 30,0 Forraje seco de alfalfa 500,0
Fríjoles secos 2,0 Forraje seco de fríjol 200,0
Guisantes (arveja seca) 5,0 Forraje seco de maiz 150,0
Huevos 0,05 Productos cárnicos
comestibles de aves de corral 0,5
Maiz 5,0 Productos cárnicos
comestibles de mamìferos 5,0
Productos cárnicos
comestibles de porcino 0,5 Salvado de trigo 20,0
Asi mismo, Los valores de Ingesta Diaria Aceptable (IDA) establecida por la Comisión
Europea para el glifosato es de 0,3 mg/kg peso corporal/día [94].
20
5. METODOS ANALÍTICOS PARA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE GLIFOSATO
5.1 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA ANÁLISIS
Para la determinación de glifosato y AMPA en diferentes matrices, es necesario realizar
procesos de extración, limpieza (clean up) y preconcentración de las muestras, debido a
que son compuestos poco volátiles pero altamente solubles [19],[21]. Para obtener
resultados óptimos, los procedimientos de análisis involucran procesos de eliminación de
materia orgánica u otro tipo de interferente que puede afectar durante la determinación.
5.1.1 Extración con bases
Debido a la alta polaridad del glifosato y su tendencia a formar especies iónicas, la mayoría
de los procedimientos de extracción en suelo se basan en reacciones ácido-base, ya que
el compuesto se encuentra ligado a especies iónicas de las matrices a través del grupo
fosfonato [16], [69]. Los procedimientos de extracción utilizados hacen uso de soluciones
de bases fuertes (KOH, NaOH), sales básicas fuertes (KH2PO4), bases débiles (trietilamina,
NH3) o ácidos débiles [54]. De manera convencional, en la mayoría de las casos, es seguido
de una etapa de limpieza
5.1.2 Extracción en Fase Sólida (SPE)
El método de Extracción en Fase Sólida (SPE), es ampliamente utilizado en los procesos
de análisis de glifosato [66],[70],[72],[97] debido a su alta selectividad y rapidez. Consiste
en pasar una muestra diluida a través de un cartucho que contiene un material adsorbente
sólido polimérico o de sílice modificada [33], que extrae selectivamente el analito de interés,
reteniéndolo y desechando los compuestos que pueden producir interferencias en el
análisis [52],[98],[99].
La Extracción en Fase Sólida (SPE) presenta dos modalidades:
Off-line: La preparación de la muestra se hace separada del análisis cromatográfico en
donde se utilizan cartuchos desechables por los cuales pasa la muestra. Los analitos
retenidos, son eluídos con solventes y pasan por un proceso final de evaporación antes de
ser inyectados a la columna del equipo [100], [101].
21
On-line: El proceso se realiza de manera directa al sistema cromatográfico. La muestra es
preconcentrada y los analitos retenidos se transfieren directamente a la columna analítica.
Este procedimiento genera resultados más confiables y precisos [100], [101].
Las etapas del proceso de extracción en fase sólida son (Figura 8):
Acondicionamiento: En esta fase se realiza la preparación del material adsorbente para
su interacción con el analito a fin de promover la retención. El acondicionamiento se realiza
haciendo uso de solventes de distintas polaridades [33], [52].
Aplicación de la muestra (adsorción): El objetivo principal de la etapa de carga de la
muestra es asegurar que el analito sea cuantitativamente retenido por el adsorbente,
mientras que se reduzcan al mínimo la cantidad de interferencias [33]. La muestra puede
ser aplicada al adsorbente a un flujo constante entre 1-10 mL/min, a fin de optimizar los
rendimientos.
Lavado del adsorbente: En esta etapa se eliminan selectivamente las impurezas que
están ligadas al adsorbente con menos fuerza que el analito, mediante el lavado con un
solvente cuya polaridad sea diferente a la del compuesto de interés [33]. Posteriormente,
se puede realizar una etapa de secado del cartucho con nitrógeno para eliminar agua, si el
disolvente de elución es inmiscible con ésta [22]. Esta etapa permite mejorar la elución de
los analitos en el sistema cromatográfico ya que se pueden presentar solapamiento de
bandas en un cromatograma.
Elución de los analitos: Los analitos extraídos en el material adsorbente, son eluídos con
un disolvente adecuado a fin de disminuir las interacciones entre analito-adsorbente [33].
Posteriormente se realiza el análisis cromatográfico.
22
Figura 8:Etapas del proceso de Extracción en Fase Sólida (SPE).(.) Analito de interés. (x) impurezas. [84].
Adsorbentes de Extracción en Fase Sólida (SPE)
La SPE se puede llevar a cabo utilizando diferentes tipos de adsorbentes, cuya naturaleza
y de los grupos funcionales adicionales en determinarán sus usos. Las propiedades a tener
en cuenta para elegir los adsorbentes adecuados son:
Porosidad y área superficial. La extracción de analitos de la muestra depende de un
equilibrio entre los analitos y el sólido adsorbente. Para que la SPE sea efectiva,
generalmente se necesitan áreas superficiales superiores a 100 m2/g. Actualmente las
partículas que se usan tienen áreas superficiales entre 200 y 800 m2/g. El tamaño de poro
del sólido y su área superficial suele estar relacionada inversamente, es decir, el área
superficial disminuye cuando el tamaño de poro aumenta [102].
Pureza. Las partículas sólidas deben estar libres de impurezas, ya que podrían ser
extraídas durante la elución de los analitos e interferir en el análisis cromatográfico.
Estabilidad química. Los adsorbentes de sílica son poco estables a pHs superiores a 8 y en
pHs muy ácidos. En cambio, las resinas poliméricas son bastante estables en todo el rango
de pH. También es necesario que las partículas sólidas sean estables en medio acuoso o
23
en disolventes orgánicos, en caso de que sean empleados en la etapa de elución [102],
[103].
En las determinaciones de glifosato en agua, Patsias et al, [22] realizan procesos de
preconcentración de muestras de aguas subterráneas con un sistema de acoplamiento
entre la línea de extracción en fase sólida de intercambio aniónico y el análisis de
Cromatografía Líquida de Intercambio Catiónico. Para tal efecto, se usan cartuchos de sílice
de trimetilaminopropilo (SAX) y dietilaminopropilo (DEA) (10 x 3mm, 40 - 70µm) y PRP-
X100 poliestirendivinilbenceno a base de trimetilamonio (20 x 2 mm, 10µm). Las muestras
se filtran a través de un filtro de membrana de 0,2 µm y se toman alícuotas de 100 mL que
son pasadas por los cartuchos SPE de intercambio aniónico a un caudal de 5mL/min.
Después, los cartuchos SPE se lavan con 2 mL de agua destilada y los solutos se sumergen
en la línea de la columna analítica del equipo de Cromatografía Líquida. En la detección se
obtienen bandas más definidas y estrechas usando los cartuchos SPE PRP-X100 debido a
que se presentan menores interferencias.
Por su parte, en el estudio realizado por Zhang et al, [72] se usaron cartuchos Cleanert
PEP-2 SPE para el proceso de preconcentración. Se utilizó el método de SPE de un solo
paso para estudiar la eficiencia de extracción de Glifosato y AMPA en muestras de agua y
suelo, mediante columnas SPE, que incluían C18E (200 mg / 6 mL), PEP-2 (200 mg/6 mL),
PEP-2 (500 mg / 6mL), C18 (200 mg/6 mL) y SIM (200 mg / 6 mL). Los autores observaron
que la variedad y las cantidades de disolvente de lavado y eluyente influyen en el proceso
de extracción [31]. Como el glifosato y AMPA son insolubles en metanol, se emplearon 0,5,
1, 2 y 3 mL de metanol como disolvente de lavado para evaluar los efectos de diferentes
volúmenes de metanol y eliminar las impurezas. El metanol acidificado (ácido clorhidrico en
solución de metanol), agua y solución de metanol se seleccionaron como eluyentes. Se
concluyó que tres columnas SPE (C18E, C18 y SIM) mostraron menores valores de
retención para Glifosato y AMPA, mientras que la columna PEP-2 SPE (elaborada con
polidivinilbenceno, vinilpirrolidona y urea) exhibió una mejor eficiencia de extracción para
esos compuestos.
Para Mallat y Barceló [20], la determinación de trazas cuantitativas de glifosato y su
metabolito principal, AMPA en aguas superficiales, se realizan mediante Cromatografía de
Intercambio Iónico (IEC), en donde en primer lugar se preconcentran 50 mL de muestra de
24
agua natural mediante un procedimiento de dos pasos: primero se filtra la muestra a través
de cartuchos poliméricos: LiChrolut EN y Isolute ENV. Posteriormente se eluyen los analitos
con 10 mL de solución de citrato de sodio 0,4M. Finalmente, se realiza el análisis por
Cromatografía de Intercambio Iónico seguido de una columna posterior acoplada a un
detector fluorimétrico. Se concluye que hay mejores recuperaciones de glifosato y AMPA
usando los cartuchos LiChrolut EN.
En el análisis de glifosato en material vegetal, Schrübbers et al, [104] desarrollan un método
analítico para la cuantificación glifosato y AMPA a niveles traza en las hojas de café, fríjoles
negros y agua de río mediante LC/MS. El método se realiza en dos pasos: extracción en
fase sólida (SPE) y reacción de derivatización intermedia usando Cloruro de 9 -
fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC-Cl). Para el caso de las muestras de material vegetal,
estas son llevadas a secado por liofilización alrededor de 48 horas, luego son molidas hasta
obtener un polvo fino que se almacena a -20°C hasta su análisis. Para la extracción de los
analitos en la muestra, se usan solventes de baja polaridad como diclorometano con el fin
de eliminar las impurezas no polares. También, se adiciona ácido clorhídrico 1,0 M para
aumentar el área de pico en detecciones de AMPA y controlar el pH durante la extracción.
A continuación, la muestra es llevada a sonicación, agitación de 40 rpm por 30 min y
centrifugación, y el sobrenadante es recogido sobre un cartucho de SPE de
poliestirendivinilbenceno o trimetilaminopropilo que previamente ha sido acondicionado con
metanol y ácido fórmico al 0,1%. La técnica permite que los analitos se adsorban
selectivamente a un cartucho donde son retenidos, desechando así los compuestos que
pueden producir interferencias en el análisis [105], [106]. El lavado se realiza con
acetonitrilo y la elución de los analitos con metanol. El eluyente posteriormente es tratado
con soluciones básicas para ajustar a pH = 9. Finalmente, el eluyente está en condiciones
adecuadas para ser derivatizado con FMOC-Cl. El límite de cuantificación (LOQ) para
glifosato y AMPA en las hojas de café fue de 41 y 111 μg/kg en peso seco, respectivamente.
5.1.3 Microextracción en fase sólida (SPME)
Es una técnica eficaz de adsorción y desorción para la concentración de compuestos
volátiles o no volátiles en muestras líquidas principalmente [98]. El procedimiento se basa
en la extracción de los analitos de la matriz de la muestra, mediante una fibra de sílice
fundida recubierta por un material adsorbente incorporada en una jeringa. Posteriormente
25
ocurre la desorción de los analitos por acción de la temperatura o un disolvente orgánico
[107] (Figura 9). Los analitos se desplazan a través de la fibra una vez esta tiene contacto
con la muestra. La extracción se considera completa cuando la concentración de analito
ha alcanzado el equilibrio de distribución entre la muestra y la fibra [33], [98], [107].
Figura 9: Proceso de Microextracción en Fase Sólida (MPSE).[80]
5.1.4 Extracción líquido-líquido (LLE)
Una extracción líquido-líquido o de partición es una técnica para separar dos líquidos
inmiscibles que se utilizan para aislar componentes de una mezcla en función de una
diferencia en sus solubilidades [108]. En esta técnica, se desea separar un componente
disuelto deseado de su solvente transfiriéndolo a otro solvente. Con frecuencia, uno de los
solventes es un líquido orgánico no polar [109]. De esta manera, la solubilidad se puede
cambiar modificando el valor de pH del solvente. El ajuste del pH conducirá a una mayor
selectividad. Sin embargo, este método se usa con menos frecuencia para el análisis de
muestras que contienen glifosato debido al gran uso de solventes y bajas recuperaciones
[19], [20], [99]. Las principales desventajas de esta técnica son las grandes cantidades de
solvente orgánico que se utiliza siendo estos de baja polaridad, como el hexano, éter
dietílico, diclorometano, cloroformo o acetato de etilo [103]. Esta técnica es poco aplicada
en la extracción de glifosato en muestras acuosas, debido a la elevada solubilidad del
glifosato en agua (12 g/L de 25ºC) y su insolubilidad en la mayoría de disolventes orgánicos
[102]. La Tabla 5 relaciona diferentes procedimientos realizados en investigaciones:
26
Tabla 5: Tratamiento de muestras para análisis de glifosato.
MATRIZ PROCEDIMIENTO FUENTE
Aguas Naturales
Limpieza, extracción y preconcentración Filtración Cartucho polimérico LiChrolut EN Columna de intercambio aniónico Derivatización con POSTC-OPA
Mallat et al, 1998 [20]
Aguas Naturales
Limpieza, extracción y preconcentración Cartucho PRP X100 SPE Columna de intercambio aniónico Derivatización con POSTC-OPA
Patsias et al,
2001 [22]
Agua Potable
Limpieza, extracción y preconcentración Cartucho LiChrolut EN (elimina materia orgánica) Filtración Cartucho de resina de intercambio aniónico OH- (SPE) Derivatización con OPA
Rodríguez et al, 2002 [18]
Agua lluvia
Filtración. Limpieza y preconcentración con cartucho intercambiador de cationes. Derivatización con FMOC-Cl
Nedelkoska et al, 2004 [19]
Material Vegetal
Filtración. Liofilización con Nitrógeno líquido. Centrifugación, decantación, lavado, Evaporación. Preconcentración con cartucho intercambiador de cationes. Derivatización con FMOC-Cl
Agua potable
Limpieza, extracción y preconcentración Cartucho SLM (Membrana Líquida Compatible)
Piriyapittaya et al, 2008 [21]
Agua potable
Limpieza Centrifugación Filtración con membrana de 0,45µm Derivatización con PREC- CNBF
Qian et al, 2009 [5]
Aguas estancadas
Filtración Evaporación a sequedad a 60°C. Derivatización con PITC 0.13M Centrifugación 5 min a 5.000rpm
Amelin et al, 2012 [75]
Aguas subterráneas
Limpieza, extracción y preconcentración Filtración membrana de éster de celulosa 0,45μm Cartucho de resina aniónica Dowex Ag1 X8-100 Derivatización con PREC- NBD-Cl
Delmonico et al,2014 [110]
Hojas de café
Sonicación con diclorometano. Agitación 40 rpm/30min Centrifugación 4.000rpm/5min Derivatización FMOC-Cl
Schrübbers et al, 2016 [104]
Suelo Extracción con KH2PO4 0,03M y citrato trisódico 0,01M Sonicación 30 min. Centrifugación 1.0000 rpm/5 min. Ajuste de pH=9 con HCl 1,0M Filtración Lavados con 50 mL de n-hexano. Derivatización con FMOC-Cl
Sun et al, 2017 [111]
Sedimento Centrifugación 1.0000 rpm/5 min. Extracción con KH2PO4 0,03M y citrato trisódico 0,01M Sonicación 30min. Derivatización con FMOC-Cl
Suelos Arcillosos
Filtración. Agitación constante con KH2PO4 0,01M Centrifugación 1.000rpm/10 min. PREC-FMOC-Cl
Garba et al, 2018 [106]
Agua de escorrentía
Almacenamiento a -18ᵒC. Centrifugación 5000rpm/15 min 25°C. filtración por membrana de celulosa regenerada. Derivatización con AQC.
Carretta et al,
2019 [112]
27
5.1.5 Derivatización
La derivatización analítica implica la conversión de la estructura química del analito para
aumentar la detectabilidad de compuestos no absorbentes o no fluorescentes [1],[113]
cuando el analito genera un factor de respuesta bajo o nulo [17],[114]. En el proceso, se
hace uso de reactivos que sean capaces de reaccionar con un grupo funcional específico
de la estructura química del analito (grupos amino, tiol, carboxílicos), formando un nuevo
compuesto: el "derivado" [115]. Con frecuencia se obtienen picos más simétricos y se
minimizan las interacciones excesivas con la fase estacionaria, que conducen a una
adsorción irreversible y la formación de picos asimétricos o su desaparición [116], [117].
La molécula de glifosato contiene tres fragmentos de diferentes naturalezas químicas:
ácido fosfónico, amina secundaria y ácido carboxílico. Por lo tanto, se requiere enriquecer
la molécula con grupos cromóforos que absorben en la región UV [75].
5.1.5 .1 Derivatización para Cromatografía de Gases
La reacción de esterificación, es un método muy utilizado para la derivatización de ácidos
carboxílicos ya que conduce a la formación de ésteres que son compuestos no polares,
más volátiles que son aptos para el análisis cromatográfico [114]. Generalmente la
derivatización se realiza en operación pre-columna [19], [118], [119].
Para el analisis de glifosato y AMPA por cromatografia de gases, es necesario realizar
derivatización por medio de reacciones de acilación con cloroformiatos de alquilo y agentes
acilantes [19], [20], [29], [86]. Este proceso reduce la polaridad de los grupos amino,
hidroxilo, tioles, adicionando funciones halogenadas adecuadas para empleo de detectores
de captura electónica (ECD), al generar un aumento en la señal del compuesto que se
desea detectar [113]. La acilación transforma los compuestos con hidrógenos ácidos en
ésteres, tioésteres y amidas [106], [120]. Además, los acilderivados se fragmentan y pueden
ser analizados por Espectrometría de Masas, permitiendo dilucidar la estructura de la
molécula [104],[107]. Algunos de los reactivos más empleados en estas reacciones son
anhídrido trifluoroacético (TFAA), [103] ácido trifluoroacético (TFA) y trimetilortoacetato
(TFMA) [121], anhídrido propiónico y metanol [48] como se muestra a continuación en la
Figura 10:
28
Figura 10: Reacción de derivatización de glifosato con anhídrido trifluoroacético TFAA, ácido trifluoroacéticoTFA y trimetilortoacetato TMCA.[86], [121].
Isopropilcloroformiato: Los cloroformiatos de metilo, etilo, isopropilo e isobutilo
(MCF,ECF,IPCF,IBCF) son útiles en el tratamiento de grupos fenólicos y amino [122]. Se
implementa para derivatizaciones de glifosato y AMPA según la reacción de la Figura 11:
Figura 11: Reacción de derivatización de glifosato con isopropilcloroformiato (IPCF).[86]
Anhídrido trifluoroacético y trifluoroetanol (TFA,TFE): La esterificación implica la
condensación del grupo carboxilo de un ácido y el grupo hidroxilo de un alcohol, con la
formación de agua, la cual se elimina mediante condiciones anhídridas, debido a que no
existe competencia por el anhídrido entre el agua formada en la reacción de esterificación
y el exceso de alcohol, en las condiciones adecuadas el anhídrido reacciona
preferentemente con el agua [116]. En la derivatizacion de glifosato y AMPA se usa
anhídrido trifluoroacético (TFAA) y trifluoroetanol (TFE) o anhídrido trifluoroacético (TFAA)
[123], ya que estos analitos en su estructura química contienen ácido carboxílico y ácido
fosfónico, que son esterificados y un grupo amino, capaz de sufrir una reacción de
acilación[103],[123] como se evidencia a continuación en la Figura 12:
29
Figura 12: Reacción de derivatización de glifosato con anhídrido trifluoroacético y trifluoroetanol (TFA, TEE).[86]
5.1.5.2 Derivatización para Cromatografía Líquida
Para las determinaciones de glifosato por medio de Cromatografía Líquida, se recomienda
hacer uso de técnicas de derivatización pre-columna [124] como post-columna
[71],[73],[125] teniendo como diferencia el punto de análisis en el que tiene lugar la reacción
de derivatización. En la derivatización pre-columna, los reactivos de derivatización se
agregan a la muestra antes de su introducción en el sistema cromatográfico a fin de
conseguir una mayor volatilidad de los analitos o una menor termolabilidad [17],[19]
mientras que en post-columna los reactivos de derivatización se agregan a la corriente de
eluyente entre la columna y el detector [29],[114].
Entre los reactivos de derivatización más usados en cromatografia se encuentran:
OPA (o-ftalaldehído): Reacciona con compuestos que tienen grupos amino para producir
sustancias que exhiben una fuerte fluorescencia en presencia de 2-mercaptoetanol (OPA-
MERC) [19],[126]. El OPA es usado principalmente en el análisis de glifosato por HPLC
empleando un detector de fluorescencia en derivatizaciones post-columna [15],[17]. Sin
embargo, en estas derivatizaciones, el OPA puede reaccionar sólo con aminas primarias
[127]. El glifosato, al ser una amina secundaria, requiere de una hidrólisis antes de la
reacción con el OPA posterior a la columna [19],[128]. La Figura 13 representa la
derivatizacion de glifosato y AMPA, donde se realiza la oxidación con hipoclorito de sodio
para obtener la glicina y posteriormente se completa la reacción con OPA-MERC:
30
Figura 13: Reacción de derivatización de Glifosato con Hipoclorito de sodio y OPA en presencia de o-2-mercaptoetanol.[129].
Cloruro de 9 - fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC-Cl): Reacciona con aminas primarias y
secundarias en medio acuoso y alcalino (pH 9-9.5) formando derivados fluorescentes a
través de una sustitución nucleofílica aromática (Figura 14) [15],[19],[49],[79],[130]. La
reacción permite la eliminación simple del exceso de reactivo por partición, mejora la
resolución cromatográfica e introduce un fluoróforo con un gran rendimiento
[1],[91],[125],[126]. Al final de la reacción, los derivados fluorescentes existen como
especies cargadas negativamente que son estables sólo en condiciones básicas [42]. Dado
que el FMOC-Cl es insoluble en agua y soluble en solventes orgánicos como el acetonitrilo,
es necesario incluir en el medio de reacción un porcentaje de acetonitrilo entre el 10% y
50% [19],[29].
31
Figura 14: Reacción de derivatización de Glifosato y AMPA con Cloruro de 9 – fluorenilmetiloxicarbonilo.[101]
Una de las principales desventajas de usar FMOC-Cl es la interferencia del producto FMOC-
OH, que se evidencia como un gran pico que se superpone en la señal de glifosato
presentando dificultades para su detección [19],[28],[133].
Cloruro de 2,5-dimetoxibencenosulfonilo (DMOSC): Reactivo derivatizante pre-columna
[106], [119], [125], [134] que presenta en su estructura química grupos de cloruro de
sulfonilo que pueden reaccionar con aminas primarias y secundarias para mejorar su
detección al unirse con el anillo cromóforo del benceno (Figura 15) [119].
Figura 15:Reacción de derivatización de Glifosato con Cloruro de 2,5-dimetoxibencenosulfonilo (DMOSC).[119]
4-cloro-3,5-dinitrobenzotrifluoruro (CNBF): Reacciona fácilmente con aminas primarias y
secundarias en presencia de una base a través de una reacción de sustitución aromática
nucleofílica [5],[135]. El mecanismo se observa a continuacion en la Figura 16:
32
Figura 16:Reacción de derivatización de Glifosato con 4-cloro-3,5-dinitrobenzotrifluoruro (CNBF).[5].
Los derivados resultantes, son muy estables y de alta en absorción en el ultravioleta [136].
Según estudios realizados [5], [136], no se han detectado impurezas derivadas de forma
múltiple ni subproductos en las mezclas de reacción durante el proceso de derivación de
CNBF. El uso de reactivo en exceso y la aparición del producto de hidrólisis no tienen ningún
efecto adverso en el proceso de separación ya que se usa en derivaciones pre-columna[5].
4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazol (NBD-Cl): Fue introducido en 1968 por Cochrane
como agente de derivatizacion que reacciona con aminas primarias y secundarias en medio
etanólico y básico para producir derivados fluorescentes como se observa en la reacción
de la Figura 17 [23], [137].
Figura 17:Reacción de derivatización de Glifosato y AMPA con 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazol (NBD-Cl) [137].
33
6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC): Este reactivo reacciona con el
grupo funcional amino presente en el glifosato y en sus metabolitos (Figura 18). La
derivación se lleva a cabo directamente en el vial de inyección y no se necesita
preconcentración de la muestra [138],[139]. Es usado altamente en procesos de detección
con Espectrometria de Masas.
Figura 18: Reacción de derivatización de Glifosato y AMPA con 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) [112].
5.4.3 Derivatización para Electroforesis Capilar
Para la determinación de glifosato, se han llevado a cabo análisis con detección UV-VIS y
FLD con derivatización pre-columna o en el mismo capilar [140] con reactivos como: cloruro
de p-toluensulfonilo (detección UV a 240 nm), 5-(4,6-diclorotriazinilamino) fluoresceína
(DTAF) (detector FLD) [33] o fenilisotiocianato (PITC) [75] como se muestra en la Figura
19:
Figura 19: Reacción de derivatización de glifosato y AMPA con fenilisotiocianato (PITC).[86]
34
Isotiocianato de fluoresceína: Es un tipo de colorante derivado del xanteno que presenta
especificidad hacia las aminas primarias. Las moléculas forman una unión covalente con
grupos amino libres de los analitos [26], [141]. El mecanismo de reacción se muestra a
continuación:
Figura 20: Reacción de derivatización de glifosato con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC). [86]
35
5.2. COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS
5.2.1 Columnas cromatográficas para GC
Las columnas para los análisis por GC están hechas de cobre, acero inoxidable o tubos de
vidrio, dobladas o enrrolladas. Las columnas analíticas tienen de 1-6 metros de longitud y
de 2-4 mm. de diámetro. La separación de los componentes se realiza dentro de la columna,
por lo tanto, es la parte más importante del cromatógrafo [142].
La selección de la fase estacionaria en el proceso de separación de muestras que contienen
glifosato, es un factor crítico a la hora de realizar el análisis, debido a que parámetros como
la selectividad y polaridad están determinadas por las interacciones físico-químicas de las
moléculas de los solutos y la estructura de la fase estacionaria [143]. La separación se
realiza si las interacciones entre la fase estacionaria y los solutos son distintas.
Teniendo en cuenta que la polaridad está directamente relacionada con la selectividad, se
encuentra una influencia considerable en la retención del compuesto y, por consiguiente,
en la separación. En el caso de los compuestos con un nivel de volatilidad similar, la mayor
retención se obtiene para los solutos con polaridades similares a las de la fase estacionaria.
Es decir, los compuestos polares presentan una mayor retención en una fase estacionaria
polar que en una fase estacionaria menos polar y viceversa.
La columna de GC PRP-X400, contiene un relleno de poliestireno-divinilbenceno sulfonado
de 7µm de diámetro de partícula y de 2,5 meq/g, separa glifosato y sus metabolitos en el
agua potable, cationes inorgánicos y orgánicos, según su carga iónica en menos de 10
minutos. La detección requiere una oxidación y una derivatización pre-columna [22], [130],
[144].
Así mismo, columna capilar de sílice fundida reticulada DB-1701, es una columna de
baja/media polaridad (14% de cianopropil-fenil) -metilpolisiloxano. Es ideal para el análisis
de plaguicidas, herbicidas, derivados de trimetilsililo (TMS), de azúcares y sustancias
relacionadas. La columna está unida, reticulada y se puede enjuagar con solvente y está
disponible con DuraGuard (con una columna de protección incorporada) [143].
36
5.2.2 Columnas cromatograficas para HPLC
Para el análisis de glifosato y AMPA por HPLC debe realizarse la selección de la columna
a utilizar teniendo en cuenta las indicaciones referentes al analito y a la fase móvil que,
generalmente suele ser acetonitrilo. Su longitud oscila entre 5 y 30 cm y contienen un
diámetro interno de 4 a 10 mm.
La mayoría de los análisis de glifosato y AMPA se elaboran por HPLC de fase reversa (RP)
como una de las principales técnicas. La HPLC de fase reversa sirve para analizar analitos
tanto iónicos como no iónicos. En el caso del herbicida, se sugiere seleccionar un tamaño
de poro de relleno de la columna que oscile de 80 a 120 Å (3,5 a 10 µm), debido a que las
moléculas pequeñas se pueden difundir fácilmente fuera y dentro de los rellenos de poro
estándar. Se recomienda C18 como fase ligada en columna inicial para la mayoría de las
muestras, ya que maximiza la retención de compuestos moderadamente polares a no
polares. Se deben considerar las fases de cadena más corta si la resolución no se puede
optimizar con una fase C18 [145]. El material base de una columna HPLC suele ser material
de sílice de alta pureza con partículas completamente porosas.
Las columnas pickering PCX 5000 contienen un sistema de intercambio iónico, supresión
iónica, par iónico y técnicas de fase inversa en la misma columna para análisis por HPLC.
El empaque de la columna consiste en un material macroporoso altamente reticulado (área
de superficie alta) con una superficie interna hidrofóbica neutra. El relleno polimérico de
etilvinilbenceno / divinilbenceno tiene una superficie exterior reactiva a la que se puede unir
un coloide polimérico. Este coloide polimérico, en forma de partículas de látex, se
funcionaliza para crear grupos sulfonato ácidos, los sitios de intercambio catiónico. El látex
de intercambio catiónico activo está anclado permanentemente al relleno macroporoso de
la columna. Este tipo de columnas son usadas en procesos de análisis en derivatización
post columna con detector de fluorescencia [18], [20], [21], [36], [104], [115] ya que son muy
selectivas.
Las columnas C18 kromasil ODS (octadecilsilano) son de fase reversa, usadas en HPLC con
alto poder de separación. Otorgan mayor sensibilidad por medio de la inyección de grandes
volúmenes y selectividad mediante una preseparación eficiente de analitos muy polares de
37
las interferencias menos polares. Este tipo de columnas son las más utilizadas en la
determinación de glifosato con reactivo FMOC-Cl [110],[119],[146].
Las columnas HPLC de intercambio aniónico PRP X100 son usadas para el análisis del
glifosato y AMPA en aguas potables según el método de la EPA 547 [15], [19], [43], [147].
El empaque polimérico es estable entre pH 1 a 13 permitiendo separar con facilidad todo
tipo de especies aniónicas sin que haya deterioro. La extremada resistencia del material del
que está constituido el soporte cromatográfico permite que prácticamente cualquier
eluyente pueda ser utilizado en esta columna, incluyendo modificadores orgánicos en
cualquier proporción.
38
5.3. DETECTORES
Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en fase móvil, convirtiendo
una señal no medible en una propiedad física detectable. Esta señal es elaborada por cada
uno de los componentes previamente separados en la columna traducido en una señal
eléctrica que es amplificada y registrada al momento de salir de la columna [142]. Un buen
detector es altamente sensible, tiene una respuesta lineal sobre un amplio rango de
concentración y es relativamente insensible a variaciones de flujo y temperatura (rango
dinámico lineal) [102], [104], [148].
Para fines de clasificación, los detectores cromatográficos se pueden agrupar de diferentes
maneras según sus propiedades y características [149], [150]: Por tipos de aplicación,
pueden agruparse en universales, selectivos o específicos y por tipo de respuesta, según
la masa o la concentración. Los detectores de ionización de fase gaseosa usados en
cromatografía de gases más importantes son el detector de ionización de llama (FID),
ionización Nitrógeno-Fósforo (NPD) fotométrico de llama (FPD) y captura de electrones
(ECD).
Así mismo, los detectores empleados en HPLC se han diseñado, adaptado y perfeccionado
con el fin de incorporar celdas de flujo que permitan medir las bajas concentraciones de
analito que hay en el líquido. Los detectores de UV-VIS, FLD y MS, han sido ampliamente
usados en el análisis de glifosato y AMPA.
5.3.1 Detector de ionización de llama (FID)
Es el detector universal usado para cromatografía de gases. Consiste en una llama H2/aire
y una placa colectora. Las muestras al salir de la columna, pasan a través de la llama por
medio de un gas de transporte (He, Ar, Ne, Xe, H2, N2, O2) [150], [151]. Posteriormente se
rompen las moléculas orgánicas y se producen iones. Los iones son colectados en un
electrodo parcial y produce una señal eléctrica [142]. Es extremadamente sensible en un
amplio rango para compuestos orgánicos. Proporciona límites de detección bajos,
estabilidad a largo plazo, simplicidad de operación, una respuesta rápida y un rango de
respuesta lineal excepcional [121].
39
5.3.2 Detector de ionización Nitrógeno-Fósforo (NPD)
Selectivo para análisis de compuestos que contienen en sus estructuras químicas grupos
nitrogenados y fosforados [101]. Utiliza una llama de H2/aire por donde pasa la muestra. El
detector emplea una superficie sólida, compuesta de una matriz de cerámica o vidrio
dopada con una sal de metal alcalino (usualmente rubidio o cesio), en forma de un cordón
o cilindro, moldeado sobre un cable eléctrico como fuente termiónica en donde los
compuestos que contienen nitrógeno o fósforo son absorbidos por la superficie del cordón
[150].
5.3.3 Detector fotométrico de llama (FPD)
Utiliza una llama de hidrógeno para excitar a un estado electrónico elevado fragmentos de
moléculas que contengan atomos de azufre y fósforo produciendo especies
quimioluminiscentes. Cuando retornan a su estado fundamental, emiten una luz
característica de las lineas de sus espectros a 526 nm para fósforo, especificamente. La
intensidad de la radiación emitida es medida por un fotomultiplicador el cual la traduce a
una señal [152].
5.3.4. Detector de captura de electrones (ECD)
Selectivo para compuestos organoclorados y halogenados. Los compuestos de baja
afinidad electrónica, por ejemplo, hidrocarburos, alcoholes, fenoles, aminas y aldehídos,
cetonas, éteres y ésteres alifáticos registran una respuesta favorable a concentraciones
normales [150]. Es muy sensible a las moléculas que contiene grupos funcionales
electronegativos, tales como halógenos, peróxidos, o grupos nitro, entre otros. El principio
de funcionamiento de este detector se basa en la disminución de la conductividad debido a
que los electrones, son capturados por analitos específicos que tienen grupos
electronegativos. El detector tiene una fuente radiactiva de baja intensidad, usualmente,
una lámina de 63Ni, para generar electrones de alta energía mediante emisiones β [117]. El
ECD se ha empleado para detectar glifosato y AMPA [96],[116],[120]–[122].
40
5.3.5. Detector UV-Visible
Su fuente de radiación es una lámpara de descarga de arco de deuterio para el rango de
longitud de onda ultravioleta (UV) de 190 a 600 nm. El haz procedente de la lámpara
atraviesa una lente, un filtro, una rendija de entrada, un espejo esférico, un difractor, un
segundo espejo esférico, un divisor del haz y finalmente la celda de flujo para llegar al diodo
de la muestra. La absorción UV tiene lugar en la celda de flujo; la intensidad de luz emitida
se convierte en señal eléctrica mediante el fotodiodo de muestra [154].
El detector de absorción en UV-VIS acoplado a HPLC es probablemente el más empleado
en estudios medioambientales por su amplia versatilidad en la detección de la mayor parte
de los contaminantes medioambientales analizados por Cromatografía Líquida.
Proporciona una sensibilidad adecuada, tiene un rango lineal amplio, es adecuado para la
elución por gradientes, no es sensible a los cambios de temperatura y es relativamente
barato [54], sin embargo, una de sus limitaciones es que no permite obtener información
estructural y está sujeta a múltiples interferencias, lo que hace necesario una etapa previa
de limpieza de muestras o una derivatización de los compuestos [118]. A su vez presenta
una baja selectividad cuando las muestras medioambientales son complejas y los
contaminantes se encuentran a niveles traza [155].
5.3.6. Detector de Fluorescencia (FLD)
La fotoluminiscencia o emisión de luz tiene lugar cuando las moléculas pasan de un estado
excitado a su estado natural. Cuando una molécula más compleja pasa de su estado
energético fundamental a un estado excitado, la energía absorbida se distribuye en varios
subniveles de vibración y rotación [102], [132]. Así mismo, si esta misma molécula vuelve a
su estado fundamental, pierde inicialmente esta energía de vibración y de rotación por
relajación, sin emitir radiación. Después, la molécula pasa de este nivel energético a uno
de los subniveles de vibración y de rotación de su estado fundamental, emitiendo luz. La
fluorescencia es el retraso de la emisión tras la excitación cuando una molécula emite luz
entre 10-9 y 10-5 segundos [31], [156]. En el análisis de glifosato y AMPA es común la
derivatización con FMOC-Cl que reacciona con aminas primarias y secundarias para
producir derivados estables y altamente fluorescentes, originando una respuesta que es
recibida por el detector de fluorescencia [49], [114], [129] altamente sensible y selectiva.
41
5.3.7. Detector de masas
Este tipo de detector presenta una complejidad desde la perspectiva instrumental en cuanto
a la formación o fragmentación de iones, principalmente por impacto de electrones (EI). Las
moléculas se bombardean con electrones acelerados a 70 eV de energía, emanados de un
filamento de tungsteno o rutenio, lo que conduce a la formación de los iones moleculares
(M+·) [150], [117] que finalmente son detectados con alta selectividad.
42
6. MÉTODOS ANÁLITICOS INSTRUMENTALES
El uso excesivo de glifosato en la agricultura y su impacto en el medio ambiente está
promoviendo el desarrollo de análisis del herbicida en matrices como agua, suelo y
alimentos. La ausencia de grupos cromóforos en la estructura molecular dificulta la
detección de este herbicida por analisis convencionales [19],[20]. Detectar residuos de
glifosato utilizando un método analítico simple, se ha convertido en un reto, debido a su
carácter iónico [5], alta polaridad y solubilidad en agua [6],[125], baja solubilidad en
solventes orgánicos comunes [45], baja volatilidad [25] y masa molécular [48]. En las
determinaciones de glifosato, generalmente se analiza simultáneamente su metabolito
principal: El ácido aminometilsulfónico (AMPA) [6],[8],[20],[43],[135] que a su vez, presenta
una alta poliaridad, lo que le otorga alta solubilidad en agua [8],[18],[20],[29],[157].
La detección fotométrica y fluorométrica directa de este tipo de sustancias no es viable
debido a la ausencia de grupos cromóforos o fluoróforos en las estructuras de glifosato
[42],[43],[86], por lo tanto, para su analisis, se requiere de procedimientos de derivatización
[19],[20],[125]. Así mismo, la similitud con los aminoácidos u otros componentes naturales
de la planta puede causar interferencias [48]. La determinación del glifosato se lleva a cabo
habitualmente por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) o Cromatografía de
Gases (GC) [19],[21],[48],[49],[50],[144], haciendo uso de diferentes detectores. Sin
embargo, la aplicación de técnicas alternativas es cada vez más frecuente. A continuación,
se revisan los métodos usados con más frecuencia, destacando aquellos que permiten
analizar niveles de concentración bajos.
6.1. Cromatografía de Gases
La Cromatografía de Gases (GC) no es usada comúnmente para detectar glifosato debido
a la alta polaridad del herbicida. Si se va a utilizar, es necesario derivatizar su estructura
para inhabilitar los grupos polares tales como hidroxilo, carbonilo y amina [48], [125] en
operación pre-columna para convertirlo en un derivado volátil y térmicamente estable
[147],[121],[127].
En cuanto a los detectores, se usa habitualmente el Detector de Captura de Electrones
(ECD), Nitrógeno y Fósforo (NPD)[148], Fotométrico de llama (FPD) [105], [158] y de
Ionización de llama (FID) para la detección de glifosato por este método [48], [125], [159].
43
Algunos análisis por GC se han elaborado partiendo de una acetilación separada con
anhídrido trifluoroacético, alquilación con diazometano [75],[144] en donde se han reportado
resultados irreproducibles y bajas recuperaciones. Adicionalmente, el emplear diazometano
genera contraindicaciones severas para la salud humana ya que es un reactivo altamente
tóxico, cancerígeno y explosivo.
Hu et al, [148] diseñaron un método para determinar residuos de glifosato en muestras de
suelo, donde se emplea como extractante NH4OH 2M. Posteriormente, las muestran eran
derivatizadas con TFA,TFE y se analizan por Cromatografía de Gases con un Detector de
Nitrógeno y Fósforo (GC-NPD). Los resultados fueron confirmados por Espectrometría de
Masas (MS/MS). La concentración mínima detectada de glifosato fue de 0,01 mg/kg y las
recuperaciones que oscilaron entre 84,4–94,0%.
En el estudio elaborado por Kataoka et al, [160], se derivatizaron muestras de agua que
contenían glifosato, glufosinato y AMPA con isoPCF a pH=10. El producto derivado se
analiza por GC usando una columna capilar de sílice fundida DB-1701. Los límites de
detección hallados son 10 pg/L para glifosato y 15 pg/L para AMPA. Las recuperaciones en
general de glifosato y AMPA de las muestras ambientales fueron del 91-106% y las
desviaciones estándar relativas fueron del 0,3 al 7,7%.
En algunos casos la cuantificación de glifosato en suelo y agua a través de NPD ha
alcanzado LOD de 0,02 mg/kg [36], [125] y 0,5 ng/L [148]. Las dificultades que se presentan
en el análisis por GC es el uso de solventes como cloroformo, diclorometano y n-hexano
[105] los cuales presentan alta toxicidad y afecciones para la salud humana. Así mismo, el
proceso de derivatización incluye varios pasos y en algunos casos, se producen derivados
inestables generando inconvenientes durante la detección [147].
Zhang et al [72], analizan muestras de agua y el suelo que contenían GLYP y AMPA. Para
el tratamiento de las muestras, se realiza extracción en fase sólida (SPE) y posteriormente,
se optimiza la derivatización haciendo ensayos con diferentes mezclas de reactivos
derivatizantes: Trifluoroetanol TFA y anhídrido trifluoroacético (TFAA), heptaflouro-1-
butanol (HFB) y anhídrido trifluoroacético (TFAA), anhídrido heptafluorobutírico (HFBA) y
heptafluoro-1-butanol (HFB). Después de la derivatización, las muestras se secaron con
nitrógeno gaseoso a temperatura ambiente. La determinación de los analitos se realiza por
44
cromatografía de gases con detección fotométrica de llama (GC-FPD). Según los
resultados, la mezcla de derivatización que arroja mejores retenciones, es la conformada
por anhídrido heptafluorobutírico (HFBA) y heptafluoro-1-butanol (HFB). Los reactivos de
derivatización se estudiaron en función del tiempo de retención, el área de pico y la
resolución de las bandas obtenidas como se observa en los cromatogramas (Figura 21).
Los límites de cuantificación (LOQ) para GLYP y AMPA fueron 0.37 y 0.81 ng/mL,
respectivamente.
Figura 21: Cromatogramas de derivados de GLYP y AMPA con diferentes reactivos de derivatización (A= TFA: TFAA, B= HFB: TFAA, C= HFB: HFBA) [72].
6.2. Cromatografía Líquida. Debido a su idoneidad para muestras acuosas, la Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia
(HPLC) es la técnica analítica de elección para compuestos polares [95], por lo tanto La
Cromatografía Líquida (LC) es el método más adecuado para detectar glifosato en agua
[19], [29], [42], [49], [79] ya que permite trabajar con sistemas de separación cromatográfica
en fase reversa y realizar la derivatización en solución acuosa [102]. La etapa de
derivatización en LC es necesaria por la ausencia de grupos cromóforos o fluoróforos en la
45
estructura, pero también para disminuir los límites de detección. Según la AOAC el método
oficial 991.08 para la determinación de glifosato y AMPA en aguas subterráneas, agua
potable y agua superficial es con la técnica de Cromatografía Líquida con derivatización
post-columna con OPA-MERC usando columnas aminopoliméricas (específicas para
aminas primarias y secundarias) para producir derivados fluorescentes o para mejorar la
retención en fases estacionarias de fase inversa antes de la detección como se indica en la
Figura 22: [19],[115], [AOAC].
Figura 22: Diagrama de procedimiento según el método 991.08 AOAC para la determinación de GLYP y AMPA en aguas.
En el cromatograma (Figura 23), se observan tiempos de retención entre 8 minutos para
AMPA y 12 minutos para glifosato llevando a cabo el método propuesto por la AOAC.
Figura 23: Cromatograma de GLYP y AMPA según método AOAC 991.08. [58]
46
Los primeros procesos de análisis por cromatografía HPLC con derivatización previa a
columna usando FMOC-Cl, los realizaron Moye y Boning en el año 1978 [1], debido a la
necesidad de derivatizar el glifosato y su metabolito AMPA, antes de la separación por
intercambio aniónico [1],[19]. Desde entonces, se han desarrollado varias modificaciones a
los procesos para mejorar el rendimiento del método, incluidos los pasos de limpieza y en
algunos casos, preconcentración de las muestras [42],[19],[29],[114].
En las revisiones bibliográficas se encuentra el uso de la Cromatografía Líquida con
sistemas de Detección de Fluorescencia (LC-FLD) [32], [45], [70],[72],[75],[22] y
Ultravioleta/Visible (LC/UV-VIS) [46], [75], [133], [135], [161] como se evidencia en la Tabla
6. Los reactivos de derivatización empleados en los detectores de Fluorescencia (LC-FLD)
generalmente son: Cloruro de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC-Cl) en operación pre-
columna [19], [27], [42], [49], [79], [135], [162] y o-ftalaldehído (OPA) en análisis post-
columna [134],[71],[73],[83],[90],[93]. Para los detectores de UV los reactivos comúnmente
son: 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl) [86],[88],[94], cloruro de p-
toluenosulfonilo (TsCl) [5],[119][167],[110], o-cloruro de nitrobencenosulfonilo, cloruro de
2,5 dimetilbencenosulfonilo (DMOSC) [23], [125], [137] y 4-cloro-3,5-dinitrobenzotrifluoruro
(CNBF) [5], [135], [136] en procesos pre-columna. Se considera que el método de detección
más popular es la Espectroscopía UV-VIS porque es sensible, tiene un amplio rango lineal,
no se ve afectada a los cambios de temperatura y es relativamente económico [71].
En aquellos sistemas que emplean derivatizaciones post-columna para glifosato, se han
encontrado dificultades que afectan al resultado de los análisis. Según Valle et al, [48],
Ding et al, [125] y Chow et al, [168], debido a que se evidencian tiempos de análisis
prolongados, separaciones inadecuadas en las señales cromatográficas, grandes
diferencias relativas en la sensibilidad, cuantificaciones ineficientes, tiempo de retención
demasiado bajo para señales de glifosato y AMPA. A su vez, se presentan eluciones cerca
de señales interferentes, siendo este un factor limitante para obtener una buena calidad en
la determinación [23],[105],[132].
El método de determinación de glifosato en aguas potables propuesto por la EPA (EPA
Method 547), se basa en la inyección directa de las muestras de agua, previamente
filtradas, la utilización de una columna de intercambio catiónico (250 x 4,6mm, BioRad
Aminex A-9) a 65°C y una precolumna C18, una fase móvil isocrática compuesta por
47
KH2PO4 (0,005 M) y metanol en una relación 96:4 v/v. Tras la elución a 65ºC, se realiza la
oxidación con hipoclorito de calcio y, el producto, se mezcla con o-ftaldehído (OPA) y 2-
mercaptoetanol (MERC) a 38°C, para obtener un derivado altamente fluorescente, que se
detecta a las longitudes de excitación y emisión de 340 nm, y 455 nm, respectivamente
como se indica en la Figura 24:
Figura 24: Diagrama de procedimiento según el método EPA 547 para la determinación de GLYP y AMPA en aguas.
Los niveles mínimos de detección que se obtienen por el método EPA son de 6,0 µg/L y 9,0
µg/L para aguas potables y subterráneas [39],[43],[72],[74],[102].
Sin embargo, el reactivo OPA para la derivatización post-columna, puede reaccionar sólo
con aminas primarias [44],[111]. El Glifosato, al ser una amina secundaria, requiere
hidrólisis antes de la reacción OPA posterior a la columna. Como consecuencia de este
procedimiento, se requiere más instrumentación [19],[71]. Por lo tanto, se prefiere la
derivatización pre-columna sobre la derivatización post-columna, porque no es necesario
contar con instrumental analítico complejo y es fácil controlar las condiciones de reacción
[170] siendo estas, más eficientes y precisas [125] al presentar mejor separación entre las
señales cromatográficas y pocos interferentes en los procedimientos [59]. Según Fang et
al. [119], el uso de agentes derivatizantes como en DMOSC a bajas temperaturas, permite
la obtención de derivados estables a temperatura ambiente y con una alta absorción en la
región UV-visible que ofrece una cuantificación sensible y selectiva de los derivados como
se observa en el cromatograma:
48
Figura 25: Cromatograma de GLYP analizado por HPLC-UV con derivatización con DMOSC (1=GLYP-
DMOS; 2=DMOS-OH; 3= DMOSC en exceso. [119].
En general, la metodología más usada ha sido la cromatografía HPLC con derivatización
pre-columna con FMOC-Cl y detector de fluorescencia [19], [49], [71], [106], a pesar de que
una de las principales desventajas de usar FMOC-Cl es la interferencia del producto FMOC-
OH, que está representado por un gran pico frente a la señal de glifosato. El producto
FMOC-OH algunas veces se superpone completamente con el pico de glifosato y crea
dificultades en su detección [19], [71]. Para Qian et al, [5], la derivatización con CNBF tiene
buena actividad y selectividad para compuestos amino y se emplea como un excelente
grupo activo. Puede reaccionar con aminas en baja concentración para formar derivados
estables en condiciones de base, y el exceso de reactivo se hidroliza al fenol
correspondiente sin ningún subproducto e interferencia [5],[135]. La Tabla 6 relaciona
diferentes metodologías usadas para la detección de glifosato y AMPA en aguas:
49
Tabla 6:Parámetros analíticos en HPLC: Tipo de derivatización, Detector, Columna, Límites de detección para glifosato y AMPA y porcentaje de recuperación.
*LOD: Límite de detección, Prec: Derivatización pre-columna; Postc: Derivatización post-columna; OPA: o-ftalaldehído; FMOC-Cl: Cloruro de 9 – fluorenilmetiloxicarbonilo; CNBF: 4-cloro-3,5-dinitrobenzotrifluoruro; NBD-Cl: 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1, 3-diazol, TsCl: cloruro de p-toluenosulfonilo, Mobs-F: Fluoruro de 4-metoxibencensulfonilo; DMOSC: Cloruro de 2,5-dimetoxibencensulfonilo. RP Fase reversa; IE: Intercambio iónico.
Matriz Derivatización Detector Columna TIPO DE CROMATOGRAFIA
LOD Glifosato LOD AMPA % de recuperación Fuente
Agua potable POSTC-OPA-MERC FLD PCX 5100 IE 0,8 µg/L No Reporta
73% Rodríguez et al -2002[18]
Agua de mar PREC- FMOC-Cl FLD ZORBAX SB-C18 column RP 0,60 µg/L 0,30 µg/L 80% Wang et al - 2016 [49]
Aguas Superficiales PREC- FMOC-Cl FLD polymeric amino C1 IE 0,16 µg/L No Reporta
94% Nedelkoska et al -2004
Aguas Superficiales MOBS-F UV/VIS Kromasil (ODS) C18 RP 0,1 µg/L 0,1 µg/L No Reporta
Sun et al 2010 [71]
Aguas Superficiales POSTC-OPA-MERC FLD PCX 5100 IE 2,0 µg/L 4,0 µg/L 83-90% Mallat et al – 1998 [20]
Agua potable POSTC-OPA-MERC FLD PCX 5200 IE 0,22 µg/L 3.40 µg/L No Reporta Piriyapittaya et al – 2008 [21]
Aguas superficiales y subterráneas
POSTC-OPA-MERC FLD PRP-X100 IE 0,02 µg/L 0,1 µg/L 72% Patsias et al -2001 [22]
Aguas superficiales PREC- CNBF UV/VIS Kromasil C18 RP 0,009 µg/L No Reporta
91.80–100.20% Qian et al -2009 [5]
Aguas subterráneas PREC- NBD-Cl UV-VIS ion Exchange IE 43 µg/L 60 µg/L 84% Pérez et al 2019 [171]
Agua potable PREC- NBD-Cl FLD C-18 column Pinnacle ODS RP 1 µg/L 0,1 µg/L No Reporta Colin et al 2000[23]
Aguas Naturales PREC- DMOSC UV Kromasil ODS C18 column RP 0.067 μg/mL No Reporta 97% Fang et al 2014 [119]
Aguas Naturales PREC-FMOC-Cl FLD C18 Zorbax Eclipse plus RP 0.008 mg/L 0.076 mg/L 34-74% Garba et al 2018 [106]
Agua potable PREC-FMOC-Cl UV Dowex AG1X8-100 RP 0,09 mg/L 0,20 mg/L 40% Delmonico et al 2014 [110]
Aguas Superficiales PREC- FMOC-Cl LC–SPE–ESI/MS/MS
ODS-2 RP 0,05 mg/L 0,05 mg/L No Reporta Vreeken et al 1998 [29]
Aguas Superficiales PREC-FMOC-Cl MS/MS C18 RP 0,0007 µg/L 0,0008 µg/L No Reporta Hanke et al [27]
Aguas Superficiales PREC-FMOC-Cl FLD + MS/MS C18 RP 0.058 μg/L 0.108 μg/L 83% Ramirez et al [31]
48
6.3. Cromatografía Iónica (IC)
La Cromatografia Iónica (IC) ha sido una herramienta útil para detectar sustancias iónicas
[172] por medio de la retención de moléculas y la atracción entre iones de solución y sitios
cargados unidos a la fase estacionaria [147]. La muestra queda retenida sobre el soporte
sólido por afinidad electrostática. Dependiendo de la relación carga/tamaño, algunos
constituyentes de la mezcla se retienen con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros,
conduciendo a su separación [117]. Como ya se mencionó, el glifosato es un compuesto
iónico (pKa1 < 2,0; pKa2= 2,2; pKa3 =5,4 y pKa4 =10,1) [103],[148] por lo cual se puede usar
una columna de intercambio aniónico seguida de una elución con un tampón alcalino.
A continuación, se describen los parámetros de un sistema de IC para la determinación de
glifosato mediante detección de conductividad suprimida (DX-100), donde el eluyente esta
compuesto por 9,0 mmol/L Na2CO3 y 4,0 mmol/LNaOH. El LOD es de 0,042 mg/mL. La
recuperación es del 94% [172]. Para algunos autores [138], es posible lograr una buena
retención y separación de glifosato y AMPA con la mayoría de los métodos basados en IC.
Sin embargo, este enfoque implica la necesidad de un instrumental específico.
Qiu et al, [173] analizaron fosfito, fosfato, glifosato y AMPA en agua natural mediante un
sistema de Cromatografía Iónica bidimensional acoplado con Cromatografía Iónica Capilar
(2D-CIC). Después de realizar filtración por membrana de 0,22 µm, se inyectan 25 µL de
muestras en la columna analítica AS11-HC para la separación preliminar. De acuerdo con
los diferentes tiempos de retención en la primera dimensión, los iones objetivo se dividen
en dos grupos ( grupo 1: fosfito y fosfato; grupo 2: glifosato y AMPA), luego se cambia a
la columna capilar de segunda dimensión MAX-100 para obtener mayor separación y
detección. Los resultados muestran LOD de 0,18 nM para fosfito, 0,073 nM para fosfato,
0,15 nM para glifosato y 2,6 nM para AMPA. Las recuperaciones varian de 80,1% a 118,4%.
Los resultados demuestran que el sistema capilar acoplado podría permitir la detección
simple de materiales traza en agua natural con matriz compleja.
6.4 Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas
La Cromatografía Líquida acoplada a la Espectrometría de Masas tándem (LC–MS/MS) es
actualmente el método elegido con mayor frecuencia para los analitos polares debido a su
51
alta selectividad y sensibilidad [16]. En el análisis de glifosato por LC – MS / MS, a menudo
se requiere derivatización para reducir el carácter polar de los analitos y permitir una buena
separación cromatográfica. Actualmente, el método más utilizado implica la derivatización
previa a columna con Cloruro de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC-Cl) [138]. Las
derivatizaciones de glifosato y AMPA se requieren para alcanzar una retención suficiente
en las columnas cromatográficas de fase inversa comúnmente utilizadas y para la
preconcentración de analitos en la mayoría de los solventes cromatográficos [174].
Botero-Coy et al, [174] desarrollaron un método que se basa en la determinación de
glifosato y AMPA en suelos colombianos y argentinos, por medio de derivatización con
FMOC seguido de análisis LC–MS/MS utilizando triple cuadrupolo. Después del proceso de
limpieza, preconcentración y extracción con cartuchos SPE Oasis HLB, se marca el
glifosato con isótopos 1,2-13C y 15N como estándar interno para la corrección de los efectos
de la matriz y para compensar cualquier error que ocurriera durante el procesamiento de la
muestra. En el análisis se encuentran concentraciones de 1,74 mg/kg para glifosato y 1,14
mg/kg de AMPA.
Poiger et al, [30] elaboraron un procedimiento para la determinación de glifosato y AMPA
en muestras de aguas superficiales, subterráneas y aguas residuales utilizando SPE,
derivatización con FMOC-Cl y detección por (LC-MS/MS). El análisis demostró ser simple,
sensible y confiable. Los resultados arrojaron límites de cuantificación de 0,005 μg/L. El
glifosato y el AMPA se detectaron en la gran mayoría de las muestras de agua en el área
de Zurich-Suiza con concentraciones de 0,11 y 0,20 μg/L respectivamente.
6.5 Cromatografía Líquida con Ionización por Electrospray y Detección en Masas Tándem (LC-ESI/MS/MS)
En esta técnica, la muestra en solución se hace pasar a través de un capilar al que se aplica
un alto potencial eléctrico. A la salida del capilar la solución se dispersa en forma de spray
formado por pequeñas gotas cargadas, las cuales se evaporan rápidamente por procesos
de desorción a causa del campo eléctrico o de evaporación del solvente, liberando
moléculas protonadas a la fase gaseosa [175]. Los iones generados pueden estar
protonados de forma múltiple dando lugar a diferentes especies para una misma molécula.
La Ionización por Electrospray (ESI) se puede acoplar a múltiples analizadores. Los iones
formados en la fuente entran en el analizador donde se aplican diferentes voltajes
52
generando un campo eléctrico tridimensional en la cavidad de la trampa. Este campo atrapa
y concentra los iones dada su trayectoria de oscilación estable. La naturaleza de la
trayectoria depende del potencial y de la relación masa-carga (m/z) de los iones. Durante
la detección, los potenciales de los electrodos se alteran para provocar inestabilidad en las
trayectorias de los iones y expulsarlos en la dirección axial en función de su relación m/z
dando lugar a un espectro de masas (MS).
Se realiza la validación de un método de extracción en fase sólida con Cromatografía
Líquida de Alto Rendimiento y detección por Espectrometría de Masas con Ionización por
Electrospray (SPE-HPLC-ESI-MS-MS) para analizar glifosato y AMPA en agua potable y
aguas residuales. Se realiza preconcentración y extracción de los analitos con cloruro de 9-
fluorenil metoxicarbonilo y separación por HPLC. La identificación y cuantificación se realiza
basada en la relación constante de tres iones seleccionados para cada compuesto (ión
precursor y dos iones de producto) junto con el tiempo de retención. El proceso es muy
selectivo. La validación del método HPLC-MS para glifosato y AMPA registra LOD de 0,03
mg/L y recuperaciones del 96% [29].
Así mismo, Ibáñez et al, [26], desarrollan un método analítico sensible y robusto para la
cuantificación de glifosato, AMPA y glufosinato en agua natural con derivatización con
Cloruro de 9 - fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC-Cl), extracción en fase sólida (SPE) y
Cromatografía Líquida seguida de espectrometría de Masas en tándem de Electrospray
(LC-ESI-MS / MS). En el proceso, se obtienen LOQ de 0,7 ng/L, 0,8 ng/L y 2,3 ng/L para
glifosato, AMPA y glufosinato y LOD de 0,2 ng/L para glifosato y AMPA, 0,6 ng /L para
glufosinato,
6.6 Cromatografía Líquida de alta eficiencia con Espectrometría de Masas con Plasma
Acoplado Inductivamente (HPLC-ICP-MS/MS)
La Espectrometría de Masas en tándem (MS/MS) con sistema de Plasma Acoplado
Inductivamente (ICP) se usa habitualmente en determinación de residuos de plaguicidas.
La alta densidad de iones y la temperatura en un plasma proporcionan un atomizador ideal
y un ionizador de elementos para todo tipo de muestras y matrices introducidas por una
variedad de dispositivos especializados [176]. La técnica presenta mayor precisión en la
53
cuantificación conduciendo a altos rendimientos en la detección e identificación de
elementos traza. El proceso consta aproximadamente de cuatro etapas:
Inyección de la muestra: La muestra líquida se bombea desde un vial, a través de una
bomba peristáltica, al nebulizador. Las gotas de líquido se forman en la punta de una aguja,
donde se nebulizan debido al gas argón que fluye a través de una segunda aguja
perpendicular a la aguja de muestra. Una pequeña cantidad de aerosol creado se introduce
en la llama teniendo en cuenta que la mayoría de la muestra se condensa en las paredes
del nebulizador [177].
Ionización en llama: El gas argón fluye continuamente a través de la antorcha de cuarzo, y
un generador de radiofrecuencia (RF) proporciona energía a la bobina de RF a frecuencias
oscilantes. La generación de plasma (una mezcla gaseosa conductora eléctrica) ocurre
cuando el gas argón atraviesa la bobina de radiofrecuencia. La chispa ioniza parte del
argón, y los cationes y electrones producidos a partir de ese aceleran hacia la bobina de
RF. Los cationes y los electrones chocan con otras moléculas de argón a altas temperaturas
(6.000°C) [178], [179]. La muestra nebulizada ingresa al plasma donde es atomizada. Estos
átomos son ionizados.
Interfase: Después de la ionización la muestra pasa a un muestreador donde el plasma es
despresurizado en una cámara. Allí se produce un enfriamiento rápido y expansión del gas.
Posteriormente, ingresa al espectrofotómetro de masas.
Detector MS: Después de pasar a través de la muestra, la corriente de iones se enfoca en
la región cuadrupolo mediante lentes de iones individuales. Los iones generados en el
plasma están casi todos cargados positivamente y tienden a repelerse entre sí. Los iones
pasan a través de un cilindro metálico cargado que evita que el haz de iones diverja. Los
electrones energéticos chocan con las moléculas de analito e imparten suficiente energía
para dejar las moléculas en un estado excitado. En estado de relajación, a menudo ocurre
por fragmentación de parte de los iones moleculares para producir iones de masas
inferiores.
Los iones se dispersan en el analizador de masas en función de su relación masa-carga (m
/ z).
54
Recientemente, la gama de instrumentos ICP-MS/MS basados en cuadrupolo se ha
sofisticado con la incursión ICP-MS triple cuadrupolo (ICP-QQQ). La Figura 26 muestra en
esquema de un equipo ICP-MS/MS. Este tipo de instrumento se caracteriza por la presencia
de un analizador cuadrupolo adicional frente a la celda de reacción de colisión [48]. Este
filtro cuadrupolo (Q1) puede funcionar como un filtro de masa, permitiendo así que solo
ingresen en la celda iones con relación m/z [95].
Figura 26: Esquema de sistema de detección ICP/MS/MS. [180]
En el análisis simultáneo de glifosato, AMPA, glufosinato, fosamina y etefón [95] mediante
la técnica de IPC-MS/MS se implementa el isótopo de fósforo, m/z =31 [95] (que es
detectado como 31P16O+) para la cuantificación de los analitos, usando oxígeno como gas
de reacción [95]. Durante el proceso, no se realiza ningún tratamiento previo de la muestra,
excepto la filtración con filtros de Nylon de 0,22 µm utilizando jeringas de polipropileno. Se
usa un buffer de malonato de amonio 2,0 mM a pH = 5.3, ya que proporciona una separación
simétrica mientras se mantiene el tiempo de retención cromatográfico menor a 14 min, con
un factor de retención mínimo de k = 1,4 (Figura 27A) Para el caso específico de análisis
de AMPA y glifosato, se modifican las condiciones cromatográficas aumentando la
concentración del buffer a 5,0 mM, logrando la separación de AMPA, fosfato y glifosato en
tiempos menores a 5 min (Figura 27B):
Figura 27: Cromatogramas de análisis de GLY y AMPA por ICP/MS-MS. (A= Adición de Buffer de
Malonato de amonio 2,0 Mm, B= Adición de buffer 5,0 Mm) [95]
55
Se obtienen límites de detección de 0,14, 0,12, 0,20, 0,19 y 0,27 µg/L para AMPA,
glufosinato, fosamina, glifosato y etefón, respectivamente. Los beneficios de realizar
análisis por ICP-MS/MS se evidencian en la precisión, exactitud, especificidad en la
detección, poca interferencia de los componentes de la matriz, procedimientos simples sin
derivatización y pretratamientos en comparación con detectores convencionales
[140],[142]. Las dificultades de la técnica se encuentran en el efecto matriz que se puede
producir.
6.7 Cromatografía Líquida de alto rendimiento con Detector de Arreglo de Diodos
(DAD/HPLC)
El método se emplea para la determinación de glifosato en la atmósfera después de la
extracción de espumas de poliuretano (PUF) (medio adsorbente) ubicadas en un
muestreador orgánico Amotox®. El aire pasa a través del prefiltro/espuma de poliuretano.
El glifosato se recolecta simultáneamente con partículas sólidas suspendidas (SPT) de la
atmósfera rural y urbana del Municipio de Limoeiro do Norte-Ceará, ubicado en el noreste
de Brasil. Para la extracción de glifosato, se usa 0,211 g de KH2PO4 y 10 mL de metanol
grado HPLC en agua ultrapura a 250 mL. El pH = 2 se mantiene usando ácido fosfórico
concentrado. Los PUF se sumergen completamente en 200 mL de la solución extractiva
durante 12 horas. Posteriormente, 50 mL de la solución de extracción se filtra y se pasa por
un cartucho SPE Chromabond® C18 de Macherey-Nagel. Previamente, los cartuchos se
acondicionan con 5 mL de metanol y 5 mL de agua ultrapura grado HPLC. Luego, se eluyen
50 mL de la solución de extracción que contiene el herbicida. El glifosato adsorbido se
recupera con 5 mL de agua ultrapura. La muestra es analizada por HPLC con detector de
disposición de diodos (DAD/HPLC), columna μBondapak ™ C18 (10 μm, 3.9 mm × 300
mm), a longitud de onda de 195 nm, volumen de inyección de 20 μL, usando como fase
móvil 0,006 mM KH2PO4 y velocidad de flujo de 1,0 mL/min. Los resultados reportan niveles
de glifosato entre 0,002 y 0,144 μg/m3 en zona rural, mientras que en la zona urbana varió
de 0,009 a 2,576 μg/m3 [182]. Según el estudio, estos valores pueden considerarse altos y
peligrosos para la salud humana y el medio ambiente.
56
6.8 Electroforesis Capilar (CE)
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación micro-analítica basada en la
diferencia de velocidad de migración de las distintas especies cargadas bajo la acción de
un campo eléctrico [183]. La movilidad electroforética de un soluto está determinada por su
carga, el tamaño y la viscosidad del medio. Por lo tanto, a mayor carga y menor tamaño,
mayor será su movilidad electroforética, siendo estos analitos los primeros en ser
detectados [184]. La separación se lleva a cabo en un capilar de sílice fundida de diámetro
de alrededor de 10 a 200 µm. El procedimiento es aplicable para el análisis de una amplia
gama de compuestos iónicos, ionizables y neutros [102],[185]. El capilar y los viales se
llenan con una solución buffer un pH determinado. La muestra está formada por un conjunto
de aniones y cationes que se introduce dentro del sistema ocupando una zona específica.
Al someterlo a un campo eléctrico, los analitos migran hacia el electrodo correspondiente,
estableciéndose un movimiento de iones que forman parte del sistema [183],[186],
provocando la separación de moléculas cargadas en función de su movilidad electroforética
según el punto isoeléctrico (pI) de la molécula.
Amelin et al, [75] desarrollan un procedimiento para la determinación de glifosato y AMPA
en aguas superficiales y aceite vegetal mediante Electroforesis de Zona Capilar (CZE) con
derivatización preliminar con fenilotiocianato y detección UV, donde se obtienen LOD para
glifosato y AMPA de 0,005 y 0,02 mg/L, respectivamente. El análisis tarde de 1 a 2 horas
en donde la desviación estándar relativa de los resultados no supera el 7%. El
electroferograma indica tiempos de retención cortos y selectividad en las señales obtenidas:
Figura 28: Electroferograma de GLYP y AMPA. [75].
57
Entre los sistemas de detección más reportados se encuentran detectores UV-V, FLD y MS,
que como se mencionó anteriormente, requiere de una derivatización previa o de detección
indirecta [54], [187]. La CE proporciona ventajas en términos de velocidad, bajo costo y
simplicidad. Por tanto, este método se puede emplear como una excelente alternativa para
análisis de herbicidas [33].
6.8.1 Electroforesis de Microchips
La Electroforesis de Microchips puede ser un método de determinación rápida de herbicidas
organofosforados que puede usarse para el análisis con detección de Fluorescencia
Inducida por Láser (LIF) que es altamente sensible en este tipo de metodologías
[141].Hernandez et al, realizan análisis de glifosato en muestras de soya y brócoli. Para la
soya se mezclan 2 g de material vegetal con 6,0 mL de agua en un tubo de polipropileno
de 25 mL. La mezcla se somete a ultrasonido durante 5 minutos y se filtra al vacío después
de 1 minuto de sedimentación. El precipitado se lava dos veces con 3,0 mL de agua y se
adiciona 1 mL de acetonitrilo a 1 mL del filtrado para precipitar las proteínas presentes en
la soya. Luego, la mezcla se centrifuga a 4.000 rpm durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Para el Brócoli se homogenizaron 10 g del vegetal con 100 mL de agua y se
transfiere a un vaso de precipitado de polipropileno de 250 mL. Se realiza el mismo proceso
de sonicación, filtración al vacío y limpieza de la soya. Para las dos matrices, el
sobrenadante se recoge y se filtra a través de un filtro de membrana de 0,45 µm antes de
la etapa de derivatización. Las muestras se derivatizan con una solución de FITC en 200
µL de acetona que contiene piridina al 1% (v/v). En la fase de inyección, se aplica un voltaje
de 400V a la muestra para hacer que los analitos migren. Se encuentran valores de LOD
de 0,05 µg/Kg y LOQ de 0,17 µg/Kg para glifosato. Las ventajas del método se deben a su
rápida separación para la detección de residuos de herbicidas en agua y productos
agrícolas.
Adiconalmente, Wei et al, [141] elaboraron un sistema de Electroforesis en Microchips de
un copolímero de olefina cíclica con detección de Fluorescencia Inducida por Láser (LIF)
para el análisis de glifosato y glufosinato en agua. La muestra se filtra a través de un filtro
de membrana de 0,45 µm y se adiciona un buffer que contiene 10 mmol/L de bórax y 2,0%
(m/v) de hidroxipropilcelulosa a pH 9.0. Posteriormente, se derivatiza con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) [140]. Se obtienen LOD de 0,34 µg/L de glifosato y 0,18 µg/L para
58
glufosinato. Durante el proceso, no se realiza preconcentración de las muestras
obteniéndose porcentajes de recuperación de 84–101% y 90–103% respectivamente.
6.9 ELISA
El Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) es reconocido como una
herramienta valiosa en el análisis de residuos de plaguicidas y complementa los métodos
analíticos convencionales [100],[188],[189] siendo un enfoque alternativo a los
inconvenientes expuestos en otras técnicas, como el requisito de procedimientos de
derivatización, pretratamientos de muestras duras, equipos finales de alto costo y
reacciones y tiempo para analizar. ELISA proporciona pruebas de muestra rápidas y
resultados precisos y es más rentable que el análisis cromatográfico convencional.
ELISA utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la
formación de complejos antígeno-anticuerpo. Existen diversas variaciones al método de
ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso molecular (>30000 Daltons), el
marcador enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga con un ligando, que puede
ser un antígeno, un anticuerpo específico para el antígeno de interés o un anticuerpo para
el anticuerpo primario. Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en los
cuales se adsorbe un antígeno o un anticuerpo sobre un soporte sólido. Algunos de los
protocolos se basan en reacciones de enlace competitivo y otras en reacciones de enlace
no competitivo, pero en todas las pruebas ELISA se requiere de un paso de separación
para eliminar el conjugado enzimático libre antes de proceder a determinar la cantidad de
conjugado enzimático enlazado. Para lo cual se añade sustrato enzimático y se mide la
reacción catalítica entre la enzima y el sustrato.
Figura 29: Esquema prueba ELISA directa.
Por sus características catalíticas las enzimas son marcadores muy sensibles y versátiles.
Una sola proteína enzimática puede transformar en algunos minutos gran número de
moléculas de sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final,
produciendo un cambio de color amplificado y que se detecta con facilidad. En el método
59
ELISA de inhibición el cambio de color se reduce, porque la actividad enzimática se inhibe
cuando el anticuerpo se enlaza al conjugado enzimático [190].
Se ha desarrollado un proceso de análisis de glifosato en agua de rio con ELISA y HPLC
que incluye un paso de derivatización con anhídrido acético seguido de detección con
anticuerpos inmovilizados marcados con albúmina de suero de bovino (BSA) (Figura 24),
lo que permite obtener valores de LOD igual o menores a 0,6 ng/mL [188]. Los anticuerpos
marcados pueden usarse en reacciones competitivas para detectar herbicidas. El método
es selectivo y sensible para determinar glifosato y sus LOD son más bajos que los obtenidos
por técnicas cromatográficas.
Figura 30: Estructura del glifosato unido a BSA. (A=inmunógeno, B= glifosato acetilado). [188]
En contraste con las técnicas de HPLC y GC, el método analítico ELISA, es un
procedimiento sensible, rentable y eficiente para analizar muestras ambientales que
contienen glifosato [147], [188].
6.10 Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
La técnica consiste en someter los núcleos a un campo magnético externo donde estos,
absorben radiación electromagnética en el orden de las radiofrecuencias [191]. Como la
frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno químico de los núcleos, el
espectro de señales de absorción de los mismos revela una valiosa información sobre la
estructura de la molécula [192]. En RMN, la fuente de emisión es un generador de
radiofrecuencia de 10-60 MHz (longitud de onda 30-50 m) [193]. Desde su descubrimiento,
la Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se ha utilizado como técnica
60
cualitativa para la identificación y aclaración de estructuras de una enorme variedad de
materiales orgánicos, inorgánicos y biológicos.
En los espectros de 1H-RMN, 13C- RMN, 31P- RMN, las impurezas de estructura similar
pueden identificarse fácilmente en el espectro, lo que convierte a la técnica en una
alternativa muy rentable a otros métodos analíticos que requieren la adquisición de
estándares separados del analito objetivo y todas las impurezas. A su vez, la RMN es una
técnica no destructiva con una preparación mínima de la muestra que es particularmente
útil para analitos que contienen 13C, 15N, 31P y 1H [194].
Esta metodología se emplea para el análisis de glifosato, AMPA en muestras de agua de
rio previamente filtradas. Las muestras se derivatizan con ácido trifluoroacético (TFA),
anhídrido trifluoroacético (TFAA) y ortoformiato de trimetilo (TMOA). Posteriormente, los
fosfonatos volátiles producidos en la reacción se analizan usando RMN 31P, seguido de
detección por GC–CI-MS y GC–FID con una columna capilar DB-17. Los LOD para glifosato
fueron de 10 pmol por GC–CI-MS y 15 pmol por GC–FID. La recuperación promedio de
glifosato fue de 96,8 % y 97 – 97,5% para AMPA [121].
Cartigny et al, [195] realizan análisis de fluidos biológicos (orina, suero y jugo gástrico), de
tres pacientes con intoxicaciones agudas después de haber ingerido glifosato. Las muestras
se congelan inmediatamente a -20°C hasta el análisis. Para las mediciones de 1H NMR y
31P NMR se introducen 500 µL de cada muestra en un tubo capilar de 5 mm que contiene
una solución de ácido 3-trimetilsilil 2,2’,3,3’- ácido tetradeuteropropriónico (TSP-d4) y ácido
metilendifosfónico (MDP) respectivamente, que proporciona un bloqueo interno en la
frecuencia de campo para desplazamientos químicos. Posteriormente, se realizan curvas
de calibración para 1H y 31P usando concentraciones de glifosato de 0.5; 1; 2; 5; 10; 20 y
200 mmol/L. La cuantificación de glifosato se realiza mediante la integración de la señal
CH2 – P con TSP-d4 como referencia para 1H con confirmación con la señal CH2-N y MDP
para 31P. Las relaciones de área de pico de protones se representan frente a la
concentración de glifosato como se muestra a continuación en los espectros de resonancia
(Figura 31):
61
Figura 31: Espectro 1H 300.09 MHz muestra de suero. [195]
Figura 32: Espectro 1H 300.09 MHz muestra de orina. [195]
Figura 33:Espectro 1H 300.09 MHz muestra líquido gástrico.[195]
62
Figura 34: Espectro de RMN 31P (1H desacoplado) a 121,48 MHz glifosato en orina.[195]
Los espectros que aparecen en la Figuras 32, 33 y 34 de RMN 1H indican la presencia de
glifosato en suero, líquido gástrico y orina respectivamente. Las señales de dobletes
encontradas en 3,12 ppm son asignadas a los protones CH2– P de la molécula de glifosato
en las tres muestras. El valor de constante de acoplamiento (J = 12: 3 Hz) es característico
de la interacción magnética 1H – 31P. El grupo CH2– N de glifosato produjo un multiplete a
3,72 ppm. Otro doblete intenso observado a 1,28 ppm (J = 6: 6Hz) se asigna a los grupos
metilo de isopropilamina de la estructura.
Así mismo, como se evidencia en la Figura 34, el espectro de RMN 31P de orina es muy
simple. El pico a 8,77 ppm como señal de un singlete se le asigna al núcleo de fósforo de
glifosato, determinándose previamente su resonancia característica en patrones de control.
La concentración de glifosato en orina se encuentra entre 34 y 125 mmol/L, en suero entre
0,2 -1,9 mmol/L y líquido gastrico de 3,0 mmol/L.
El uso de la técnica de RMN permite confirmar la presencia de herbicida en residuos de
muestras biológicas. Estos resultados sugieren que la espectroscopía de RMN que
involucra núcleos de 1H y 31P es una herramiental util ya que genera la detección rápida y
confiable de compuestos organofosforados, proporciona un diagnóstico rápido que consta
de 10 a 20 minutos, además emplea pequeños volumenes de muestra sin ningún
tratamiento previo, permitiéndo recopilar datos cualitativos y cuantitativos específicos. La
63
limitación del análisis de RMN es que el procedimiento de cuantificación puede ser difícil
cuando se superponen varias señales.
6.11 Espectroscopía Raman
La espectroscopía Raman es una técnica de dispersión, donde se produce el efecto Raman,
es decir, la luz incidente excita las moléculas de la muestra que dispersan la luz. Mientras
que la mayoría de la luz dispersa tiene igual longitud de onda que la luz incidente, otra parte
se dispersa con una longitud de onda diferente. Esta luz dispersa inelásticamente se
denomina dispersión Raman siendo el resultado de los cambios en los movimientos
moleculares [156], [196].
Figura 35: Diagrama de Espectroscopía Raman.
La diferencia de energía entre la luz incidente (Ei) y la luz dispersa Raman (Es) es igual a la
energía involucrada en el cambio de estado vibracional de la molécula (es decir, en hacer
que la molécula vibre; Ev) siendo esta el desplazamiento Raman que se asocia a diferentes
movimientos vibracionales o rotacionales de moléculas de la muestra [197], [198]. La
molécula en particular y su entorno determinarán qué señales se van a observar. A la
representación de la intensidad frente al desplazamiento se la denomina espectro Raman
[156].
A su vez, la Espectroscopía Raman de Superficie Mejorada (SERS) es una técnica
espectroscópica sensible y selectiva para la detección y caracterización de analitos, que se
adsorben en superficies metálicas adecuadas [199]. En el proceso básico de SERS, el
analito se adsorbe sobre una superficie metálica rugosa de un metal adecuado,
generalmente plata u oro. Al excitar esta superficie con un rayo láser, se produce un cambio
64
en la polarización del analito en una dirección perpendicular a la superficie, lo que conduce
a una dispersión mejorada. La superficie rugosa requerida para la dispersión se puede
proporcionar de muchas maneras. Los métodos comunes usan partículas coloidales
agregadas, electrodos rugosos o películas metálicas delgadas depositadas en frío [196],
[200]–[202].
Lei Xu et al [203] analizan glifosato y AMPA realizando derivatizacion con ninhidrina.
Posteriormente, al derivado producido se adiciona una solución coloidal que contiene
nanoparticulas de plata y se realiza la detección por sistema UV-VIS. El producto es
detectado como se evidencia en el siguiente espectro de UV determinando su pico de
máxima absorción a 658 nm:
Figura 36: Espectro UV de derivado de glifosato. [203]
Teniendo el pico de mayor absorción a una longitud de onda de 633 nm, para el producto
de derivación que contiene glifosato, se realiza la detección por espectroscopía de
dispersión Raman mejorada en superficie (SERS):
65
Figura 37: Asignaciones de señales de glifosato en espectro RAMAN . [203].
El espectro Raman indica las señales representativas para glifosato a diferentes
concentraciones: (a) 1.0×10−3; (b) 1.0×10−4; (c) 1.0×10−5; (d) 1.0×10−6; (e) 1.0×10−7 M; (f)
blanco. Los espectros Raman se consideran como la huella digital de un compuesto, de
manera similar a la espectroscopía Infrarroja, ya que es posible encontrar modos
vibracionales en regiones determinadas representando interacciones típicas como: C-C, C-
O, C=O entre otras. En el estudio realizado se encontraron las siguientes asignaciones en
la estructura química del glifosato:
Tabla 7:Asignaciones de señales específicas de la estructura del glifosato.[203]
El límite de detección (LOD) del método para el glifosato es 1.43×10−8 M, considerándose
altamente sensible, rápido y eficiente en aplicaciones prácticas para la evaluación del
herbicida en el medio ambiente.
66
Góes et al, [196] produjeron nanopartículas de Plata por ablación con Láser Pulsada en
Líquidos (PLAL) en una solución de citrato-agua, que se usa como sustrato para la
detección de glifosato en agua. Los parámetros PLAL y la proporción de citrato utilizado
como agente estabilizante, se elige para formar una solución coloidal que permanezca
estable durante el lapso de medición cuando se agrega glifosato al coloide. Se investigan
dos principios de transducción: colorimétrico, utilizando el espectro UV-Vis que depende de
la concentración de analito, y SERS que lleva información no sólo sobre la concentración
de analito, sino también sobre la interacción entre el analito y el sustrato de plata coloidal.
Del análisis se obtienen límites de detección de 0,9 mg/L y 3,2 mg/L para glifosato con UV-
VIS y SERS respectivamente.
67
7. CONCLUSIONES
En el análisis de glifosato y AMPA por técnicas cromatográficas, es indispensable realizar
procesos limpieza, extracción y preconcentración de las muestras, así como
derivatizaciones químicas donde es posible encontrar la formación de derivados inestables
que actúan como interferentes durante el proceso. Es necesario derivatizar el herbicida para
aumentar la detectabilidad del compuesto, haciendo del método un proceso más complejo.
A pesar de que existen métodos reglamentados para el análisis de glifosato y AMPA en
agua: Método EPA 547 y AOAC “Determinación de glifosato y AMPA en agua potable
mediante inyección HPLC con derivatización post-columna y detección de Fluorescencia”,
donde su principal diferencia radica en la preparación de las muestras, estos presentan
inconvenientes. Las derivatizaciones con OPA-MERC y FMOC-Cl requieren de mayor
instrumental y pasos de tratamiento de muestras, dificultando el proceso de análisis e
incrementando el uso de reactivos químicos.
En la mayoría de los métodos analizados se hace uso de procesos cromatográficos (CG,
LC o HPLC) donde la diferencia radica en el tipo de detector que se use. Los resultados a
niveles de concentración más bajos se alcanzan usando LC/MS-MS con FMOC-Cl donde
se obtienen LOD de 0,11 µg/L para glifosato y 0,20 µg/L para AMPA o LC/ ESI/ MS-MS que
se encuentran LOQ del orden de 0,7 y 0,8 ng/L para glifosato y AMPA, respectivamente en
el análisis de aguas. En la determinación de material vegetal, los LOD mínimos hallados
son de 0,05 µg/Kg. En aire las concentraciones oscilan alrededor de 0,009 a 2,576 μg/m3
de glifosato.
En las derivatizaciones de glifosato con DMOSC, se encontraron optimizaciones de
parámetros a bajas temperaturas sin ser necesario eliminar el exceso de reactivos después
de la reacción. El procedimiento se realiza en 10 minutos a 35 °C produciéndose derivados
muy estables, así como una alta absorción con detectores convencionales de UV-VIS,
generando una cuantificación sensible y selectiva a bajo costo.
68
El glifosato es un compuesto que no contiene una estructura química compleja, pero al
tener cuatro grupos altamente polares dificulta el análisis por métodos convencionales. para
la química, sigue siendo un desafío desarrollar técnicas que arrojen resultados confiables
en tiempos cortos, teniendo en cuenta cada uno de los parámetros a analizar para que, en
el momento de realizar la operación, el método elegido sea óptimo, confiable, eficaz y no
se presenten errores en los procedimientos que pueden generar resultados inadecuados.
Así mismo, el uso de técnicas analíticas robustas que permitan la determinación de glifosato
sin pasos previos de tratamiento de las muestras implica mejoras en los procesos,
reducción en el uso de reactivos derivatizantes, solventes y costos elevados debido al
equipamiento para realizar los análisis.
El uso de nuevas técnicas como Electroforesis capilar y las pruebas ELISA son
procedimientos que se encuentran en gran auge al ser una alternativa para la detección de
glifosato, pero comparado con técnicas convencionales cromatográficas también requieren
de procesos de derivatización. La RMN y Espectroscopía RAMAN, son técnicas que arrojan
resultados confiables en poco tiempo al limitar el uso continuo de reactivos teniendo como
limitación los grandes costos en equipamiento y producción.
69
8. RECOMENDACIONES
A lo largo de esta revisión bibliográfica se evidenció que se han desarrollado metodologías
innovadoras para el análisis y detección de glifosato y AMPA. Se sugiere tener en cuenta
cada uno de los parámetros mencionados anteriormente para que los posteriores análisis
del herbicida sean eficaces.
Así mismo, se sugiere plantear técnicas que permitan realizar los análisis de glifosato a
nivel “In situ” teniendo en cuenta que el herbicida es uno de los más usados a nivel mundial,
que presenta una afectación ambiental, pero es mayor su incidencia política y social en
países latinoamericanos como Colombia.
70
9. BIBLIOGRAFIA
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and secondary amines: 9-fluorenylmethyl chloroformate,” Anal. Lett., vol. 12, no. 1,
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