MICROSCOPIO: BASES Y APLICACIONES FORMAS Y TIPOS CELULARES OBJETIVOS Conocimiento y manejo del microscopio óptico común Realización de preparaciones microscópicas sencillas. Observación de células procariotas y eucariotas (animales y vegetales) La unidad de organización de los seres vivos es la célula. Esta puede ser estudiada bajos distintos aspectos: morfológico, químico y fisiológico. A cada uno de estos aspectos le corresponden métodos de estudios particulares.

METODOS DE ESTUDIOS MORFOLOGICOS Los estudios morfológicos se realizaron mediante el uso de instrumentos de aumento denominados microscopios El microscopio de luz es un sistema óptico de lentes convergentes que cumplen Ia función de aumentar Ia irnagen de un objeto. CARACTERISTICAS Y FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO Entre los instrumentos ópticos conocidos con el nombre de microscopio se incluyen los llamados microscopios simples o lupas, compuestos por una sola lente, o un solo sistema de lentes convergentes; y los microscopios compuestos, cuya parte óptica consta de dos lentes, o dos sistemas de lentes convergentes: ocular y objetivo. El micoscopio simple da una imagen aumentada, derecha y virtual. El microscopio compuesto da una imagen aumentada, invertida y virtual. DESCRIPCIÓN DEL MICROSCOPIO COMPUESTO En el microscopio distinguimos un sistema óptico, destinado a la iluminación y obtención de una imagen muy aumentada del objeto examinado; y un sistema mecánico, cuya finalidad es la de sostener convenientemente los elementos ópticos y los preparados que se examinan. Sistema mecanico Recibe también el nombre de estativo o montura del microscopio. Consta de pie, columna, tubo, mecanismo de movimiento y platina. PIE Soporte sobre el cual se apoya el microscopio. La COLUMNA es un vástago articulado con el pie. TUBO Es un tubo hueco que separa los dos grupos de lentes (ocular y objetivo). Mecanismo de movimiento:

TORNILLO DE ENFOQUE (MACROMÉTRICO) Acerca o aleja rápidamente el objetivo a la preparación para hacer un enfoque aproximado. Se usa sólo con los objetivos de menor aumento. TORNILLO MICROMÉTRICO Permite enfocar con precisión, moviendo muy lentamente el objetivo REVÓLVER PORTAOBJETIVOS Permite colocar en posición de trabajo a los distintos objetivos con que cuenta el microscopio. Presenta unas ranuras que facilitan la fijación del objetivo en la posición correcta. PLATINA Es la superficie sobre la cual se colocan las preparaciones. Tiene un orificio en su centro para permitir el paso de la luz. En algunos microscopios está dotada de un sistema con dos tornillos que permiten el desplazamiento preciso de la preparación. PINZAS Sirven de sujeción de la preparación sobre la platina. TORNILLO DEL CONDENSADOR Permite subir o bajar el condensador respecto a la platina para mejorar la iluminación.

Parte Optica: esta parte consta de los siguientes elementos: • Dos sistemas de lentes convergentes centradas: Objetivo y Ocular. • Condensador. • Diafragma. • Fuente luminosa.

1. Objetivo: Llamado asi porque se halla próximo al objeto a examinar. Es un sistema de lentes ubicadas en la parte inferior del tubo. Existen dos tipos de objetivos: los objetivos secos y los objetivos a inmersión. Los objetivos secos son aquellos en los que entre la lente y el objeto existe una pequeña capa de aire. Este tipo de objetivos son los de menor aumento. Los objetivos a inmersión son aquellos en los cuales se interpone entre Ia lente y el objeto un liquido (aceite de cedro) el cual tiene un índice de refracción que es semejante al del cristal de la lente.

2. Ocular: es llamado de ésta forma porque se halla próximo al ojo del observador. Está formado por un sistema de lentes convergentes. Los microscopios pueden tener dos modelos de oculares: modelos de un solo ocular (monocular) o modelos con dos oculares (binoculares). Su función es la de aumentar la imagen proyectada por el objetivo.

3. Condensador: recibe la luz y la intensifica, permitiendo una mayor claridad de Ia imagen.

4. Diafragma: su función es la de graduar la cantidad de luz que reciba el objeto.

5. Fuente luminosa: es una lámpara que se encuentra al pie del microscopio. Habitualmente los microscopios la tienen incorporada. En el caso nuestro, la luz es provista por un foco, que es captada por un espejo que posee una cara plana y otra cóncava, que proyectan el haz de rayos que iluminan el objeto, dirigiéndolo hacia el eje óptico.

Formación de la imagen en el Microscopio

La imagen en un microscopio se forma por Ia transmisión de los rayos provenientes de una fuente luminosa a través del objeto. Los rayos luminosos atraviesan el diafragma, que a manera de iris, delimita el diámetro del haz lumínico que penetra por el condensador. Este último, está formado por un sistema de lentes convergentes que concentra y proyecta el haz lumínico sobre el objeto a examinar, a través de la abertura de la platina. El objetivo recoge la luz que atravesó el objeto examinado y proyecta una imagen real, invertida y aumentada que se forma dentro del tubo y que es recogida por el ocular que es la segunda lente, la cual forma una imagen virtual, invertida y aumentada del objeto examinado.

Se tienen dos lentes: Objetivo y ocular y un objeto. Este objeto lanza un rayo paralelo sobre el lente objetivo que pasa por el foco y un rayo que pasa por el foco y se refleja paralelo, formando con el choque de estos 2 rayos la imagen 1, que entra a ser objeto para el lente ocular (2do lente), esta imagen 1 que es "objeto" refracta un rayo por el centro del lente y otro rayo paralelo que pasa por el foco formando asi con las prologanciones de estos rayos la imagen 2, que es la imagen final observada por nosotros.

Aumento: E s l a p r o p o r c i ó n e n t r e e l t a m a ñ o d e l a i m a g e n o b s e r v a d a a l microscopio y el tamaño real del objeto. El aumento total puede calcularse como el producto del aumento del ocular por el del objetivo. Cada lente objetivo lleva inscripto su aumento: 5X, 10X, 40 X o 100X. (el signo X significa “aumento”) La imagen aumentada producida por el objetivo, es tomada por el ocular, y magnificada nuevamente. La imagen definitiva (que es invertida, respecto a la original) resulta del producto entre el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Por ej: OCULAR 10x OBJETIVO: 40x AUMENTO TOTAL: 1Ox40=400X Profundidad de campo o de foco o poder de penetración:

Es el espesor del preparado que se observa con nitidez, es decir, profundidad de planos que están en foco en un momento dado. Con aumentos medianos o grandes, al mov er e l tornillo micrométrico, podemos observar sólo pequeños espesores con nitidez, mientras que por encima y por debajo de esta zona la imagen se desvanece. La profundidad de foco guarda relacion inversa con el aumento: es menor cuanto mayor es el aumento utilizado. Con aceite de inmersión la profundidad de campo es muy escasa. Poder de resolución (PR): E s l a c a p a c i d a d d e l a s l e n t e s d e d i s t i n g u i r o r e s o l v e r (mostrar separados) con nitidez dos puntos situados muy próximos entre sí. Se expresa como la distancia mínima que permite dar una imagen bien definida de dos puntos, en vez de verlos como uno solo. Cuanto mayor es el poder de resolución (PR), menor es la distancia que separa los puntos entre sí sin que estos se confundan. En consecuencia, cuanto mayor sea el poder resolutivo del objetivo, más finos serán los detalles de la preparación que puedan distinguirse. Puede determinarse en base a la longitud de onda de la luz utilizada (λ) y directamente proporcional a la apertura numérica (AN) . El valor de AN varia con cada objetivo y esta inscripto con números decimales pequeños en cada uno de ellos. El PR se puede estimar indirectamente calculando el “limite de resolución”. Limite de resolucion (LR) : Es la distancia mínima que puede existir entre dos puntos para que puedan ser distinguidos como tales. Nuestras posibilidades de estudiar los componentes de los distintos niveles de organización de la materia viva están limitados por el poder de resolución del ojo humano, que puede distinguir dos puntos separados por 0,1mm o mas, del microscopio óptico cuyo, limite de resolución es de 0,2 µm y del microscopio electrónico que alcanza un límite resolutivo de aproximadamente 4 A. Por ejemplo: si fotografiamos con el microscopio óptico dos líneas que están a menos de 0,2mm de distancia entre si , la fotografía podría ampliarse indefinidamente, pero las líneas siempre se verían como una soal.

LR= λx0.61/AN El límite de resolución es INVERSAMENTE PROPORCIONAL al poder de resolución, es decir que al aumentar el poder de resolución se pueden diferenciar puntos que estan separados entre si a distancias cada vez menores (a mayor PR, menor LR)

1 CENTÍMETRO (cm) = 10 -2 METROS (metros) = 1/100 m 1 MILÍMETRO (mm) = 10-3 METROS (m) = 1/1000 m = 1/10 cm 1 MICRÓMETRO (µm) = 10-3cm = 1/1000 cm 1 NANÓMETRO (nm) = 10-9 (metros) m = 1/1.000.000.000 m = 1/1.000.000 cm 1 METRO = 102 cm = 103 mm = 106 µm = 109 nm 1Anstrong = 1 Å = 1/10 nm = 10-8cm

El nivel de observación se halla limitado por el poder de resolución del microscopio utilizado. El poder de resolución de cada microscopio, determina entonces, un limitado rango de dimensiones dentro del cual deber estar la estructura biológica en estudio para que pueda ser discriminada. Existen distintos tipos de microscopios en la actualidad entre los cuales podemos nombrar: MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA Se basa en que una sustancia natural de las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayos luminosos. Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA (MI)

Permite determinar las diferencias ópticas de las estructuras celulares. Además se calcula el peso seco de una célula o de una estructura observada. Tiene la ventaja de reflejar cambios de color en las células vivas. El MI da imágenes tridimensionales (efecto 3D), lo que con un procesador adecuado nos permite medir el grosor de las muestras observadas. MICROSCOPIO DE FONDO CLARO

Para formar una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen. El campo del microscopio está intensamente iluminado, mientras que los objetos observados aparecen más oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos. MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA

La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para detectar ácidos nucléicos, y proteínas que contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada célula. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE Se utiliza cuando se necesitan ver objetos incoloros. Se usa una iluminación por varios sitios y se miden diferencias de fase para poder "ver" el objeto. Una muestra microscópica normalmente se visualiza porque su densidad varía de unas zonas a otras. Con iluminación de campo claro es muy difícil ver detalles de una muestra completamente transparente, (todas las zonas son de la misma densidad). Sin embargo, no todas tienen el mismo índice de refracción. MICROSCOPIA ELECTRONICA El avance trascendental en la Biología celular lo constituyó el desarrollo del microscopio electrónico. El microscopio electrónico utiliza en lugar de un haz de luz (fotones), haces de electrones de una longitud de onda (0.05 A).Esta longitud de onda resulta 100.000 veces inferior a la de la luz empleada habitualmente (5500A) y logra un aumento y resolución muy superior a la de los microscopios comunes u ópticos y permite estudiar la ultraestructura o morfología submicroscópica de la célula.

La microscopía electrónica de transmisión se basa en la dispersión de electrones que inciden y pasan a través del objeto de manera que la imagen refleja la falta de electrones que fueron dispersados. Es el instrumento indicado para el estudio de la ultraestructura de la célula, es decir la morfología detallada de los componentes de la misma. Esta capacidad es consecuencia de su gran poder de resolución, que resulta de su notable disminución en la longitud de onda que utiliza. La microscopía electrónica de barrido (scanning) utiliza los electrones que se reflejan en la superficie del objeto y producen una imagen tridimensional. Una de sus mayores cualidades del ME de barrido es su capacidad de enfocar simultáneamente elementos ubicados en distintos planos, es decir, tienen mucha profundidad de foco, con lo cual se logra la imagen tridimensional.

DIFERENCIAS ENTRE EL MICROSCOPIO OPTICO Y EL MICROSCOPIO ELECTRONICO MO ME

Imagen dada por Interferencia de rayos luminosos

Dispersión de electrones

Fuente Luz (fotones) Filamento de tungsteno Elementos Lentes: ocular, objetivo,

condensador Bobinas electromagnéticas

Estudian células Vivas o muertas Muertas Observación de la

muestra Coloreada o no Sin coloración o con aumento

de contraste con técnicas especiales

Límite de resolución

2500 A a 0.25 micrómetros 10 A a 2 A

Longitud de onda 5500 A (término medio) 0.056 A Aumento 500X a 1500X 20000X a 160.000X con lente

intermedia. 1.000.000X o más con aumento fotográfico

Nivel de observación

Estructuras Ultraestructura

La observación por transmisión (de fotones o electrones) exige que los objetos a estudiar respondan a ciertas condiciones de espesor y contraste. Para que la luz o los electrones puedan atravesarlos, el espesor no debe exceder de 10 micrómetros y 0.1 de micrómetro respectivamente.

Nivel de observación

Instrumento Dimensión Nivel de estructura biológica

Macroscópico Límite inferior 0.1 mm

Ojo y lente simple Desde 0.2 mm Órgano

Microscópico Límite inferior 0.1 micrómetro (m)

Microscopio común Varios tipos de microscopios

Desde 100m hasta 0.2 Desde 1m hasta 0.1

Tejidos Células

Bacterias Submicroscópico

Límite inferior 10 A Microscopio de

polarización Microscopio electrónico

Desde 1000 A hasta 10 A

Componentes celulares Virus

Macromoléculas Microscópico

Límite inferior 1 A Difracción de rayos X Desde 10 A hasta 1 A Moléculas y átomos

Con el microscopio óptico se pueden observar: La forma general de la mayoría de las células procariontes La forma general de las células eucariontes Algunas organelas eucariontes: núcleo, nucleolo/s, cromosomas,

mitocondrias, cloroplastos, flagelos, cilios, centríolos, vacuolas, pared celular. Estas estructuras se identifican con claridad utilizando alguna técnica accesoria de preparación de la muestra.

No se pueden observar con el M.O. Las bacterias más pequeñas La estructura interna de las células procariotas La estructura de las organelas eucariotas La membrana plasmática Los conjuntos membranosos como retículo endoplasmático rugoso

(RER) y aparato de Golgi, aunque por ciertas técnicas puede revelarse su ubicación

Los ribosomas

ACTIVIDAD N1:

El area le proveerá de un preparado fijo con una letra impresa en el portaobjetos, para su observación. 1) Ajuste preliminar e iluminación del campo. a) Usar el tornillo macrométrico para elevar el tubo o bajar la platina con el fin de que los objetivos no la toquen al hacer girar el revólver. b) Girar el revólver de modo que el objetivo de menor aumento (el más corto) quede alineado por el ocular. c) Abrir el diafragma todo lo posible y seleccionar la iluminación correcta. Para ello utilizar el condensador y el diafragma, y mover el espejo de manera que capte la luz del foco que tiene sobre la mesada. 2. Enfoque. a) Usar el tornillo macrométrico y elevar el tubo o mover la platina hasta que haya un espacio de aproximadamente 1 cm entre el objetivo de menor aumento y la superficie de la platina. b) Colocar el portaobjetos sobre la platina y sostener con las pinzas. Mirar a través del ocular y elevar lentamente hasta obtener una visión clara. c) Realizar un enfoque fino de la estructura con el tornillo micrométrico hasta observar con total nitidez. d) Hacer girar el revólver y el portaobjetivo de modo que el objetivo de gran aumento quede alineado con el ocular (asegurándose que el extremo del objetivo no toque el cubreobjeto. Si esto ocurre debe repetirse toda la secuencia). e) Si el preparado no se observa con nitidez usar el tornillo micrométrico para el enfoque final. f) Si se va a usar el objetivo de inmersión (el más largo) depositar una gota de aceite de cedro sobre el portaobjeto. Bajar lentamente el objetivo hasta tocar el preparado y enfocar con el micrométrico. 3. Práctica. a) Observe el portaobjetos que presenta la letra A y describa tal coma lo ve a simple vista y a través del microscopio óptico. b) Observe el preparado que posee la letra F. Describa su posición tal como lo ve a simple vista y a través del microscopio óptico. c) Mire a través del ocular y mueva el portaobjetos hacia delante lentamente. Hacia que lado se mueve la letra? d) Mueva el portaobjetos hacia la derecha. En que dirección se desplaza la letra? e) Como es la imagen que recibe su ojo con respecto al objeto? …………………………………………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Actividad N2: PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Célula procariótica Las células procariotas pertenecen al reino Monera. Dentro de este reino encontramos a las bacterias que fueron las primeras células en aparecer sobre la tierra , precediendo a las eucariotas Pueden adoptar distintas formas y por ello tomar nombres particulares, estando en forma solitaria o en agrupaciones. Forma de las bacterias - Cocos: tienen forma esférica. Los cocos que forman racimos se conocen como estafilococos. Otros aparecen en cadena, son los estreptococos. - Bacilos: tienen forma de bastones. La mayoría de los bacilos aparecen en forma individual, pero pueden aparecer en pares, diplobacilos, o en cadena, estreptobacilos. - Espirilos: cuando tienen forma helicoidal. - Vibrios: tienen forma de coma. Finalidad: Estudio de las formas y agrupaciones bacterianas Materiales: cultivo bacteriano en suspensión. Coloque una gota de la suspensión bacteriana directamente sobre el portaobjetos. Aplique sobre ella con mucho cuidado un cubreobjetos, coloque en el microscopio y luego utilice el tornillo micrométrico hasta enfocar. b) Observe y dibuje los tres tipos morfológicos fundamentales de bacterias: Cocos, Bacilos, Espirilos, aislados o agrupados: Diplococos, Estreptococos, Estafilococos, Sarcinas, Estreptobacilos.

Celula eucariotica

Finalidad Observación de levaduras

Hemos elegido para esta parte del trabajo práctico las levaduras, hongos eucariontes unicelulares que se utiliza para conseguir una fermentación industrial (Saccharomyces cerevisiae) y que es un organismo capaz de respirar aeróbica o anaeróbicamente Pueden hallarse aisladas o en pequeños grupos. Algunas presentan brotes que han sido originados por el proceso de gemación (reproducción sexual). Materiales: Levadura fresca de panadería Tubo de ensayo Porta y cubreobjeto Método 1. Tomar una pequeña porción de levadura y colocarla en un tubo de ensayo 2. Agregar agua tibia en cantidad suficiente como para conseguir una suspensión muy

diluida. 3. Colocar una gota de la suspensión en un portaobjeto y cubrir con el cubreobjetos. 4. Observar primero con bajo aumento y luego con el mayor, sin usar el de inmersión Resultados: 1) Dibujar una parte del campo con las levaduras a pocos aumentos. 2) Dibujar a gran aumento, señalando, si lo observa, núcleo y brotes.

Diagnostico: Aumento; ……... Aumento:………..

Cuestionario:

1) Identifica sobre el siguiente dibujo cada uno de los componentes del microscopio descritos más arriba:

2) Indica qué partes del microscopio están relacionadas con cada una de las siguientes funciones: Sirven para aumentar el tamaño aparente del objeto que estamos observando __________________________________________________________________ Sirven para iluminar correctamente la preparación ____________________________________________________________ Sirven para sujetar o mover otras partes del microscopio __________________________________________________________________ 3) Las preparaciones se montan empleando unos pequeños vidrios como los que aparecen en los siguientes dibujos. Señala cómo se llama cada uno de ellos.

4) Determina el aumento total con el que estás observando si empleas la combinación de ocular y objetivo que aparece en el dibujo siguiente:

Aumento del ocular: _____________ Aumento del objetivo: ____________ Aumento total: __________________ 5) Para observar una preparación microscópica no basta con situarla en la platina y poner los ojos en el ocular, sino que hay que seguir un procedimiento cuyos pasos se deben seguir con meticulosidad. A continuación se indican estos pasos, pero están desordenados; señala poniendo el número que le corresponda delante, el orden en el que debe realizarse este procedimiento. ____ Asegúrate de que está puesto el objetivo de menor aumento y que éste está suficientemente alejado de la platina. ____ Coloca la preparación de tal manera que el objeto de observación quede situado en el centro del orificio de la platina y, por supuesto, con el cubreobjetos hacia arriba. ____ Dibuja los objetos observados. El dibujo debe ser fiel a lo que observamos pero podemos suprimir detalles innecesarios para simplificarlo (por ejemplo, si hay muchas células semejantes en el campo de visión, no es necesario dibujarlas todas, sino que bastará si nos fijamos en algunas y las dibujamos con precisión). Junto a estos dibujos debe ir una indicación de los aumentos con que se ha realizado la observación y el tipo de coloración. ____ Mirando a través del ocular, y con el objetivo de menor aumento puesto, asegúrate de que el campo de observación está uniformemente e intensamente iluminado. Para conseguirlo deberás orientar correctamente el espejo hacia la fuente

de luz (o encender la lámpara del microscopio si la lleva incorporada) y abrir a tope el diafragma. ____ Mirando lateralmente el microscopio acerca el objetivo de menor aumento (el más corto) a la preparación para después, mirando a través del ocular, enfocar (con el tronillo macrométrico) alejándolo ____ Moviendo muy lentamente la preparación centra la zona más interesante en el campo de visión. Si no lo haces así, al cambiar a un aumento mayor puede que no consigas ver nada ya que cuanto mayor es el aumento, menor es el campo de visión. ____ Pasa al objetivo siguiente girando el revólver y corrige ligeramente el enfoque con el tornillo micrométrico. En todo momento tienes que asegurarte de que al girar el revólver has anclado el objetivo perfectamente en su posición (existe un pequeño tope que te lo indica). ____ Vuelve a poner el objetivo de menor aumento, levanta el tubo y retira la preparación. 6-Teniendo en cuenta la escala de medidas que vimos anteriormente; ¿En qué unidades se medirán estructuras pertenecientes a cada uno de los siguientes niveles? -Nivel macroscópico -Nivel microscópico -Nivel ultramicroscópico 7-¿Qué instrumentos le permiten observar y estudiar estructuras en cada uno de los niveles anteriores? 8-¿Cuál es el límite de resolución de: -ojo humano -microscopio óptico -microscopio electrónico 9 ) ¿Con qué instrumento observaría? a) estructura interna del cloroplasto b) los diferentes estratos de la piel c) la forma de las neuronas d) la membrana plasmática en detalle e) eritrocitos. 10.-¿Es posible observar presencia o ausencia de núcleo celular al microscopio óptico? 11.- En la tabla que se dibuja más abajo se detallan algunas características específicas de los tipos de microscopios estudiados. Analice cada una y coloque una cruz en el casillero apropiado al tipo/s de microscopio/s que corresponde CARACTERISTICA M. óptico M E de

transmisión ME de barrido

Tiene el mayor poder de resolución Pueden observarse células vivas

Permite visualizar detalles de la superficie celular Se pueden ver ribosomas aislados Pueden observarse células enteras Puede observarse la estructura interna de una célula procariota

La observación mejora con el uso de colorantes Puede visualizarse una membrana plasmática cortada transversalmente

Trabaja en alto vacío Su límite de resolución es de 0.25 micrones Su límite de resolución es de 100 A aproximadamente Su límite de resolución es de 10 A aproximadamente 12) En qué unidades se medirán estructuras tales como las siguientes (Expresa para cada una de ella su tamaño aproximado y luego ordénalas de mayor a menor dimensión) : a- hígado b- un paramecio c- un glóbulo rojo d- un glóbulo blanco e- una bacteria f- una mitocondria g- un cloroplasto h- una neurona i- el espesor de una membrana j- la molécula de ADN 13).- ¿Qué instrumentos permitirían observar y estudiar estructuras en cada uno de los niveles anteriores? 14) En el siguiente cuadro, señale con qué instrumento óptico o electrónico podrá observar cada estructura

TIPOS CELULARES O ESTRUCTURAS

DIAMETRO PROMEDIO INSTRUMENTO

Microtúbulos 4 nm Estructuras subcelulares nm-m

Virus 10 nm - 0.1m Micoplasmas, ricketsias 0.1m-1m

Bacterias y algas cianofíceas 0.5 m -5m Levaduras 5m

Protozoos y algas unicelulares 10-200m Células vegetales en general 10-200m Células animales en general 10-60m

Ovulo humano 100m Ovulo de avestruz 75 mm

Acetabularia (alga ) 80-100 mm

ORGANELAS CITOPLASMATICAS.- NUCLEO

OBJETIVOS -Observar y reconocer al MO diferentes morfologías celulares y localización de diferentes organelas. -Esquematizar lo observado a través de la observación e interpretación de microfotografía electrónica -Conocer la ultraestructura de los componentes celulares

BASES TEORICAS Las bases teóricas que figuran en las guías de TP tienen como función introducir a los alumnos en el conocimiento del tema a fin de lograr su mejor desempeño durante el mismo, no pudiendo suplir, al conocimiento que deberá lograr mediante la consulta bibliográfica de cada caso. En el TP Nº 1 se puso de manifiesto que dado que las células deben cumplir múltiples papeles en la enorme gama de seres vivos diferentes, existe también una gran diversidad celular. Hay, una gran variedad de tamaños y formas celulares y en cada caso la estructura final y la presencia o desarrollo de estructuras especiales es generalmente consecuencia del proceso de diferenciación que permite a las células cumplir con una función particular. El siguiente cuadro sinóptico presenta un resumen de las diversas estructuras que presentan las células animales y vegetales glucocálix Cubiertas celulares cutículas C pared celular(vegetales) Membrana plasmática Sistema vacuolar E citoplasmático Retículo endoplásmico Aparato de Golgi Organelas Envoltura nuclear L Citoplasma citoplasmáticas Lisosomas Mitocondrias Ribosomas Plástidos (vegetal) U Peroxisomas Citoesqueleto L Citosol envoltura nuclear A Nucleo carioplasma o matriz nuclear cromatina (cromosoma en división) nucléolo Toda célula durante su vida pasa por dos períodos,uno de división y otro de interfase o no división

Durante el período de interfase toda célula eucariota presenta tres componentes o compartimentos especiales. Ellos son: A.-Membrana Plasmática B.-Citoplasma C.-Núcleo Cada uno de estos componentes contiene a su vez diversas estructuras o subcomponentes,tal como se ven en el cuadro precedente. De todos ellos nos dedicaremos a: 1)Retículo endoplásmico rugoso 2)Aparato de Golgi 4)Plástidos Todas estas estructuras se consideran organelas, ya que para ello cumplen los siguientes requisitos: a)están presentes durante toda la vida de la célula o la mayor parte de ella b)presentan una morfología relativamene constante c)cumplen una función particular Fijación: Tratamiento químico o físico que mata rápidamente las células y conserva sus estructuras evitando la aparición de fenómenos de autólisis o desintegración. La observación por transmisión sólo proporciona datos si ciertas regiones del objeto absorben la luz más que otras ,es decir, si este objeto presenta contrastes. En general, los constituyentes celulares tienen muy pocos contrastes unos con respecto a otros, por lo cual se deben emplear ciertos artificios para aumentarlos. Es posible amplificar las diferencias muy pequeñas que existen entre las diversas regiones de la célula, recurriendo a montajes ópticos que utilizan la naturaleza ondulatoria de la luz, es el caso del microscopio de contraste de fases y del microscopio de interferencia. Por otra parte, se pueden crear artificialmente contrastes a nivel de ciertas estructuras celulares, para lograrlo, se realizan combinaciones, entre sus constituyentes químicos y productos que absorben ciertas longitudes de onda de luz, llamados colorantes. Como las células vivas poseen un espesor medio de 10 µm sólo pueden estudiarse en microscopios lumínicos, células aisladas o reunidas formando una capa delgada. En la mayoría de los casos las condiciones de espesor se logran efectuando cortes de no más de 5 m, para evitar que la superposición de estructuras haga la imagen confusa. Para efectuar cortes con micrótomo es necesario endurecer la muestra (por congelación, inclusión en parafina, etc.) previa fijación. Tratamiento químico o físico que mata rápidamente las células y conserva sus estructuras evitando la aparición de fenómenos de autólisis o desintegración. La observación por transmisión sólo proporciona datos si ciertas regiones del objeto absorben la luz más que otras, es decir, si este objeto presenta contrastes.

En general, los constituyentes celulares tienen muy pocos contrastes unos con respecto a otros, por lo cual se deben emplear ciertos artificios para aumentarlos. Es posible amplificar las diferencias muy pequeñas que existen entre las diversas regiones de la célula, recurriendo a montajes ópticos que utilizan la naturaleza ondulatoria de la luz, es el caso del microscopio de contraste de fases y del microscopio de interferencia. Por otra parte, se pueden crear artificialmente contrastes a nivel de ciertas estructuras celulares, para lograrlo, se realizan combinaciones, entre sus constituyentes químicos y productos que absorben ciertas longitudes de onda de luz, llamados colorantes. TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es uno de los métodos mas populares de tinción utilizado en histología y medicina diagnostica. Hematoxilina Se utiliza en histología para teñir los componentes aniónicos (ácidos) de los tejidos, a los que da una coloración violeta. Tiñe intensamente los núcleos de las células, dado que estos contienen ácidos nucleicos ricos en radicales ácidos. Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante básico, ya que el componente cromógeno reside en el complejo catiónico (básico) de la misma. Es de notar que la tinción histológica por hematoxilina no indica tanto la constitución química de los componentes celulares, sino la densidad de cargas eléctricas negativas de los mismos. Eosina La eosina es un colorante basófilo (tiene afinidad por las sustancias alcalinas), de uso ampliamente extendido en el ámbito industrial, desde la industria textil hasta el estudio biológico e histológico. El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos Azul y Púrpura, como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma. Resultados

Núcleo celular: Azul Citoplasma: Rosa Musculatura: Rojo , rosa o fucsia Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado Fibrina: Rosa

ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF (PAS) La técnica de Schiff, es una reacción colorimétrica que se usa comúnmente en citoquímica. Utiliza PAS, ácido peryódico de Schiff, o leucofucsina. La reacción oxida los grupos funcionales diol en glucosa y otros azúcares, creando aldehídos que reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color púrpura-magenta. Es una tinción utilizada para detectar glucógeno y otros polisacáridos en los tejidos permite la tinción de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo algunas membranas celulares, células caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que están rodeados por hidratos de carbono, etc.

Tincion con Nitrato de plata (técnica de Ramón y Cajal). En esta tincion las proteinas son detectadas por la reduccion diferencial de los iones plata que se unen a las cademas laterales de aminoacidos. Donde hay muchas proteínas, t iñe de color marron. Tincion con azul de toluidina: Es un colorante Básico, es decir que reacciona con los grupos anionicos de los componentes del tejido a estudiar. Son los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos SULFATO de los glucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La reacción de estos grupos varía según el pH. PARTE PRACTICA: OBSERVACION DE DIFERENTES TEJIDOS Y LOCALIZACION DE ORGANELAS. Célula vegetal Finalidad: *Realización de la preparación microscópica. *Observación de los componentes celulares típicos de una célula vegetal y las características del tejido elegido Materiales: *Cebolla. *Acido acético al 50% *Lugol, azul de metileno o hematoxilina. *Pinzas, tijera, escalpelo, portas y cubres, cuentagotas. Método: 1) Interesa como material, la epidermis interna de una escama de bulbo de cebolla. Para obtenerla, se corta una cebolla en dos mitades. Se separa manual-mente en cascos, sacando entre cada dos cascos una capa fina y translúcida, que es, precisamente, la epidermis interna, y se lleva a una cubeta de agua (o cápsula de Petri) para que se desenrolle. 2) Cortar dos trozos de esta epidermis. 3) Un trozo se coloca entre porta y cubre con una gota de agua, cuidando que quede bien extendido y sin burbujas de aire 4) El otro trozo se sumerge en ácido acético al 50% durante 1 ó 2 minutos (fijación); luego en el colorante elegido, durante 2 min y posteriormente se coloca entre porta y cubre para su observación. Observación: (Recordar que para observar preparados sin teñir, debe reducirse la entrada de luz, y en todos los casos, comenzar con aumentos débiles) Las células de la epidermis de la cebolla, poligonales y grandes, se hallan íntimamente adheridas unas con otras. La pared se destaca muy clara teñida por el colorante. En las células vivas se ven los núcleos aplanados (con 2 o más nucleolos) adosados a la pared. A medida que las células van degenerando, el núcleo se redondea y tiende a situarse en el centro.

El citoplasma tiene un aspecto bastante claro, en él se distinguen algunas vacuolas grandes, débilmente coloreadas. En algunas ocasiones se observa que la preparación tiene a manera de mosaico, otros estratos de células; estas proceden de las capas más internas de las hojas que facilmente han podido ser arrancadas al desprender la epidermis. Para la observación es más adecuado utilizar las zonas constituidas por un único estrato epidérmico. Es característica de las epidermis vegetales que sus células carezcan de cloroplastos, con excepción de las células estomáticas.

1) Dibujar un trozo de epidermis de cebolla a pocos aumentos.

2) Dibujar una célula a gran aumento, señalando pared celular, vacuolas y núcleo.

Diagnóstico:...................... Coloración:................... Aumento:.............. Plástidos Objetivo: Reconocer cloroplastos, cromoplastos y leucoplastos en material vegetal fresco Características: Estas organelas exclusivas de la célula vegetal y algas eucariontes, pueden diferenciarse en plástidos incoloros o leucoplastos y plástidos coloreados cromoplastos y cloroplastos. A.-Los leucoplastos están rodeados por una doble membrana, no contienen pigmentos y se caracterizan por acumular sustancias de reserva. B.-Los cromoplastos también están limitados por una doble membrana y presentan pigmentos diferentes de la clorofila.Su función es dar color a las flores y frutos,a fin de dotarlos de una coloración atractiva para los animales que intervienen en la polinización y dispersión defrutos y semillas. C.-Los cloroplastos, de importancia fundamental para la célula vegetal, ya que en

ellos se lleva a cabo el fenómeno de fotosíntesis. Poseen clorofila como pigmento principal, pero, puede tener diversas cantidades de otros pigmentos. El cloroplasto posee forma ovoide o de disco biconvexo con 10 um de largo x 3um de diámetro. Está limitado por dos membranas que no presentan puntos de contacto. En el interior presenta una matriz o estroma, donde se encuentran ribosomas pequeños (tipo procarionte) y una molécula de ADN circular y un sistema de membranas. Las membranas internas del cloroplasto se disponen formando vesículas aplanadas llamadas tilacoides.Estos se agrupan como pilas de moneda formando los grana.Los grana también están comunicados entre sí mediante vesículas. Observación de plástidos al MO A.-Leucoplastos: en papa,puede observarse que los gránulos de almidón están incluidas en leucoplastos. Se los ve como delgadas capas concéntricas depositadas alrededor de un punto, el hilio. B.-Cromoplastos:se pueden observar en pulpa de tomate o de morrón. Se acumulan con mucha frecuencia alrededor del núcleo como pequeñas esferas coloreadas. C.-Cloroplastos:en epidermis de hoja de lirio o malvón,se observa, entre las células epidérmicas, unas células arriñonadas agrupadas por parejas, que forman los estomas; en estas células se encuentran cloroplastos, que se ven como esferas de color verde.

A B Diagnostico………………………. Diagnostico…………………….. Aumento-………………………… Aumento…………………………

Diagnostico………………………. Diagnostico……………………..

Célula animal Finalidad: Observación de células anucleadas y mononucleadas *Colorante May-Gründwal Giemsa Observación En un frotis de sangre observamos distintos elementos que se diferencian entre sí, por su tamaño, color y estructura del núcleo, cuando éste existe. Los que predominan, son de tamaño mediano, de color rojo anaranjado y sin núcleo: los glóbulos rojos, eritrocitos o hematíes. Si recordamos que el diámetro de los eritrocitos es de aproximadamente 7 um, esos elementos nos podrán servir para calcular aproximadamente el tamaño de los otros elementos presentes en el mismo campo microscópico. Otras células algo mayores (10 a 12 um ),tienen núcleo lobulado ( 2,3,4 ó 5 lóbulos) de color violeta oscuro. Son glóbulos blancos que poseen granulaciones citoplasmáticas. De ahí el nombre de granulocitos. Otros glóbulos blancos, de tamaño similar al de los hematíes (8 um) con núcleo violeta oscuro, ligeramente escotado y escaso citoplasma, son los linfocitos. Los monocitos,son también leucocitos de 12-20 um con núcleo redondeado u oval, de color violeta oscuro. Resultados *Observe y dibuje los elementos de la sangre, señalando los tipos celulares según las descripciones anteriores (con 400X y 1000X)

Diagnóstico:...................... Coloración:................... Aumento:............... Finalidad: Observación de célula multinucleada (célula muscular estriada voluntaria) en un preparado definitivo de corte de lengua Observación: Las células o fibras del tejido muscular estriado voluntario de la lengua, cortadas longitudinalmente, se presentan en forma de cintas angostas, de color rojo, con varios núcleos situados en la periferia. Con mayor aumento y movimiento del micrométrico es posible observar una estriación transversal, sumamente apretada que corresponde a las zonas claras y oscuras de las miofibrillas(diferenciaciones citoplasmáticas que intervienen activamente en la contracción muscular) En corte transversal, las fibras aparecen poligonales, con ángulos redondeados, todas ellas de espesor semejante, separadas unas de otras por tejido conectivo. En estos cortes es posible establecer bien la posición periférica de los núcleos. Resultados -Observe y dibuje una fibra cortada longitudinalmente, señalando los núcleos y estriación transversal Diagnóstico:...................... Coloración:................... Aumento:............... Retículo Endoplasmático Rugoso

Finalidad:

Reconocer la localización del RER en células secretoras de un acino pancreático

Características: El RER constituye la mayor parte del sistema vacuolar citoplasmático ( o sistema de endomembranas).Está formado por túbulos y sacos aplanados cuya superficie externa presenta ribosomas asociados, encargados de la síntesis de proteínas. Por esta razón se encuentra muy desarrollado en células que participan activamente en la síntesis de proteínas, como por ejemplo las células de los acinos pancreáticos que producen las enzimas del jugo pancreático. Funciones del RER 1.-Sostén mecánico 2.-Acumulación y procesamiento de proteínas exportables 3.-Intercambios entre la matriz citoplasmática y los compartimentos del retículo (los iones y las moléculas pequeñas que son transportados a través de las membranas del retículo) 4.-Distribución intracelular de sustancias Observación al M.O. del RER en células de acino pancreático El páncreas es una glándula de secreción mixta (endócrina y exócrina). Como glándula exócrina produce un jugo que contiene enzimas importantes para la digestión del alimento El jugo pancreático va ser vertido en el intestino por un conducto. Las células que sintetizan las enzimas se hallan dispuestas en las glándulas en pequeños acúmulos, cada uno de los cuales se llama acino. En ellos, las células están dispuestas rodeando una pequeña luz central hacia donde envían su secreción, que luego pasará a un sistema de conductos. Cada célula del acino se asemeja a una porción de un pastel con base ancha y vértice estrecho. La secreción, de acuerdo a esta disposición es liberada por el vértice de la célula pudiéndose verse porque aparece en forma de cuerpos redondeados denominados gránulos de zimógeno (o granulos de secrecion, contienen proteínas enzimáticas inactivadas). El citoplasma cercano a la base de la célula tiene color azul oscuro que pone de manifiesto una considerable cantidad de ARN que se concentra en esta parte. Esta gran cantidad de RNA debe su presencia a que se están sintetizando proteínas activamente. Con el ME se observa que estas partes basales que se tiñen intensamente presentan vesículas aplanadas y túbulos membranosos muchas veces dispuestos paralelamente, con ribosomas adheridos a sus superficies externas Método de tinción: Azul de toluidina

Diagnóstico:............................................................................................................... Coloración.................................................................................................................. Aumento..................................................................................................................... Aparato de Golgi-Dictiosomas

Finalidad Reconocer la localización del aparato de Golgi en corte de epidídimo

Características: Es una parte diferenciada del sistema de endomembranas. Al ME se observa como un apilamiento de sacos aplanados, dispuestos concéntricamente, con una cara convexa (proximal) y una cóncava (distal), con bordes dilatados y vesículas y vacuolas ubicadas cerca de esos bordes. En las células que presentan una estructura polarizada su ubicación es definida y se presenta entre el núcleo y el polo de la célula, donde se libera la secreción El tamaño y distribución dentro de la célula y otras características (como el nº de sacos apilados) varía de acuerdo al estado metabólico de la célula. El aparato de Golgi en células animales es único y bien desarrollado. En células vegetales, en cambio, se divide en numerosas estructuras y recibe el nombre de dictiosoma. Todo el sistema vacuolar citoplasmático parece ser una estructura muy dinámica. Es muy probable que esa dinámica esté dada por el flujo de membranas o interconversiones entre las membranas de las distintas estructuras que lo componen. Funciones del aparato de Golgi 1.-Circulación intracelular de sustancias 2.-Síntesis de polisacáridos complejos (ejemplo: celulosa) 3.-Formación de glucoproteínas de secreción 4.-Concentración, condensación y empaquetamiento de sustancias de

secreción dentro de una vesícula limitada por una membrana 5.-Concentración y empaquetamiento de enzimas hidrolíticas dentro de una vesícula limitada por una membrana (formación de lisosomas primarios) 6.-Formación del fragmoplasto en la división de células vegetales Observación al MO de la localización de aparato de Golgi en epidídimo El epidídimo es un órgano que forma parte del aparato reproductor masculino. Está formado por un conjunto de túbulos que se ubican por encima de cada testículo y cumple con la función de completar la maduración de los espermatozoides, que logran allí su completo poder fecundante. Se ha elegido este órgano para la observación del aparato de Golgi por su gran actividad secretoria que facilita la observación de la organela en sus células. Importante: Recordemos que en el M.O. lo que se puede observar es la localización de las organelas, ya que su estructura se encuentra por debajo del poder de resolución de este instrumento Técnica de tinción :Ramón y Cajal (Nitrato de plata)

Células caliciformes

Finalidad *Reconocer vesículas de secreción en células caliciformes, en corte de vellosidad intestinal.

Características:Son células especializadas en secretar moco. Reciben su nombre porque la porción supranuclear de las células suele hallarse distendida por la secreción, tanto,que la célula adopta la forma de copa o cáliz. El ME muestra que la secreción de las células caliciformes se halla acumulada en las vesículas del Aparato de Golgi. Elegimos un corte de vellosidades intestinales, porque éste presenta células caliciformes en abundancia, las que mediante el moco que secretan, protegen a la mucosa intestinal de los daños químicos y mecánicos a los que se encuentra expuesta.

Diagnóstico:............................................................................................................... Coloración: ……………… ….. ................................................ Aumento:......................................

Método de tinción: P.A.S.(Schiff).Este reactivo se utiliza para el reconocimiento de mucopolisacáridos;que en este caso tiñe la secreción de púrpura.

Diagnóstico:............................................................................................................... Coloración.................................................................................................................. Aumento..................................................................................................................... BIBLIOGRAFIA Alberts,B;Bray D;Lewis,U y col.Biología Molecular de la célula.Ed Omega. España.1986 Berkaloff y col. Biología y Fisiología celular.Ed Omega.España.1987. Curtis Helen. Biología.Ed Panamericana.BsAs.1992 De Robertis y De Robertis. Biología celular y molecular.Ed El Ateneo.1986

ACTIVIDADES DE AUTOEVALUACION 1.- Diferencie: Núcleo de nucleolo REL de RER cloroplastos de mitocondrias 2.-¿Cuáles son las principales diferencias entre una célula animal y una célula vegetal? 3.-¿Cuál es la interacción entre ribosomas, retículo endoplasmático, aparato de Golgi y vesículas de secreción, en la síntesis y envío del nuevo material de membrana y en la exportación de proteínas por la célula? 4.-En función de los conocimientos de la relación organelas-función que componentes esperaría que fuesen los más destacados en cada uno de los siguientes tipos celulares? -célula muscular -espermatozoide -células de las hojas verdes -glóbulos blancos 5) Por qué el REL no puede funcionar como RER ? 6) Que función cumplen las vacuolas en una célula? Por Que luego de un rato de mantener el preparado de la célula vegetal en un portaobjetos vemos que se comienzan a “arrugar”?

FFOOTTOOSSIINNTTEESSIISS yy RREESSPPIIRRAACCIIOONN INTRODUCCION: Es probable que, el primer organismo fotosintético, haya aparecido hace 3000/3500 millones de años atras. La atmósfera en la que evolucionaron las primeras células no tenía oxígeno libre. Con el advenimiento de la fotosíntesis, los organismos logran modificar el ambiente, y de tal forma, que en nuestros días la vida terrestre es posible gracias a este proceso. Esencialmente, en la Fotosíntesis, las plantas captan la energía lumínica y la emplean para formar carbohidratos y oxígeno libre a partir de CO2 y H2O . Los carbohidratos los utilizan como materia prima y la energía química, para su crecimiento; el exceso lo almacenan como reserva, en forma de Almidon, Inulina, etc. El proceso fotosintético en su forma mas sencilla y concreta, consiste en: Impulsar con la energía solar, una corriente de electrones desde el agua a un aceptor cuyo potencial lo capacite para cederlo a una molécula de CO2 que de esta manera se reduce. Para que éste fenómeno se lleve a cabo es ademas necesario, la clorofila, el pigmento que poseen todos los vegetales verdes.

LA FOTOSINTESIS COMPRENDE DOS ETAPAS

Etapa lumínica Ocurre en los tilacoides y se utiliza la energía luminosa

Se sintetizan productos que van a ser utilizados en la etapa siguiente como el ATP y el NADPH , ademas se genera oxígeno que se libera a la atmósfera (O2) y agua.

Etapa oscura Ocurre en el estroma del cloroplasto y es independiente de la presencia o ausencia de

luz. En esta etapa se produce la fijación y reducción del dióxido de carbono, mediante una serie de transformaciones metabólicas, resultando finalmente un compuesto orgánico

que va a ser utilizado en otros procesos metabólicos con el fin de obtener energía biológicamente útil para la célula.

La fotosíntesis puede expresarse mediante la siguiente fórmula

luz y clorofila 6CO2 + 6H2O C6H12O6 (glucosa) + 6O2

Objetivos A partir de los conocimientos referidos a los fenómenos de fotosíntesis y respiración, el objetivo del presente práctico es desarrollar en el alumno la capacidad de: - Interpretación de tablas - Interpretación de gráficos - Razonamiento y resolución de un problema experimental

A continuación se describen dos experimentos típicos en el estudio del fenómeno de la fotosíntesis, el ensayo I: Disco de hoja flotante y el ensayo II: Determinación de la liberación de 02 / fijación de CO2 por utilización de un indicador de pH. Dichos experimentos fueron desarrollados para responder a los siguientes objetivos - Inferir la existencia del desprendimiento de ciertos gases en un vegetal - Determinar el efecto de presencia o ausencia de la luz como fuente de energia - Relacionar el desprendimiento de O2 con la presencia o no de Clorofila - Relacionar los procesos de fotosíntesis y respiración

Luego de leer e interpretar la etapa experimental y los diferentes resultados obtenidos, razone en particular, discuta en grupo y redacte las probables causas que generaron los resultados obtenidos

ENSAYO DE DISCO DE HOJA FLOTANTE

ETAPA EXPERIMENTAL I 1-Se rotularon 3 jeringas de 5 ml (1-2-3) colocándole en c/u 3 ml de solución de Infiltración (Acido Cítrico (0.1M), PO4HNa2 (0.2M) y 1 gota de detergente Tween 20) 2- Con un sacabocado se cortaron discos de hojas de 6 mm de diametro. A las jeringas 1 y 2 se les colocó a c/u 10 discos de hojas de espinaca y a la jeringa 3 se le colocaron 10 discos de hojas de planta jaspeada o blanca (Sansiviera o repollo blanco) 3- se tapa fuertemente el cono para evitar la salida de liquido y de presiono el embolo hasta ver que que los discos vegetales sedimentaron 4- Se extrajo la solución de infiltración de las tres jeringas reeemplazándola por 5 ml de solución de bicarbonato [Acido Cítrico (0.1M), PO4HNa2 (0.2M) y CO3HNa (0.02 M)]. 5- Se ubicaron las jeringas 1 y 2 en una gradilla próximos a una lámpara encendida de 150 watt. interponiendo una cubeta con agua entre la lámpara y los tubos . 6- se cubrio la jeringa 3 con papel de aluminio y se lo llevó a la oscuridad total. 7- Se toma el tiempo cero y a medida que los discos van ascendiendo en función del tiempo.se van anotando en una planilla diseñada al efecto. A los 60 minutos se da por finalizado el ensayo ETAPA EXPERIMENTAL II No se realizara en el transcurso del TP 1- Luego de los 60 min del ensayo de la etapa experimental I, el tubo 1 es colocado en total oscuridad.

2- Se toma el tiempo cero y a medida que los discos van descendiendo en función del tiempo.se van anotando en una planilla diseñada al efecto. A los 60 minutos se da por finalizado el ensayo.

ENSAYO DE DISCO DE HOJA FLOTANTE 1 2 3 Colocar 3 ml de Solución de Infiltración a cada tubo Cortar con sacabocados los discos de hoja de ambas especies vegetales elegidas y colocar 10 discos en cada tubo Aplicar vacio hasta que los discos se depositen en el fondo del tubo. Retirar la Solución de Infiltración y agregar 10 ml de la Solución de Bicarbonato a cada tubo. Llevar a una fuente de luz a los tubos 1 y 3 y dejar en total oscuridad al tubo 2

Interponer entre la fuente de luz y los tubos 1 y 3 una cubeta de vidrio transparente llena de agua fria LIBERACION DE OXIGENO/FIJACION DE ANHIDRIDO CARBONICO

ESPINACA REPOLLO BLANCO

RESULTADOS

ETAPA EXPERIMENTAL I

Los discos sedimentados en los diferentes tubos experimentales comenzaron a ascender en función del tiempo. Se recabaron los valores obtenidos y al cabo de una hora de ensayo se obtuvieron los siguientes resultados. Tabla 1 Cantidad de discos que ascendieron al final del ensayo (60 min) en los diferentes tubos experimentales.( Media n= 5)

DETALLE TUBO TIEMPO INICIAL TIEMPO FINAL

Espinaca + Luz 1 arriba

0 abajo

10 arriba

10 abajo

0 Espinaca + Oscuridad 2 arriba

0 abajo

10 arriba

2 abajo

8 Jaspeada + Luz 3 Arriba

0 abajo

10 arriba

4 abajo

6 Tabla 2 Cantidad de discos que ascendieron en los diferentes tubos experimentales en función del tiempo. ( Media n= 5) T I E M P O (en min )

Tubo 0’ 5’ 10’ 15’ 20’ 25’ 30’ 45’ 60’ 1 0 2 4 5 6 7 8 10 10

2 0 0 0 1 1 1 2 2 2

3 0 0 1 2 2 2 3 4 4

Gráfico 1: Evolución del ascenso de los discos vegetales en función del tiempo en los diferentes tubos experimentales. .( Media n= 5) (Tubo 1 ____ , Tubo 2 ......... y Tubo 3 - - - - - )

Cuando se incorporó a los resultados el correspondiente desvio estandar para cada uno de los puntos analizados se obtuvo el siguiente gráfico Gráfico 2: Evolución del ascenso de los discos vegetales en función del tiempo en los diferentes tubos experimentales. .( Media Desvio estándar, n= 5)

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Tiemp o en minutos

Nº d

e di

scos

flot

ante

s

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Tiempo en minutos

Nº d

e di

scos

flot

ante

s

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

ETAPA EXPERIMENTAL II

Tabla 3 Cantidad de discos que se encuentran en la superficie del buffer (flotando) en los diferentes tiempos de análisis. ( Media n= 5) T I E M P O (en min )

Tubo 0’ 5’ 10’ 15’ 20’ 25’ 30’ 45’ 60’ 1 10 10 9 7 6 5 3 1 0

Gráfico 3: Evolución del descenso de los discos vegetales en función del tiempo ( Media n= 5) (Tubo 1 ____ )

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Tiempo en minutos

Nº d

e di

scos

flot

ante

s

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

La siguiente serie de items deberá ser resuelta en grupos de no mas de 5 alumnos quienes generaran un informe que deberá ser presentado al final del trabajo práctico

1) En el primer paso de la etapa experimental I se utiliza una solución de infiltración - Que utilidad tiene el Tween 20 ?

2) Cual es la razon para que los discos al inicio del ensayo floten en la solución de

infiltración? 3) Cual es la causa para que el vacio generado en el tubo haga sedimentar los discos? 4) Una vez sedimentados los discos de hoja, se reemplaza la solución de infiltración

por la solución de bicarbonato. - Que utilidad se le da al bicarbonato? - Que sucederia si los discos se mantuvieran inmersos en agua destilada?

5) Cuando se colocan los tubos frente a la lámpara - Porque cree que es imprescindible el colocar un recipiente con agua interpuesto

entre el tubo y la fuente de luz? - Que estima que sucedería si no lo coloca?

6) Cual cree que es la causa por la cual los discos comienzan a ascender? - Fundamente en relación al fenómeno de fotosíntesis 7) Que resultados esperaría encontrar si compara varios ensayos con fuentes de luz

de diferente intensidad?. Si obtiene diferentes resultados cual sería la causa probable?

8) Fundamente las probables causas de las diferencias detectadas entre los diferentes

tubos del grafico 1 9) Cuando se incorporó a los resultados el correspondiente desvio estandar para cada

uno de los puntos analizados se obtuvo el gráfico 2. Estimativamente, cree Ud que existen diferencias significativas entre los tres ensayos? Porque?

10) Si Ud realizara un experimento comparativo relacionando discos de brotes de hoja

verde y discos de hoja verde adulta de la misma planta - Espera encontrar diferencias? - Si las hubiera, cual sería el resultado y cual sería la causa?

11) Si a la solución de bicarbonato se le hubiera agregado un herbicida cuyo

mecanismo de acción reside en el bloqueo del fenómeno de fotosíntesis,

- Que esperaría observar y porque? - Si a pesar de la presencia del herbicida los discos se siguen comportando igual,

cuales serían las caracteristicas particulares de esa planta frente a dicho herbicida.

12) Cual es la causa que explique los resultados obtenidos en la segunda etapa (ver

Tabla 3 y Gráfico 3)

ENSAYO II LIBERACION DE OXIGENO/FIJACION DE ANHIDRIDO CARBONICO ENSAYO CON INDICADOR DE pH Materiales y drogas necesarios: Pipetas de 5 y de 10 ml, tubos de ensayo, papel cartulina negro, estufa de cultivo, vaselina, Azul de Bromotimol pH 7.8-8.0, Elodea o Microphillum (un brote) Importante: La solución de Azul de Bromotimol en esas condiciones de pH es de color azul y vira al amarillo cuando el pH baja, es decir, cuando el medio se acidifica , volviendo a tomar el color azul cuando el medio se alcaliniza

Etapa Experimental En una serie de 4 tubos de ensayo se colocaron los reactivos y las cantidades que se indican a continuación en la Tabla Nº 1 Tabla Nº 1:

TUBO Nº 1 2 3 4

AZUL DE BROMOTIMOL

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

INSUFLAR AIRE

SI

SI

NO

NO

ELODEA (un brote)

SI

NO

SI

NO

VASELINA O.5 ml O.5 ml 0.5 ml 0.5 ml El paso que consistió en insuflar aire se realizó con una pipeta burbujeando la solución del Azul de Bromotimol acidificando el medio hasta hacerlo virar.al color amarillo Vuelque en la Tabla Nº 2 el color que estima que presentará la muestra en cada tubo al iniciar la experiencia Inicio de la Experiencia 1- Los tubos 1 y 2 se expusieron a la luz. Los tubos 3 y 4 se cubrieron con cartulina negra y se colocaron en estufa a 30 C 2- Se esperó 90 minutos

ENSAYO CON INDICADOR DE pH

1 2 3 4 Colocar 10 ml de la solución de Azul de Bromotimol Insuflar aire a los tubos 1 y 2

Colocar la planta acuática en los tubos 1 y 3 Agregar 0,5 ml de Vaselina a los 4 tubos Poner la fuente de luz a los tubos 1 y 2 Colocar en estufa a 30ºC (en total oscuridad) a los tubos 3 y 4

30 ºC Oscuridad

3- Si Ud ha seguido el procedimiento paso a paso y teniendo en cuenta lo que ya conoce sobre el proceso de fotosíntesis y sumado a los datos que se le proporcionaron sobre el Azul de Bromotimol, discuta con su grupo y responda lo siguiente:

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

1- Que utilidad cree Ud que tiene el agregado de los 0,5 ml de vaselina? 2- Porqué el medio se acidifica al insuflar aire haciendo que el indicador de pH vire al

amarillo? 3- Vuelque sus predicciones en la Tabla Nº2 Tabla Nº 2: Escriba en las correspondientes casillas del cuadro el color que presenta la muestra al inicio de la experiencia y luego escriba el color que estima que presentará al final

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4

INICIO

FINAL 4- Que cambios en el color de la muestra espera que ocurran en cada Tubo en el transcurso de la experiencia?. - Fundamente su predicción relacionando con el proceso de fotosíntesis el resultado

estimado en cada tubo 5) Observaría en alguno/s de los tubos desprendimiento de gas ? - En cual/les? - Que gas supone que es ? - Porque

6) Cuales diferencias espera encontrar si compara brotes jóvenes con hojas ya

adultas?

R E S P I R A C I Ó N C E L U L A R La respiración celular ocurre en la mayoría de las células de plantas y animales. Tiene lugar en la mitocondria, donde la energía de los nutrientes convierte ADP a ATP, el cual es utilizado para todas las actividades celulares que requieren energía. En este Practico Ud. va a analizar que sucede en el proceso de respiración con semillas de maíz y investigara el efecto de la temperatura sobre la velocidad de respiración.

De que manera puede ser medida la velocidad de respiración?

C6H12O6 (glucosa) +6O2 6CO2 +6H2O + ATP Cuando uno observa la ecuación para la respiración celular, puede ver que hay por lo menos tres formas de hacerlo: 1. Medir la cantidad de glucosa consumida. 2. Medir la cantidad de oxigeno consumida. 3. Medir la cantidad de dióxido de carbono producido. En este experimento nosotros vamos a medir la cantidad de oxigeno consumido.

Características y funciones de un respirómetro La ilustración muestra las características básicas de un respirometro. Esto nos permite medir cambios en el volumen de gas, relacionado con el consumo de oxigeno.

Ud. podrá construir un respirómetro poniendo

un pequeño organismo en un vial con una

pipeta adosada como se ilustra. En el

ejemplo se usó un grillo, en el experimento de laboratorio que Ud. va a analizar se usara

maíz, Recuerde, que la respiración celular ocurre tanto en células de animales como de

plantas.

Pipeta: aire fresco equilibrado con el aire del vial, vía este tubo.

El aire en el vial, es una mezcla de gases, incluido O2.

Organismo vivo: la mayoría de los organismos requieren O2.

Tapón: impide que los gases y el agua filtren dentro del

El algodón protege el organismo del KOH cáustico.

KOH se combina con CO2 para formar un precipitado sólido.

Como trabaja el respirometro Cuando la pipeta del respirometro es sumergida, no puede entrar aire adicional Como el O2 es consumido, la presión de los gases dentro del respirometro decrece, esto causa que entre agua a la pipeta. El CO2 que se produce se combina con el KOH para formar un precipitado sólido de K2CO3. Note que a medida que el volumen de gas dentro decrece, la presión de agua fuera del vial fuerza al agua a entrar en la pipeta. La cantidad de agua que entra a la pipeta es directamente proporcional a la cantidad de oxigeno consumida por el organismo (en este caso por el grillo).

Como se lee la pipeta El agua en una pipeta se adhiere a los lados del tubo y forma una superficie curva llamada menisco Por practica común, todas las lecturas son hechas sobre el fondo del menisco. Las unidades para esta pipeta son ml

Diseño Experimental En este experimento se comparan las velocidades de respiración en semillas de maíz germinadas, a la velocidad en semillas en estado latente (semillas secas). Ud. va a poder comparar a dos diferentes temperaturas: 12oC and 22oC. Además, Ud. podrá comparar estas velocidades a un control no metabólico. Porque es importante tener un control? Es importante que los tres viales contengan un igual volumen de contenidos. Ud. debe adicionar bolitas de vidrio al vial con semillas en estado latente, puesto que las semillas secas ocupan menos espacio que una igual cantidad de semillas germinadas. Recomendaciones :

1. Ud. necesita usar una capa de algodón no absorbente entre el KOH y las semillas. 2. El tapón debe estar firmemente colocado para un cierre hermético. Chequee que las

semillas o las bolitas no bloqueen el orificio de la pipeta. 3. Deje los respirómetros equilibrar por algunos minutos en sus respectivos baños de

agua. Esto minimiza los cambios de volúmenes debidos a cambios en la temperatura del agua

Midiendo la velocidad de reacción El volumen de gas está relacionado a la temperatura del gas. De acuerdo a la Ley de los Gases (V=nRT/P), un cambio en la temperatura va a causar un cambio directo en el volumen. Como la temperatura en el respirómetro puede variar durante el curso del experimento, Ud. debe corregir las diferencias en volumen que son debidas a fluctuaciones de temperatura antes que a velocidad de respiración. Para lograr esto sustraiga cualquier diferencia en el movimiento de agua en el vial con las bolitas de vidrio del vial experimental mantenido a la misma temperatura. Registre el resultado como la diferencia correcta.

Análisis de Resultados Después que Ud. ha colectado datos sobre la cantidad de oxigeno consumido en función del tiempo por semillas de maíz germinadas y no germinadas a dos diferentes temperaturas, Ud. puede construir un gráfico, colocando en el eje de las y los cambios de volumen y en el de las x el cambio en el tiempo. Podrá luego calcular y comparar las velocidades de respiración en las distintas curvas. ¿Cómo se calcula la velocidad? Velocidad es la pendiente de la curva o y x En este caso, y es el cambio en volumen y x es el cambio en tiempo (10 min).

1. En cada uno de los 3 viales, empape el algodón absorbente con solución de KOH.

2. Cubra con algodón no absorbente seco

3. Al vial #1, sume 25 semillas de maíz germinadas, su organismo vivo

4. Al vial#2, sume 25 semillas de maíz no germinadas, y suficiente bolitas de vidrio para igualar el volumen del vial#1

Tape cada vial con un tapón perforado con una pipeta, con la punta hacia fuera

Sume un peso a cada vial.

5. Al vial#3, sume un igual volumen de bolitas de vidrio, su control no metabólico.

1.Coloque los tres respirómetros en un baño de agua a 10°C con las puntas de las pipetas apoyadas sobre un cabestrillo por encima del nivel del agua. Déjelos en esta posición algunos

2.Baje las puntas de las pipetas en el agua. 3. Tome una lectura inicial de cada respirómetro. 4. Tome lecturas de cada respirómetro a intervalos de 5 minutos para los próximos 15 min.. 5. Use el segundo set de tres viales para medir la velocidad de respiración en un baño a 25°C.

Analize la siguiente tabla

Vial 1

germin Vial 2

No germ

Vial 3 Control

Vial 1 germin

Vial 2 No

germin

Vial 3 control

Tiempo 12oC 12oC 12oC 22oC 22oC 22oC

0 minuto

0.08

0.09

0.09

0.12

0.11

0.085

5 minutos

0.24

0.17

0.099

0.72

0.24

0.09

10 minutos

0.39

0.22

0.1

1.27

0.33

0.091

15 minutos

0.5

0.23

0.1

1.7

0.38

0.09

20 minutos

0.61

0.26

0.095

2.12

0.43

0.091

Cuestionario Sobre la base del gráfico responda las preguntas.

1. Cuál de los siguientes aseveraciones es verdadera (basado en los datos)?.

La cantidad de oxigeno consumido por maíz germinado a 22oC es aproximadamente dos veces la cantidad de oxigeno consumido por las germinadas de maíz a 12oC

La cantidad de oxigeno consumido es igual en ambos casos, en semillas de maíz no germinadas y germinadas durante el periodo inicial de 0 a 5 minutos.

La cantidad de oxigeno consumido en las semillas germinadas a 12 oC a los 10 minutos es 0.4 ml O2/minute

La cantidad de oxigeno consumida es mayor para semillas no germinadas a 12 oC que a 22oC. Si el experimento fuera desarrollado por 30 minutos la velocidad de consumo de oxigeno debería

decrecer.

Semillas germinadas a 22ºC. Semillas germinadas a 12ºC. Semillas no germinadas a 22ºC Semillas no germindas a 12ºC

2. Cuál es la velocidad de consumo de oxigeno en semillas de maiz germinadas a 12oC? 0.08 ml/in 0.04 ml/min. 0.8 ml/min. 0.8 ml/in 1.00 ml/in

3. Cuál de las siguientes conclusiones es apoyada por los datos? a) La velocidad de respiración es mayor en semillas no germinadas que en semillas germinadas. b) Semillas de maíz no germinadas no son viables y no muestran diferencias en la velocidad de

respiración a diferentes temperaturas. c) La velocidad de respiración en semillas germinadas debería haber sido mayor si el experimento

fuera conducido bajo luz solar. d) La velocidad de respiración incrementa como incrementa la temperatura en semillas germinadas

como no germinadas. e) La cantidad de oxígeno consumida debería incrementarse si las semillas de maíz fueran

reemplazadas por semillas de arvejas. 4. Cuál es el rol del KOH en este experimento? a) Sirve como un dador de electrones para estimular la respiración celular. b) Por descomposición del KOH, el oxigeno necesario para la respiración celular es liberado. c) Sirve como fuente temporaria de energía para la respiración del organismo. d) Se une con el dióxido de carbono para formar un sólido, previniendo que la producción de CO2

afecte el volumen de gases. e) Su atracción por el agua causa la entrada de agua al respirometro.

BIOLOGÍA CELULAR Y SISTÉMICA TRABAJO PRÁCTICO Nº 4

MITOSIS

Aunque resulta difícil de pensar, un ser vivo multicelular y complejo como un mamífero, por ejemplo, fue alguna vez una única célula: el huevo o cigota. Una vez formada, la cigota comienza a dividirse activamente: una primera división dará lugar a dos células hijas; luego, cada una de esas células hijas se dividirá nuevamente en dos, que sufrirán una nueva división y así sucesivamente. El proceso de división celular por el que una célula madre da lugar a dos células hijas idénticas entre sí e idénticas a las que les dio origen se denomina MITOSIS. Cuando se indica que la Mitosis da lugar a dos células idénticas a partir de una célula madre, se lo hace desde dos puntos de vista: 1.- con respecto a la información genética 2.- en relación con el número de cromosomas EL PROCESO DE DIVISION MITOTICA: Para poder estudiarlo con mayor claridad, en la división mitótica se pueden distinguir varias etapas. Además, debe considerarse lo que ocurre antes del comienzo del proceso, lo cual es clave para poder comprender la división en su totalidad. INTERFASE

Si las dos células producto de una división mitótica han de recibir el mismo

número de cromosomas que tenía la célula madre que les dio origen, es evidente que - antes de comenzar el proceso - el material genético de esta última debe duplicarse. En ese momento, cada cromosoma pasará de estar formado por una cromátide (una molécula de ADN), a estar formado por dos cromátides (dos moléculas de ADN). Ambas moléculas de ADN son idénticas entre sí, es decir, ambas llevan exactamente la misma información genética. Dicho de otro modo, los cromosomas pasarán de simples a dobles.

Para ser exactos, en este momento no podemos hablar con propiedad de cromosomas. El material genético en esta etapa de la vida de la célula se ve al microscopio como una red difusa y laxa a la que llamamos cromatina. No es que los

cromosomas no existan en esta etapa; simplemente, no podemos reconocerlos ni individualizarlos, ya que presentan un estado poco condensado.

Cromatina y cromosomas son términos que aluden, ambos, a ADN unido a proteínas. Lo que los diferencia es el grado de plegamiento (y, consecuentemente, de compactación) del material que los forma y el hecho de ser observables en distintos momentos de la vida de la célula (la cromatina en interfase y los cromosomas durante la división). PROFASE

Esta es la primera etapa del proceso. Los principales fenómenos que ocurren

en ella, son: los cromosomas, que ya se habían duplicado en interfase, se han ido acortando y

aparecen como estructuras más compactas. la envoltura nuclear se desorganiza y deja de hacerse visible, como así también

el nucléolo. los centríolos, que también se han duplicado, migran uno a cada polo de la

célula. entre ambos centríolos se organiza el huso acromático, formado por

microtúbulos compuestos por una proteína, la tubulina. Esta estructura será la que permitirá la migración de los cromosomas hacia los polos de la célula.

PROMETAFASE Se denomina así a la transición entre la profase y la metafase. Se trata de un

período muy corto durante el cual los cromosomas quedan en aparente desorden. Posteriormente, las fibras del huso acromático invaden la zona central y sus microtúbulos se extienden entre los polos de la célula.

METAFASE

Los cromosomas, completamente condensados, se unen a algunas de las fibras del huso acromático y se ordenan en el plano ecuatorial de la célula.

ANAFASE

Durante esta etapa los centrómeros de los cromosomas se dividen longitudinalmente, por lo que ambas cromátides de todos los cromosomas se separan y comienzan a dirigirse hacia los polos, unidos a fibras del huso acromático. En la anafase los microtúbulos que forman el huso se acortan entre un tercio y un quinto de su longitud.

Aquí podremos observar a los cromosomas en forma de V; los metacéntricos con brazos iguales, los submetacéntricos con brazos distintos.

TELOFASE

El final de la migración de los cromosomas a los polos de la célula señala el principio de esta etapa: los cromosomas comienzan a descondensarse, por lo cual vuelven a asemejarse

a filamentos delgados. la envoltura nuclear de las células hijas se organiza y se torna visible. Lo mismo

ocurre con el nucléolo.

Lo que hemos visto hasta aquí ha ocurrido a nivel del núcleo celular. A esta división a nivel nuclear se la conoce como cariocinesis.

No obstante, durante la telofase también se da una división citoplasmática. A esta división se la denomina citocinesis. En las células animales, el citoplasma se constriñe en la zona central de la célula, comenzando desde la periferia y progresando hacia el centro. Esta constricción se acentúa y profundiza hasta que la célula se divide, quedando los componentes citoplasmáticos de la célula madre repartidos entre las dos células hijas.

Si volvemos ahora a la cigota de la cual hablábamos al principio, vemos como a través de la división mitótica, se ha dividido en dos células idénticas a ella, que sufrirán posteriores divisiones por este mismo proceso. De esta manera, la mitosis aparece como la base del proceso de crecimiento. Más tarde, éste estará acompañado por el fenómeno de diferenciación. Además del crecimiento, también la mitosis es el proceso por el cual se produce la regeneración de tejidos y células.

OBJETIVOS DEL TRABAJO PRÁCTICO: Se espera que los alumnos En el plano conceptual: Distingan y comprendan los principales fenómenos que ocurren durante la

división de células somáticas. Comprendan el proceso de división mitótica en términos de la conservación de la

identidad de la información genética y de la constancia del número cromosómico. En el plano procedimental: Observen cromosomas en las distintas etapas mitóticas y registren los resultados

de dichas observaciones. Observen imágenes animadas del proceso y extraigan las ideas principales.

DESARROLLO: Primera parte: Observación de cromosomas en células de raíz de cebolla en división (coloración: hematoxilina férrica; aumento: 400X), identificación de las etapas mitóticas y registro. A.- Usted deberá observar los preparados que se le presentarán, buscar e identificar las etapas mitóticas correspondientes y dibujarlas en los campos que figuran a continuación:

INTERFASE PROFASE PROMETAFASE

METAFASE ANAFASE TELOFASE Segunda parte: Observación de imágenes animadas del proceso mitótico y actividades. B. - Luego de haber visto el video y luego de formar con otros compañeros un grupo de no más de cinco personas, deberá resolver las cuestiones que se le plantean. ACTIVIDADES: De las siguientes afirmaciones referidas a la MITOSIS: ¿cuál/es consideran

correctas? 1. Es un proceso que, al producir variabilidad genética, se torna importante para la

evolución biológica. 2. Las células sexuales maduras, luego de sufrir mitosis, restablecen el número

diploide de cromosomas.

3. Luego de completado el proceso mitótico, cada una de las células hijas ha heredado una de las cromátidas hermanas de cada uno de los cromosomas de la célula. Esquematice con dos colores distintos.

4. Previo a la mitosis, luego del proceso de duplicación del ADN, cada molécula de

ADN ha pasado a estar formada por dos cadenas polinucleotídicas.

5 Si en una especie hipotética el número haploide fuera n = 18 ¿cuál es el número de cromosomas que tendría una célula somática de un organismo de dicha especie? ¿Qué cantidad de moléculas de ADN encontraríamos en el núcleo de dicha célula en el momento en que está por comenzar la mitosis? ¿Y al finalizarla?

6 Supongan que cuentan con ciertas células eucariotas diploides que pueden

dividirse asexualmente in vitro, en un medio con nutrientes especiales. El experimento comienza con células que no han comenzado la fase S premitótica, que como recordarán, es la fase en la que ocurre la replicación del ADN. Se colocan esas células en una solución de nutrientes que contiene numerosos nucleótidos radiactivos que pueden incorporarse a las nuevas cadenas de ADN sintetizadas por la ADN polimerasa. Utilizando dos colores distintos, esquematicen la doble hélice del ADN de un cromosoma en las situaciones siguientes:

a) En G1, es decir, antes de la fase S.

b) En G2, previo a la división mitótica.

MEIOSIS

OBJETIVOS -Distinguir en observación microscópica núcleos interfásicos y núcleos en division -Observar e identificar las distintas fases meioticass. . -Observar fases meióticas en microfotografías. -Relacionar los procesos de meiosis y gametogénesis.

Introducción: Los procesos de mitosis y meiosis, sus fases y resultados, fueron exhaustivamente analizados en las clases teóricas previas al trabajo práctico. Por lo tanto, solo se revisarán los conceptos básicos de cada tema. MEIOSIS: Es un proceso que comprende dos divisiones nucleares, seguidas de sus correspondientes divisiones citoplasmáticas. A partir de una célula diploide, se obtienen en la primera división meiótica, dos células haploides (con cromosomas constituídos por dos cromátidas), y en la segunda división meiótica, cada una de ellas da lugar a dos células haploides así se obtienen cuatro células haploides, a partir de la diploide original. Como recordará, en la Profase I meiótica ocurre intercambio de material genético entre cromosomas homólogos, por lo que las cuatro células producto de meiosis, son geneticamente diferentes entre sí y con respecto a la que les diera origen. La meiosis ocurre en células sexuales, y tiene como resultado la formación de gametas (óvulos y espermatozoides haploides). A éste proceso se lo llama GAMETOGENESIS y segun el resultado sea la formación de óvulos o espermatozoides, al proceso lo denominamos Ovogénesis o Espermatogénesis. MEIOSIS I - División reduccional Para su mejor estudio describimos varios períodos: Profase I, Metafase I, Anafase I y Telofase PROFASE I: Es el período más prolongado de la meiosis, a la vez para su mayor

comprensión consideramos varias subetapas: a. Leptonema: Los cromosomas se presentan como largas fibras, delgadas, poco espiralizadas. Las cromátidas no son visibles.

b. Cigonema: Los cromosomas homólogos se alinean y aparean de una manera altamente específica, este proceso es llamado

sinapsis.

El apareamiento comprende la formación del complejo sinaptonémico, una estructura proteínica que se halla interpuesta entre los homólogos. Al par de cromosomas homólogos apareados lollamamos bivalente.

c. Paquinema: Los homólogos se aparean íntegramente ( en toda su longitud ). Los cromosomas se visualizan más cortos y gruesos debido al alto grado de espiralización. Cada unidad es ahora una tétrada, compuesta por dos homólogos, es decir cuatro cromátidas. Las dos cromátidas de cada cromosoma se denominan cromátidas hermanas.

Durante el Paquinema es característico el intercambio de segmentos, proceso llamado entrecruzamiento o crossing-over. Este intercambio de material cromosómico es una fuente importante de variabilidad genética.

a. Diplonema: Los cromosomas apareados empiezan a separarse, aunque permanecen unidos en los puntos de intercambio o quiasmas.

b. Diacinesis: La contracción de los cromosomas llega a su máximo, los cromosomas homólogos siguen unidos por los quiasmas que ahora se ubican en los extremos ( terminalización de los quiasmas ).

Mientras ocurren los procesos antes mencionados, se desorganiza la envoltura nuclear y se organiza el huso acromático.

METAFASE I

Los homólogos unidos como en diacinesis se asocian por sus centrómeros a las fibras del huso, ubicándose en el plano ecuatorial de la célula. ANAFASE I Se separan los homólogos cada uno hacia polos distintos de la célula. Hacia finales de esta etapa puede observarse el comienzo de la citocinesis ( división del citoplasma ). Cabe aclarar que la migración de los cromosomas hacia polos opuestos de la célula es al azar.

TELOFASE I

Los cromosomas ubicados en los polos de la célula se reagrupan. Cada polo recibe la mitad del número de cromosomas de la célula origina. Se completa la citocinesis. Luego de este período puede existir un intervalo llamado intercinesis.

MEIOSIS II - División ecuacional Esta segunda división es muy parecida a la Mitosis, excepto que no va precedida por una duplicación del ADN. Al comienzo de esta división los cromosomas pueden haberse dispersado un poco, pero vuelven a condensarse. También aquí describimos varios períodos.

PROFASE II Se organiza nuevamente el huso acromático. Los cromosomas se unen a las fibras del mismo por sus centrómeros. METAFASE II Los cromosomas ( cada uno formado por dos cromátidas ) se ubican en el plano ecuatorial.

ANAFASE II

Al igual que en la anafase mitótica las cromátidas hermanas de cada cromosoma se separan, migrando hacia polos distintos de la célula. TELOFASE II

Se desorganiza el huso acromático, se forman las envolturas nucleares. Ahora hay cuatro núcleos hijos, cada uno de los cuales tiene la mitad del número de cromosomas de la célula progenitora.

La citocinesis ocurre del mismo modo que tras la mitosis.

CONSECUENCIAS DE LA MEIOSIS La meiosis desde el punto de vista genético se considera un mecanismo destinado a distribuir al azar los genes maternos y paternos en las gametas. Esta distribución al azar es la consecuencia de dos procesos que tienen exclusivamente durante la meiosis. Ellos son: - La recombinación genética o crossing over. · - La segregación al azar de los cromosomas homólogos.

Ambos sucesos son fuente de variabilidad genética. A su vez las fallas en la segregación al azar de los homólogos en la Anafase I y II, conduce a aberraciones cromosómicas que provocan graves patologías (por ej. El Sindrome de Down). GAMETOGÉNESIS

El proceso antes descripto es el que ocurre en aquellas células destinadas a formar células sexuales. Según el tipo de organismo del que se trate, podemos hablar de una gametogénesis (es decir que la meiosis produce gametas ) o esporogénesis ( cuando los productos son esporas ). En el caso de las gametas, se originan por meiosis los óvulos femeninos y los espermatozoides masculinos. En ambos casos, se trata de células especiales, las gametogonias, las que en los órganos reproductivos (ovarios y testículos ) van a experimentar la meiosis y así originar las gametas.

La serie de cambios que conducen a la formación de espermatozoides, empieza con la conversión de las espermatogonias en espermatocitos I, son éstos los que

experimentan la primera división meiótica, originando dos espermatocitos II, estas células ya son haploides. Cada uno de los espermatocitos II experimentan la segunda división meiótica, dando origen así a cuatro espermátidas. Posteriormente estas células se diferencian en espermatozoides a través de un proceso denominado espermiogénesis .

Para la formación de los óvulos en los ovarios, la célula primordial es la ovogonia que se diferencia en ovocito I. Éste pasa por una división meiótica para producir un ovocito II y un cuerpo polar, que es una célula de pequeño tamaño. Esta primera división comienza en la mujer en el tercer mes de vida fetal, se detiene en profase I avanzada reiniciándose en el momento de la ovulación. La segunda división meiótica que produce el óvulo y un segundo cuerpo polar, sólo ocurre después de la fecundación. El cuerpo polar también puede dividirse pero de todas formas son células que no intervienen directamente en la fecundación.

COMPARACIÓN ENTRE MITOSIS Y MEIOSIS

AUTOEVALUACIÓNA.- Observe, analice y compare los siguientes esquemas:

ESPERMATOGENESIS Células germinales

o o o o embrionarias Mitosis ...........................

o o espermatogonias Crecimiento ...........................

o espermatocito Meiosis I ...........................

o o espermatocito II Meiosis II ............................

o o o o espermátidas Diferenciación ............................ 0 0 0 0 espermatozoides OVOGENESIS Células germinales O O O embrionarias Mitosis ....................... O O ovogonias Crecimiento .......................

o ovocito I Inicio meiosis I ....................... detención en profase I

o ovocito I Completamiento ....................... de meiosis I

o o ovocito II Meiosis II .......................

o o o o óvulo corpusculos polares ....................... 1) Para cada célula nombrada en los esquemas, complete la línea de puntos indicando: a) si es 2n o n b) si los cromosomas son dobles o simples

2) Número de células como resultado final. En la Ovogénesis:.....................................células En la Espermatogénesis:.........................células 3) Las gametas resultantes son haploides o diploides? ............................................................................................................................... 4) Son genéticamente iguales o distintas entre sí? ................................................................................................................................ 5) Teniendo en cuenta las características de las células que se forman como resultado de la mitosis. En que procesos biológicos tiene importancia la misma? ................................................................................................................................... 6) Cual es la importancia biológica de la meiosis ? ................................................................................................................................... 7) Que proceso biológico tiene como base la meiosis ? ................................................................................................................................... C) Observe las microfotografías de fases meióticas Analícelas e interprételas CUADRO COMPARATIVO D) Completar los datos omitidos en el siguiente cuadro comparativo entre los procesos de mitosis y meiosis.

M E I O S I S M I T O S I S

En células de la línea germinal (gametogénesis) (animales de repr. sexual)

En células somáticas

Apareamiento de homólogos ............................................. Profase I compleja y complicada N O Se segregan homólogos en Anafase I (no hay ruptura de centrómeros)

..............................................

.............................................................. Una división nuclear

..............................................................

..............................................................

..............................................................

Producto final: 2 células diploides a partir de 1 celula diploide

El ADN se duplica solo una vez ............................................... Variabilidad genética: a) Segregación independiente y al azar de homólogos en Anafase I (Probabilidad: 2n) b) Intercambio de fragmentos de ADN (Crossing-over)

............................................... ............................................... ...............................................

1.- Distinga entre cromátidas hermanas y cromosomas homólogos. Indique en que etapa del ciclo celular se sintetiza el material que forma las cromátidas hermanas 2.- Compare la gametogénesis femenina y masculina humana en cuanto a: a) duración del proceso de división b) frecuencia con que se realiza durante la vida del individuo c) momento en que se completa la división d) número de células funcionales ( aptas para la reproducción) resultantes 3.- Explique y ejemplifique la diferencia que existe entre un organismo haploides y diploide 4.- Considere una célula 2n= 6 . Esquematice una meiosis de ésta célula suponiendo la existencia de un entrecruzamiento en cada par de homólogos Indique en que momento se produce la división reduccional y cuando se separan las cromátidas hermanas