mÉtodo para la extracciÓn de rna basado en el uso
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11/PRPM
MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN DE
RNA BASADO EN EL USO
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS
Dra. Capriotti [email protected]
Centro Regional de Estudios Genómicos
11/PRPM
Instituto de Física de La Plata
(IFLP)
Claudia Rodríguez Torres
Fabiana Cabrera
Silvana Stewart
Pedro Mendoza Zeliz
Elisa De Sousa
Luciana Juncal
Odín Vázquez Robaina
Instituto de Investigaciones
Fisicoquímicas Teóricas y
Aplicadas (INIFTA)
Patricia Schilardi
Carolina Diaz
Diego E. Pissinis
Centro Regional de Estudios Genómicos
(CREG)
Sheila Ons
Lucila Traverso
Natalia Capriotti
Instituto De Biotecnología Y Biología
Molecular (IBBM)
Victor Romanowski
Matías Pidre
Leticia Ferrelli
Florencia López
Leslie Amorós
Laboratorio de Salud Pública
Instituto Biológico
Hospital Rossi
Convenio Agosto 2020 – PBA
- Ministerio de Producción,
Ciencia e Innovación
Tecnológica.
- Ministerio de Salud.
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Muestra
BiológicaExtracción de
RNA
Generación de
cDNA
Amplificación
por PCR
Detección
> cc. RNA < Ct
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Métodos de extracción de RNA
• Propensión a obstruirse
• Retención de ácidos nucleicos grandes como el ADNg
• Necesidad de equipamiento costoso (centrifugas)
• Difícil de automatizar
Solventes orgánicos Fase sólida (columnas Si02)
• Residuos
• Procesamiento laborioso y manual intensivo
• Difícil de automatizar
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El objetivo del trabajo es proporcionar un protocolo de extracción de RNA
basado en perlas magnéticas de sílice de bajo costo, independiente de
equipamiento sofisticado y de producción nacional.
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Antecedentes
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- Se obtuvieron nanopartículas de magnetita (NPM, Fe3O4) por el método de co-precipitación
(IFLP)
- Se recubrieron con sílice (SiO2) por hidrólisis detetraetilortosilicato (TEOS) obteniéndose así las
“perlas magnéticas” (PEM) (INIFTA)
Gentileza Y-TEC
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Desarrollo y optimización de un protocolo de extracción (CREG-IBBM)
Buffer de Lisis: GITC + Triton
LISIS DE
LA
MUESTRA
RNA LIGADO A LAS PEM LAVADOS ELUCIÓN
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Método de
extracción RNA
Dilución 1:2 Dilución 1:4 Dilución 1:8
Trizol Reagent 19,40 21,5 26,34
Protocolo PEM
+ centrifuga
17,80 20,01 21,22
Protocolo PEM 21,69 23,46 24,08
• Muestra biológica: tejido blando de Rhodnius prolixus (3 replicas)
• Síntesis de cDNA: protocolo MML-V (Promega)
• RT-qPCR: Sybr Green y gen de referencia Rhopr_Actina
(CREG)
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Resultados
• Muestra biológica: línea celular pulmón A549. Concentración 105
• Molde RNA - dilución 1/5
• RT-qPCR: Kit MGI
1 2 3
PEM 03720 15,03 15,97 16,28
PEM 23720 15,34 15,99 15,94
PEM 24720 14,95 16,2 16,44
Columnas GeneAid 14,72
1. 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,5
2. 4M GITC, 4% TritónX100 y pH6,5
3. 2M GITC, 4% TritónX100 y pH6,5
(IBBM-CREG)
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Resultados
• Muestra biológica: hisopado bucal del operador (X 2)
• Molde RNA
• RT-qPCR: Kit BGI
H 23 H 24
PEM 23720 21,96 -----
PEM 24720 ----- 21,65
Columnas GeneAid 21,53
Buffer 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,5
(CREG)
11/PRPMResultados
Laboratorio Salud Pública (Exactas-UNLP)
Número de muestras procesadas por ambos métodos: 46.
Número de muestras DETECTABLE según columnas: 15
Número de muestras DETECTABLE según PEM-UNLP: 13 (criterio Ct <35)
Coincidencia en muestras detectables: 86.7 %.
Coincidencia en muestras no detectables: 96.8 %.
Diferencia promedio de Ct para gen control (Ct PEM-UNLP - Ct columna)= 1,9
(+/-1.1 ).
Diferencia promedio de Ct para gen ORFab (Ct ORFab PEM-UNLP - Ct ORFab
columna)= 1.2 (+/-2.4 ).
• Muestra biológica: oro y naso faríngeo sospechados de COVID
• Molde RNA
• DETECTABLE una muestra si se detecta el gen ORFab
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Conclusiones
• Las PEM funcionalizadas con SiO2 son eficientes en la extracción de RNA. Se obtienen
resultados comparables con los obtenidos con los métodos comerciales disponibles.
• El protocolo resulta útil para la extracción de RNA en distintos tipos de muestras
biológicas.
• El protocolo depende en gran medida del buffer GITC/Tritón. Variaciones en las
concentraciones, pH podrían aumentar el rendimiento y eficiencia del método.
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Muchas gracias