MINIEXTRACCIÓN DE ADN PLASMIDIAL - ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSAResumen

La electroforesis en gel se encuentra entre los métodos más resolutivos y convenientes empleados en la separación de macromoléculas. Un gel es un estado intermedio entre el sólido y el líquido, los geles de uso más generalizado son: poliacrilamida y agarosa ya que poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y moléculas trasladadas durante el proceso electroforético. De esta forma, la separación no se produce sólo por las diferentes cargas de las moléculas, sino también por las diferencias de tamaño. Donde el material a trabajar fue la extracción de ADN plasmído previamente aislado de la cepa E. coli DH5 alfa. Donde se obtuvo como resultado que para el contenido de agarosa al 1%, el rango de pares de bases de ADN (pb) debe estar entre 500 y 10 000. La solución tampon se encarga de mantener el pH estable a lo largo del corrido y garantizar la formación de un campo eléctrico.

Palabras claves: Electroforesis, gel de agarosa, ADN plásmidos, TBE.

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de replicarse de forma autónoma, independientemente del cromosoma. Son muy comunes en bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células bacterianas en un número elevado (hasta 100 copias por célula). Los plásmidos son una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés. (Pinto Yadira Y leana, 2014)

Miniextracción de ADN Plasmidial

Se realiza en medio LB (Luria Bertani) es el medio utilizado por excelencia para el mantenimiento de las cepas de E. coli recombinante en procesos de microbiología molecular ya que contiene peptona de caseína y extracto de levadura que proporcionan al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo óptimo.

Los pasos básicos de aislamiento de ADN son la interrupción de la estructura celular para crear un lisado, la separación del ADN soluble de desechos celulares y otros materiales insolubles y la purificación del ADN de interés de las proteínas solubles y

otros ácidos nucléicos. (Pinto Yadira Y leana, 2014)

En el desarrollo de la práctica se utilizó, la lisis alcalina, en combinación con el detergente Dodecil Sulfato de Sodio, SDS, ha sido usada para aislar ADN plasmídico de E. coli. La exposición de suspensiones bacterianas a detergentes aniónicos fuertes en valores de pH altos desestabiliza la envoltura celular, desnaturaliza el ADN cromosomal y las proteínas, y libera el ADN plasmídico al sobrenadante. Aunque la solución alcalina separa completamente las bases apareadas del ADN, las hebras de un plásmido circular no se separan completamente unas de otras debido a que están topológicamente entrelazadas. Mientras la intensidad y la duración de la exposición al OH- no sea demasiado larga, ambas hebras del ADN plasmídico se renaturalizarán cuando los niveles de pH retornen a sus valores neutros reconstituyendo una molécula de ADN doble cadena circular (Culteck, 2006).

Durante la lisis, las proteínas bacterianas, la pared celular rota y el ADN cromosomal desnaturalizado constituyen grandes complejos que se agregan y son cubiertos con SDS. Estos complejos 17 son precipitados eficientemente de la solución

acuosa cuando los iones sodio son reemplazados por potasio. Después que este material ha sido removido por centrifugación, el ADN plasmídico puede ser recuperado del sobrenadante. (Culteck, 2006).

La principal consideración para la purificación del plásmido es la separación de ADN del plásmido a partir del ADN y el ARN cromosómico celular de la bacteria huésped. Varios métodos han sido desarrollados para generar un lisado que no sólo elimine las proteínas y los lípidos, sino que también elimine eficazmente la contaminación de ADN cromosómico del ADN plásmido, dejándolo libre en la solución (McGilvery Robert, 1997)

Este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el ADN plasmídico (pequeños círculos de ADN cerrados covalentemente) y el ADN cromosómico (fragmentado). La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalización del ADN cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. Los plásmidos se ven menos afectados por su pequeño tamaño y estructura superenrollada. La neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal (acetato potásico), provoca que se cierre covalentemente el ADN plasmídico y la precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potásica del dodecil sulfato) y la del ADN cromosómico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de proteínas y ADN cromosómico se separan por centrifugación del ADN plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa (Pinto, 2014).

Electroforesis en Gel de Agarosa

Un método que permite visualizar el ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la

electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan los fragmentos de ADN en función de su tamaño (M. Somma, M. Querci, 2014).

Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que fluoresce cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN (M. Somma, M. Querci, 2014).

La solución Tampón se encarga de mantener el pH estable a lo largo del corrido y garantizar la formación de un campo eléctrico, este es una solución tampón el cual es una solución de Tris base, ácido bórico y EDTA, además posibilita la separación de los ácidos nucleicos, en conjunto con la agarosa. El Tris cumple la función del tamponamiento por lo que contribuye a ajustar el pH y por ende regularlo. El empleo del TBE como buffer de electroforesis es particularmente útil para discriminar a pequeños fragmentos de ADN (<500 bp) en geles de agarosa (en comparación al TAE). En términos generales los fragmentos grandes (>20 kbp) de ADN tienden a migrar más rápido en el TAE que en el TBE, mientras que los fragmentos pequeños (<300 bp) migran más rápido en el TBE que en el TAE. Esta capacidad discriminatoria ha llevado a establecer parámetros optimizados para la discriminación de fragmentos en base a su tamaño. Así pues, la mejor discriminación de

fragmentos de entre 100 y 500 bp de ADN se logra con geles de agarosa al 2% empleando TBE como buffer, mientras que los fragmentos de entre 900 y 2000 bp son mejor separados con geles de agarosa al 0.8% empleando TAE como buffer de electroforesis (UASLP, 2008).

METODOLOGÍA

1. Preparar la cubeta colocando los seguros para conformar un contenedor para el gel y colocar el peine en posición.

2. Pesar la cantidad necesaria de agarosa para la preparación del gel. Es suficiente la preparación de 80 mL de gel para llenar la cubeta, de manera que si se requiere un gel de agarosa al 1%, pesar 0.8 g de agarosa y llevar a volumen con tampón TBE 1X en el erlenmeyer destinado para tal fin. (El tampón generalmente se encuentra preparado en una solución concentrada 10X. Para preparar, por ejemplo, 80 mL de tampón, adicionar 8 mL de TBE concentrado en una probeta y completar el volumen con agua destilada estéril).

3. Calentar la solución en el horno microondas el tiempo necesario para que la agarosa se diluya, alrededor de 30 seg., pero evitando que hierva. Para lograrlo es recomendable calentar por periodos cortos (por 10 seg. cada vez por ejemplo).

4. Esperar unos minutos a que el gel se enfríe (se puede tener una medida de la temperatura adecuada si se toca el recipiente con el envés de la mano) y adicionar 1 µL SYBR Safe de (para una concentración final de 0.4 µg/L) ó. Homogenizar el gel agitando suavemente el erlenmeyer.

5. Transferir el gel a la cubeta lentamente para evitar que se formen burbujas. Esperar alrededor de 30 min. hasta que el gel solidifique.

6. Cuando el gel esté listo, quitar los seguros y colocar en la cámara; adicionar suficiente tampón TBE 1X para cubrir totalmente el gel.

7. Cortar un trozo de papel parafilm para colocar muestras del buffer de carga (colorante) de 1 µL. Cargar la micropipeta con el volumen requerido de muestra (para DNA vegetal cargue 5 µL) y el colorante. Homogeneizar la muestra con la micropipeta.

8. Cargar cuidadosamente el pozo con la muestra evitando la transferencia a los pozos contiguos. Cambiar la punta cada vez que se va a cargar una nueva muestra con su colorante.

9. Cerrar la cámara y conectarla a la fuente de poder. Asegurarse que la posición de los pozos es correcta respecto a la dirección de migración del DNA.

10. Remueva el gel con cuidado y visualice el resultado en transiluminador de luz blanca. Limpie con alcohol la pantalla de éste antes y después de trabajar con el gel.

RESULTADO

Figura 1. Desplazamiento de las moléculas de ADN Plasmídico

DISCUSIÓN DE RESULTADO

Al depositar todas las muestras, incluyendo el marcador de peso molecular (fragmentos de ADN de tamaño conocido), se cierra la cámara y se conecta a la fuente de poder a un voltaje de 90V por aproximadamente 15 minutos (desde el momento en el que es seguro que la corriente está actuando en la cámara). Al cabo del tiempo se remueve el gel que se coloca sobre el transiluminador de luz blanca y se observa el desplazamiento de la muestra, comparándola con el marcador de peso molecular.

Como se puede observar en la Figura 1, las moléculas del ADN plasmídico se van desplanzando ya que gracias al grupo fosfato que conforma los nucleótidos (monómeros de los ácidos nucleicos) poseen una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo. Mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) o la solución tampón TBE que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína (McGilvery, 1997). Se percibe que el ADN que se extrajo, pasó por la malla del gel debido a que presentaban pequeñas

moléculas las cuales se movilizan más fáciles por los poros del gel.

Se tiene que el bromuro de etidio permite observar el desplazamiento de las moléculas de ADN, que se intercala entre las bases del mismo y son fluorescentes cuando se ilumina con luz ultravioleta. También permite realizar el taponamiento y la regulación del pH, debido a su formación por Tris base. Esto es importante para poder percibir la migración del ADN, el cual depende de las cargas negativas presentes en los fosfatos.

Hay que tener en cuenta el pH ya que puede alterar la migración de las moléculas de ADN debido a que este altera la fuerza eléctrica ya que contiene una amplia variación de ácido para equilibrar esto en el TBE se encuentra el borato que ayuda ajustar el pH ya que se requiere que este sea neutro. Se tiene que al mezclar el TBE con el EDTA, este cuida los ácidos nucleicos con la degradación enzimática que surge.

Para el contenido de agarosa al 1%, el rango de pares de bases de ADN (pb) debe estar entre 500 y 10 000 y los resultados se encuentran dentro de este rango.

CONCLUSIONES

Se determinó la importancia de la concentración de la agarosa ya que a mayor concentración se disminuye la velocidad de desplazamiento de los fragmentos de las moléculas de ADN.

Se evidencia experimentalmente que la muestra inicial del ADN plasmídico era realmente y contenido material genético de E. coli DH5 alfa.

Se identificó que el ADN tiene una carga negativa debido a los fosfatos presentes, por ello tendió a desplazarse a la parte positiva de la cámara de electroforesis horizontal.

Se comprobó el desplazamiento del ADN gracias al bromuro de etidio y el colorante GRC porque estos se

ubican dentro de las bases de ADN y permite visualizar gracias a la luz ultravioleta un color fluorescente.

Los pares de bases se determinaron gracias al marcador de peso molecular.

REFERENCIAS

• Pinto Yadira Yleana, 2014, Universidad de Santander, preparación de dna plasmídico por lisis alcalina con sds. Consultado el 22 de marzo de 2014.

• Uah, 2013, Biología Molecular e Ingeniería Genética, 3º, FarPurificación y análisis de dna plasmídico- F-BMIG plásmido17.doc. Disponible en: http://www2.uah.es/bioquimica/f-bmig/practics/plasmido.pdf

• M. Somma, M. Querci. s.f, Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos. Electroforesis en gel de agarosa. European Commission. p. 11. Consultado el 22 de marzo de 2014

• Culteck, 2006 Electroforesis de proteínas. Protocolo y Técnicas. Consultado el 22 de marzo de 2014

• McGilvery Robert., 1997, Conceptos bioquímicos. Consultado el 22 de marzo de 2014.

• UASLP - Universidad Autónoma de San Luis Potosí, 2008, Protocolos y métodos Preparación de TAE y TBE Laboratorio de Genómica Viral y Humana. Consultado el 22 de marzo de 2014.

• Senna, 2014, Transiluminadores de luz UV/Blanca. Disponible en: http://www.cientificasenna.com/index.php?modulo=catalogo&accion=articulo&id=280.