modulo sobre metodos espectrofotometricos - analisis farmaceuticos ii

Universidad de Panamá Facultad de Farmacia

Departamento de Química Medicinal y Farmacognosia

Análisis fArmAcéuticos ii fAr 310

Profesor

Goy E. Navas, PhD

Objetivos

Prof. Dr. Goy E. Navas 2

• Reconocer las ventajas y desventajas que plantean los métodos espectrofotométricos para el análisis de los productos farmacéuticos

• Comprender las bases teóricas que rigen el fenómeno de absorción y su aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo de medicamentos

• Reconocer los fundamentos de las técnicas espectrofotométricas aplicadas en las especificaciones de calidad contenidas en las farmacopeas con valor legal en Panamá

• Comprender las técnicas cromatográficas aplicables al análisis cualitativo y cuantitativo

• Reconocer los principios básicos y las aplicaciones de las técnicas de refractometría, electroforesis y absorción atómica en el análisis de medicamentos

Temario

1. Introducción al tema de análisis espectrofotométrico – Principios y fundamentos

2. El espectro electromagnéticos 3. Instrumentación utilizada en espectroscopía (en Laboratorio) 4. Leyes fundamentales aplicadas a espectroscopía – Fundamentos 5. Leyes fundamentales aplicadas a espectroscopía – Aplicaciones 6. Leyes fundamentales aplicadas a espectroscopía – Transiciones 7. Leyes fundamentales aplicadas a espectroscopía – Procesos de

relajamiento – absorción y grupos funcionales de las estructuras 8. El espectro de absorción – características 9. Grupos que absorben en la región UV-Vis 10. Región visible del espectro electromagnético 11. Análisis basado en la fluorescencia 12. Región infrarroja del espectro 13. Fundamentos de la cromatografía 14. Fundamentos de la refractometría, electroforésis y absorción

atómica


Análisis espectrofotométrico de medicamentos

4 Prof. Dr. Goy E. Navas

FUNDAMENTOS

• Los métodos espectrofotométricos y particularmente en la REGION ULTRAVIOLETA han sido los métodos más usados en las farmacopeas

• En la REGIÓN VISIBLE, también han sido un método de elección

• Se basan en la interacción de una sustancia química con la energía radiante

• Esta energía puede estar en la forma de – LUZ ULTRAVIOLETA

– LUZ VISIBLE

– LUZ INFRARROJA

– RAYOS X

– ETC

• El efecto de esta interacción es la absorción de UNA parte de la energía incidente por parte de la sustancia que se irradia

• Conociendo la energía que incide sobre la muestra y la energía que se transmite de la muestra se calcula la cantidad absorbida por la sustancia química presente en la muestra


Ventajas y Desventajas Análisis espectrofotométrico

VENTAJAS

• Fácil de usar

• Confiabilidad

• Exactitud y precisión razonables

• Mayor sensibilidad que los métodos antes estudiados en Química Analítica (volumétricos y gravimétricos) (impacto)

• Nos permite trabajar a menores rangos de concentración (impacto): – Métodos gravimétricos: 0.1 mg/mL

– Métodos volumétricos: 0.1 mg/mL

– Métodos espectrofotométricos: 0.01 – 0.001 mg/mL

DESVENTAJAS – No son específicos: no pueden distinguir entre sustancias análogas

– Requieren de comparación con una sustancia de referencia: las respuesta de una muestra de concentración desconocida se compara con la respuesta de una muestra de concentración conocida

• La exactitud de un análisis depende de la pureza de la solución de la sustancia química de referencia y la exactitud con que se prepara


Naturaleza de la energía radiante

• La energía radiante (ER) se define como la energía electromagnética o como radiación electromagnética

• ¿Cómo se genera la energía radiante? – Por efecto del calor sobre una sustancia

– Por descarga electrónica

– Combinación de ambas

• Dualidad de la naturaleza de la energía radiante por su capacidad de ser absorbida y emitida – Como partícula (paquetes de energía)

– Como onda

• La ER se puede definir como un campo electromagnético oscilante que viaja a través del espacio, con movimientos como una onda y también como un haz de partículas (llamadas fotones), a la velocidad de la luz

• La característica principal de esta energía es que se puede propagar en el vacío, sin necesidad de soporte material alguno. Ej.: La energía que proporciona el Sol y que nos llega a la Tierra en forma de luz y calor


Ondas electromagnéticas


La frecuencia (ʋ) (# de ciclos por intervalo de tiempo) y la longitud de onda (ʎ) se relacionan por la velocidad de la luz; La frecuencia y la longitud de onda son inversamente proporcionales: ʋ x ʎ = c y ʋ = c / ʎ

• En espectroscopía, la energía en la región visible y ultravioleta del espectro electromagnético se mide en nanómetros (nm) (una billonésima parte del metro) – La frecuencia se mide en Hercios y la unidades son ciclos por segundo (cps)

• En espectroscopía de la región infrarroja la frecuencia se mide en número de onda, con unidades en cm-1 ; número de onda = 107 / ʎ (nm) para que los números sean más pequeños

• En espectroscopía, cuando se habla de ENERGÍA pareciera implicar que a medida que un haz de luz sea más intenso debería contener más ENERGÍA……. Falso!

• Cuando se habla de energía de la radiación, se refieren a la energía de un solo fotón u onda

• La intensidad de la radiación se mide por el número de fotones u ondas presentes en los haces de luz, lo cual a su vez se relaciona con el PODER (P) de los haces y no con la Energía


• Por lo tanto, la cantidad de energía presente en cualquier onda electromagnética depende de la FRECUENCIA de la radiación y NO de la INTENSIDAD

• Mientras MAYOR sea la FRECUENCIA de una radiación, MAYOR será el contenido energético de la misma; relación de proporcionalidad directa

E = h ʋ (1)

• Igualmente se esperaría una relación inversa entre la ENERGÍA y la LONGITUD DE ONDA

E = hc / ʎ (2)

• Combinando las ecuaciones anteriores (1) y (2) llegamos a un enunciado general

La energía de cualquier onda electromagnética AUMENTA cuando aumenta la FRECUENCIA y DISMINUYE cuando aumenta la LONGITUD DE ONDA



+ FRECUENCIA - ENERGÍA

- LONGITUD DE ONDA +

Formas de energía


La energía térmica


La energía eléctrica


La energía radiante


Fundamentos

• Todos los métodos espectrofotométricos están basados en la interacción de una sustancia química con la energía radiante

• La energía radiante puede estar en la forma de luz ultravioleta (UV) o luz visible (VIS), luz infrarroja, rayos X, ondas de radio

• El resultado de esta interacción en la mayoría de los casos es la absorción de energía por parte de la sustancia química que está siendo irradiada

• Al medir la cantidad de energía que pasa a través de la muestra irradiada podemos determinar por diferencia la cantidad de muestra (sustancia química) presente que ha interaccionado con la energía radiante y que ha absorbido dicha energía


E0 E

• La espectrofotometría se basa en la relación que existe entre la magnitud de la radiación absorbida y la cantidad de sustancia que irradiada

• Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida

• Como consecuencia, la intensidad del rayo de luz se ve atenuada desde Eo a E, siendo Eo la intensidad de la luz incidente y E la intensidad del rayo de luz transmitida; atenuación depende además del espesor del cuerpo absorbente

• Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase líquida (o en disolución), sólida o gaseosa

• En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una disolución

• Los análisis en la región infrarroja, la muestra puede estar en fase gaseosa, en solución líquida, en solución sólido-sólido (cristales), en suspensión oleosa


El espectro de absorción

• El espectro de absorción es una curva que muestra la cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda de una porción del espectro electromagnético; es decir a una determinada longitud de onda de la energía radiante

• Cada sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto

• El espectro de absorción de dos sustancias diferentes; cada sustancia tiene su propio espectro de absorción


Leyes de absorción de la luz

• El fenómeno de la absorción de la luz

• ¿Qué sucede al hacer incidir un haz de energía monocromática (es decir, un haz de energía de solamente un estrecho rango de longitudes de onda) sobre una superficie absorbente?

• Si se corrige la Pr, se observa una relación entre Po y Pt


• La cantidad de Poder transmitido por un medio homogéneo es proporcional a la cantidad de Poder que se hace incidir sobre dicho medio

• La ENERGÍA transmitida por el medio será siempre una fraccíón de la Energía total incidente. Esta fracción se denomina Transmitancia

• La Transmitancia mantiene un valor constante para una sustancia determinada, cuando el espesor del medio absorbente y la longitud de onda de la energía permanecen constante; por ejemplo, T siempre será igual a 2, a un cierto espesor y longitud de onda. Al variar cualquiera de estos valores T dejará de ser igual a 2.


¿Qué sucede con la Transmitancia cuando se aumenta el espesor del material absorbente?


El comportamiento de la energía electromagnética de acuerdo a la ley de Bourger. Al graficar T vs espesor se produce una curva de decaimiento exponencial

Al graficar el Log T vs el espesor, se produce una curva lineal

Relación entre Transmitancia y Absorbancia


La Absorbancia es directamente proporcional al espesor del medio absorbente

Ley de Beer


• La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente la CONCENTRACIÓN de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo

• En forma análoga llegamos visualizar la relación entre P y Po . Pero esta vez la variable es la concentración c en vez del espesor b.

• Llegaremos a una ecuación similar donde -log T = a c = Absorbancia

• Por lo tanto: A = a c , según la Ley de Beer

• Las leyes combinadas dan lugar a la ley conocida como Ley de Lambert y Beer o Ley de Bourger-Beer A = a b c la cual enuncia que la Absorbancia es directamente proporcional al espesor del medio (b) y a la concentración(c)

Definición de Absorbancia y Transmitancia

• Transmitancia (T) : Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.

T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P / P0

• Absorbancia(A) : Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la Transmitancia (T)

A = - log T = 2 – log %T

A = a b c

• Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la concentración, donde a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la concentración c está expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b en centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar (ξ); Luego A = ξ b c


Mediciones de transmitancia y absorbancia

• Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación entre la muestra problema y un estándar arbitrario o referencia.

• Como la referencia debe poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero


Selección de la longitud de onda de trabajo • La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud

de onda en la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y recibe la denominación de Lambda máximo (λmax).

• Para seleccionar el λmax, se hace un espectro de absorción o curva espectral la cual consiste en una gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de concentración adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el λmax

• Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente y así tener mayor sensibilidad y precisión al hacer las mediciones



λ1 Abs Conc

A1 C1

A2 C2

A3 C3

C1 Abs λmax

A1 λ1

A2 λ2

A3 λ3

ε1 >ε3>ε2

ε1>ε3>ε2

Curva de calibración

• Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una muestra problema, es el método de la curva de calibración.

• Esta curva de calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max)


• Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta dicha recta a través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentración de un analito.

• La siguiente ecuación matemática corresponde a dicha función:

A = mc + n A = a b c

• Donde A = absorbancia; m = pendiente de la curva, que corresponde al producto entre la absortividad de la muestra (a) y el espesor (b) de la cubeta o celda; n es el intercepto de la curva con el eje de las Y;

• Luego se mide la absorbancia de la solución problema y se interpola su valor en la gráfica o se reemplaza en la ecuación anterior, para obtener el valor de concentración del analito

• La concentración de la solución problema debe estar comprendida en el rango de concentración que comprende la curva de calibración.


• Si la concentración de la solución problema es menor que la concentración del estándar más diluido, debe usarse el método de adición estándar, que consiste en adicionar un volumen determinado de un estándar concentrado a la solución problema, antes de realizar la lectura y que permite que esta lectura este dentro de las obtenidas para la curva de calibración. En el caso contrario, si la concentración del analito es mayor que la concentración del estándar más concentrado la solución problema deberá ser diluida.

• La medición de la absorbancia de la solución problema debe hacerse a la misma longitud de onda que fue hecha la curva de calibración


Am

Cmuestra

A muestra

Razón de la absorbancias • Cuando se usa este método para realizar un análisis cuantitativo, no es

necesario graficar una curva de calibración.

• Se debe asumir que existe una relación lineal entre la Abs y la concentración para hacer un buen uso de esta aproximación

• La siguiente es la aproximación que se debe usar: – Para el patrón:

Ap = apbpCp

– Para la muestra de concentración desconocida:

Ad = adbdCd

– Dado que ap = ad y el espesor de la celda es igual bp = bd ,

– Entonces [Ad / Cd ]= [Ap / Cp ] y por lo tanto

Cd = [Ad/Ap] Cp Por esta vía también se puede usar esta ecuación para averiguar la

concentración de una solución cuya concentración se desconoce, siempre y cuando se conozca la concentración de la solución que contiene la sustancia patrón y la absorbancia de ambas soluciones.


La razón de las absorbancias como prueba de identidad y pureza

• Si corremos el espectro de dos soluciones de dos sustancias que se quiere determinar si son idénticas o si su pureza es aceptable, podemos comparar la razón de los valores de las absorbancias a las mismas dos longitudes de onda; siempre y cuando el espesor de la celda sea igual y también la concentración sea la misma en ambas soluciones.

• Si la razón de las absorbancias coincide entonces se trata de la misma sustancia. Si lo que se quiere es demostrar su pureza entonces se compara la razón de las absorbancias de una sustancia patrón con la razón de las absorbancias de la sustancia problema.


A1 / A2 = a1 / a2 = constante Dos sustancias diferentes no poseen los mismos valores de las razones de absorbancia, medidas bajo las mismas condiciones

Sustancia patrón

Espectroscopía de Absorción UV-Vis

• Muchas moléculas absorben luz visible o ultravioleta.

• La absorbancia de una solución aumenta cuando la atenuación del haz aumenta.

• La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del paso óptico, b, y la concentración, c, de las especies absorbentes.

• La Ley de Beer establece que A = εbc, donde ε es una constante de proporcionalidad, llamada absortividad molar

• Muchas moléculas absorben radiación a longitudes de onda diferentes.

• Un espectro de absorción mostrará un número de bandas de absorción correspondientes a grupos estructurales o funcionales que están dentro de la molécula.

• Por ejemplo, la absorción que se observa en la región UV para el grupo carbonilo en la acetona es de la misma longitud de onda que la absorción del grupo carbonilo en la dietilcetona. Y por qué? Porque en ambos caso el grupo funcional responsable de la absorción es el mismo; el grupo carbonilo.


• Cuando un fotón de energía radiante es absorbido por una molécula en su estado “basal”, se aumenta el contenido energético de la molécula en una cantidad equivalente al contenido energético del fotón.

• En este momento se dice que la molécula entra en un “estado de excitación” luego de haber absorbido esa cantidad de energía y al haber transitado desde el estado basal al estado excitado. Cuando tiene lugar esta absorción se da, decimos que ha ocurrido una transición.

• Hay 3 transiciones de interés en una molécula: – Transiciones electrónicas (con energía asociada a la región UV)

– Transiciones vibracionales (con energía asociada a la región IR)

– Transiciones rotacionales (con energía asociada a la región micro-onda)

• Los espectros de excitación de una molécula son más bien achatado debido a la sobreposición de las transiciones electrónicas, vibracionales y rotacionales.



Energía

En un espectro de excitación de átomos no hay transiciones vibracionales o rotacionales ya que no hay enlaces que vibren o roten. Se observan solamente transiciones electrónicas en su forma más pura generándose entonces líneas de absorción bien definidas.

Orígenes de las transiciones electrónicas

• Considere el grupo funcional formaldehido – Posee electrones en orbitales sigma (σ)y el enlace se llama enlace sigma σ

(enlace sencillo)

– Posee electrones en orbitales π (pi) y el enlace en que están se llama enlace π (enlace doble)

– Los electrones no compartidos están en orbitales no-enlazantes “n” y son los más reactivos de los tres tipos de electrones


• Transiciones σ→σ*

Un electrón en un orbital σ es excitado al orbital anti-enlazante σ* correspondiente. La energía requerida es grande. Por ejemplo, el metano (que solo tiene enlace sencillos C-H, y sus electrones únicamente pueden efectuar transiciones σ→σ*) muestra una absorción máxima a 125 nm. La absorción máxima debida a transiciones σ→σ* no se observa en un espectro típico UV-Vis (200 nm a 700 nm)

• Transiciones n→σ*

Los compuestos saturados que contienen átomos con pares de electrones no-compartidos (electrones no-enlazantes) son capaces de efectuar transiciones n→σ*. Estas transiciones generalmente necesitan menor energía que las transiciones σ→σ*. Pueden ser iniciadas por una radiación de longitud de onda en el rango de 150 nm a 250 nm. El número de grupos funcionales orgánicos con señales n→σ* es pequeño.


• Transiciones n→π* y π→π*

La mayoría de los estudios de espectroscopía de absorción, en la región UV, de compuestos orgánicos está basada en las transiciones de los electrones n y π al estado excitado π*. Esto es debido a que las bandas de absorción para estas transiciones caen en una región del espectro (200 nm a 700 nm) experimentalmente útil. Estas transiciones necesitan un grupo insaturado en la molécula que proporcione los electrones π


• El disolvente de la muestra también tiene un efecto notable sobre el espectro de absorción. Las bandas de absorción de las transiciones n→π* son desplazadas a longitudes de onda menores (desplazamiento azul o hipsocrómico) cuando se incrementa la polaridad del disolvente. Esto es debido al incremento de la solvatación de los electrones n que da como consecuencia una disminución de la energía de su orbital


• Generalmente (aunque no siempre), el efecto opuesto (el desplazamiento rojo o batocrómico) se observa para las transiciones π→π*. Esto es debido a las fuerzas polares de atracción entre el disolvente y el absorbente, que disminuye la diferencia de energía entre los niveles basal y excitado. Este efecto es mayor para el estado excitado, y así la diferencia de energía entre los estados basal y excitado es ligeramente disminuida, dando como resultado un aumento en la longitud de onda de absorción (desplazamiento rojo o batocrómico). Este efecto también influye en las transiciones n→π*, pero es eclipsado por el efecto azul que resulta de la solvatación de los pares de electrones solos


Compuesto Posición, λ (nm) Intensidad, ε (L/cm .mol)

Fenol 270 1,450

Fenolato de sodio 287 2,600


Compuesto Posición, λ (nm) Intensidad, ε (L/cm .mol)

Anilina 280 1,430

Clorhidrato de anilina 254 160

Dos consideraciones importantes en torno al análisis cuantitativo de medicamentos

• La selectividad de los espectrofotómetros es muy baja y por lo tanto se requiere de procesos de separación y purificación de (el/los) principio(s) activo(s) removiendo las posibles interferencias, e.g., excipientes

• Esquemas de dilución – E s necesario hacer diluciones para llevar la concentración del analito a concentraciones de trabajo que estén dentro del rango de linealidad de la concentración del espectrofotómetro


Análisis espectrofotométrico del acetaminofén

• Longitud de onda de trabajo: 244 nm (transición π π*)

• Método de ensayo: Se disuelve cerca de 120 mg de acetaminofén, pesada con exactitud, en 10mL de metanol en un frasco volumétrico de 500.0mL, se diluye con agua hasta el aforo, y se mezcla (Paso 1). Se transfieren 5.0mL de esta solución a un frasco volumétrico de 100.0mL, se diluye con agua hasta el aforo y se mezcla (Paso 2). Simultáneamente se determinan las absorbancias de esta solución y de otra solución patrón de acetaminofén (SQR) disuelta en el mismo medio, a una concentración de 12µg/mL en una celda de 1 cm de espesor, a una λmáx de 244nm utilizando agua destilada como balnco (Paso 3). Calcule la cantidad, en mg, de acetaminofén a partir de la fórmula 10C[Ad/Ap] donde C es la concentración en µg/mLde la solución patrón de acetaminofén (SQR), Ad (absorbancia del desconocido) y Ap (absorbancia de la solución patrón)


Ensayo de la muestra

Datos experimentales para el análisis:

• Peso de la muestra de acetaminofén: 116.8mg que se disuelve en metanol

• Concentración de la sustancia patrón SQR: 12.0µg/mL

• Ap (absorbancia de la solución estándar) = 0.612

• Ad (absorbancia de la solución desconocida) = 0.584

• La concentración de la sustancia desconocida (muestra de acetaminofén)

Cd = Cp ∙ Ad / Ap = 12.0µg/mL ∙ 0.584 / 0.612 = 11.5µg/mL

Cd es la concentración de acetaminofén en el Paso 2 (transparencia anterior)

• Si 1.0 mL contiene 11.5µg; entonces en 100.0mL debe haber 1,150µg = 1.15mg/5.0mL; por lo tanto en 500.0mL deberá haber (500.0/5.0)x1.15mg = 115mg (cantidad de acetaminofén en la muestra)

• 115mg es la cantidad de acetaminofén en 116.8mg de la muestra pesada

• Entonces (115/116.8) x 100% = 98.5% pureza de la muestra!


Cuestionario: responda las siguientes preguntas

1. Cuáles son los 3 tipos de transiciones moleculares?

2. En qué región del espectro electromagnético (microonda, infrarrojo, ultravioleta, visible, rayos gama, etc.) ocurren las transiciones electrónicas?

3. Por qué las especies atómicas solo muestran líneas de absorción y no bandas de absorción?

4. Cuáles son los tipos más comunes procesos de relajamiento que se observan luego de las transiciones electrónicas?

5. En los procesos de relajamiento como fluorescencia y fosforescencia, la energía que se re-emite es de mayor, menor o igual energía que la energía de excitación absorbida?

6. En qué difiere la fluorescencia de la fosforescencia

7. Arregle las siguiente transiciones en orden ascendente de longitud de onda:


8. Marque con un gancho las transiciones posibles

Sustancia

Metanol

Benceno

Fenol

n-Hexano

Agua

Acetona

Naftaleno

Acido acético

Trietilamina

p-clorofenol

Quinona

Cloroformo


Si es necesario busque las estructuras

9. Cuáles son las regiones de interés analítico dentro del espectro ultravioleta? Qué tipo de transiciones ocurren en esos rangos de longitud de onda?

10. Cuáles son las dos características importantes de una banda de absorción?

11. Cuáles son las propiedades moleculares que determinan la posición de una banda de absorción en la región UV del espectro?

12. Cuáles son las propiedades moleculares que determinan la intensidad (ε) de una banda de absorción en la región UV del espectro?

13. Cuáles son las características de un grupo cromóforo?

14. Cuáles son las características de un grupo auxocromo?

15. Qué efecto causa la conjugación de dos o mas grupos cromóforos?

16. Por qué ocurre un desplazamiento batocrómico cuando hay cromóforos conjugados en comparación a cuando los cromóforos no lo están?


Prediga los desplazamientos observados en las siguientes transformaciones, si acaso alguno, tanto en

posición como en intensidad

Transformaciones Batocrómico Hipsocrómico Hipercrómico Hipocrómico


Responda las siguientes preguntas

• Qué efectos se observan en el espectro de absorción cuando un auxocromo se añade a un sistema cromofórico?

• Un compuesto X que muestra una máxima de absorción a 255 nm y una ε de 1900 se deshidrohalogenó para generar un nuevo compuesto Y que

mostró una λmax de 270 nm y una ε de 2100. Qué tipo de desplazamiento ocurrió? A qué conclusión podemos llegar sobre la posición del nuevo doble enlace que se generó después de la deshidrohalogenación?


Aplicaciones cualitativas (pruebas de no-identidad) • No es un método muy usado para fines de identificación; existen otros

métodos mejores para comprobar identidad, e.g., infrarrojo, RMN, etc.

• No obstante, los desplazamientos batocrómicos e hipsocrómicos observados con los cambios en el pH de la solución de una sustancia se usan ocasionalmente para comprobar la presencia de una sustancia en una muestra de identidad desconocida o bien para comprobar la ausencia de una sustancia en dicha muestra

• La comprobación de la identidad de la morfina se ha realizado mediante la espectroscopía de absorción observando su espectro de absorción UV en solución acuosa tanto en solución de HCl como en solución de KOH

• Se observa un desplazamiento batocrómico e hipercrómico en solución de KOH; sin embargo, esta NO es una prueba plena ya que cualquier grupo fenólico presente como contaminante en cantidades suficientes presentaría el mismo comportamiento

• No obstante, si la muestra de morfina en cuestión en solución no presenta un cambio batocrómico e hipercrómico en solución de KOH, entonces SÍ podemos señalar de manera concluyente que la muestra NO es morfina, siempre y cuando la muestra no contenga impurezas en cantidades importantes y que absorban fuertemente a la λmax de medición Prof. Dr. Goy E. Navas 60

Efecto del pH sobre la máxima de la morfina

61

285nm

298nm

Observación: Desplazamiento batocrómico (285 a 298nm) e hipercrómico (A=0.24 a A=0.65) en solución de KOH (comparar con espectro inferior)

A0.24

A0.65

Colorimetría

OBJETIVOS

• Estudiar el proceso de absorción que ocurre en la región visible del espectro

• Conocer en qué se diferencia de la espectroscopía UV

• Reconocer las características estructurales necesarias para que ocurra absorción en la región visible

• Aprender a interpretarlos métodos colorimétricos y los cálculos correspondientes


• La colorimetría es la rama del análisis espectrofotométrico que estudia la absorción de energía radiante de sustancias en el rango de 400 a 700 nm


Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo

Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo (400-450) (450-500) (500-570) (570-585) (585-620) (625-700) nm

Proceso de absorción colorimétrica

• Al igual que en la región UV el proceso de absorción de la energía en la región visible es un proceso de excitación que resulta en una mezcla de niveles de energía vibración y rotacional (mayor achatamiento de las máximas de absorción)

• La principal diferencia entre los procesos de absorción UV y Vis es la energía de la respectiva transición

• Un cromóforo es un sistema molecular que sufre una transición del estado basal al estado excitado

• Si la transición ocurre como resultado de un proceso de excitación n π* o de π π* el cromoforo normalmente caerá en la región UV (200-400 nm)

• Si a consecuencia de la conjugación o con la presencia de grupos auxocromos las máximas de absorción se desplazan más allá de 400nm y debajo de 700nm la absorción ocurre en la región visible y se analizará por colorimetría


Aplicaciones del análisis colorimétrico

• Diferentes usos de la colorimetría – Para el análisis de sustancias que poseen color

– Para el análisis de sales metálicas y complejos que absorben fuertemente en la región visible

– Para el análisis de sustancias que una vez preparados los respectivos “derivados” que resultan de la combinación con ciertas sustancias “derivatizantes” causan desplazamiento de la máxima de absorción hacia mayores longitudes de onda

– Para el análisis de sustancias que se convierten a un cromoforo de color que absorbe en la región visible pero sin que se combinen ambas sustancias


• La mayoría de los indicadores se pueden analizar en la región visible del espectro por colorimetría

Fenolftaleina: Este es el caso del indicador ácido-base y medicamento catártico (Ex-lax)


Incoloro Absorbe en UV

Color rojo; Absorbe en Vis (550-555nm)


Azul de metileno

Verde indocianina

Azul de Evans Auxiliares de diagnóstico clínico

Antídoto de cianuro


550nm

Derivados de grupos aminos aromáticos

cloranfenicol

• Grupo cetónicos reaccionan con la 2,4-DNFH para dar un complejo de color que absorbe a 450nm



Hidroxi progesterona caproato

isoniacida

modulo sobre metodos espectrofotometricos - analisis farmaceuticos ii

Documents