microbiología y biotecnología - fc.ens.uabc.mxfc.ens.uabc.mx/documentos/manuales/manual...

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE CIENCIAS

Microbiología y biotecnología MANUAL DE PRÁCTICAS

BIOLOGIA: PLAN DE ESTUDIOS 2008

M. en C. Miguel Humberto Carrillo Mendívil

Microbiología y biotecnología

2 Miguel Humberto Carrillo Mendívil

CONTENIDO

No. de práctica

Nombre de la práctica No. Página

1a Bioseguridad 4

1b Observación al microscopio de preparaciones fijas 9

2 Preparación de medios de cultivo y la necesidad de practicar la técnica aséptica

12

3 Importancia de la técnica aséptica (ubicuidad de los microrganismos)

15

4 Observación morfológica de las colonias bacterianas 18

5 Técnicas de inoculación 24

6 Tinción de microorganismos 29

7 Tinción de esporas 34

8 Aislamiento de microorganismos aerobios mesofilos 40

9 Determinación del número de microorganismos esporógenos en alimentos

48

10 Recuento de bacterias heterótrofas totales en el suelo 51

11 Uso de los medios de cultivo 58

12 Efecto de los agentes físicos sobre los microrganismos 64

13 Efecto de los agentes químicos sobre los microrganismos 70

14 Relación entre los microorganismos y caries dental 76

15 Coeficiente fenólico 78

16 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico

80

17 Estudio bacteriológico de bivalvos 82

Apéndice 1 Formato para presentar el reporte 84

Bibliografía 86



REGLAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Localizar todos los equipos de seguridad como extinguidores, lavador de ojos,

regaderas, etc.

Proteger los ojos si trabajará con reactivos corrosivos, peligrosos o con luz

ultravioleta.

Usar bata de laboratorio, lo protegerá del material corrosivo o blanqueadores.

Nunca pipetee con la boca o pruebe algún reactivo.

No fumar, comer o beber en el laboratorio.

El pelo largo de preferencia recogerlo.

No usar sandalias con los pies descubiertos.

No colocar los libros o cuadernos en el área de trabajo.

Reporte cualquier daño o accidente en el laboratorio.

Pregunte al maestro cualquier duda en el manejo de reactivos y/o equipos.

Todos los reactivos pueden ser un riesgo para la salud, trabaje con cuidado.

La mayoría de las prácticas de este laboratorio usan reactivos cancerígenos o

tóxicos, así como agentes potencialmente patógenos, trabaje con seriedad y

cuidado.

En caso de contaminarse con algún reactivo lavarse con agua rápidamente y

avisar al maestro.



UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA

PRÁCTICA No. 1a

Bioseguridad

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será capaz de trabajar en un laboratorio de

microbiología de forma segura para preservar su salud, la de sus compañeros y la del medio; así

como de aplicar los conocimientos para disminuir algún riesgo biológico.

Introducción:

TELÉFONO DE EMERGENCIA 066

El laboratorio constituye el lugar de trabajo en la enseñanza y en la investigación, por eso

es preciso conocer las características que debe reunir. Existen algunos puntos comunes a casi

todos los tipos de laboratorio:

Localización y orientación del laboratorio: su localización depende del trabajo que en él se

realice. Por ejemplo, un laboratorio de biología marina debe ubicarse, obviamente cerca del

mar o en el mismo mar (barco) y no en una montaña, así como debe de buscarse que las

ventanas estén orientadas de forma tal que sea la iluminación natural la que predomine.

Instalaciones: las principales son: calefacción y ventilación, desagüe y provisión de agua,

gas, electricidad, líneas de vacío y aire a presión, iluminación.

1. La ventilación puede ser natural o artificial, debe de evitarse la formación de corrientes

de aire, ya que pueden perjudicar aparte del material de estudio, al personal que labora en

el laboratorio.

2. Deben evitarse los sistemas de desagüe abierto o de cámaras alimentadas para varios

sumideros. Los materiales de construcción deben ser capaces de soportar todas las

condiciones impuestas, para lo cual se recomienda usar caños y uniones de material

resistente a ácidos y solventes.



3. Es necesario que los conductos para los cables eléctricos, gas, agua, etc, sean accesibles y

estén fuera de los lugares de paso y además lleguen por instalaciones ocultas o

superficiales pero de forma que no obstruyan las superficies de las mesas.

4. La iluminación puede ser natural o artificial, la más conveniente por su intensidad es la

natural.

Entre los requisitos principales para los materiales de construcción tenemos:

a) Superficies lisas no porosas

b) Resistentes a la corrosión

c) No iónicas

d) Resistentes al calor

e) Impermeables

El conocimiento de las reglas de seguridad es de vital importancia para TU seguridad y la

de tus compañeros, lo más importante es pensar siempre con sentido común. La mayoría de los

accidentes en el laboratorio podrían haberse evitado si no se hubiera actuado irreflexivamente.

Los descuidos o el desconocimiento de posibles peligros en el laboratorio pueden originar

accidentes de efectos irreversibles. Es importante, por tanto, que cumplas con las instrucciones

que te indique el instructor acerca del cuidado que se debe tener en el laboratorio

Los mayores peligros en un laboratorio no son el fuego y las descargas eléctricas, sino el

descuido y la irresponsabilidad. Ocasionalmente, se producen accidentes por una falta en el

diseño, con frecuencia, por un mantenimiento no apropiado y en la mayoría de los casos, por un

operador que actúa antes de pensar. Es necesario que antes de empezar las sesiones de

laboratorio leas y comprendas y lo que en él se va a realizar, sigue las siguientes

recomendaciones.

La realización de las actividades experimentales además de cumplir con el objetivo para

el cual fueron diseñadas, deben de realizarse dentro de un ambiente de seguridad que nos permita

trabajar con un mínimo de riesgo, para lo cual deben de seguirse ciertas normas. Lee

detalladamente las siguientes reglas.

1. Prepárate siempre para cualquier experimento, leyendo las instrucciones antes de ir al

laboratorio. Ten presente todas las precauciones indicadas en la guía. LO QUE NO

ENTIENDAS PREGUNTASELO AL INSTRUCTOR ANTES DE EMPEZAR A

TRABAJAR. Cerciórate bien de lo que se está haciendo y de lo que hacen tus compañeros.

Evita las bromas y juegos en el laboratorio, así como comer y beber.

2. Nunca efectúes un experimento distinto al indicado sin previa autorización del instructor,

ASEGURATE DE QUE TE ESCUCHO BIEN, EFECTÚA CONTACTO VISUAL CON EL.



3. Siempre porta la bata dentro del laboratorio, así como el equipo de protección indicado en

cada práctica. Registra en tu cuaderno de notas, las técnicas empleadas y los resultados así

como las modificaciones que se hayan realizado.

4. Si llegara a ocurrir algún accidente en el laboratorio, informa inmediatamente al profesor y/o

al auxiliar de laboratorio y si es posible proporciona ayuda

a) Incendios: usa extintor o manta para sofocar incendios; los incendios pequeños se apagan

con una toalla; si el fuego alcanza a una persona se debe conducir inmediatamente a la

ducha (regadera) de seguridad, en caso de no contar con ella, enrollarla en la manta y

darle vueltas en el piso, nunca se debe permitir que una persona corra con las ropas

incendiadas pues esto aviva la combustión. Conserva la calma y evita situaciones

alarmistas innecesarias.

b) Ingestión de productos químicos: si accidentalmente se ingiere un ácido o un álcali fuerte,

proceder como se indica:

- Para ácidos: suministrar hielos, clara de huevo y conducirlo a servicios médicos.


- Para álcalis: suministrar vinagre o jugo de limón, leche, aceite de cocina y conducirlo

a servicios médicos. TELÉFONO DE EMERGENCIA 066

- Para sales como el nitrato de plata: agua y sal y conducirlo a servicios médicos.


c) Quemaduras externas con ácidos: lavar abundantemente con agua corriente y

posteriormente lavar con solución de bicarbonato de sodio al 1 % w/v. TELÉFONO DE

EMERGENCIA 066

d) Quemaduras externas con álcali: lavar abundantemente con agua corriente y

posteriormente lavar con solución de ácido bórico al 2 % w/v. TELÉFONO DE

EMERGENCIA 066

PARA LOS CASOS ANTERIORES SE DEBE DE FIJAR SI EL ACCIDENTADO ESTA

CONSCIENTE, NUNCA, nunca, NUNCA, NUNCA, SE DEBEN DE DAR LÍQUIDOS A UNA

PERSONA INCONSCIENTE.

5. No se deben probar o saborear los productos químicos o biológicos que estén bajo análisis,

tampoco se debe de comer o de llevar objetos a la boca. Bajo ninguna circunstancia se deben

de oler los cultivos microbianos

6. No toques nunca los cultivos con la mano, a menos que se le autorice DE FORMA

EXPLICITA A ELLO. Para manipularlos usa espátulas, asas bacteriológicas, pinzas, etc.

lávate las manos antes de salir del laboratorio.

7. Cuando dejes de usar un reactivo o una solución, regrésala a su lugar. Conserva en la mesa

de trabajo el mínimo de equipo y materiales necesarios y opera en condiciones de limpieza.

8. Al preparar cualquier solución de sustancias químicas se deben de seguir las instrucciones de

las prácticas o las que se indiquen en la dosificación de los reactivos. Una vez preparada se

deben envasar y etiquetar indicando de:

a. que sustancia y concentración se trata

b. fecha de preparación y caducidad

c. nombre de quien la elaboró

d. condiciones de almacenamiento



e. cuidados especiales (si procede).

9. Al prender la llama de un mechero, usa de preferencia un encendedor largo, préndelo primero

y colócalo sobre la parte superior del propio mechero (conectado a la toma de gas), enseguida

abre la llave del gas hasta obtener la intensidad de la flama requerida; ajustar en caso

necesario, el paso del aire para obtener una buena combustión. Al darse cuenta de una fuga

de gas, no se deben encender cerillos ni luces. SE DEBEN DE abrir puertas y ventanas para

que se ventile y no provocar una explosión. Una vez ventilada el área y solucionado el

problema, se podrá trabajar.

10. Deja pasar bastante tiempo para que se enfríen el vidrio y los objetos calientes antes de

guardarlos y/o manipularlos.

11. Cuando trabajes con equipo de vidrio, como tubos y termómetros, presta mucha atención

pues es un material frágil y se rompe fácilmente pudiendo producirte lesiones, estos

desafortunadamente son accidentes frecuentes.

12. Todos los sólidos y papeles que sean desechados se deben de arrojar a un recipiente

adecuado para desechos. No arrojar al drenaje cerillos, papel filtro, sólidos poco solubles o

cualquier material no indicado. NUNCA DEPOSITAR dos reactivos químicos juntos si se

desconoce su reactividad.

13. Antes de usar un reactivo o una solución se debe leer la etiqueta para identificarlo, tomar la

cantidad exacta y necesaria y tapar enseguida el frasco. En caso de duda, leer la hoja de

seguridad para tal reactivo (MSDS, por sus siglas en inglés), estas se encuentran en una

libreta en el almacén o en el laboratorio de donde tomaste el reactivo o medio.

14. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los compuestos utilizados, pese

solamente lo necesario. Guarda los frascos de las sustancias que hayas utilizado,

perfectamente tapados y limpios, las sustancias que así lo requieran deben guardarse en

frascos ámbar.

15. La mesa y el equipo de trabajo deben estar limpios antes de iniciar el experimento, debes de

cerciorarte de que tienes todo lo necesario en tu mesa de trabajo. Al finalizar la sesión, todo

debe quedar limpio antes de salir del laboratorio. Si se derrama algún reactivo o mezcla o

cultivo, AVISA AL MAESTRO O INSTRUCTOR para que te oriente acerca de la forma

correcta de limpiarlo. Los equipos se deben colocar en su sitio correspondiente. Cerciórate de

que las llaves de agua, aire, vacío y gas quedaron perfectamente cerradas, así como revisar

los aparatos y las instalaciones eléctricas. NINGÚN APARATO DEBE QUEDAR

ENCENDIDO SIN MOTIVO.

16. Al desconectar un aparato eléctrico del contacto, jala de la clavija, NUNCA del cable. No te

expongas a un corto circuito.

17. Antes de lavar recuerda que los materiales que contuvieron cultivos deben esterilizarse

primero. El lavado de material de vidrio, porcelana se efectúa comúnmente con detergente

líquido y agua fría o caliente. El lavado se repite varias veces, el material se revisa y se deja

escurrir después de haberlo enjuagado con agua destilada. Se recomienda secar el material

antes de usarlo. En ocasiones es posible que no baste con el simple lavado por lo que deben

de usarse escobillones de diferentes tamaños (procedimiento mecánico, pm).

¡CUIDADO! ESTO LO HARÁ SÓLO EL PERSONAL CALIFICADO PARA

TRABAJAR CON SUSTANCIAS REACTIVAS. Si los procedimientos anteriores no han dado



el resultado deseado, se puede lavar con sustancias químicas como ácido clorhídrico, ácido

nítrico, solución de hidróxido de sodio, agua regia, solución de permanganato de potasio,

hidróxido de amonio concentrado, etc. Se vierte el ácido o la solución de lavado y se deja

bastante tiempo y luego se procede al lavado. Los materiales grasosos pueden lavarse con mezcla

crómica, la cual puede calentarse para acelerar su acción. ¡CUIDADO! ESTO LO HARÁ SÓLO

EL PERSONAL CALIFICADO PARA TRABAJAR CON SUSTANCIAS REACTIVAS.

El trabajo en el laboratorio requiere frecuentemente de conexiones y de dispositivos sencillos

que podemos fabricar nosotros mismos. Con este fin se utiliza la tubería de vidrio, las mangueras

de látex y los mecheros de gas.

Cuestionario:

1. Explica cuales son las partes de la flama de un mechero y sus usos en el laboratorio

2. Explica las diferencias entre los mecheros bunsen y Fisher

3. ¿Cuál es el número al que debes de llamar en caso de una emergencia?








PRÁCTICA No. 1b

Observación al microscopio de preparaciones fijas

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será capaz de determinar diferentes características

microscópicas de los microorganismos utilizadas para su identificación y clasificación por medio

del uso adecuado del microscopio óptico.

Introducción: debido a su pequeño tamaño (menor a 0.2 mm), los microorganismos deben de

ser tratados para poder observarlos, este tratamiento involucra un procedimiento para fijarlos a

una placa de vidrio (portaobjeto) para ser posteriormente teñidos y luego observados con un

instrumento que aumente su tamaño. En los laboratorios se emplea de forma común para

observarlos el microscopio óptico que tiene un límite de resolución (0.2 µm) que es menor al

tamaño de los microbios.

El microscopio consta fundamentalmente de partes mecánicas y ópticas. La parte mecánica,

soporte o cuerpo del microscopio, es en esencia un armazón mecánico que sostiene el sistema

óptico del aparato. Las características del soporte deben ajustarse a las necesidades funcionales

de los componentes de la parte óptica, a los cuales debe mantener sólidamente unidos entre sí, de

modo que no sufran vibraciones ni distorsiones y se mantengan siempre perpendiculares al eje

óptico que las atraviesa. Al mismo tiempo, el soporte debe estar provisto de mecanismo que

permita el desplazamiento de estas unidades a lo largo del eje óptico, de modo que puedan

variarse las distancias a que se encuentran. Finalmente la platina o pieza que sostiene la

preparación, debe formar ángulo recto con el eje óptico.

El soporte consta de un pie o base para darle estabilidad al microscopio y evitar que resbale,

sujeto al pie se encuentra el brazo, que es el que lleva las tres unidades ópticas del microscopio

así como los mecanismos para el enfoque, el brazo consta de la parte por donde se coge el

microscopio y se llama asa, la pieza que sostiene la preparación denominada platina y el tubo

que es la parte donde están montados los oculares en la parte superior y los objetivos en la parte

inferior.



La pieza que sostiene la preparación se llama platina que tiene movimientos de arriba a abajo y

de derecha a izquierda, debajo de ella se encuentra la subplatina que es el dispositivo donde va

montado el condensador, también en el brazo están los tornillos que permiten el enfoque, el

macrométrico que es el de ajuste rápido y grosero y el tornillo micrométrico que es el de ajuste

lento y preciso.

Los tres elementos ópticos del microscopio son: oculares, objetivos y condensador. De estos tres

el objetivo es el más importante ya que éste produce la imagen aumentada del objeto y la calidad

de esta imagen en cuanto a sus detalles estructurales y aspecto general no puede ser mejorada por

los demás elementos. Los microscopios que se utilizan en la facultad están dotados de objetivos

parafocales, que significa que si cualquiera de ellos está enfocado, al cambiar de objetivo, éste

queda prácticamente enfocado, de modo que, en todo caso será suficiente una ligera graduación

con el tornillo micrométrico para conseguir un enfoque perfecto. Esto es más evidente cuando se

pasa de objetivos de gran aumento a objetivos de pequeño aumento, ya que los últimos tienen

una gran profundidad de enfoque y puede suceder fácilmente que el enfoque inicial no esté bien

centrado sino que se realice en la parte superior o inferior de la profundidad de campo. Por tanto

para la comprobación de la parafocalidad de los objetivos conviene hacer el enfoque inicial con

el objetivo de mayor aumento sin inmersión y pasar después a los demás objetivos de mayor a

menor aumento. El aumento nominal es el que viene grabado sobre el cuerpo del objetivo y

aumento total es el aumento que se observa por el ocular, para calcularlo basta multiplicar el

aumento primario (nominal) por el del ocular.

La segunda unidad óptica fundamental del microscopio es el ocular, su objetivo es aumentar la

imagen producida por el objetivo, con el fin de que pueda llegar aumentada al ojo del

observador.

El tercer elemento óptico básico del microscopio es el condensador, su finalidad primordial es

iluminar la preparación en la parte enfocada por el objetivo de modo que el campo visual

presente una iluminación uniforme, una segunda finalidad es la de suministrar al objetivo un

cono de luz del tamaño y naturaleza adecuadas para la obtención de resultados óptimos.

Material:

Microscopio

Aceite de inmersión

Laminillas con tinciones bacterianas

Papel secante

Procedimiento:

Coloca el microscopio de forma estable en la mesa y ubica todos sus componentes.



Toma una laminilla y límpiala de algún residuo de aceite o de polvo, a continuación colócala en

la platina y sujétala con las pinzas del carro móvil. Enfoca primero con el objetivo de menor

aumento (lupa) y localiza un área que sea fácilmente visible, continua con el siguiente objetivo

en aumento (seco débil) y así hasta finalizar con el de mayor aumento sin inmersión (seco

fuerte), pata comprobar la parafocalidad repite esta operación a la inversa, esto es, disminuye de

aumento. Regresa al seco fuerte y sin desenfocar, mueve el revólver (donde se encuentran los

objetivos) y déjalo en un punto intermedio, coloca una pequeña gota de aceite de inmersión y

enfoca ahora con el objetivo de inmersión en aceite, ésta es la imagen que debes de reportar,

fíjate en la forma de las células y en su agrupación, así como en el color que presentan.

Repite lo anterior con otra laminilla.

Cuestionario:

1. ¿Cuál fue el procedimiento que se te indicó para enfocar correctamente las muestras a

observar?

2. ¿Cuáles son las partes ópticas de un microscopio y cuál es la función de cada una de

ellas?








PRÁCTICA No. 2

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y LA NECESIDAD DE PRACTICAR LA

TÉCNICA ASÉPTICA

Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será competente para preparar medios de cultivo

sólidos y líquidos, de esterilizarlos, vaciarlos en cajas petri y tubos así como de practicar la

técnica aséptica y ver de manera objetiva la importancia de ésta.

Introducción: los microorganismos son ubicuos en la naturaleza, los podemos encontrar en el

aire, agua, tierra y aún en el interior de los organismos. Por éste motivo es necesario que al

investigar la presencia de determinados microorganismos o el número de ellos, el material a usar

esté libre de ellos (estéril.) Para esto se ejercen las técnicas asépticas y la esterilización del

material.

Las bacterias pueden ser clasificadas en autótrofas y heterótrofas, dentro de las primeras

se encuentran las bacterias del suelo y del agua, que obtienen C y N de la atmósfera y de la

materia inorgánica simple. Las heterótrofas requieren compuestos orgánicos (proteínas,

carbohidratos y grasas) como fuente de C y N.

Las proteínas se suministran como peptonas preparadas por digestión parcial de la carne

con enzimas pépticas. Los carbohidratos suministran el C necesario. Otros factores como las

vitaminas del complejo B, son requeridos por algunas bacterias (auxótrofas). En ocasiones es

necesario complementar los medios de cultivo con nutrimentos complejos como suero, sangre,

yema de huevo, etc. (medios enriquecidos) Existen medios de cultivo en donde los ingredientes

necesarios son conocidos en su totalidad (medios mínimos). En los medios mínimos que no

llevan metabolitos esenciales crecen los microorganismos protótrofos.

Los aerobios obligados precisan de una atmósfera con oxígeno para su desarrollo; los

anaerobios obligados son incapaces de reproducirse en presencia de oxígeno libre, los que

pueden reproducirse tanto en presencia como en ausencia de oxígeno son los anaerobios

facultativos.

Los microorganismos cuya temperatura óptima es menor es de 15 0C o menos y una

temperatura mínima de crecimiento de 0 0C o menos, se consideran psicrófilos verdaderos, los

microorganismos que crecen a temperaturas por arriba de los 45 o 50 0C se les llama termófilos.

Aquellos cuya temperatura mínima está por arriba de los 15 0C y su temperatura máxima por

debajo de los 45 0C, son los llamados mesófilos. A las temperaturas mínima, máxima y óptima se

les llama temperaturas cardinales.

Material:

Agar nutritivo

Caldo nutritivo



Detergente

Papel estraza

2 pipetas de 1 mL

1 pipeta de 10 mL

Una espátula

Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL

Una piceta con alcohol

Una piceta con agua destilada

Balanza granataria

Testigos de esterilización

4 cajas petri de vidrio

4 tubos con rosca

Un mechero Fisher

Procedimiento:

1. NO LIMPIES LA MESA DE TRABAJO

2. Limpia de polvo perfectamente todo el material de vidrio.

3. Lava perfectamente dos cajas, dos tubos con rosca, una pipeta de 1 mL, la pipeta de 10 mL y

los dos matraces con detergente.

4. Enjuaga el material lavado perfectamente con agua destilada (para evitar dejar restos del

detergente).

5. Prepara 50 mL de caldo nutritivo y coloca 10 mL en cada uno de los 4 tubos con ayuda de la

pipeta de 10 mL (El caldo se prepara en un matraz y luego se transfiere a tubos)

6. Prepara 100 mL de agar nutritivo en el matraz erlenmeyer restante, fúndelo (El agar se

prepara en un matraz erlenmeyer de al menos el doble del volumen de agar que se preparará).

CUIDADOSAMENTE con el mechero, USA GUANTES PROTECTORES. Deja enfriar a

más o menos 45 0C.

7. Vacía agar en las dos cajas que no lavaste, deja solidificar sin taparlas.

8. Envuelve las cajas y la pipeta de 1 mL que lavaste con papel estraza.

9. Coloca dentro del autoclave el material envuelto en papel estraza, dos de los tubos que

contienen caldo nutritivo y el matraz con el resto del agar que preparaste y esterilízalos (121 0C/15 min). Usa testigos de esterilización.

10. Con ayuda de la pipeta de 1 mL que no envolviste, transfiere un mL de un tubo a otro de los

que no metiste a la autoclave y regresa el mL al tubo original de la misma forma, este es un

ciclo, repite el ciclo 5 veces no enciendas el mechero, no cierres la puerta, puedes hablar

mientras trabajas (márcalos nEnA).

11. Verifica que las cajas que vaciaste en el paso 7 ya solidificaron, puedes tocarlo con los dedos,

para asegurarte de su estado (márcalas nEnA).

12. LIMPIA LAS MESAS CON AGUA Y JABÓN Y POSTERIORMENTE CON ALCOHOL.

CIERRA PUERTAS Y VENTANAS.

13. Cuando sea el tiempo de sacar el material del autoclave (presión cero y temperatura inferior a

80 0C), hazlo.

14. Vacía 25 mL por caja, haz esto con el mechero encendido. Cierra las cajas y deja solidificar

en reposo (márcalas EA.).



15. Con una pipeta ESTÉRIL, pasa 1 mL de un tubo con caldo estéril a otro con caldo estéril,

con el mechero encendido (márcalos EA.) Haz la operación inversa. Repite el ciclo 5 veces.

16. Cada vez que vacías agar en una caja petri recuerda que lo debes de dejar solidificar.

17. Incuba todo el material a 37 0C por 24 horas, recuerda que las cajas van en posición

invertida, esto es, con la tapa hacia abajo, el agar debe de quedar arriba.

18. Revisa tu material al día siguiente y anota tus observaciones

19. Etiqueta tu material NO CONTAMINADO y guárdalo en el refrigerador

Cuestionario:

1. ¿Porque las cajas petri se incuban en posición invertida?

2. ¿Qué es un testigo de esterilización?

3. ¿Qué es esterilización?

4. ¿Qué métodos existen para comprobar temperaturas y tiempos de esterilización?

5. ¿Cuándo se debe considerar que un material está medio estéril?

6. ¿Qué es el agar-agar

7. ¿Cuál es la composición del caldo nutritivo

8. ¿En qué difieren la composición del caldo nutritivo y del agar nutritivo?

9. Examine las fórmulas de los medios utilizados y explique cuáles de sus ingredientes sirven

como:

fuente de carbono

fuente de nitrógeno

fuente de energía

fuente de sales minerales

10. ¿De dónde procede el agar-agar?

11. ¿Para qué se utiliza el agar agar?

12. ¿Cómo se esterilizan los medios termolábiles?

13. ¿Qué hubiera pasado si el material se esteriliza, pero no se limpia la mesa y se habla mientras

se trabaja?

14. ¿Qué hubiera pasado si el material no se esteriliza, pero se limpia la mesa, no se habla

mientras se trabaja y se enciende el mechero?








PRÁCTICA No. 3

IMPORTANCIA DEL USO DE LA TÉCNICA ASÉPTICA

(UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS)

Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será capaz de comprobar que el uso de la técnica

aséptica es vital para obtener resultados óptimos en el laboratorio de microbiología.

Introducción: el termino asepsia se refiere a un estado libre de gérmenes, como el trabajo en el

laboratorio de microbiología consiste en poner en evidencia la presencia o ausencia de los

microbios (ya sea en lo general o en específico a un grupo de ellos), es notoria entonces la

importancia de trabajar en condiciones asépticas. Debido a que los microorganismos se

encuentran en prácticamente todo tipo de ambiente terrestre es necesario practicarla para evitar

los resultados falsos (ya sean falsos positivos o falsos negativos).

Los objetivos de la investigación microbiológica son encontrar algún tipo de

microorganismo o no encontrar ningún tipo de ellos en el material que se examina. Si el equipo,

reactivos, medios o la realización del trabajo no aseguran que los microorganismos encontrados

o no, lo son en razón del material, entonces no hay confiabilidad en los resultados.

Debido a la plasticidad genética que exhiben los microbios es posible encontrarlos en una

gran variedad de ambientes, esto es de fundamental importancia para el trabajo en condiciones

asépticas, pues no basta con saber de la ubicuidad de los microorganismos sino trabajar cuidando

todos los detalles.

Los microorganismos tienen diversas funciones: degradación de material orgánico,

fijación de nitrógeno atmósferico, producción de vitaminas, etc. Además de estas funciones

también son capaces de causar enfermedades es por esto que el estudiante debe de:

1. Estar conciente del riesgo potencial de los materiales y de los microorganismos que maneja.

2. Saber cuales son las rutas de entrada de los microorganismos patógenos al cuerpo humano y

por lo tanto causar infecciones.

3. Recibir las instrucciones adecuadas y de practicar una buena técnica microbiológica que

contenga efectivamente a los microorganismos de modo tal que no tengan acceso a estas

rutas.



Existen al menos cuatro rutas por las cuales los microorganismos pueden entrar al cuerpo

humano y causar infección, estas son:

1. A través de los pulmones: los aerosoles (pequeñas gotas, <0.5 m) que contienen

microorganismos, se liberan frecuentemente durante las manipulaciones microbiológicas:

trabajo con asa y jeringas, pipetear, centrifugar, licuar, mezclar, homogenizar, vaciar, abrir

cajas y tubos de cultivo. La inhalación de estas gotas ha causado probablemente el mayor

número de infecciones adquiridas en el laboratorio.

2. A través de la boca: se pueden ingerir microorganismos durante las actividades de pipeteo y

pueden ser transportados a la boca por dedos y artículos contaminados (comida, cigarros,

plumas, etc.) que hayan estado en contacto con mesas de laboratorio contaminadas por

vertimientos, salpicaduras o por asentamiento de aerosoles.

3. A través de la piel: la piel raras veces está libre de cortadas y abrasiones (generalmente

diminutas) por las cuales los microorganismos pueden entrar al torrente sanguíneo. Las

infecciones también pueden resultar como consecuencia de inoculación accidental con

agujas, material de vidrio roto u otros utensilios afilados.

4. A través de los ojos: las salpicaduras de material infectado a los ojos o la contaminación de

estos por los dedos contaminados son también una ruta común.

Dependiendo de la peligrosidad de los microorganismos con los que se trabaja, existen

los niveles de seguridad o de contención, que van del nivel 1 para los microorganismos que no

poseen riesgo o este es mínimo, hasta el nivel cuatro para los microorganismos que poseen

riesgos altos de causar infección ya sea al trabajador o a la comunidad.

Material:

1. Dos cajas petri con agar nutritivo estériles.

2. Un mechero tipo Fisher.

3. Alcohol, algodón.

4. Un plumón marcador para vidrio.

5. Cerillos chispa

6. Probeta de 250 mL

7. Un matraz erlenmeyer de 250 mL

Procedimiento:

SE PUEDEN SUSTITUIR POR LAS DOS CAJAS EA DE LA PRÁCTICA ANTERIOR, EN

CASO DE QUE SE TE HAYAN CONTAMINADO, ENTONCES

1. Lava perfectamente las cajas petri.

2. Enjuágalas perfectamente con agua destilada (para evitar dejar restos del detergente).

3. Prepara agar con agua destilada.

4. Esteriliza el agar en autoclave (15/15)

5. Deja enfriar el agar hasta 45 0C aproximadamente

6. Vacía el agar en las cajas petri y deja solidificar.



7. Remueve la tapa de dos cajas petri que contengan agar nutritivo estériles y déjalas expuestas

al aire, en diferentes sitios por espacio de 30 minutos (ten la precaución de dejarlas en sitios

diferentes) Al termino de este tiempo coloca la tapa en su lugar.

8. Etiqueta estas cajas como “estériles, expuestas al aire”

9. Etiqueta estas cajas según la procedencia de la muestra.

10. Incuba las cajas a 370 C.

11. Revísalas por 24 a 48 horas para detectar cualquier crecimiento.

12. Anota los resultados de tus observaciones de cada cultivo y sus interpretaciones.

Cuestionario:

1. ¿Qué significan los términos:

estéril

aséptico

sepsis

estriar

ubicuidad

2. ¿Cuáles son a) las bacterias aerobias y b) las bacterias anaerobias?

3. ¿Cuáles son a) las bacterias auxótrofas y b) las bacterias protótrofas?

4. ¿Cuáles son a) las bacterias psicrófilas b) las bacterias psicrotrofas, c) mesófilas, d)

termofilas y e) termodúricas?

5. En qué consiste la técnica aséptica.

6. Explica porque limpio no es sinónimo de estéril

7. Menciona tres sitios con probabilidades escasas de tener microorganismos y explica el

porqué.

8. ¿A que nos referimos cuando hablamos de “falsos positivos” o “falsos negativos”?








PRÁCTICA No. 4

OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA DE COLONIAS BACTERIANAS

CLASIFICACION DE COLONIAS

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será capaz de determinar el tipo de crecimiento

bacteriano en medio sólido y líquido y clasificar distintas colonias bacterianas en medio sólido y

líquido para su posterior aislamiento y su identificación

Introducción: los pasos iniciales en la identificación de las bacterias involucran a los caracteres

morfológicos y los culturales. Las características culturales quizá sea una de las etapas más

orientadoras en la identificación de las bacterias, pues a través de ellas apreciamos la apariencia

de las colonias, creciendo en medios líquidos y agar inclinado, tipo de germinación en gelatina,

resistencia a los agentes físicos y químicos, propiedades metabólicas y actividad bioquímica.

La apariencia de las colonias se estudia en placas de agar simple o enriquecido según el

caso, apreciándose forma, elevación, bordes, tamaño, superficie, estructura, consistencia, color y

transparencia. (Figura 3-1)



Bordes Formas

Formas Elevación.

FIGURAS 3-1. Bordes, formas y elevaciones más comunes de las colonias bacterianas

La germinación en gelatina da información sobre el tipo de crecimiento que ocurre a lo

largo del trazado de inoculación que se hace por picadura en el medio y la forma de licuación

que se extiende desde la línea de siembra. (Figura 3-2)



EN GEL: (SEMISÓLIDO)

Línea de picadura Licuefacción

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1. Filiforme 6. Crateriforme

2. Perlada 7. Forma de nabo

3. Papilar 8. Infundibuliforme

4. Vellosa 9. Saculada

5. Arborescente 10. Estratiforme

Figura 3-2. Línea de picadura en gel y licuefacción de la gelatina

En agar inclinado por inoculación en estrías se aprecia la intensidad y forma de

crecimiento, bordes, aspecto, color, consistencia y ¿olor?. (Figura 3-3)

ESTRIA EN AGAR.

1 2 3 4 5 6

1. Arborescente 4. Filiforme

2. Difuso 5. Rizoide

3. Equinulado 6. Esparcido

Figura 3-3. Crecimiento en agar inclinado



En un medio líquido, crecen a manera de sedimentos, turbidez del medio, o nata. El

crecimiento en medio líquido nos indica el grado de crecimiento y turbiedad, formación de

película (nata) en la superficie o de simple anillo en la pared del tubo, sedimento y ¿olor? (Figura

3-4)

EN MEDIO LÍQUIDO. (CALDO NUTRITIVO)

1 2 3 4 5 6

1. Sin crecimiento 4. Espumoso

2. Turbio 5. Con anillo

3. Floculento 6. Con sedimento

Figura 3-4. Crecimiento en medio líquido

Existen 3 medios de cultivo utilizados generalmente para el cultivo de bacterias: sólido,

semisólido y líquido, definidos por su estado físico. Cada tipo de medio tiene propiedades

particulares que hacen más adecuado el crecimiento para ciertas bacterias. La mayoría de los

medios sólidos y semisólidos contienen agar como agente gelificante. Las bacterias, en un medio

sólido, forman acumulaciones de células idénticas, llamadas colonias, que crecen sobre el agar

nutritivo contenido en la caja petri. Estas cajas son ideales para el cultivo de bacterias ya que

permiten la entrada de aire hacia el interior sin dejar entrar polvo. Las bacterias generalmente

crecen en grupos de colonias que surgen como resultado de una siembra.



La pigmentación, tamaño, forma, y la apariencia de una colonia en general, son

fundamentales para su identificación.

Material:

1 regla graduada en mm

1 asa bacteriológica

1 mechero Fisher

Metodología:

Describa la morfología de 2 (al menos) colonias bacterianas y aisladas de acuerdo con las siguientes

características:

1. tamaño

2. Color

3. Elevación: plana, convexa, elevada, pulvinada, umbonada

4. Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, huso

5. Bordes: enteros, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado.

6. Superficie: lisa, rugosa, membranosa.

7. Aspecto: húmeda, seca.

8. Luz reflejada: brillante, mate.

9. Luz transmitida: opaca, traslucida o transparente

10. Consistencia: suave (butirosa, mucoide) o dura.

Describa el tipo de crecimiento en los tubos de acuerdo con las siguientes características:

1. Turbiedad: poca, mediana, abundante

2. Presencia de película o anillo

3. Sedimento: mucoide o granular



RESULTADOS:

Característica de la colonia Colonia 1 Colonia 2

Tamaño

Color

Elevación

Forma

Bordes

Superficie

Aspecto

Luz reflejada

Luz transmitida

Consistencia

Cuestionario.

1. ¿Cuales el inconveniente de oler los cultivos bacterianos?

2. ¿Como se puede medir la turbiedad?

BIBLIOGRAFIA.

Collins, C.H (1969). Metodos Microbiologicos. Editorial Acribia. Primera edicion. España

R. Granados , C. Villaverde (1998) Microbiologia. Editorial Paraninfo. Primera edicion .

España.

Hans. G Schegel. (1979) Microbiologia general. Editorial Omega. Segunda edicion. España.








PRÁCTICA No. 5

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN

Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será capaz de obtener cultivos puros utilizando las

diferentes técnicas de inoculación.

Introducción: los microrganismos necesitan de sustancias nutritivas para su crecimiento,

desarrollo y mantenimiento. La gama de sustancias es muy amplia y van desde productos tan

simples como sales inorgánicas, CO2 y agua pasando por metabolitos simples como

aminoácidos, azúcares hasta llegar a sustancias complejas como sangre, extractos de carne, de

levadura y otros.

Un prerrequisito en la caracterización de especies microbianas es la disponibilidad de

estudiarlas en cultivo puro. El término cultivo puro denota que todas las células cultivadas tienen

un origen común y son descendientes de la misma célula. Es posible obtener cultivos puros

transfiriendo una sola célula a un medio estéril. Esto puede lograrse utilizando un

micromanipulador en conjunto con un microscopio. Sin embargo, los métodos indirectos son

más utilizados para obtener cultivos puros, por ejemplo, placas de medios nutritivos son

inoculadas para obtener colonias aisladas.

La suposición que se hace es que todas las células de la colonia se desarrollaron a partir

de una sola célula y por tanto representan un cultivo puro. Esto no siempre es cierto y entonces

es necesario examinar lo que se presume es un cultivo puro por medio de pruebas microscópicas.

Una vez que se tiene un cultivo puro lo deseable es mantenerlo sin cambios en sus

características, en condiciones viables por periodos de tiempo que van de semanas a años. Para

una preservación a corto tiempo de un cultivo se hacen transferencias periódicas a medio fresco.

Las preservaciones a largo plazo implican liofilización o congelación profunda.

Prácticamente todos los especímenes obtenidos de un ambiente natural contienen una

mezcla de microrganismos. Antes de poder hacer un estudio detallado de las características



inherentes a cada especie de las que constituyen la mezcla es imperativo que las especies sean

aisladas en un cultivo puro. La técnica de estriado en placa provee un método simple para este

propósito.

Material:

4 cajas de Petri con agar nutritivo


1 mechero Fisher

Suspensión de bacterias

Metodología:

Estría cada una de las cuatro cajas con cada una de las siguientes técnicas.

Técnicas de inoculación en Placa.



Existen varias formas para sembrar una población de microrganismos, la que de acuerdo

a nuestro experiencia da mejores resultados es la conocida como estriado en cuadrante. Se hace

de la siguiente forma:

Estríe la suspensión bacteriana en una caja Petri que contenga un agar adecuado de la

siguiente forma: con el asa estéril, primero se estría el inóculo inicial sobre un área

correspondiente a la zona 1, de forma continua, se puede estriar sobre una parte ya estriada, a

continuación se flamea el asa para esterilizarla, se enfría y se estría la zona correspondiente a la

zona 2, sin levantar el asa y sin pasar sobre lo estriado, es importante hacer notar que no se toma

inóculo del espécimen, sino que el inóculo para la zona 2 procede de la zona 1. Se flamea el asa

nuevamente y se repite el proceso, ahora tomando como inóculo para la zona 3 lo estriado de la

zona 2, de igual forma se procede para la zona 4.

Para el estriado en forma radiante se procede de la siguiente forma:

1. Dispersar una asada de organismos en una área pequeña cerca de un extremo de la placa.

2. Flamear el asa y enfriar.

3. Desde una esquina del área 1, hacer 6 o 7 trazos rectos en sentido opuesto a esta.

Flamear el asa y cruzar con trazos sobre los últimos que se hicieron, empezando cerca del

área 1.



Para el estriado en forma de T llamada también Estría en tres Campos se hace lo siguiente:

1. Con un lápiz de cera marcar una "T" en el fondo de la placa, dividiendo la superficie en

una mitad y dos cuartos.

2. Inocular la mitad de la porción con una asada de organismos con una línea continua

desde un extremo de la placa hacia la mitad de la misma.

3. Después de flamear el asa, crucé el Área 1 al Área 2 con una línea continua, hasta llenar

el Área 2.

Después de flamear el asa otra vez, cruce del Área 2 al Área 3 con un trazo continuo.

Una última forma de estriar para obtener colonias aisladas es la técnica denominada estriado

continuo.

1. Iniciar en un extremo de la placa (área A) con una asada de organismos, dispersarlos con

un movimiento continuo y simple hacia el centro de la placa.

2. Rotar la placa 180 grados, de tal forma que la porción sin inocular quede frente a Ud.



3. Sin flamear el asa y usando la misma cara del asa, continué haciendo trazos de la misma

forma que lo hizo para el Área A y trabajando hacia el centro.

Recuerda siempre flamear el asa al terminar de inocular.

Cuestionario:

1. En términos prácticos, cual consideras que es la mejor técnica?

2. En términos de resultados, cual fue la mejor técnica?

3. Porque se debe de flamear el asa antes de empezar a estriar una nueva zona?








PRÁCTICA No. 6

TINCIÓN DE MICROORGANISMOS

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será competente para fijar, teñir e identificar un

microorganismo de acuerdo a su morfología y su respuesta a los colorantes de Gram.

Introducción: debido a sus pequeñas dimensiones es necesario teñir a las células bacterianas

para aumentar el contraste. Debido a las diferencias químicas de los materiales celulares los

colorantes reaccionan de manera específica con ellos; por ejemplo los ácidos nucleicos y los

polisacáridos acídicos tienen carga negativa, por lo que los colorantes catiónicos se combinarán

fuertemente con ellos. El azul de metileno, el cristal violeta y la safranina son colorantes

catiónicos, como las superficies celulares están cargadas negativamente, se combinan con ellas

resultando células teñidas de azul, violeta o rojo respectivamente. Si en el proceso de tinción se

utiliza solamente un colorante se habla de tinciones simples.

Los colorantes generalmente se clasifican en colorantes básicos cuando muestran fuerte afinidad

por las porciones ácidas de la célula y colorantes ácidos si la afinidad es por las partes básicas

(alcalinas) de la célula. Muchas veces resulta conveniente usar una mezcla de dos colorantes, uno

ácido y el otro básico que tiñan de distintos colores. Al tratar una célula con esta mezcla, los

componentes ácidos aparecerán de color distinto a las partes alcalinas de la célula.

Las tinciones diferenciales son aquellas en las que se aprovechan las diferencias entre los

diferentes tipos celulares y/o entre las diferentes estructuras dentro de una misma célula. La

tinción diferencial más utilizada en microbiología es la tinción de Gram. La tinción de Gram

divide a las bacterias en dos grupos principales: las Gram positivas (+) y las Gram negativas (-).

Las diferencias en la pared celular hace que las bacterias Gram (+), tomen el colorante primario

que es el cristal violeta apareciendo por lo tanto de color violeta, mientras que las Gram (-) son

decoloradas y posteriormente toman el colorante de contraste que es la safranina, por lo que

aparecen al ocular de color rojo.



Es importante destacar que en microbiología la tinción de Gram es uno de los procedimientos

más útiles, para identificar una bacteria es necesario saber a qué grupo de Gram pertenece.

Los procedimientos de tinción más usuales se hacen con preparaciones secas (frotis) de

microorganismos, los cuales son adheridos al portaobjetos (fijados) para posteriormente ser

sometidos al proceso de tinción, el cual consiste en agregar el colorante y dejarlo actuar por uno

o dos minutos, enjuagarlo (y si es el caso agregar otro y volver a enjuagar con agua) secarlo y

observar al microscopio.

Para observar a los microorganismos generalmente basta con preparar un frotis de células

microbianas para luego teñirlas. Puesto que las células son tan pequeñas, el propósito

simplemente se logra preparando una suspensión de células en agua; una gota de ésta suspensión

se extiende sobre un área del portaobjetos y se deja secar al aire. Se obtiene así una delgada capa

de células sin necesidad de usar equipo especializado.

Si se desea hacer un frotis de un caldo de microorganismos, el caldo se aplica directamente al

portaobjetos con la ayuda de un asa bacteriológica, sin dilución previa. Con el asa conviene

hacer dos o tres aplicaciones en un área reducida del portaobjetos, teniendo cuidado de no

extender demasiado la suspensión. Al preparar un frotis de medio sólido el problema a evitar es

la presencia de demasiadas células. Para esto se toma del medio sólido una cantidad minúscula

de material bacteriano (no mayor que una cabeza de alfiler) la cual se emulsifica con una gota de

agua sobre la superficie del portaobjeto. La gota se extiende luego sobre una superficie

relativamente grande del portaobjeto. Una vez seco el frotis debe aparecer ligeramente

blanquecino, como el residuo que se obtiene al evaporar una gota de leche diluida.

Una vez hecho el frotis hay que fijarlo, para asegurarse que las células no se desprenderán

durante los repetidos lavados a que se somete el portaobjeto para teñir la preparación. Mediante

la técnica de fijado se intenta detener toda actividad enzimática en la célula antes de observarla al

microscopio. Muchas, si no todas las células poseen enzimas capaces de destruir gran parte de

las estructuras intracelulares después de la muerte de la célula. En microbiología ésta destrucción

de estructuras celulares se evita por medio de la fijación por calor. Por lo tanto, si la célula no ha

sido fijada adecuadamente antes de teñirse, la acción destructora de estas enzimas impedirá la

apreciación de todo detalle. El calor además de inactivar a las enzimas ayuda a adherir las células

al portaobjetos minimizando así la pérdida de células durante el proceso de tinción.

Las formas bacterianas más comunes son: esféricas, llamadas cocos (estafilococos,

estreptococos, diplococos, tétradas, sarcinas) y cilíndricas llamadas bacilos (estreptobacilos,

espiroquetas).



Material

20 portaobjetos (por equipo) 1asa bacteriológica

Azul de metileno safranina (Gram)

Cristal violeta (Gram) Lugol

1 piceta con alcohol 1mechero fisher

1 piceta con agua destilada muestras biológicas

1 par de guantes desechables (opcional) 1 puente de coloración

1 cuba de plástico 1 pinzas para tubo de ensayo

1 microscopio compuesto Etanol potable (para el grupo)

Papel secante cbp Aceite de inmersión

5 pipetas pasteur con bulbo

Procedimiento:

Frotis

a. Lave muy bien los portaobjetos con detergente, enjuágalos varias veces,

agrega unas gotas de alcohol etílico (no uses alcohol desnaturalizado). Sécalos

y flamea por unos segundos el lado superior de cada portaobjeto. Los

portaobjetos usos dificultan el trabajo y pueden ocasionar pérdida de material.

b. Calienta el asa hasta el rojo en la flama del mechero.

c. Si el cultivo procede de medio líquido, toma una o dos asadas y colócalas en

el centro del portaobjetos, con ayuda del asa extiéndelas con movimientos

circulares, déjalas secar al aire.

d. Si el cultivo procede de medio sólido, toma con el asa una o dos asadas de

agua destilada, colócalas en el centro del portaobjetos y con ayuda del asa

toma una pequeña porción de una colonia aislada, emulsifícala con el agua y

extiéndela en el centro del portaobjeto por medio de movimientos circulares,

déjala secar al aire. Debe de verse como una mancha de leche. Este es el

procedimiento estándar para hacer frotis.

e. Los frotis deben de ser ahora fijados al portaobjetos, esto puede hacerse por

medio del calor o por sustancias químicas.

f. Para fijar al calor se sigue el siguiente procedimiento: toma el portaobjetos y

con el frotis hacia arriba, pásalo lentamente sobre la llama del mechero unas

tres a cinco veces, asegúrate de que no está demasiado caliente en cada

ocasión, poniéndolo sobre el dorso de la mano, no debe ser doloroso al tacto.

Puedes utilizar unas pinzas para sujetar el portaobjeto

g. Para fijar con alcohol simplemente se colocan unas dos gotas de alcohol

sobre el frotis, se espera un minuto y luego se seca al aire. Los frotis ahora

están listos para ser teñidos.

Tinción simple



Procedimiento:

1. Coloca el portaobjetos con el frotis sobre el puente de coloración.

2. Cubre el frotis con el colorante (uno por frotis) y déjalo actuar el tiempo indicado:

i. azul de metileno 3 minutos

ii. cristal violeta un minuto

iii. safranina un minuto

3. Lava de “canto” con agua corriente

4. Deja secar al aire y observa con el objetivo de inmersión en aceite.

5. Haz esquemas de lo observado.

Tinción de Gram. (CLASA)

1. Coloca el portaobjetos con el frotis hacia arriba sobre el puente de coloración.

2. Cubre el frotis con cristal violeta por un minuto.

3. Escurre el exceso de solución, lava con agua de la llave y escurre.

4. Cúbrelo con la solución de lugol por un minuto


6. Decolora con alcohol-cetona (usa alcohol hasta que domines el proceso de decoloración)

hasta que quede un tenue color violeta.

7. Lava con agua

8. Cubre el frotis con safranina de 30 a 60 segundos.


10. Déjalo secar al aire y observa con aceite de inmersión.

Notas: Puedes tomar fotografía de tus observaciones en caso de que optes por dibujarlos

entonces tus dibujos deben ser claros y bien definidos. Ejecútalos a colores ciñéndote a los

colores observados en las preparaciones teñidas. No trates de dibujar todos los organismos que

observes sino aquellos que sean típicos, pon especial atención a las variaciones de forma y

tamaño y sobre todo a las formas de agrupación. Si los campos observados están saturados de

microorganismos de modo tal que dificultan la observación, busca un campo donde puedas

observar a las bacterias clara e individualmente. Generalmente es más fácil encontrar campos

más favorables en la periferia del frotis. Nunca dibujes manchas amorfas coloreadas.

El procedimiento para lavar los portaobjetos ya usados es el siguiente: sostén el portaobjetos

sobre el fregadero y pon varias gotas de xilenos (xilol) sobre el frotis, posteriormente enjuágalo

con agua y jabón. Repite la operación por lo menos otra vez para eliminar todo rastro de frotis.

Luego lava el portaobjetos de la manera ordinaria y guárdalo para ser usado posteriormente.

Cuestionario:



1. ¿Para qué se utiliza la tinción simple?

2. Mediante la tinción de Gram, ¿cómo se clasifican las bacterias?

3. ¿Cómo se denominan aquellos microorganismos que muestran variación en la respuesta a

la tinción de Gram?

4. ¿Cuál es la diferencia entre forma de involución y pleomorfismo?

5. ¿Qué es la fijación?

6. ¿Cuáles son los grupos cromóforos de un colorante básico?

7. ¿Porqué se tiñe el núcleo con colorantes básicos?

8. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de gram?

9. Explique qué es un mordente.

10. Menciona tres géneros grampositivos y tres géneros gramnegativos.








PRÁCTICA No. 7

TINCIÓN DE ESPORAS

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será competente para fijar, teñir e identificar un

microorganismo de acuerdo a la presencia, forma y localización de la espora.

Introducción: Las esporas son estructuras de resistencia a las condiciones adversas que pueden

prevalecer en el medio en el que se desarrollan los microorganismos, en el caso de las esporas

bacterianas no son estructuras de reproducción.

Figura 8.1 Diagrama de una espora

Solamente pocos géneros bacterianos forman endosporas (llamadas así porque se forman

en el interior de la célula vegetativa), entre estos sobresalen las bacterias grampositivas Bacillus

y Clostridium.

Estas estructuras son de las formas de vida más resistentes que se conocen: pueden

soportar temperaturas por arriba del punto de ebullición del agua y condiciones de extrema

desecación. Pueden permanecer viables en un estado metabólicamente inactivo por más de 300

años (se han recuperado especimenes del suelo de raíces de vegetales almacenados en el herbario

británico) y germinar en pocos minutos cuando las condiciones del medio les son favorables.



Otro motivo de estudio de las bacterias esporógenas ha sido el tratar de entender en su totalidad

el mecanismo de la diferenciación en procariotes. Condiciones adversas, por ejemplo la falta de

nutrientes, dispara la formación de endosporas. Los mecanismos que se dan son: Formación de

una endospora en un bacilo gram positivo



Figura 8.2 Formación de una espora



Debido a su alta resistencia a la temperatura, los microbiólogos han tenido que diseñar, teniendo

en cuenta a las endosporas, métodos de esterilización para matarlas, ya que los otros organismos

sin duda estarán muertos. Más aún, es importante eliminar las esporas del alimento que va a ser

almacenado por periodos largos de tiempo, ya que algunas de estas bacterias esporógenas forman

toxinas letales, tal es el caso de la toxina botulínica producida por Clostridium botulinum, una de

las sustancias más letales conocidas.

La mayoría de las endosporas no son capaces de germinar inmediatamente después de haber sido

formadas. Ellas pueden germinar después de haber estado en dormancia por días o después de ser

brevemente calentadas (60 0C por cinco minutos.) Si los nutrientes adecuados están disponibles

la espora toma agua y se hincha, se rompen las cubiertas esporales y una célula vegetativa

empieza a desarrollarse.

La endospora es una estructura extremadamente resistente a los métodos ordinarios de tinción,

por lo que es posible por medio de una tinción simple teñir toda la célula excepto la espora, por

lo que resaltará como un cuerpo birrefringente. Otros métodos de tinción son aquellos en los a

través de medidas enérgicas se introduce el colorante en la espora, una vez teñida la espora es

difícil de extraer el colorante, por lo cual decolorando el soma bacteriano y luego contratiñendo,

la espora quedará teñida con el colorante primario y el citoplasma con el colorante secundario.

Material

10 portaobjetos (por equipo) 1 asa bacteriológica

azul de metileno 1 mechero fisher

Verde de malaquita Safranina 0.5% (no de Gram)

1 piceta con agua destilada 1 piceta con alcohol

Muestras biológicas 1 cuba de plástico 1

pinzas para tubo de ensayo 1 mechero de alcohol o microbunsen

1 par de guantes desechables (opcional) 1 puente de coloración

1 microscopio compuesto 2 Tripies

Papel secante cbp Aceite de inmersión

1 Charola de disección 3 pipetas pasteur con bulbo

Cloro (lavado de material)

Procedimiento:

Lava meticulosamente y desengrasa los portaobjetos, prepara 10 frotis de 5 diferentes colonias

(dos de cada una). Cinco frotis tíñelos (uno de cada colonia diferente) con azul de metileno y



déjalos reaccionar de 3 a 5 minutos, lávalos y sécalos al aire, obsérvalos con el aceite de

inmersión.

Los otros 5 serán teñidos con la técnica de Schaeffer-Fulton que consiste en:

1. Cubrir los frotis con verde de malaquita

2. Dejarlos reaccionar por un minuto.

3. Calentarlos hasta emisión de vapores con el mechero de alcohol por un minuto. Ten

cuidado de que no se sequen, si es necesario añade más verde de malaquita, para

reemplazar al que se evapora.

4. Dejarlos enfriar y lavarlos con agua corriente durante medio minuto

5. Contra teñir con safranina al 0.5% (no uses safranina de Gram) y déjala actuar por medio

minuto.

6. Lavarlos con agua corriente y seca al aire.

7. Examina la preparación con aceite de inmersión y has dibujo de las esporas y de las

células vegetativas. Las esporas son verdes y las células vegetativas rojas. Nota: no es necesario dibujar todo el campo sino tan sólo lo representativo

Cuestionario:

1. ¿A qué se debe la resistencia de la espora a ser teñida?

2. ¿Qué géneros bacterianos esporulados son los más comunes?

3. De acuerdo a su forma y posición ¿cómo se clasifican las esporas? Utiliza de modelo el

siguiente esquema, las faltantes, añádelas

4. ¿Cómo se realiza la tinción de los flagelos?

5. ¿En qué consiste la tinción de Ziehl-Neelsen? ¿Para qué se utiliza?

6. Si se te encargara el conteo de microorganismos aerobios esporulados de una muestra de

pimienta en polvo, ¿cómo la harías?



Pintor: Charles Bell (1774-1842). Escuela Inglesa. Título: Opistótonos. 1809. Real

Colegio de Cirujanos de Edimburgo. Características: Óleo sobre lienzo








PRÁCTICA No. 8

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS

(MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA)

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá determinar el número de microorganismos

en una muestra y de comparar los resultados de un aislamiento cualitativo y otro cuantitativo

Introducción: las bacterias están ampliamente distribuidas en la biosfera, desde los sedimentos

en las profundidades oceánicas hasta las corrientes superiores de aire de la superficie terrestre.

Las bacterias son extremadamente importantes para la fertilidad del suelo y tienen una función

significativa en los ciclos biogeoquímicos, son utilizadas en el tratamiento de las aguas negras.

Algunos antibióticos son productos metabólicos de bacterias, otras son importantes en la

industria, principalmente en la fermentativa. Algunas pocas bacterias son responsables de

enfermedades, deterioro de alimentos u otros materiales. Debido a la importancia que tienen las

bacterias en el establecimiento, desarrollo y mantenimiento de la vida en la tierra es importante

que profundicemos en el conocimiento de ellas.

Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos, en los primeros se identifican fácilmente las

colonias. Idealmente todos los medios de cultivo que se emplean en microbiología deberían ser

del tipo llamado sintético. Por otro lado, la gran mayoría de los medios microbiológicos

contienen sustancia de fórmula química desconocida, de composición o de concentración

variable: extracto de carne, varias peptonas, extracto de levadura. Estos medios presentan

mezclas heterogéneas de sustancias de composición y estructura química no identificada o de

concentración variable. Siempre que se le añaden estos productos al medio de cultivo este deja

de ser sintético.

Las bacterias que crecen en los medios de composición y de concentración química conocida,

además de que solamente llevan sales minerales y agua, se llaman autótrofas. Las que solamente

pueden crecer en medios en medios a los cuales se les han añadido sustancias orgánicas, ya sea

como fuente de carbono o de nitrógeno se eles denomina heterótrofas.



En la actualidad diversas casas comerciales venden medios de cultivo deshidratados, a los cuales

solo basta con añadir la cantidad de agua necesario y esterilizar de la manera indicada para poder

utilizarlos.

Siempre es necesario que el medio de cultivo empleado para cultivar microorganismos esté

completamente libre de toda forma de vida antes de usarse. Para esterilizar en ambiente húmedo

se utiliza la autoclave que es un aparato semejante a una gran olla de presión, en la cual se logran

temperaturas superiores a la temperatura de ebullición del agua por medio de un aumento de

presión. Otro método es la esterilización en seco, esto se logra en un horno de aire seco, la

cristalería se puede esterilizar de esta manera. Las soluciones que se descomponen o inactivan al

someterse a elevadas temperaturas, se esterilizan en frío, pasándolas a través de filtros de poros

pequeños que impiden el paso de las bacterias y de organismos de mayor tamaño.

Resumiendo; el desarrollo de los microorganismos bajo condiciones artificiales (medios de

cultivo) depende de varios factores importantes:

1. los alimentos adecuados deben estar disponibles

2. debe disponerse del oxígeno que se requiera

3. un cierto grado de humedad es necesario

4. el medio debe ofrecer la reacción adecuada

5. debe prevalecer la temperatura óptima

6. el medio debe estar estéril

7. debe eliminarse la contaminación

El crecimiento bacteriano es afectado por factores físicos, químicos y biológicos. Dentro de los

factores físicos, que impactan a las bacterias tenemos las condiciones gaseosas y la temperatura.

Las bacterias en su respuesta al oxígeno pueden clasificarse en cuatro grupos:

1. Aerobias, son aquellas que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.

2. Anaerobias, son aquellas que para poder desarrollarse necesitan la ausencia del

oxígeno libre.

3. Anaerobias facultativas, son las que pueden desarrollarse tanto en presencia como en

ausencia de oxígeno libre.

4. Microaerofílicas: son las bacterias que crecen en tensiones bajas de oxígeno libre.

Se dice con frecuencia que las bacterias son fábricas químicas en miniatura, esto se debe a

que sintetizan una variada lista de productos químicos. Estas síntesis dependen de las reacciones

químicas, y la velocidad a la que suceden son profundamente influidas por la temperatura. La



temperatura óptima de crecimiento varia con los diferentes tipos de microorganismos y de

acuerdo a ésta podemos clasificar a los microorganismos en:

1. Psicrófilas, son aquellas que aún cuando son capaces de desarrollarse a temperaturas

inferiores a 0 ºC o superiores a 20 ºC, su temperatura óptima se encuentra dentro de este

intervalo.

2. Mesófilas, son las bacterias que tienen su temperatura óptima en el intervalo entre los 20

y 45 ºC.

3. Termófilas, son las bacterias que tienen temperaturas óptimas mayores a 45 ºC. Se

subdividen en

a. Termófilas facultativas o euritermófilas, son las bacterias termófilas que pueden

crecer dentro de los límites de las mesófilas.

b. Termófilas obligadas o estenotermófilas, éstas no se desarrollan en el intervalo de

las mesófilas y crecen mejor en temperaturas mayores a los 60 ºC.

Los factores de crecimiento son sustancias como vitaminas, aminoácidos, bases nitrogenadas,

etc. Que son indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Los microbios que

pueden crecer en medios sintéticos a los cuales sólo se les ha añadido una fuente de carbono

orgánica (un azúcar por ejemplo) se les conoce como protótrofas, mientras que las que los

necesitan son llamadas auxótrofas. Por otro lado, los factores de crecimiento, pueden ser

esenciales si son necesarios para que el organismo se reproduzca o estimulantes o accesorios, si

los microorganismos pueden desarrollarse en su ausencia, pero en su presencia su crecimiento es

mejor (más rápido, actividad metabólica diferente)

Para poder determinar las características de especies concretas de microorganismos es necesario

aislar y desarrollar al microorganismo en el laboratorio como cultivo puro. Este proceso que se

conoce como sembrado en estría se logra transfiriendo los microorganismos de su ambiente a

uno artificial, esto se logra por medio del asa bacteriológica y un medio de cultivo adecuado, con

el asa estéril se toman los microorganismos y por movimientos de estría se siembran en la

superficie del medio de cultivo, después de un tiempo de incubación a una temperatura

determinada por las condiciones fisiológicas del organismo se apreciarán las “colonias”, que son

el resultado de n divisiones de una sola bacteria. Como es posible que más de una bacteria den

origen a una colonia se dice que son unidades formadoras de colonias (ufc). Una técnica similar

es la llamada espatulado, la cual se realiza por medio de una espátula de vidrio sobre la

superficie de una caja de petri que contiene el medio adecuado, para esto se coloca un pequeño

volumen que contiene a las bacterias sobre la superficie del agar y por movimientos verticales de

la espátula y rotatorios de la caja se distribuyen los microorganismos en la superficie del medio.

Para determinar el efecto que tienen sobre el ambiente es necesario determinar su concentración

también. Una de las técnicas más usadas para el conteo de microorganismos es la de diluciones

seriadas y vertido en placa, la cual consiste en hacer una serie de diluciones decimales seriadas y

agregar un volumen conocido de ellas a una caja petri estéril y a continuación vaciar sobre ella



agar fundido mezclando por movimientos rotatorios en uno y otro sentido, así como por

movimientos verticales y horizontales, todo esto sobre una superficie plana y sin levantar la caja.

Material

Muestra de suelo, agua, leche. 7 pipetas de 1 mL

1 mechero Fisher Agar nutritivo (c.b.p.)

6 cajas Petri vacias, estériles 1 piceta con alcohol

1 balanza granataria 1 piceta con agua destilada

6 tubos con rosca con 9 mL de agua peptonada

1 matraz Erlenmeyer de 500 mL Papel aluminio (10 cm2 aprox.)

1 espátula de vidrio 1 vaso de precipitado de 250 mL

Alcohol 2 cajas con agar nutritivo estéril

Procedimiento:

Técnica del espatulado

Procedimiento:

1. Toma una décima de mL de la dilución (e). (Ver adelante cuadro de diluciones)

2. Deposítala en el centro de una placa que haya estado en incubación durante un día.

3. Con ayuda de una espátula de tubo de vidrio, esterilizado por medio de calor, extiéndela con

movimientos de vaivén mientras realizas movimientos de rotación con la caja, ten cuidado de

no romper el agar.

4. Al asimilarse el líquido al medio tapa la caja y métela a incubar a 37 0C durante 24 a 48

horas.

5. Hazlo por duplicado

Método de las diluciones (NOM-092-SSA1-1994)

Procedimiento:

1. Coloca en un matraz 99 ml de diluyente (agua peptonada o solución reguladora de

fosfatos) Para nuestro propósito bastará con un tubo de rosca con 9 mL de agua

peptonada

2. Agrega 9 mL de agua destilada a los tubos.

3. Esterilízalos en autoclave por 15 minutos.

4. Esteriliza las 7 pipetas de 1 mL en el horno o en la autoclave.

5. Haz diluciones de la muestra que vas a examinar de acuerdo al siguiente esquema:



CANTIDAD DE SOLUTO CANTIDAD DE

DILUYENTE

DILUCION

11 g o 11 mL de muestra 99 mL 10-1

(a)

1 mL de (a) 9 mL 10-2

(b)

1 mL de (b) 9 mL 10-3

(c)

1 mL de (c) 9 mL 10-4

(d)

1 mL de (d) 9 mL 10-5

(e)

1 mL de (e) 9 mL 10-6

(f)

En nuestro caso la dilución (a) se hará con 1 g o 1 mL de muestra

1. Al terminar de hacer cada dilución agita el tubo 25 veces. Agitar la muestra manualmente

con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7

segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe

encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el

diluyente.

2. Con una pipeta estéril coloca un mL de las diluciones (f) (e) y (d) (sigue este orden) en

cajas petri estériles. Haz esto por duplicado.

3. Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según la NOM-110-SSA1-

1994, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico,

en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6

movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en

sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta

lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje

la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. .(Agrega a cada caja petri de 15 a 20 mL de

agar fundido y enfriado a 45 0

C. Mezcla mediante movimientos rotatorios y deja que

solidifique el agar.)

4. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de

esterilidad.

5. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente

hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20

minutos.

6. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura

que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase el

cuadro 1.



CUADRO 1

Grupo Bacteriano Temperatura Tiempo de Incubación

Termofílicos aerobios 55 ± 2°C 48 ± 2 h

Mesofílicos aerobios* 35 ± 2°C 48 ± 2 h

Psicrotróficos 20 ± 2°C 3 - 5 días

Psicrofílicos 5 ± 2°C 7 - 10 días

* En el análisis de agua potable y agua purificada se debe incubar a 35 ± 2°C durante

24 h.

7. En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para

disminuir el error en la cuenta.

8. Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos

y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del estereoscopio para

resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas

partículas de alimento

NOTA: TODO EL TRABAJO DEBE DE REALIZARSE EN CONDICIONES DE

ASEPSIA Y LAS ASAS, LAS PIPETAS Y LA ESPATULA DEBEN DE ESTAR

ESTERILES.

Reglas para contar colonias:

1. Posterior a la incubación, las colonias resultantes se cuentan utilizando un contador de

colonias tipo Québec, este cuenta con un enrejado que nos facilita el contarlas, se escogen

los duplicados que presenten entre 25 y 250 colonias por caja y se determina el promedio.

Se multiplica el promedio por el factor de dilución para obtener la cuenta en placa por

gramo o por mililitro.

Nota en algunos casos pueden usarse para la determinación cuentas de una sola caja o el

promedio de triplicados o más cajas por dilución.

2. En el caso de no tener cajas con 25 a 250 colonias se procede de la siguiente forma:

a. Si solamente una de las cajas está dentro del intervalo se cuentan ambas y se

promedia.

b. Si las cajas de dos diluciones decimales consecutivas tienen entre 25 y 250 se

cuentan ambas diluciones (4 cajas) y se reporta el promedio como la cuenta en

placa por mililitro o gramo, excepto si la cuenta más alta es mayor por dos

veces o más el valor de la cuenta más en cuyo caso se utiliza la cuenta más baja.



c. Si ninguna caja tiene entre 25 a250 colonias pero una o más tienen más de 300, se

usa la dilución con valores más cercanos a 250. Para esto se usa el enrejado:

i. Si hay menos de 10 por cm2, se cuentan las colonias en trece (13)

cuadros representativos de la distribución de colonias y se multiplica

por 5 para obtener el número de colonias por caja (se cuentan 11 si

las cajas son de plástico, área de las cajas de vidrio 65 cm2, de las de

plástico 56 cm2). Se reporta como “Cuenta en placa estimada” por

gramo o por mililitro.

ii. Si hay más de 10 por cm2, se cuentan las colonias en 4 cuadros, se

promedia y se multiplica por 65 si se usaron cajas de vidrio o por 56

si fueron cajas de plástico. Se reporta igual que en I.

iii. Si hay más de 100 colonias por cm2, se reporta como “Estimado

>6500” veces el factor de dilución, ejemplo:

“Estimado>65,000,000”. No se reporte como “demasiado

numerosas para ser contadas”

iv. Siempre reporte los resultados de tales cajas como cuenta aeróbica

“estimada” por caja por gramo o por mililitro.

d. Si se encuentran menos de 25 colonias en cada caja, se obtiene el número

promedio , se multiplica por el factor de dilución y se reporta como cuenta

aeróbica “estimada” por caja, ejemplo: Estimado 18.

e. Si no se encuentran colonias en ninguna dilución se reporta como “estimado”

menor que el factor de dilución, ejemplo: Estimado <10, si no se encontraron

colonias en la dilución 10-1

.

f. Otras claves: SC = sin colonias, Spr = diseminadas (si más de la mitad de la caja

está cubierta, no se use para contar), AL = accidente de laboratorio, IG =

inhibidor de crecimiento (sólo si se observa inhibición del crecimiento, i.e. si las

diluciones más altas tienen cuentas más altas que las diluciones más bajas,

verificar primero que no sea un problema de dilución, en este último caso sería

AL), DNSC = demasiado numerosas para ser contadas (no se use a menos que la

dilución más alta, sea realmente incontable. Las siglas respectivas en inglés son:

NC, Spr, LA, GI y TNTC

3. Los resultados de las cuentas después de ser multiplicados por el factor de dilución se

redondean a dos cifras significativas para evitar dar la idea de exactitud ficticia..

4. Ejemplos:

Promedio

Muestra Colonias/ dilución Razón Cuenta aeróbica Sección

10-3

10-4

de cuentas por gramo (mL) aplicable

1 151 16 150,000 1

2 272 39 1.4 330,000 2b

3 120 35 2.9 120,000 2b

4 Spr 40 400,000 1, 2f



5 375 17 380,000 est. 2ci

6 DNSC 8010 >65,000,000 est. 2ciii

7 9 1 9,000 est. 2d

8 0 0 <1,000 est. 2e

Cuestionario:

1. Diseña un método para producir microorganismos aerobios a escala industrial

2. Explica tres métodos diferentes para cultivar bacterias anaerobias.

3. ¿Cuál es la temperatura óptima de las bacterias que habitan en el intestino de los

pichones? ¿porqué?

4. Diga porqué el uso de las bacterias estenotermófilas ha revolucionado a la microbiología

y cuales son sus ventajas en la industria fermentativa.

5. Explica las ventajas y las desventajas de los métodos anteriores para aislar

microorganismos.

6. Explica tres métodos para la preservación de cultivos puros.

7. ¿Cuál es el número de unidades formadoras de colonia en tu muestra?

8. ¿Qué son ciclos biogeoquímicos?

9. ¿Cómo actuan las bacterias sobre los metales? ¿Qué significa el término “biofouling”?

10. En qué consisten las técnicas de siembra por estría en placa, técnica de siembra por

difusión en placa, técnica de vertido en placa, técnica del enriquecimiento de cultivo,

técnica de diluciones seriadas y técnica de aislamiento de una célula?

11. Diseña un método para producir, a escala industrial, bacterias esporuladas aerobias.

Referencias:

NOM-092-SSA1-1994

NOM-109-SSA1-1994

NOM-110-SSA1-1994








PRÁCTICA No. 9

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS ESPORÓGENOS EN

ALIMENTOS.

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá determinar el número de microorganismos

esporógenos potencialmente dañinos en alimentos.

Introducción: El conocer la cantidad de microorganismos potencialmente dañinos en algunos

alimentos tales como almidón, azúcar, harina y especias utilizados como ingredientes en otros

alimentos es importante. En algunas ocasiones es importante saber también la cantidad de

esporas que pueden sobrevivir al procesamiento. Además de los mesófilos, las esporas

termorresistentes son también importantes de determinar. Una forma de detectar la cantidad de

esporas en los alimentos es el uso del choque térmico. Un análisis similar al realizado en la

práctica anterior combinado con este te permitirá saber la cantidad de esporógenos dentro del

total de mesófilos aerobios.

Material

Muestra de especia (pimienta) 1 matraz de 250 mL

7 pipetas de 1 mL 1 mechero Fisher

10 cajas petri 1 matraz de 500 mL

1 balanza 8 tubos de ensayo

Agua destilada estéril 1 pipeta de 10 mL

1 termómetro de 100 0C 1 baño maria

1 tripié 1 asa bacteriológica

4 portaobjetos Colorantes para esporas

1 piceta con alcohol 1 piceta con agua destilada

Agar nutritivo o agar para cuenta de colonias

Agar dextrosa triptona o agar púrpura bromocresol



Procedimiento:

1. Pesa 11 g de pimienta negra molida y mézclalos con 99 ml de agua destilada estéril.

2. Transfiere 10 mL a dos tubos estériles de 22 mm de diámetro. Asegúrate de

transferir parte del sedimento. Coloca un termómetro en un tubo para que sirva de

control de temperatura. Marca la línea donde son los 10 mL.

3. Calienta los tubos en un baño con agitación constante a una temperatura de 82 – 83

ºC,

4. Mantén los tubos a 80 ºC por 10 minutos, con agitación constante o o hierve los

tubos por cinco minutos, Se restaura la cantidad de agua en el tubo, que se haya

perdido por evaporación.

5. Enfría rápidamente al chorro de agua

6. Prepara diluciones decimales seriadas hasta 10-5

(el tubo que se calentó es 10-1

)

7. Vacía en cajas con agar para cuenta de colonias, mezcla bien e incuba a 32 ºC

por 48 a 72 horas.

8. Verifica que sean esporógenos por medio de la tinción de Schaeffer-Fulton.

9. Cuenta las colonias resultantes y reporta como “esporógenos mesófilos aerobios por

gramo”

Procedimiento de acuerdo a la NMX-F-248-1975:

Unas vez ejecutadas las diluciones de las siembras arriba indicadas (incisos 7.1, 7.2, 7.3,

y 7.4, ), se hierve la suspensión inicial (inciso 6) durante 5 minutos.

Se restaura la cantidad de agua que se haya perdido por evaporación. Se preparan dos series de

tres cajas de Petri. Se distribuyen 10 ml de la suspensión hervida en las tres cajas Petri. Se agrega

medio de agar dextrosa triptona o agar púrpura bromocresol, si se desea diferenciar las bacterias

productoras de ácido. Se incuba a 32°C por 72 horas una de las series en condiciones de

anaerobiosis y la otra en aerobiosis.

Nota: en la NMX-F-248-1975 dice 10 ml en realidad deben ser 1.0 mL

Cuestionario:

1. ¿Cuál es el objeto de enfriar rápidamente los tubos?

2. ¿Explica la razón para determinar esporas mesófilas o termófilas en los alimentos?

3. ¿Describe un método adecuado para determinar esporas termofílicas en alimentos en

lugar de mesofílicas?

4. ¿Describe un método adecuado para determinar esporógenos anaeróbicos en lugar de

aeróbicos?

5. Si un ingrediente tiene 106 células vegetativas más 5 X 10

5 esporas por gramo ¿Cuántas

colonias nos revelará el análisis después de un choque térmico?

6. Nombra dos organismos esporógenos aerobios y dos anaerobios y el tipo de alimento

donde es posible encontrarlos.

7. Explica tres métodos diferentes para cultivar bacterias anaerobias.



Referencias:

NORMA MEXICANA NMX-F-248-1975

DETERMINACION DE MICROORGANISMOS EN ESPECIAS Y CONDIMENTOS DE

CANELA EN POLVO








PRÁCTICA No. 10

RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS TOTALES EN SUELO

TÉCNICA DEL NUMERO MÁS PROBABLE

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá poner en práctica la Técnica del Número

más Probable (NMP) para realizar recuento de microorganismos del suelo.

Introducción: el suelo constituye un gran reservorio de microorganismos que cumplen sus ciclos

vitales mineralizando materia orgánica disuelta y particulada, proceso del que obtienen energía

para su metabolismo y materia prima para sus constituyentes celulares. La biomasa y la

producción secundaria bacteriana representan una fracción importante de la producción y

biomasa total. Las poblaciones microbianas son controladas tanto en el agua como en el suelo,

por depredadores específicos como los protozoos incorporándose así a las cadenas tróficas de los

sistemas.

Los tamaños de las poblaciones de bacterias son bastante constantes en el agua en donde

muestran buena correlación con la concentración de materia orgánica presente. El contenido de

materia orgánica en el agua varía entre 1 mg/l en ambientes muy oligotróficos y más de 5 mg/l

en ambientes muy contaminados. Existen índices del estado trófico o del grado de contaminación

de las aguas basados en su contenido de bacterias heterótrofas; utilizando estos indicadores los

resultados obtenidos del recuento de bacterias pueden aportar información para el conocimiento

de un ecosistema y su funcionamiento.

El número de bacterias heterótrofas totales en el suelo se correlaciona más con el contenido de

agua del mismo que con la cantidad de nutrientes; habiendo suficiente humedad los nutrientes

pasan a ser el factor limitante del crecimiento. Cualquiera sea el ambiente en el que se

desarrollen estas comunidades microbianas, el tamaño de las poblaciones es sumamente

dinámico y cambia fácilmente ante las alteraciones fisicoquímicas o nutricionales en las que se

desarrollan.



En prácticas anteriores se explicaron algunas técnicas que se utilizar para realizar el recuento de

microorganismos; entre ellas el número de microorganismos viables mediante el Recuento en

Placa es uno de los más usados. En esta práctica se empleará la técnica de Número más Probable

que es aplicable tanto para muestras de agua como de suelo. Primero se empleará dicha técnica

para realizar recuento de microorganismos heterótrofos totales en muestras de suelos de diversos

orígenes, esta misma metodología con algunas variantes se utiliza para determinar organismos

coliformes en agua, esto es medir la contaminación en agua.

Material:

-10 tubos de ensayo con 9 mL de agua destilada estéril rotulados desde 10 -1

hasta 10 -10

-10 pipetas estériles de 1 ml

-30 tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo estéril, cada uno debidamente rotulado

con la dilución a la que corresponde por triplicado

-pipetas automáticas de 100 µl (0.1 ml) con puntas estériles o pipetas de 1 ml graduadas

-mechero fisher

Procedimiento:

Extrae una muestra de suelo, pesa 1 g de la misma y colócala en un tubo de ensayo que contiene

9 ml de agua destilada estéril rotulado con 10 -1

que corresponde al primer nivel de dilución

(1:10).

Agítala de acuerdo a la NOM y toma 1 ml del sobrenadante con otra pipeta estéril y agrégalo al

segundo tubo con agua destilada estéril rotulado como 10-2

(1:100), correspondiente al segundo

nivel de dilución. Procede de la misma manera hasta el tubo correspondiente a la última dilución

10 -10

(1:10,000,000,000).

De esta manera se espera que los primeros tubos tengan la mayor concentración bacteriana y que

en los últimos tienda a cero.

Una vez que dispones de estos 10 tubos que contienen la solución del suelo, procede a sembrar

una alícuota de 0.1 mL, por triplicado de cada uno de ellos, en los tubos que contienen caldo

nutritivo, a partir de la dilución 10-1

. (fig 1).



Fig. 1: Diluciones seriadas y siembra en caldo nutritivo por triplicado

Nota: ten en cuenta que la muestra utilizada siempre tiene cierto nivel de humedad, por lo tanto

los resultados obtenidos están en relación con un gramo de peso húmedo y deberán referirse a un

gramo de peso seco. Para ello se toman 5 g de la muestra que se utilizó para sembrar y se lleva

hasta peso seco constante, se calcula el porcentaje de humedad del suelo para luego corregir el

número hallado.

Cálculo del Número mas Probable

Se siembran como mínimo tres tubos para cada dilución aunque se pueden utilizar también

cinco réplicas de cada uno de ellos, lo que disminuye la desviación. Revisa los tubos para

detectar crecimiento hasta por 72 horas. Al cabo de tres días, lee los resultados, toma como

positivos a aquellos tubos con caldo nutritivo en los que ha habido desarrollo (se ven turbios

debido a la proliferación de microorganismos).

Toma nota, para cada dilución, del número de tubos positivos (+) y se obtiene un número

característico representado por tres cifras. La primer cifra del número característico

corresponderá al nivel de dilución menos concentrado en el que todos los tubos sean positivos.

En la siguiente tabla se indican, a modo de ejemplo, los resultados obtenidos para dos siembras

distintas con tres repeticiones para cada nivel de dilución.



Nivel de dilución 10 -1

10 -2

10 -3

10 -4

10 -5

10 -6

10 -7

10 -8

10 -9

10 -10

Ejemplo 1 +++

(3)

+++

(3)

+++

(3)

+++

(3)

+--

(1)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

Ejemplo 2 +++

(3)

++-

(2)

++-

(2)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

---

(0)

Ejemplo 1: número característico 310 (para la dilución 10 -4

)

Ejemplo 2: número característico 322 (para la dilución 10 -1

)

Una vez que has obtenido el número característico, búscalo en una tabla en la que figuran todas

las combinaciones posibles y para las que se ha calculado, mediante un método estadístico, el

número más probable de microorganismos presentes en la muestra. Ver tabla del apéndice 2 del

Bacteriological Analytical Manual.



Tabla de Mc Crady (para tres réplicas por dilución)

Número

característico

Número de

microorga-

nismos

Número

característico

Número de

microorga-

nismos

Número

característico

Número de

microorga-

nismos

000 0,0 201 1,4 302 6,5

001 0,3 202 2,0 310 4,5

010 0,3 210 1,5 311 7,5

011 0,6 211 2,0 312 11,5

020 0,6 212 3,0 313 16,0

100 0,4 220 2,0 320 9,5

101 0,7 221 3,0 321 15,0

102 1,1 222 3,5 322 20,0

110 0,7 223 4,0 323 30,0

111 1,1 230 3,0 330 23,0

120 1,1 231 3,5 331 45,0

121 1,5 232 4,0 332 110,0

130 1,6 300 2,5 333 140,0

200 0,9 301 4,0

Se ingresa en la tabla con el número característico y se lee el número más probable de

microorganismos en el volumen de siembra. En este caso, en el que el inóculo de partida es un

gramo de suelo, se refiere el número final al peso seco de la muestra.



Número característico N.M.P de microorganismos

Ejemplo 1 310 4,5

Ejemplo 2 322 20

A este número obtenido de la tabla debe multiplicárselo por la inversa de la menor dilución en la

que se han hallado 3 (+), es decir que corresponde a la dilución de la primer cifra del número

característico.

Ejemplo 1: 4,5x10 4 bacterias/g de suelo

Ejemplo 2: 20x10 1

bacterias /g de suelo

Además, como se señaló anteriormente, a este valor se le debe corregir en función del porcentaje

de humedad de la muestra.

Cuestionario:

1. ¿Cuál es la NOM que se aplica para la técnica de agitar los tubos?

2. ¿Qué dice al respecto la NOM citada anteriormente?

3. ¿Por qué se refieren los datos a gramos de tierra seca?

4. ¿Qué importancia tiene saber el número de microorganismos en una muestra de suelo?

Bibliografía:

-NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.

DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES. TECNICA DEL NUMERO MAS

PROBABLE.

-AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (APHA), American Water Works

Association & Water Pollution Control Federation. 1989. Standard Methods for the examination

of Water and Wastewater. 17th ed. APHA, Washington, D.C. USA. Part 9000.

- Bacteriological Analytical Manual



Appendix 2

Most Probable Number from Serial Dilutions BAM Appendix 2: Most Probable Number from

Serial Dilutions, October 2010. Author: Robert Blodgett

http://www.fda.gov

Table 1. For 3 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs per

gram and 95 percent confidence intervals.

Pos. tubes MPN/g

Conf. lim. Pos. tubes MPN/g

Conf. lim.

0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High

0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --

mailto:robert.blodgett








PRÁCTICA No. 11

USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

(EFECTO DE LOS NUTRIENTES, AGENTES INHIBIDORES Y SUSTANCIAS QUE

DETERMINAN LA SELECTIVIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.)

Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá seleccionar el medio de cultivo que le

permita al microrganismo exhibir las propiedades bioquímicas que serán base para su

identificación.

Introducción: se entiende por crecimiento microbiano el aumento del número de

microrganismos a lo largo del tiempo, es decir, al crecimiento de bacterias, el estudio que se hace

puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos.

Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo

del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis de componentes

celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble del inicial y su división por

bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo

de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este.

El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los

individuos de dicha población.

La mayoría de los cultivos de microorganismos son del tipo denominados asincrónicos,

puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular.

Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que acaban de

dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están creciendo, otras que están iniciando

la división celular, etc. Por el contrario, en un cultivo sincrónico todas las células se encuentran

simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy

difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos

de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en

condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta



sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales

probablemente se comporten como relativamente sincrónicas.

Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes números en

un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microrganismos en la mayoría

de los casos depende de su número, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es

importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o

aplicados.

Cultivo de microrganismos: el cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles

las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma

controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las

características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de

nutrientes en el medio.

Medios de cultivo: un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten

energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la

fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autótrofos si es el

CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterótrofos si utilizan carbono

orgánico.

La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que

supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrededor del 50% del

peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros

elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mo, Cu y Zn.

La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en

una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgánico para los

heterótrofos y como CO2 para los autótrofos, el N en forma de NH4, de NO3 o de NO2 o en

forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de

PO4-3

, el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4-2

, etc. Además, en ciertos casos, es

necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados

tipos de microorganismos no pueden sintetizar.

En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más

concreta es: C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056, esta composición puede variar

ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento

de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva, facilita la formulación del medio de

cultivo más adecuado para el mismo.



Clasificación: los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos o simples, cuando

su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están

compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de

carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún

agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar).

En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser,

selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microrganismos mientras suprimen el de

otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios). La elección de un medio selectivo debe ser

apropiada para el aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser

colorantes, antibióticos, sales biliares y sustancias que afecten el metabolismo enzimático de

algunas especies. Los medios selectivos para especies Gram- , pueden incluir cristal violeta el

cual inhibe el crecimiento de muchas bacterias Gram+. La penicilina con una concentración de

5.50 unidades/ml inhibe la mayoría de las bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace

selectivo para bacterias Gram-. Los medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de

Potasio, azida sódica, etc. Que inhiben el crecimiento de bacterias Gram-. Diferenciales cuando

alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por

ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos),

selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo, el agar

de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten

aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla de una población mixta de

gran tamaño.

Crecimiento microbiano en medio líquido: si la bacteria crece en un medio líquido, en la

mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida

independientemente formándose una suspensión de células libres.

En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar, mínimamente,

cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:

1.- Fase lag o de adaptación: durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo

a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para

iniciar la fase de crecimiento exponencial.

2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el

tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima

los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase se explica con

modelos matemático.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros

parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al



de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos

secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase

estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de

desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el

crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente

represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los

ambientes naturales.

4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo.

Figura 10.1 Curva de crecimiento ideal para un microorganismo que se reproduce por

duplicación

Procedimiento de enriquecimiento. Cuando se necesita obtener un cultivo de un

organismo determinado es necesario una técnica de enriquecimiento adecuada para esa especie.

Los métodos se basan en cualquier característica fisiológica del organismo deseado, por ejemplo,

pH o temperatura óptima, requerimientos nutricionales o tolerancia a algunos inhibidores. En

algunos casos se puede hacer un tratamiento térmico de suspensiones de suelo para el

aislamiento de organismos esporulados y otros organismos termo-resistentes, seguido por un

plaqueo en medio sólido. Otras veces se puede usar diferentes temperaturas de incubación, de

manera que el organismo deseado aumente su número en relación con el de los otros organismos

presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio líquido es inadecuado para dar un

cultivo puro, y el procedimiento final de aislamiento, comprende la obtención de colonias

separadas en medio sólido.



La preparación de medios terminados a partir de materiales deshidratados debe hacerse

de acuerdo a las instrucciones. Sólo debe usarse equipos y cristalería química limpios. El agua

debe ser siempre destilada o desmineralizada, salvo indicación en contra. La pesada exacta de los

materiales y la medida correcta de agua son esenciales. El calor debe ser directo o en baño de

agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con agitación. El calentamiento excesivo debe

evitarse. La homogeneidad también es esencial, especialmente para medios que contienen

agentes gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin espuma ni

burbujas.

La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o filtración. Casi

todos los medios se esterilizan a 121°C durante 15 minutos para volúmenes de hasta 500 ml.

Para volúmenes mayores el tiempo debe extenderse a 20, 30 ó más minutos según sea necesario.

Para verificar la esterilización placas y tubos con el medio se deben incubar a 20-25°C ó 30-

35°C durante uno o dos días. Los medios deben guardarse en un refrigerador.

Material

Muestras de microorganismos 1 caja con agar nutritivo

1 caja con agar EMB 1 mechero Fisher

1 caja con MacConkey sorbitol 1 asa bacteriológica

4 portaobjetos Colorantes para esporas

Colorantes para Gram 1 puente de coloración

1 piceta con alcohol 1 piceta con agua destilada

2 tubos con caldo nutritivo

Procedimiento:

2. Divide cada una de las cajas en dos partes.

1. Marca una mitad como A y la otra como B

2. Siembra por estría abierta un microrganismo en cada una de las mitades A y en la

mitad B siembra el “otro” microrganismo.

3. Incuba las cajas a 37 0C por 24 a 48 horas.

4. Observa y reporta si hay diferencias entre las mitades de los diferentes medios.

5. Determina si son Gram + o Gram – y verifica si son esporógenos por medio de la

tinciones adecuadas.

Cuestionario:

1. ¿Cuál es la composición química de cada medio?

2. ¿A que tipo corresponde cada medio? Clasifícalos.

3. Según el crecimiento ¿se puede saber de que microrganismos se trata?

4. ¿A que tipo de Gram pertenece cada uno?

5. ¿Cuál es la razón de los diversos componentes de los diferentes medios?



Referencias:

NORMA Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones

sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.








PRÁCTICA No. 12

EFECTO DE AGENTES FÍSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Objetivo: al término de la práctica el alumno determinará el efecto que tienen diferentes agentes

físicos sobre el crecimiento de los microorganismos y la aplicación de estos para el control de

ellos.

Introducción: existen muchos factores en el ambiente que son letales o potencialmente letales

para los microorganismos. Por regla general, los microorganismos son más resistentes a estos

factores que las células eucarióticas. Variaciones drásticas en temperatura, pH, presión osmótica

y otras se suceden con gran rapidez. Por ejemplo: una pequeña gota de humedad en una roca es

capaz de propiciar una inmensa población activa de microorganismos hasta que la temperatura se

eleva y la gota se evapora por completo; esto es típico de las condiciones a veces óptimas y en

ocasiones todo lo contrario en las cuales los microorganismos viven.

Las actividades metabólicas de un organismo son el resultado de la suma de todas las

reacciones químicas y como estas son influenciadas por la temperatura, en consecuencia el

proceso vital también lo está. Los microorganismos se desarrollan en una amplia gana de

temperaturas, desde las muy bajas, características de los psicrófilos, hasta las muy altas,

características de los termófilos.

Todos los microorganismos tienen una temperatura, mínima, óptima y máxima de

desarrollo. Las temperaturas superiores a la máxima, generalmente los matan, mientras que las

inferiores a la mínima usualmente les producen éstasis y por ello se les considera preservativas.

La cantidad de agua en el medio a cualquier temperatura tiene efectos notables para la

supervivencia de los microorganismos, debido a esto es que se utilizan altas temperaturas

combinadas con altos grados de humedad para destruir microorganismos (autoclave). El calor

húmedo es más rápido y eficaz que el calor seco para destruir microorganismos y las células

vegetativas son más sensibles al calor que las esporas.

Se utilizan tres términos para indicar el grado de resistencia al calor que tienen las

bacterias:



i) Punto térmico letal, que es la temperatura más baja a la cual una suspensión de

bacterias muere en 10 minutos.

ii) Tiempo térmico letal, es el tiempo más corto necesario para matar una suspensión

de bacterias (o esporas) a una temperatura determinada y bajo condiciones

específicas.

iii) Reducción decimal de tiempo, esto es, el tiempo en minutos necesario para matar

al 90 % de la población (son los minutos del tiempo térmico letal que pasan a

través de un ciclo logarítmico).

Las bajas temperaturas son útiles para preservar cultivos, ya que los microorganismos

tienen la capacidad única de sobrevivir al frío muy intenso. Las temperaturas de preservación

varían desde 7 0C hasta –196

0C. Desde un punto de vista práctico podemos considerar a las altas

temperaturas como microbicidas y a las bajas temperaturas (0 0C o menores) como

microbiostáticos.

Todos los organismos dependen del agua; la mayor parte de su masa es agua y todas sus

actividades se realizan en ambientes acuosos. La desecación de las células microbianas y su

medio produce la detención de la actividad metabólica, seguida de una declinación de la

población viable total. El tiempo de supervivencia a la desecación es variable y depende de:

1. La clase de microorganismos

2. El material en el que, o con el que, se desecan los microorganismos

3. La terminación del proceso de desecación

4. Las condiciones físicas a las cuales los microorganismos son expuestos, por ejemplo,

la luz, temperatura, humedad, etc.

5.

Estas generalidades se aplican al secado con aire. En el proceso de liofilización, los

microorganismos son sometidos a gran deshidratación en estado de congelación y después a

sellado al vacío, los cultivos liofilizados de microorganismos permanecen viables por muchos

años.

Osmosis es la difusión de productos a través de una membrana semipermeable que separa

a dos soluciones de diferentes concentraciones y que llega a un equilibrio al igualarse la

concentración a ambos lados de la membrana. Si las células son colocadas en una solución más

concentrada que su interior, el agua pasará a través de la membrana celular, que es

semipermeable, de la región de menor concentración de sustancias disueltas (el interior de la

célula) a la solución que rodea a la célula dando como resultado su deshidratación, esto es

conocido como plasmolisis. En el caso contrario (menor concentración de sales en el medio

exterior) la corriente se invertirá y el agua pasará al interior de la célula, a este fenómeno se le

conoce como plasmoptisis.

La mayor parte de los microorganismos son inhibidos por altas concentraciones de sal

(10-15%) o de azúcar (50-70%) hecho que es utilizado para preservar alimentos por medio de las



salmueras o de los almíbares. Sin embargo existen microorganismos que resisten altas presiones

osmóticas e incluso las necesitan para desarrollarse (osmofílicos). Aquellos que necesitan altas

concentraciones de sal para desarrollarse son llamados halofilicos, los que necesitan altas

concentraciones de azúcar son llamados sacarofílicos.

Las radiaciones electromagnéticas pueden interaccionar con la materia. Los rayos gama y

los rayos X que tienen energía de más de 10 eV son llamados radiaciones ionizantes porque

tienen suficiente energía para empujar los electrones fuera de las moléculas e ionizarlas. Cuando

estas radiaciones pasan a través de las células se produce hidrógeno libre, radicales hidroxilo y

algunos peróxidos, que a su vez producen diferentes tipos de daño celular. Las radiaciones

ionizantes producen poco calor en el material irradiado, siendo entonces utilizados para

esterilizar materiales en un proceso conocido como esterilización en frío.

Las radiaciones menos energéticas, particularmente la luz ultravioleta, no ionizan, sino

que son absorbidas en forma específica por diferentes compuestos. Las longitudes de onda de

alrededor de los 254 nm son los que tienen mayor eficacia como bactericidas, la luz solar, bajo

determinadas condiciones, tiene capacidad microbicida pero de un grado limitado.

Una suspensión de bacterias expuestas a la luz ultravioleta por varios minutos y luego a la

luz visible presentará mayor número de supervivientes que aquellas expuestas solamente a la luz

ultravioleta, esto es explicado por la presencia de una enzima luz-dependiente que reconoce a los

dímeros de timina en el DNA y repara el daño, restableciendo la estructura normal del mismo.

Existe otro mecanismo de reparación del daño causado al DNA por la luz ultravioleta que no es

luz-dependiente.

Materiales, reactivos y medios:

Caldo nutritivo (cbp) Agar nutritivo (cbp)

Sacarosa (cbp) Cloruro de sodio (cbp)

Cultivo de 24 horas de E. coli Cultivo de 24 horas de B. subtilis

3 tubos con agar nutritivo inclinado estériles

3 tubos con caldo nutritivo más sacarosa al 10, 20 y 40% estériles

3 tubos con caldo nutritivo más cloruro de sodio al 5, 15 y 30% estériles

4 tubos con 20 mL de agar nutritivo en bloque estériles

4 tubos estériles vacíos estériles 4 tubos con 5 mL de caldo nutritivo estériles

4 cajas petri (vidrio) estériles 2 cajas petri con agar nutritivo estéril

1 tubo con dos hisopos estériles 2 pipetas de 1 mL estériles

1 termómetro 0-100 0C 1 incubadora a 37

0C

1 refrigerador. 2 discos de cartulina negra

1 lámpara de luz ultravioleta de 254 nm 2 tubos con 10 mL de caldo nutritivo

1 asa bacteriológica 1 mechero de gas

1 baño maría a 65 0C 1 baño maría a 37

0C



Procedimiento:

Temperatura

1. Inocular tres tubos de agar nutritivo inclinado con una asada del microorganismo de

prueba.

2. Incubar los tubos a temperaturas de: 4 0C (refrigerador), ambiente y a 37

0C, por 18

horas a 24 horas.

3. Usar el siguiente sistema para indicar el grado de crecimiento:

+ + + Crecimiento excelente

+ + Crecimiento bueno

+ Crecimiento pobre

0 No crecimiento

Presión osmótica

1. Inocular los tubos de caldo nutritivo-sacarosa y caldo nutritivo-cloruro de sodio de

distintas concentraciones con una asada del microorganismo de prueba.

2. Incubar con agitación a 37 0C, por 18 horas a 24 horas.

3. Indicar el grado de crecimiento de manera similar a lo indicado en “temperatura” .

Desecación

Día 1.

1. Colocar una asada del microorganismo de prueba en el fondo de cuatro cajas estériles

vacías. Numerarlas del uno al cuatro (#1 al #4).

2. Solamente a la caja marcada con el número uno (#1) vaciarle enseguida de 15 a 20 mL de

agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.

3. Incubar las cuatro cajas a 37 0C.

Día 2.

4. Sacar solamente la caja número uno (#1) a las 24 horas y contar el número de ufc/caja.

Descartar esta caja.

Día 3.

5. Solamente a la caja marcada con el número dos (#2) vaciarle a las 48 horas de 15 a 20

mL de agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.

6. Incubar las tres cajas restantes a 37 0C. (#2, #3 y #4)

Día 4.



7. Sacar solamente la caja número 2 (#2) a las 72 horas y contar el número de ufc/caja.

Descartar esta caja. Día 5.

8. Solamente a la caja marcada con el número tres (#3) vaciarle a las 96 horas de 15 a 20

mL de agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.

9. Incubar las dos cajas restantes a 37 0C.

Día 6.

10. Sacar solamente la caja número tres (#3) a las 120 horas y contar el número de ufc/caja.

Descartar esta caja. Día 7.

11. A la caja marcada con el número cuatro (#4) vaciarle a las 144 horas de 15 a 20 mL de

agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.

12. Incubarla a 37 0C.

Día 8.

13. Sacarla a las 168 horas y contar el número de ufc/caja. Descartar esta caja.

Tiempo térmico mortal.

1. Colocar en una serie de cuatro tubos estériles un mL de cultivo de la bacteria de prueba.

2. Colocarlos en un baño maría a una temperatura de 65 0C, durante los siguientes tiempos:

Tubo No. Tiempo en minutos

1 3

2 7

3 15

4 30

3. Una vez terminado el tiempo de calentamiento para cada tubo con cultivo, se sacan del

baño y se toma una asada de cada uno para resembrarlo a un nuevo tubo con caldo

nutritivo.

4. Incubarlos a 37 0C durante 24 horas.

5. Indicar el grado de crecimiento de manera similar a lo indicado en “temperatura”

Luz ultravioleta.

1. Sembrar con el hisopo la bacteria de prueba en toda la superficie de cultivo de una caja

de petri estéril.



2. Cortar un disco de cartulina negra de tamaño apropiado de tal modo que cubra

sobradamente la caja de petri. Recortar una figura geométrica o cualquier símbolo en el

centro.

3. Quitar la tapa de la caja petri y en su lugar colocar el disco de cartulina negra.

4. Exponer la caja a la acción de la luz ultravioleta por 10 minutos. PRECAUCIÓN: LOS

RAYOS ULTRAVIOLETA SON MUTAGENOS, POR LO QUE SE DEBE DE

APAGAR LA FUENTE DE ESTOS ANTES DE INTRODUCIR O SACAR LAS

CAJAS. NO SE DEBE DE IRRADIAR NINGUNA PARTE DEL CUERPO NI

MIRAR A LA FUENTE DE LUZ ULTRAVIOLETA DE MANERA DIRECTA,

SIEMPRE PROCEDA CON CUIDADO.

5. Quitar los discos de cartulina y colocar nuevamente la tapa de las cajas.

6. Incubar las cajas a 37 0C durante 24 a 48 horas

7. Comparar el crecimiento de las áreas expuestas a la luz ultravioleta contra aquellas en las

que no hubo exposición.

Opcional: exponga las cajas irradiadas cinco minutos a la luz visible, antes de ponerlas a incubar.

Cuestionario:

1. ¿Explica cuál es el mecanismo de esterilización del calor húmedo y cuál el del calor

seco?

2. Realiza un esquema de una célula animal en: i) medio hipertónico, ii) medio hipotónico y

iii) medio isotónico. ¿Cuál es la diferencia con una célula de E. coli? ¿Cuál con un

protoplasto de E. coli?

3. ¿Qué importancia tiene el destapar la caja petri antes de ser irradiada con luz ultravioleta?

¿Cómo actúa ésta?








PRÁCTICA No. 13

EFECTO DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Objetivo: al término de la práctica el alumno analizará el efecto que tienen diferentes agentes

químicos al determinar el efecto que tienen sobre el crecimiento de los microorganismos para

considerar la aplicación de estos para el control de ellos.

Introducción: La destrucción de los microorganismos por agentes químicos es lo que se conoce

con el nombre de desinfección. La búsqueda de compuestos químicos que muestren una alta

toxicidad para los microorganismos y que causen el menor daño posible al hombre o a sus

propiedades (animales, plantas, instalaciones, etc) es continua.

Los germicidas (sustancias que destruyen gérmenes sean o no patógenos) es sinónimo de

microbicida pueden ser fungicidas, bactericidas, alguicidas, etc. según destruyan hongos,

bacterias, algas o algún otro tipo de microorganismo. Se dice que una sustancia es desinfectante

si posee la capacidad de destruir o eliminar microorganismos causantes de enfermedades, siendo

completos si su actividad es sobre la forma vegetativa y esporas e incompleto si sólo es efectivo

sobre la forma vegetativa. Los antisépticos son sustancias que detienen o inhiben el crecimiento

de una bacteria sin matarla. El término sanitizado significa que el número de bacterias está por

debajo de lo establecido como margen de seguridad para la salud, se utiliza en alimentos,

bebidas, vestuario, utensilios, etc.

La distinción entre un bactericida y un bacteriostático, es que este último no mata los

microorganismos, detiene solamente su crecimiento y su desarrollo continúa una vez que es

eliminado el agente, la diferencia es muy sutil, los dos grupos muestran muchas interrelaciones y

ella puede depender del tiempo y las condiciones de exposición. Por ejemplo, el fenol en

concentraciones del 5% es un desinfectante activo contra un gran número de gérmenes pero esta

concentración y menores constituyen un alimento para algunas especies de Pseudomonas.

Los mecanismos mediante los cuales las sustancias químicas pueden dañar a las células

microbianas o virus pueden agruparse en:



1. Interferencia con la replicación de la información genética.

2. Desajuste de la traslación de la información genética y la síntesis de proteínas.

3. Alteración de la estructura y función de la pared celular.

4. Interferencia con el funcionamiento de la membrana celular.

5. Alteración directa de las proteínas celulares.

6. Alteración química directa de otros compuestos vitales de la célula.

Varios factores, aparte del desinfectante, están involucrados en el efecto bactericida, entre

estos tenemos:

1. Concentración y tiempo de exposición

2. Edad del cultivo: en general las células de los cultivos jóvenes en la fase logarítmica del

crecimiento son más susceptibles que las de los cultivos viejos.

3. Concentración de bacterias: se requiere más tiempo para matar poblaciones grandes de

bacterias que pequeñas.

4. Composición química del medio de cultivo o del tejido: los compuestos reductores

normalmente presentes en el tejido, protegerán a los microorganismos de los agentes

oxidantes. La leche, la sangre, el suero y otros materiales proteínicos ofrecen alguna

protección contra los desinfectantes que coagulan el citoplasma bacteriano.

5. Temperatura: la actividad de la mayoría de los desinfectantes es directamente

proporcional al incremento de la temperatura.

Para que una sustancia o compuesto químico sea considerado un buen desinfectante, deberá

poseer el máximo de cualidades que caracterizan al desinfectante ideal:

Escasa o nula toxicidad para el hombre.

Gran poder germicida en altas diluciones.

Rápida acción.

Estabilidad en presencia de sustancias orgánicas.

Máxima solubilidad en agua.

Buena penetración

No tener olor desagradable.

No dañar ropa o utensilios.

Ser económico.

El poder bactericida de un producto químico se valora comparándolo con el fenol en

condiciones idénticas sobre un determinado microorganismo y en igual tiempo de acción, esto es

conocido como Coeficiente Fenólico; este se obtiene dividiendo la dilución más alta del

germicida que mata a las bacterias en 10 minutos, pero no en cinco por la correspondiente

dilución del fenol. Si el coeficiente es mayor de uno, el desinfectante es más potente que el fenol

y si es menor de uno, es más débil que este.



Para realizar la prueba, se preparan diluciones distintas del fenol y del desinfectante a probar

en agua destilada., a cinco mL de cada dilución se le agrega 1.5 mL de un cultivo en caldo de 24

h de estafilococo dorado o bacilo de la tifoidea y se toman porciones con el asa de platino (d = 4

mm) a los 5, 10 y 15 minutos para resembrarlos en 10 mL de caldo. Luego de una incubación de

48 h se efectúa la lectura.

Algunos tipos de desinfectantes y ejemplos de ellos son:

Ácidos: ácido clorhídrico, ácido benzoico.

Álcalis: hidróxido de sodio.

Sales de metales pesados: nitrato de plata

Fenol y cresol

Halógenos: hipoclorito de sodio.

Compuestos oxidantes: permanganato de potasio.

Agentes reductores: formaldehído

Alcoholes: etanol.

Glicoles: etilenglicol.

Colorantes: cristal violeta.

Jabones y detergentes.

Sales cuaternarias de amonio.

Los agentes químicos utilizados interna o externamente para el tratamiento de las infecciones

son más comúnmente designados como agentes quimioterapéuticos y su aplicación se llama

quimioterapia, algunos de ellos son:

Prontosil

Sulfonamidas

Nitrofuranos

Ácido nalidixico

Isoniacida

Procedimiento:

Efecto del pH.

1. Inocula con una asada de la suspensión de microorganismos, los tubos que contienen caldo

nutritivo a diferentes pH (una asada por tubo).

2. Incuba los tubos a 37 0C por 24 h.

3. Examina la turbidez después de la incubación.

4. Reporta tus resultados usando el siguiente sistema:



0 No turbidez (claro, similar a un tubo sin inocular)

+ Turbidez ligera

++ Turbidez moderada

+++ Turbidez fuerte (similar a la de los tubos de donde procede el inoculo)

Efecto de antibióticos, metales pesados, detergentes, colorantes, etc.

1. Humedece el hisopo con la suspensión bacteriana y siembra masivamente las tres cajas con

agar nutritivo estéril.

2. Esteriliza las pinzas flameándolas con alcohol, enfríalas. Toma con ellas los discos y

colócalos sobre las cajas de manera uniforme, procurando que quede entre ellos un espacio

mayor al doble de sus diámetros.

3. Incuba las cajas a 37 0C por 24 h.

4. Después de la incubación observa y mide el diámetro de la zona de inhibición.

Acción bacteriostática de un colorante.

1. Licua el agar nutritivo de los cuatro tubos por medio del calor y consérvalos en el baño

maría.

2. Prepara diluciones 10-4

, 10-5

y 10

-6 del colorante.

3. Coloca un mL de cada una de las diluciones recién preparadas en cajas petri estériles vacías.

4. Agrega el agar de los tubos a las cajas petri (tubo por caja) y homogeniza con el colorante

por medio de movimientos rotatorios. La cuarta caja que no tiene colorante se emplea como

testigo.

5. Deja que solidifiquen, con un marcador divídelas en dos en la superficie externa inferior,

marca una mitad como “A” y la otra como “B”.

6. Siembra ambas mitades por estría abierta, con los dos cultivos respectivos (no se te olvide

incubar siempre el mismo microorganismo en la mitad marcada con la misma letra).

7. Incuba a 37 0C por 24 h.

8. Observa y registra el crecimiento de cada cultivo en las diferentes diluciones.

9. Establece, si las hay, las diferencias entre los dos tipos de microorganismos.


4 tubos con 20 mL de agar nutritivo en bloque, estériles

4 cajas petri de vidrio estériles, vacías

3 tubos con 9 mL de agua destilada, estériles

1 tubo con dos hisopos estériles

1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 2.0









3 cajas petri estériles con agar nutritivo estéril

3 pipetas de 1 mL estériles.


1 mechero de gas

1 termómetro 0-100 0C

1 baño maría a ~50 0C

1 incubadora a 37 0C

Caldo nutritivo (cbp)

Agar nutritivo (cbp)

Cultivo de 24 horas de Escherichia coli

Cultivo de 24 horas de Bacillus subtilis

1 pinzas de disección de puntas finas

1 solución de cristal violeta 1:1000

discos de papel con antibióticos, metales pesados, detergentes, colorantes, etc.

Cuestionario:

1. ¿Cómo funcionan los siguientes tipos de desinfectantes y cuál es su aplicación?

Halógenos

Alcoholes

Sales cuaternarias de amonio

2. ¿Cómo funcionan las sulfonamidas, cómo se llama el tipo de inhibición enzimática que

ejercen?

3. Si es correcto decir que un bactericida es una sustancia que mata bacterias, porque no es

correcto decir que un viricida mata virus. ¿O, si lo es, porqué?

4. Menciona una aplicación de un agente bacteriostático.

5. Calcula el coeficiente fenólico del siguiente desinfectante:

FENOL

Dilución Tiempo en minutos

5 10 15

1:80 - - -

1:90 + - -

1:100 + + +



DESINFECTANTE DE PRUEBA


5 10 15

1: 250 - - -

1: 275 + - -

1:300 + + -

1: 300 + + +

+ = VIVOS - = MUERTOS

6. ¿Cuál es la función del ácido para-aminobenzoico en los organismos?






BIOLOGÍA


PRÁCTICA No. 14

RELACIÓN ENTRE MICROORGANISMOS Y CARIES DENTAL

Objetivo: el alumno analizará la complejidad de la comunidad microbiana oral por medio de un

ensayo microbiológico y bioquímico para relacionar sus resultados con la actividad cariogénica.

Introducción: la boca humana es un lugar fascinante. En ella abundan cientos de especies

bacterianas, y algunos se encuentran solamente en ella. Desafortunadamente, algunas de las

bacterias que viven en nuestra cavidad oral pueden pudrir nuestros dientes. Si conocemos y

entendemos el mundo microbiano de nuestra boca, podremos prevenir la destrucción causada por

microorganismos y promover un ecosistema oral benigno.

Procedimiento:

Mastica la goma o la parafina pura por espacio de tres minutos con el fin de estimular la

salivación, durante este tiempo, colecta la saliva en la caja Petri estéril. Se recomienda colectar

los especimenes antes del desayuno y antes de cepillar los dientes. Transfiere con la ayuda de la

pipeta estéril 0.2 mL de saliva a un tubo que contenga agar de Snyder fundido y a

aproximadamente 45 0C, deja solidificar ambos tubos a temperatura ambiente por medio de una

hora en posición vertical, incuba ambos tubos a una temperatura de 37 0C por 72 horas.

Examina los tubos diariamente durante tres días y anota los cambios de color comparados con el

tubo sin inocular. La observación de cambio de color se facilita usando luz reflejada y

observando contra un fondo blanco. El cambio de color será del azul verdoso del control a

amarillo. Usa la siguiente clave para reportar:

Positivo: cambio en color de tal forma que el verde ya no es dominante; repórtalo como ++ o

++++ según la intensidad del cambio.

Negativo: no hay cambio de color o solamente una ligera desviación, pero el color verde

todavía es dominante. Repórtalo como 0 o +



Interpretación:

Actividad cariogénica Horas de incubación

(Relativa al número de bacilos) 24 48 72

MARCADA POSITIVO

MODERADA NEGATIVO POSITIVO

LEVE NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

NEGATIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

Material:

8. Una goma de mascar, sin azúcar.

9. Dos tubos de ensayo con rosca, conteniendo 10 mL de agar Snyder

10. Dos tubos de ensayo con rosca, conteniendo 10 mL de agar Snyder, por sesión

11. Un mechero tipo Fisher.

12. Dos cajas petri estériles, de vidrio

13. Dos pipetas de un mL, estériles.

14. Un plumón marcador para vidrio.

15. Cerillos.

Notas:

La interpretación de los datos de laboratorio dados antes deben relacionarse con la actividad

clínica y la experiencia y compresión de algunos factores:

1. Los datos indican sólo lo que está sucediendo en el momento en el cual el espécimen fue

colectado

2. Para comparar con exactitud, es necesario obtener por lo menos dos muestras con

intervalo de dos semanas

3. Solo cuando dos o más especimenes han sido cultivados, cualquier relación o predicción

puede hacerse

4. Deben estudiarse suficientes casos para establecer el valor de significancia para el

propósito indicado.

Cuestionario:

9. ¿Cuándo una flora normal deja de serlo?

10. ¿Qué es habitat?

11. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la lisozima y de la lactoperoxidasa?

12. Define los siguientes términos

Organismo axénico

Organismo gnotoxénico

Organismo heteroxénico

Organismo holoxénico








PRÁCTICA No. 15

COEFICIENTE FENÓLICO

Objetivo: al término de la práctica el alumno determinará la concentración de una sustancia que

es necesaria para tener el mismo efecto que tiene una solución de fenol en el control de

microorganismos.

Introducción: El poder bactericida de un producto químico se valora comparándolo con el fenol

en condiciones idénticas sobre un determinado microorganismo y en igual tiempo de acción, esto

es conocido como Coeficiente Fenólico; este se obtiene dividiendo la dilución más alta del

germicida que mata a las bacterias en 10 minutos, pero no en cinco por la correspondiente

dilución del fenol. Si el coeficiente es mayor de uno, el desinfectante es más potente que el fenol

y si es menor de uno, es más débil que este.

Procedimiento: para realizar la prueba (modificada), se preparan diluciones distintas del fenol y

del desinfectante a probar en agua destilada, a cinco mL de cada dilución se le agrega 1.5 mL de

un cultivo en caldo de 24 h de E. coli o B. cereus. Se toman porciones con el asa de platino (d =

4 mm) a los 5, 10 y 15 minutos para resembrarlos en una caja Petri que contiene agar nutritivo.

Luego de una incubación de 48 h se efectúa la lectura.

Diluciones: De la dilución de fenol prepare las siguientes diluciones:

mL de fenol (# de dilución)

mL de diluyente Dilución:

3 (1) 27

3 (2) 24

De la dilución del desinfectante de prueba prepare las siguientes diluciones:

mL del desinfectante X(# de dilución)

mL de diluyente Dilución:

4.0 (3) 36.0

3.6 (4) 36.4

3.2 (5) 36.8

2.8 (6) 37.2

2.4 (7) 37.6



Dibujar 3 líneas separadas en el fondo de las cajas Petri, marcarlas 5, 10 y 15, además de

la dilución correspondiente (# de dilución)

Forma de inocular: Colocar 5.0 mL de cada dilución en un tubo perfectamente marcado,

agregar 1.5 ml del cultivo al primer tubo de fenol, después de transcurrido 0.5 minutos agregar

1.5 ml de cultivo al segundo tubo de fenol, proceder de igual forma con los tubos de las

diluciones del desinfectante de prueba, siempre debe de existir un lapso de tiempo de 0.5

minutos entre tubo y tubo. Al llegar a los 5 minutos empiece con el tubo 1 y así continúe cada

0.5 minutos


3 tubos con solución de fenol

6 tubos con solución de deseinfectante de prueba

1 tubo con cultivo de 24 horas de Escherichia coli

1 tubos con cultivo de 24 horas de Bacillus subtilis

10 cajas Petri con agar nutritivo

3 pipetas de 5 mL estériles.


1 mechero de gas

1 incubadora a 37 0C

Caldo nutritivo (cbp)

Cuestionario:

1. Calcula el coeficiente fenólico del siguiente desinfectante:

FENOL


5 10 15

1:80 - - -

1:90 + - -

1:100 + + +

DESINFECTANTE DE PRUEBA


5 10 15

1: 250 - - -

1: 275 + - -

1:300 + + -

1: 300 + + +

+ = VIVOS - = MUERTOS

2. ¿Cuál es la función del ácido para-aminobenzoico en los organismos?








PRÁCTICA No. 16

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA DE UN

ANTIBIÓTICO

Objetivo: al término de la práctica el alumno determinará la concentración mínima inhibitoria a

un antibiótico de una bacteria aislada, utilizando el método de dilución en caldo.

Introducción: La técnica de dilución en caldo permite determinar la actividad de un agente

antimicrobiano sobre un microorganismo, en forma de concentración mínima inhibitoria (CMI):

la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento. A partir de este dato

puede determinarse si es posible tratar una infección causada por ese microorganismo con ese

antimicrobiano. Si la CMI es menor que la concentración de antimicrobiano que se alcanza en

los tejidos de cuerpo humano, el tratamiento puede tener éxito y el microorganismo se considera

sensible; en caso contrario fracasará y el microorganismo se considera resistente. Un

antibiograma es un estudio de la sensibilidad de un microorganismo dado a distintos

antimicrobianos. Las distintas especies y estirpes microbianas presentan distintos grados de

sensibilidad a los diversos agentes, de ahí que sea necesario hacer una evaluación para poder

seleccionar el compuesto más apropiado para el tratamiento de una infección bacteriana.

Procedimiento:

1.- Preparación del inóculo

Esta técnica sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, previamente se

procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.

La preparación del inóculo se realiza sembrando una colonia aislada del microorganismo en

estudio en un tubo de caldo Müeller-Hinton e incubando a 37ºC durante 18-20 h.

2.- Preparación de las diluciones de antibiótico

a) Rotular los tubos de caldo Müeller-Hinton: 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 y 0 mg/ml.

b) Pipetear 1 ml del tubo que contiene la solución de ampicilina (16 mg/ml) al marcado con 8

c) Mezclar bien pipeteando y transvasar 1 ml al tubo siguiente (4 mg/ml).

d) Repetir el paso anterior hasta llegar al tubo marcado con 0.25 mg/ml, del que se desecha 1 ml

e) No añadir antibiótico al tubo marcado 0.

3.- Siembra

Tomar una muestra del cultivo de E. coli con una pipeta Pasteur e inocular una gota en cada tubo

de la serie de diluciones (incluidas las de 16 y 0 mg/ml). Finalmente, incubar los tubos a 37ºC

durante 20 h.

Interpretación



Al día siguiente, observar si hay turbidez en los tubos. De los que no presenten crecimiento, el

que contenga la concentración más baja de antibiótico corresponderá a la CMI. El tubo que no

contiene antibiótico debe estar turbio (control positivo).

Figura 10.1. Determinación de la CMI.


Cultivo bacteriano en medio líquido de Escherichia coli

7 tubos con 1 ml de caldo Müeller-Hinton,

Solución de ampicilina (16 mg/ml) en caldo Müeller-Hinton (2 ml)

7 pipetas de 1 ml

1 pipeta Pasteur.






BIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRACTICA No. 17

ESTUDIO BACTERIOLÓGICO DE BIVALVOS

Objetivo: el alumno será capaz de determinar la calidad bacteriológica de bivalvos mediante un

análisis del número más probable.

Introducción: los alimentos del mar pueden contaminarse bacteriológicamente por las descargas

de las aguas residuales de las comunidades que tienen descargas directamente al cuerpo de agua

sin tratamiento o sin control sobre el tratamiento. La contaminación también puede deberse a los

arrastres del agua de lluvia. Algunos de los microorganismos encontrados son: bacilo de la

tifoidea, éste tiene una larga sobrevivencia tanto en ostiones intactos como en su carne y jugo (15

a 60 días). Vibrio parahaemolyticus microorganismo causante de gastroenteritis y el virus de la

hepatitis infecciosa.

En algunos casos los causantes de contaminación son los mismos organismos marinos, tal

es el caso de las mitilotoxinas, que son causa de envenenamiento. Estas son adquiridas por los

bivalvos al ingerir algunas especies de dinoflagelados, responsables de las “mareas rojas”

Procedimiento: 1. Transportar los bivalvos en bolsas de plástico sobre hielo.

2. En el laboratorio, librarlos del fango; lavarlos con agua corriente, cepillarlos en su exterior y

secarlos sobre papel absorbente. Se deben de eliminar las conchas que no estén

herméticamente cerradas o que mostraron espuma en su superficie.

3. Abrir las conchas asépticamente.

4. Recoger tanto el líquido como la carne en un frasco estéril hasta alcanzar la marca de 200

mL.

5. Añadir un volumen igual de agua y homogenizar en licuadora

6. Dejar reposar dos minutos (o más si es necesario) para que sedimenten las partículas

mayores.

7. Inocular por quintuplicado tubos de fermentación con caldo lauril triptosa de la siguiente

forma:

La primera serie, cada tubo con 2 mL de la muestra homogenizada y diluida 1:2;

La segunda serie con un mL de la muestra diluida (en total) 1:10;

La tercer serie con un mL de la muestra diluida (en total) 1:100.



8. Incubar los tubos a 35 0C, hacer las lecturas a las 24 y 48 horas. Aquellos que presenten gas

(hasta aquí es la prueba presuntiva), sembrarlos en tubos de fermentación conteniendo caldo

bilis verde brillante

9. Incubar a 35 0C por periodos iguales de tiempo.

10. Con los resultados así obtenidos, determinar el “número más probable” (NMP) confirmado

de coliformes, empleando las tablas correspondientes.

11. NORMAS;

Cuando los bivalvos frescos contienen 230 o más coliformes/100 mL, NO reúnen las

condiciones sanitarias adecuadas; se pueden tolerar recuentos de hasta 2400 coliformes/100

mL siempre que esto no ocurra en más de dos muestreos sucesivos.

Material:

Bolsas de plástico vaso de ppt de 500 mL

Hielera licuadora

Hielo agua destilada estéril

Papel absorbente 30 tubos con rosca

Fibra 30 tubos durham

Caldo lauril triptosa 3 tubos con rosca con 9 mL de s.s.f. estéril

3 pipetas de 1 mL 1 pipeta de 10 mL

Incubadora caldo bilis verde brillante

Mejillones (choros) o almejas

Cuestionario:

1. De acuerdo a las condiciones climáticas de Ensenada ¿en qué época del año se deberían de

esperar mayor número de coliformes? ¿por qué?

2. ¿Qué significa el término “organismos indicadores”?

3. ¿Qué características deben de reunir los organismos indicadores?



(FORMATO PARA PRESENTAR EL REPORTE)


UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA

CAMPUS ENSENADA




PRÁCTICA No.:

NOMBRE DE LA PRÁCTICA

ALUMNO(S):

NOMBRE DE ALUMNO 1

NOMBRE DE ALUMNO 2

RESPONSABLE:

M. en C. MIGUEL HUMBERTO CARRILLO MENDÍVIL

ENSENADA, B. C. (día) de (mes) de (año)

La fecha corresponde al día que se realizó la práctica






BIOLOGÍA


PRÁCTICA No.

NOMBRE DE LA PRÁCTICA

Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será competente para

Introducción:

Material:

Procedimiento:

Cuestionario:

Literatura revisada:



BIBLIOGRAFIA

Collins, C.H (1969). Metodos Microbiologicos. Editorial Acribia. Primera edicion. España

R. Granados , C. Villaverde (1998) Microbiologia. Editorial Paraninfo. Primera edicion .

España.

Hans. G Schegel. (1979) Microbiologia general. Editorial Omega. Segunda edicion. España.

NORMA Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones

sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.

NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de

bacterias aerobias en placa

NORMA Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Procedimientos para la

Toma, Manejo y Transporte de Muestras de. Alimentos para su Análisis Microbiológico.

NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de

muestras de alimentos para su análisis microbiológico

Norma Mexicana NMX-F-248-1975 determinación de microorganismos en especias y

condimentos de canela en polvo

Most Probable Number from Serial Dilutions BAM Appendix 2: Most Probable Number from

Serial Dilutions, October 2010. Author: Robert Blodgett

http://www.fda.gov

mailto:robert.blodgett

http://www.fda.gov/

microbiología y biotecnología - fc.ens.uabc.mxfc.ens.uabc.mx/documentos/manuales/manual...

Documents