M O N O G R A F I AD EP R O D U C T O

NDICE

INTRODUCCIN05 BLANCO TERAPUTICO: GANGLISIDOS05 ESTRUCTURA Y LOCALIZACIN05 FUNCION DE LOS GANGLISIDOS07 PAPEL DE LOS GANGLISIDOS EN EL CNCER08 EXPRESIN DE NeuGcGM3 EN CNCER PULMONAR09 ANTICUERPOS13 ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPO14 ANTICUERPOS MONOCLONALES15 RACOTUMOMAB16 EVALUACIN DE P316 EVALUACIN DE RACOTUMOMAB17 EXPERIENCIA CLNICA24 Estudios de inmunogenicidad y toxicidad25Caracterizacin de la respuesta de anticuerpos33Mecanismo de accin34EXPERIENCIA CLNICA EN CNCER DE PULMN35 DE CLULAS NO PEQUEAS (CPCNP) SEGURIDAD Y TOLERABILIDAD41 CONCLUSIONES43 INFORMACIN PARA PRESCRIBIR VAXIRA44 BIBLIOGRAFA46

INTRODUCCIN

El cncer de pulmn contina siendo la principal causa de muerte por cncer tanto en Argentina, como en el mundo(*). Se estiman 1,6 millones de nuevos casos cada ao mundialmente, con un estimado de 1,3 millones de muertes anuales.En Estados Unidos la tasa de supervivencia global a 5 aos durante el perodo 19952001 para los pacientes con cncer de pulmn fue de 15,7%, con menores tasas en enfermedad diseminada(**).

05Durante el perodo 2002-2008 la tasa de supervivencia global a los 5 aos ascendi ligeramente hasta 15,9%.(***) Aproximadamente el 85% de los pacientes diagnosticados con cncer de pulmn son del tipo histolgico carci- noma de pulmn de clulas no pequeas: CPCNP o NSCLC (siglas en ingls). Existen dos tipos de NSCLC: 1) carcinoma de clulas no escamosas (que incluye los subtipos histolgicos: adenocarcinoma, carcinomas de clulas grandes, y otros tipos celulares); y 2) carcinoma de clulas escamosas. (****)Aproximadamente, entre el 50 y el 70 % de los pacientes se diagnostican con enfermedad avanzada locoregional o enfermedad metastsica a distancia. Por tal motivo existen escasas posibilidades teraputicas disponibles en la actualidad lo cual ha impulsado la bsqueda de nuevos agentes y nuevas combinaciones teraputicas, entre ellas la inmunoterapia.Vaxira, es un nuevo agente inmuno teraputico o vacuna teraputica cuyo principio activo es el anticuerpo mo- noclonal anti-idiotipo Racotumomab adsorbido en gel de hidrxido de aluminio como adyuvante. ste producto demostr interesantes beneficios en el tratamiento del cncer de pulmn de clulas no pequeas. Fue investigado tambin en cncer de mama y melanoma y est adems siendo estudiado en algunos tumores peditricos como neuroblastoma, retinoblastoma, sarcoma de Ewing y tumor de Wilms.En este material se describirn los puntos clave del producto que permitan comprender su mecanismo de accin y el beneficio para la sobrevida de los pacientes tratados.

* *http://globocan.iarc.fr/factsheet.asp consultada 14 de febrero 2013**http://cancer.gov/espanol/pdq/tratamiento/pulmon-celulas-no-pequenas/HealthProffesional consultada 14 de febrero 2013.***http://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#incidence-mortality consultada 28 de marzo 2013 (****) NCCN Guidelines Version 2.2013. Non Small Cell Lung Cancer.

BLANCO TERAPUTICO

LOS GANGLISIDOS ESTRUCTURA Y LOCALIZACIN

Los ganglisidos son una amplia familia estructuralmente relacionada con los glucolpidos. Fueron inicialmente su- geridos como blancos potenciales para la inmunoterapia del cncer basndose en su abundancia en ciertos tejidos tumorales al compararlo con tejidos normales.Los ganglisidos son glicoesfingolpidos que contienen cido silico en su estructura. Estas molculas estn com- puestas por una cadena ceramida (N-acil-esfingosina) con caractersticas hidrofbicas, y una parte polar compuesta por un oligosacrido lineal de hasta cuatro residuos neutros al que se encuentra unidos uno o ms residuos de cido silico. Este ltimo tiene como configuraciones ms frecuentes el cido N-acetil (NeuAc) neuramnico y el cido N-glicolil (NeuGc) neuramnico. La nica diferencia estructural entre ellos consiste en un tomo de oxgeno en la posicin C5 del NeuGc catalizado por la hidroxilasa citidina monofosfato del cido N-acetilneuramnico. Usualmente son encontrados como constituyentes terminales de diferentes glucoconjugados de membrana como el ganglisido GM3.

MONOGRAFIA DE PRODUCTO

OHOOHHONOHHHROHOH

OHOHOHOHOHOHCerO

06

RH: N-acetil GM3 OH: N-glicolil GM3

Figura 1: Esquematizacin de la estructura trisacardica del ganglisido GM3, donde se observan las ligeras dife- rencias qumicas entre las variantes Nacetil (NeuAc) y Nglicolil (NeuGc).

OHOHOOHOHOHOHCeramidaONeuGcGM3HOHOHONNeuGcGM3OHOHOHClula TumoralGlucosaHHOHGalactosaNeuGcGM3cido Silico Glicolilado (NeuGc)

Figura 2: Esquematizacin de la estructura trisacardica del ganglisido NeuGcGM3 y su expresin en clulas tumorales.

La sntesis de los ganglisidos ocurre en el retculo endoplasmtico y el aparato de Golgi. Las enzimas glicosiltrans- ferasas y sialiltransferasas catalizan la transferencia de monmeros de azcares a la molcula de ceramida.Se ha descripto recientemente que estas molculas, participan en la formacin de microdominios lipdicos de membrana (rafts de membrana) que juegan un rol protagnico en el comportamiento celular asociado a la trans- formacin maligna.

La insercin de los ganglisidos en la capa lipdica exterior de la membrana de los vertebrados contribuye a la ge- neracin de carga negativa de la superficie celular. Estas molculas mayormente se encuentran formando parte de estructuras supramoleculares ricas en colesterol con menor fluidez que el resto de la membrana, llamadas parches lipdicos.

En contraste con muchos mamferos, incluyendo los grandes simios, el ganglisido NeuGcGM3 es prcticamente indetectable en tejidos y fluidos humanos normales, ya que las clulas humanas carecen de la enzima hidroxilasa citidina monofosfato del cido N-acetilneuramnico. Es conocido que su ausencia se debe a una mutacin gentica que tiene ms de 2.5 millones de aos. 1, 2No obstante, como veremos ms adelante, el ganglisido NeuGcGM3 est altamente expresado en algunas clulas de cncer humano.

07Aunque inicialmente se sugiri que el NeuGcGM3 pudiera expresarse en tejidos humanos por una va metablica alternativa, hoy en da existe evidencia de que la presencia de cido silico N-glicolilado en el cncer humano es el resultado de la incorporacin metablica de NeuGc de la dieta debindose su incorporacin preferencial a las clulas tumorales por el metabolismo acelerado de stas.

NeuAcGM3GolgiNeuAcCMAHAluARNm CMAHGen CMAHClula NormalNeuGcGM3GolgiCMAHAluARNm CMAHGen CMAHNeuGcClula tumoral

Figura 3: Esquema de las clulas normales (con expresin de NeuAcGM3) y tumorales con expresin de NeuGcGM3 por incorporacin dietaria.

Adaptado de Clin Dev Immunol 2010;2010: 814397

La incorporacin se hara por pinocitosis, y de las vesculas seran liberadas al citosol celular por un transportador. (Bardor 2005)3La hipoxia inducira la expresin de sialina un transportador de cido silico en las clulas tumorales favoreciendo la incorporacin de cido silico del entorno.(Yin 2006).4

FUNCION DE LOS GANGLISIDOS

Se ha descripto que los ganglisidos estaran involucrados en una gran diversidad de procesos biolgicos, entre los que se destacan:

Comunicacin celular Regulacin de la respuesta inmune Regulacin de eventos relacionados con el crecimiento y la proliferacin celular.

MONOGRAFIA DE PRODUCTO

Esta diversidad de funciones de los ganglisidos estara dada por su expresin diferenciada de acuerdo al tipo de clula o a la etapa de diferenciacin en que se encuentre.5

PAPEL DE LOS GANGLISIDOS EN EL CNCER

08Ha sido demostrado que durante la transformacin oncognica ocurren cambios cuanti-cualitativos en la expresin de ganglisidos. La transformacin maligna parece activar enzimas asociadas con la glicosilacin de ganglisidos, resultando en patrones de expresin de ganglsidos alterados en las clulas tumorales.La sobreexpresin de ganglisidos ha sido relacionada con la regulacin del crecimiento celular, la tolerancia inmu- ne (o regulacin inmunolgica del microambiente tumoral), la metastatizacin y la angiognesis tumoral, lo que convierte a los ganglisidos en un blanco teraputico privilegiado para la terapia contra el cncer.5, 6El uso de anticuerpos anti-idiotpicos como vacunas para estimular la inmunidad anti-tumoral es un camino pro- metedor en la terapia del cncer. El gran reto de la inmunoterapia utilizando vacunas anti-idiotpicas es identificar el Ac anti-idiotpico ptimo que pueda funcionar como un verdadero antgeno subrogado o sustituto del sistema de antgenos asociados a tumores. NeuGcGM3 contiene todos los atributos relevantes para ser considerado un antgeno a priorizar en el desarrollo de vacunas contra el cncer. (Gmez, D. 2012)7El Dr. Cheever8 en su publicacin en Clinical Cancer Research del ao 2009, menciona al NeuGcGM3 entre los 50 antgenos que ms puntuacin obtenan en este ranking. Una revisin ms reciente (Gmez, D y col) sugiere que NeuGcGM3 pudiera estar entre los 15 primeros Ag a priorizar en el desarrollo de vacunas contra el cncer, resaltando entre sus atributos la alta inmunogenicidad y su funcin teraputica. (Ver Tabla).7, 8

CriterioSubcriterio para NeuGcGM3Puntaje Total(criterio ponderado)

Funcin teraputicaInformacin adecuada, trabajo controlado con vacuna sugestivo.0.27(0.32)

InmunogenicidadRespuesta de clulas T y anticuerpos obtenida en ensayos clnicos.0.17(0.17)

OncogenicidadIncremento de expresin correlacionada con sobrevida y enfermedad avanzada, pero necesidad de clarificar la funcin oncognica.0.03(0.15)

EspecificidadSobreexpresin en cncer con pobre o sin expresin en tejidos adultos normales.0.05(0.15)

Nivel de expresin(% de clulas positivas)Altamente expresada en la mayora de las clulas cancergenas en los pacientes designados a tratamiento.0.02(0.07)

Expresin en clulas madreExpresin en la mayora de las clulas cancerosas pero sin informacin sobre clula madre putativa.0.01(0.05)

N de pacientes con Ag+Alto nivel de expresin en la mayora de los pacientes con un tipo de tumor particular.0.04(0.04)

N de epitopes antignicosAntgenos pequeos con uno o pocos epitopes.0.01(0.04)

Localizacin celularde la expresin antignicaExpresados en la superficie celular con ausencia o pobre circulacin antignica.0.02 (0.02)

Puntaje acumulado para NeuGcGM30.62 (1.00)

Tabla 1: Caractersticas relevantes y score para el ganglisido NeuGcGM3 como antgeno tumoral de acuerdo al criterio descripto por Cheever7

El ganglisido NeuGcGM3 participa en la promocin de la proliferacin de las clulas malignas y la neoangiog- nesis tumoral.

El ganglisido acetilado inhibe la tirosina quinasa del EGFR. Se ha comprobado que esta accin inhibitoria est debilitada en tejidos de CPCNP con alta expresin de ganglisido glicolilado (NeuGcGM3), favoreciendo un am- biente en el que el tumor puede proliferar. 9

MONOGRAFIA DE PRODUCTO EGF (ng)10GM3 (NeuAc)_GM3 (NeuGc)_

100__

10100++__

10100__++

Anti-PY20

Anti-EGFR

Fosforilacin (% de control)100

80

60

40

20

0

250KDa

09150KDa

250KDa

150KDa

Figura 4: Inhibicin in vitro de la de fosforilacin de NeuGc y NeuAc mediada por el receptor de factor de crecimiento epidrmico (EGFR).

EXPRESIN DE NeuGcGM3 EN CNCER DE PULMN

Para evaluar la expresin de NeuGcGM3 en cncer pulmonar se utiliz el anticuerpo monoclonal murino 14F7. ste fue obtenido como respuesta a la inmunizacin de ratones con ganglisidos purificados. Su reactividad se focaliza en el ganglisido NeuGcGM3 por lo que se convierte as en una herramienta de deteccin para este gan- glisido por inmunohistoqumica (IHQ). La tcnica empleada utiliza una concentracin de 20 g/ml de 14F7, suero inmune anti-IgG biotinilado, un kit comercial basado en estreptavidina-peroxidasa (Dako) y Diaminobenzi- dina (DAB) como sustrato de la peroxidasa que pone en evidencia la inmunoreactividad del anticuerpo primario desarrollando una coloracin marrn en la muestra. Secciones de 5 m de espesor de carcinomas pulmonares de diferentes tipos histolgicos fijados en formalina y embebidos en parafina fueron obtenidas de archivos hospitala- rios como material para realizar las determinaciones.Un panel de diferentes tipos histolgicos de muestras de adenocarcinomas pulmonares fue analizado encontrando una conspicua reactividad tanto para los adenocarcinomas como para los carcinomas escamosos. La mayora de las muestras de pulmn desarrollaron una especfica marca de membrana plasmtica usando el anticuerpo anti- NeuGcGM3 14F7. Aunque la reactividad se asoci con la membrana plasmtica tambin fue encontrada una tincin difusa citoplasmtica (Figuras 5A y 5B).Es interesante destacar que muestras de carcinoma escamoso mostraron una marca especfica de membrana de asociada a la presencia de NeuGcGM3 (Figura 5C).

10 A B C

Figura 5: Tincin por inmunohistoqumica de muestras de CPCNP utilizando el anticuerpo especfico anti-Neu- GcGM3. A y B: adenocarcinomas pulmonares; C: carcinoma escamoso. X400.Adems se evaluaron a travs de la misma tcnica, muestras de metstasis alojadas en pulmn de cncer de mama y endometrio. En ellas se encontr una marcada reactividad del anticuerpo 14F7 (Figuras 6A y 6B).

A B

Figura 6. Tincin por inmunohistoqumica de metstasis en pulmn utilizando el anticuerpo especfico anti- NeuGcGM3. A: cncer metasttico de mama; B: cncer metasttico de endometrio. X400.La expresin de ganglisidos en las muestras fue evaluada tambin utilizando el anticuerpo P3, un anticuerpo mo- noclonal murino de isotipo IgM que reconoce varios tipos de ganglisidos N-glicolilados, incluyendo el NeuGc GM3 adems de algunos tipos de sulftidos. Los datos mostraron una clara reactividad del anticuerpo sobre todas las muestras analizadas, aunque la especificidad de este anticuerpo es menor.

Recientemente, una publicacin de la revista Cancer Science del 2013 de un grupo de investigadores japoneses con- firma la gran expresin de ganglisidos NeuGc en CPCNP10. Este grupo evalu a 93 pacientes con cncer de pul- mn de clulas no pequeas, y el 93,5% (83) de ellos presentaron ganglisidos Neu-Gc, incluyendo el NeuGcGM3.

11

Figura 7: Expresin de ganglisido en cncer de pulmn de clulas no pequeas. A- Expresin positiva de ganglisido glicolilado con GMR8.B- Expresin negativa de ganglisido glicolilado con GMR8.C- Expresin positiva de ganglisido glicolilado con GMR8 (Distinta muestra a la A)D- Expresin negativa de ganglisido glicolilado con CMR8, luego de remocin de componentes lipdicos incuba- dos con solucin de cloroformo-metanol (2:1).

Estos mismos autores demostraron por primera vez la relacin entre la alta expresin de NeuGcGM3 y la super- vivencia libre de progresin. Los pacientes con mayor expresin del ganglisido tuvieron una menor supervivencia libre de progresin que los que tenan menor expresin (47.5 m vs 57.4 m). Estos datos hablan a favor de la onco- genicidad del NeuGcGM3 y por tanto de la importancia del bloqueo de este efecto mediante el uso de Vaxira.10

Baja expresin de ganglisido glicoliladoMediana de sobrevida 57,4 meses Alta expresin de ganglisido glicolilado Mediana de sobrevida 47,5 mesesLog rank P