i d l bl ió di d l bl ió dMonitoreo de la población de Monitoreo de la población de DiaphorinaDiaphorina citricitri y prevencióny prevenciónDiaphorinaDiaphorina citricitri y prevención y prevención

del Huanglongbing en del Huanglongbing en ArgentinaArgentina

Lic. María Inés Plata TamayoLic. María Inés Plata TamayoINTAINTA--EEA ConcordiaEEA ConcordiaSeptiembre de 2011Septiembre de 2011

Zonas citrícolasZonas citrícolas

Jujuy MisionesNOA

Salta

T áCorrientesNEA

TucumánEntre Ríos

Buenos Aires

ARGENTINAARGENTINA

Regiones citrícolasRegiones citrícolas

Noroeste Argentino Noroeste Argentino (NOA):(NOA):

Noreste Argentino Noreste Argentino (NEA):(NEA):

(NOA):(NOA):

LimonesLimones

P lP l (NEA):(NEA):

NaranjasNaranjas

PomelosPomelos

MandarinasMandarinas

Producción Argentina en 2010Producción Argentina en 2010

Total: 2.6 millones de toneladasTotal: 2.6 millones de toneladas

Limón43%

Mandarina 17%

Pomelo 43%

17%

Naranja 33%

FuenteFuente: Federcitrus, 2011Federcitrus, 2011

ArgentinaArgentina

El Programa Nacional de Prevención de HLB fue creado el13 de agosto del 2009 por la Resolución SAGPyA 517/09:13 de agosto del 2009 por la Resolución SAGPyA 517/09:

Participantes del programa:Participantes del programa:

Sector privado (CECNEA, AFINOA)d ó ( ) Institutos de Investigación (EEAOC, INTA)

Organismos de Fiscalización (SENASA, INASE) Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pescag , y

Componentes del Programa Nacional de Prevención deComponentes del Programa Nacional de Prevención deHLB:

Fiscalización Vigilancia Fitosanitaria Investigación y desarrollo Investigación y desarrollo Capacitación y difusión Coordinación y seguimiento

Fiscalización:Fortalecimiento de fronteras y puntos de ingreso.Control de materiales de propagación (200 variedades libresControl de materiales de propagación (200 variedades libresde enfermedades), registro de viveros, inspección de laproducción y comercialización de plantas cítricas.Eliminación de hospederos alternativos y control de arbolado

urbano.Plan de contingencia y atención de emergencias.Plan de contingencia y atención de emergencias.

Vigilancia Fitosanitaria: Monitoreo, seguimiento, registro de ocurrencia y toma de

muestras de Diaphorina citri (detectado en 1984)muestras de Diaphorina citri (detectado en 1984).Monitoreo de plantaciones comerciales y urbanas, con toma

de muestras de material vegetal con sintomatologíahsospechosa.

Colocación de una Red de trampeo en las zonas de ausenciade Diaphorina citri para la detección del insecto. p p

Asignación de los Sitios de Monitoreo:Se determinaron las áreas de producción de cítricos a monitorear en todo el país.

Ubicación de lotes de cultivo y otras áreas de riesgoParaguay

Brasil

Uruguay

Cuadrícula: 1000 has

Generación de una grilla regular y asignación de sitios de monitoreo

Subcuadrículas: 111 has

g

BOLIVIABOLIVIAProvincia de Entre Ríos

PARAGUAYPARAGUAY

URUGUAYURUGUAY

CH

ILE

CH

ILE

54 Km de 54 Km de AnchoAncho3030°° 31’ S 31’ S Presencia de DcPresencia de Dc

itud

itud

5757°°48’ O48’ O

Ausencia de DcAusencia de Dc

Km

K

m L

ong

Long

5757 48 O48 O

A tiA ti

195

195

OO

ArgentinaArgentina

5858°°17’ O17’ O R. O. del UruguayR. O. del Uruguay

3131°° 49’ S49’ S

Captura de Diaphorina citri con el aspirador

Acondicionamiento de laAcondicionamiento de la muestra

Se toman las coordenadas con GPS

Usuario:

Clave:Clave:

Carga de información al sistema informático del SENASA

Ingresar

Investigación y Desarrollo:

Diagnóstico:Diagnóstico:Con la técnica de PCR en Tiempo Real:

(1) Laboratorio Vegetal del SENASA - Capital Federal, Buenos Aires(2) INTA-EEA Concordia Entre Ríos(2) INTA EEA Concordia, Entre Ríos (3) INTA-EEA Bella Vista, Corrientes(5) INTA-EECT Yuto, Jujuy(6) Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres, San ( ) p g p ,

Miguel de Tucumán, Tucumán

Técnica de PCR en Tiempo Real:

(1) L b t i V t l d l SENASA(1) Laboratorio Vegetal del SENASA, Bs. As.

(2) INTA-EEA Concordia, Entre Ríos(3) INTA-EEA Bella Vista Corrientes(3) INTA-EEA Bella Vista, Corrientes(5) INTA-EECT Yuto, Jujuy(6) EEAOC, San Miguel de Tucumán,

TucumánTucumán

Técnica de PCR Convencional:

(1) Laboratorio del INASE, Bs. As.(4) INTA-EEA Montecarlo, Misiones

Secuenciación de ADN:

(7) Laboratorio INTA-IFFIVE(7) Laboratorio INTA-IFFIVE, Córdoba, Córdoba

En países sin HLB pero con la presencia del En países sin HLB pero con la presencia del vector (vector (D. citriD. citri) se recomienda el análisis por ) se recomienda el análisis por (( ) p) pPCR en tiempo real (qPCR o cuantitativa).PCR en tiempo real (qPCR o cuantitativa).

Es posible detectar la bacteria en los psílidos 1 a 2 Es posible detectar la bacteria en los psílidos 1 a 2 años antes que la planta muestre síntomas.años antes que la planta muestre síntomas.

La alta sensibilidad de la qPCR permite detectar la La alta sensibilidad de la qPCR permite detectar la presencia depresencia de CaCa Liberibacter asiaticus (Liberibacter asiaticus (LasLas) y) y CaCapresencia de presencia de Ca.Ca. Liberibacter asiaticus (Liberibacter asiaticus (LasLas) y ) y Ca. Ca. Liberibacter americanus Liberibacter americanus (Lam)(Lam) en un solo insecto en un solo insecto adulto o en cinco ninfas.adulto o en cinco ninfas.adulto o en cinco ninfas.adulto o en cinco ninfas.

JPRB-2007EEA CONCORDIA

PCR en Tiempo Real o cuantitativa (qPCR)PCR en Tiempo Real o cuantitativa (qPCR)

Los productos son analizados a medida queLos productos son analizados a medida que Los productos son analizados a medida que Los productos son analizados a medida que se obtienen. se obtienen.

No hay manipulación postNo hay manipulación post--PCR (reducePCR (reduce No hay manipulación postNo hay manipulación post PCR (reduce PCR (reduce problemas de contaminación).problemas de contaminación).

Alta sensibilidad.Alta sensibilidad.

1. Recepción y registro de muestras1. Recepción y registro de muestras

S i ú i t d l l b t iS i ú i t d l l b t iSe asigna un número interno del laboratorioSe asigna un número interno del laboratorio

Cada muestra es registrada en una planilla.Cada muestra es registrada en una planilla.

Laboratorio de Protección Vegetal yLaboratorio de Protección Vegetal yLaboratorio de Protección Vegetal y Laboratorio de Protección Vegetal y Biotecnología Biotecnología -- INTAINTA--EEA ConcordiaEEA Concordia

2. Extracción del ADN 2. Extracción del ADN a Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papela Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papela. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel a. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel

de filtro.de filtro.b Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab. Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab. Pasar psílidos a tubos con tapa a roscac. Molerlos en homogenizador + proteinasa K.c. Molerlos en homogenizador + proteinasa K.d Dejar actuar durante 2d Dejar actuar durante 2 3 hs en baño de María3 hs en baño de Maríad. Dejar actuar durante 2d. Dejar actuar durante 2--3 hs en baño de María 3 hs en baño de María

(50ºC) (50ºC) e Extracción con fenol/cloroformo/alcohole Extracción con fenol/cloroformo/alcohole. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol e. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol --

recuperar la fase acuosa (superior).recuperar la fase acuosa (superior).f Extracción con cloroformo/alcoholf Extracción con cloroformo/alcohol -- recuperar larecuperar laf. Extracción con cloroformo/alcohol f. Extracción con cloroformo/alcohol -- recuperar la recuperar la

fase acuosa (superior).fase acuosa (superior).g Precipitar ADN con etanol heladog Precipitar ADN con etanol heladog. Precipitar ADN con etanol helado. g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.

2. Extracción del ADN 2. Extracción del ADN a Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papela Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papela. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel a. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel

de filtro.de filtro.b Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab. Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab. Pasar psílidos a tubos con tapa a roscac. Molerlos en homogenizador + proteinasa K.c. Molerlos en homogenizador + proteinasa K.d Dejar actuar durante 2d Dejar actuar durante 2 3 hs en baño de María3 hs en baño de Maríad. Dejar actuar durante 2d. Dejar actuar durante 2--3 hs en baño de María 3 hs en baño de María

(50ºC) (50ºC) e Extracción con fenol/cloroformo/alcohole Extracción con fenol/cloroformo/alcohole. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol e. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol --

recuperar la fase acuosa (superior).recuperar la fase acuosa (superior).f Extracción con cloroformo/alcoholf Extracción con cloroformo/alcohol -- recuperar larecuperar laf. Extracción con cloroformo/alcohol f. Extracción con cloroformo/alcohol -- recuperar la recuperar la

fase acuosa (superior).fase acuosa (superior).g Precipitar ADN con etanol heladog Precipitar ADN con etanol heladog. Precipitar ADN con etanol helado. g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.

2. Extracción del ADN 2. Extracción del ADN a Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papela Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papela. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel a. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel

de filtro.de filtro.b Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab. Pasar psílidos a tubos con tapa a roscab. Pasar psílidos a tubos con tapa a roscac. Molerlos en homogenizador + proteinasa K.c. Molerlos en homogenizador + proteinasa K.d Dejar actuar durante 2d Dejar actuar durante 2 3 hs en baño de María3 hs en baño de Maríad. Dejar actuar durante 2d. Dejar actuar durante 2--3 hs en baño de María 3 hs en baño de María

(50ºC) (50ºC) e Extracción con fenol/cloroformo/alcohole Extracción con fenol/cloroformo/alcohole. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol e. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol --

recuperar la fase acuosa (superior).recuperar la fase acuosa (superior).f Extracción con cloroformo/alcoholf Extracción con cloroformo/alcohol -- recuperar larecuperar laf. Extracción con cloroformo/alcohol f. Extracción con cloroformo/alcohol -- recuperar la recuperar la

fase acuosa (superior).fase acuosa (superior).g Precipitar ADN con etanol heladog Precipitar ADN con etanol heladog. Precipitar ADN con etanol helado. g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.

2. Extracción del ADN 2. Extracción del ADN g Precipitar ADN con etanol heladog Precipitar ADN con etanol heladog. Precipitar ADN con etanol helado. g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.i Resuspender ADN en tampón correspondientei Resuspender ADN en tampón correspondientei. Resuspender ADN en tampón correspondiente.i. Resuspender ADN en tampón correspondiente.i. Calentar a 65ºC en baño de María para i. Calentar a 65ºC en baño de María para

desnaturalizar DNAsasdesnaturalizar DNAsasdesnaturalizar DNAsas.desnaturalizar DNAsas.j. Almacenar a j. Almacenar a --20ºC.20ºC.

2. Extracción del ADN 2. Extracción del ADN g Precipitar ADN con etanol heladog Precipitar ADN con etanol heladog. Precipitar ADN con etanol helado. g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.i Resuspender ADN en tampón correspondientei Resuspender ADN en tampón correspondientei. Resuspender ADN en tampón correspondiente.i. Resuspender ADN en tampón correspondiente.j. Colocar a 65ºC en baño de María para j. Colocar a 65ºC en baño de María para

desnaturalizar DNAsasdesnaturalizar DNAsasdesnaturalizar DNAsas.desnaturalizar DNAsas.k. Almacenar a k. Almacenar a --20ºC.20ºC.

Muestras de ADN para Muestras de ADN para analizar por qPCRanalizar por qPCR

11 P ó t lP ó t l

qPCR:qPCR:

1.1. Preparar cóctel.Preparar cóctel.2.2. Agregar cóctel y Agregar cóctel y molde molde (muestra de ADN) a (muestra de ADN) a

cada tubito de la placa. Incluir testigos (+) y cada tubito de la placa. Incluir testigos (+) y ((--).).

3.3. Colocar placa en Termociclador y programar.Colocar placa en Termociclador y programar.4.4. Al cabo de 1h y 30 min se obtienen losAl cabo de 1h y 30 min se obtienen los4.4. Al cabo de 1h y 30 min se obtienen los Al cabo de 1h y 30 min se obtienen los

resultados.resultados.55 Analizar resultadosAnalizar resultados5.5. Analizar resultados.Analizar resultados.6.6. Informar resultados.Informar resultados.

qPCR:qPCR:

FAMFAM

HEXHEX

Gráficos de amplificaciónGráficos de amplificación. Sonda FAM: Sonda FAM: detección de ADN de detección de ADN de Ca.Ca. Liberibacter Liberibacter asiaticus/americanus. Sonda HEX: asiaticus/americanus. Sonda HEX: detección del ADN del psílido (control detección del ADN del psílido (control interno).interno).

Los resultados obtenidos se cargan online Los resultados obtenidos se cargan online

Cantidad de muestras y sitios monitoreados por provincia al 30 de Julio de 2011.

Nº de SitiosNº de Monitoreos Nº de Muestras Nº de Muestras

de MaterialProvincia N de Sitios Monitoreados

Monitoreos sin toma de muestra

de D. citrianalizadas

de Material Vegetal analizadas

Las/Lam (+)

Buenos Aires 681 681 0 0 0ue os es 68 68 0 0

Catamarca 268 268 0 0 0

Chaco 1042 1033 9 0 0

Corrientes 934 704 110 6 0

Entre Ríos 3450 1355 1085 13 0

Formosa 808 758 33 0 0Formosa 808 758 33 0 0

Jujuy 7522 2854 3544 83 0

Misiones 2373 2307 36 1 0

Salta 5136 2960 1236 301 0

Santiago del Estero 19 19 0 0 0

Tucumán 1357 1357 0 0 0

Totales 25590 14296 6039 404 0

Resumen de avance del Monitoreo al 30 de Julio del 2011

Actualmente, se han realizado más de 25500 monitoreos en todo el país. , p

Distribución del monitoreo de Diaphorina citri en plantaciones citrícolas

En el 56% de los sitios monitoreados no se detectó l i d D it i

En el 43% de los sitios d d ó l

la presencia de D. citri.

monitoreados se detectó la presencia de D. citri y se llevó a cabo la toma de muestras.

A la fecha, no se han registrado resultados positivos en las muestraspositivos en las muestras analizadas.

Investigación y Desarrollo:

Dinámica Poblacional de Diaphorina citri Control Químico de Diaphorina citri y sus consecuencias de

residuos. Control Biológico de Diaphorina citri

Tamarixia radiata (Waterston)Tamarixia radiata (Waterston)

Capacitación y difusión:

Para difundir la problemática y prevenir el ingreso de la enfermedad se hanPara difundir la problemática y prevenir el ingreso de la enfermedad se han realizado talleres de capacitación a personal de frontera y control de rutas.

1º (2009) y 2º (2011) Taller Sudamericano sobre prevención y mitigación ( ) y ( ) p y gde HLB con representantes de Argentina, Brasil, Chile, Paraguay, Perú, Uruguay y EEUU.

Capacitación al personal del programa en las distintas áreas.

Herramientas de Difusión y Capacitación:

Material Gráfico: Folletería para el público en general Folletería para el público en general Folletos técnicos Cartelería

Herramientas de Difusión y Capacitación:

Material Audiovisual:Material Audiovisual: Video institucional Micros radiales y entrevistas

con expertoscon expertos

Agradecimientos:Ing. Agr. Yanina Outi (SENASA) - youti@senasa.gov.ar

I A R P bl Fl (SENASA)Ing. Agr. R. Pablo Flores (SENASA) - rflores@senasa.gov.ar

Ing. Agr. Federico Aguirre (SENASA) - faguirre@senasa.gov.ar

Muchas graciasMuchas graciasgg

Lic. María Inés Plata TamayoLic. María Inés Plata Tamayomiplata@correo.inta.gov.armiplata@correo.inta.gov.ar