microbiología general (9/11/2017) levaduras · 10,000-6,000 adc en la medialuna de las erras...
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MicrobiologíaGeneral(9/11/2017)LEVADURAS,caracterís7casgenerales,confocoenSaccharomycescerevisiae)
Brevehistoriadelalevaduracomoanimaldomés7coFilogeniayecologíaBiologíacelularGené7ca,ciclocelular,crecimientoyenvejecimientoMetabolismoEjemplosdeusoenbiotecnología
10,000-6,000ADCenlamedialunadelas7errasfér7les
tambiénenChina,EgiptoyAmerica
fermentación(fervere:hervir),levadura,yeast(gist,zein:hervir)
Cavalieri&col,JMolEvol,2003McGovern&col,PNAS,2009Johnson&Echavarri-Erasun,TheYeasts,2010
queso
10,000-6,000ADCenlamedialunadelas7errasfér7les
larevoluciónindustrial~1750AD
Las levaduras fueron los 1ros microbios en ser examinados sistemáticamente debido a su tamaño celular y a su importancia económica. Debido a que la fermentación había sido correlacionada con la putrefacción y enfermedades, el establecimiento de levaduras como causa de procesos fermentativos disparó la identificacion de otros microorganismos como agentes causales de dichos procesos. Schwann, Pasteur fermentación -> bases para fisiología microbiana. Berthelot, Emil Fischer, Buchner utilización de glucosa -> bases para la enzimología. Dienert (adaptación a distintos azúcares) -> Monod -> inducción enzimática Harden, Young -> d-fructose 1,6-bisfosfato y coenzimas Hartwell, Nurse -> ciclo celular; Schekman -> tráfico intracelular Longo, Guarentee -> envejecimiento
levaduras
5µm
5µm
hongos,loscualesdurantesuestadoasexual(anamorfo)crecenporgemaciónofisiónyquedurantesuestadosexual(teleomorfo)noadoptanunaformacompleja(cuerposfrucFferos)enmuchaslevaduras(yhongos)seconocesuestadoanamorfoysedesconoceelteleomorfo
Taxonomía:IAPT(Interna7onalAssocia7onforPlantTaxonomy)h[p://www.iapt-taxon.org/nomen/main.php
variedadfisiológicaenlevaduras
• Sonorganismosprincipalmenteaerobios,• Sonmeso`licas(22-48ºC),existencrio`licas(notermófilas)• Mediana/altatasasdecrecimiento(td60…360min)• pHóp7mo4.5-5.5(toleranunrangoampliodepH:3-10)• toleranetanol6-14%(v/v)• xerotolerantes(bajadisponibilidaddeH2O)• secretanenzimas,an7bió7cos,etc.• Lamayoríau7lizanazúcarescomofuentesdeC(principalmente
hexosas,tambienpentosasytriosas)• ComofuentedeNaceptancompuestossimplestalescomosalesde
NH4+yNO3
-
• ComofuentedePPO43-ydeSS042-
• Muchasprecisanvitaminas(e.g.bio7na,7amina,ácidonicomnico)
OCUPANUNAENORMEVARIEDADDENICHOSECOLÓGICOS:AIRE,SUPERFICIESDEFRUTASYHOJAS,TEJIDOSVEGETALESSANOSYENDESCOMPOSICIÓN,INTESTINODEMAMÍFEROSYDEINSECTOS,RIOS,MARES,ETC.
Filogenia
Taxonomía de Linneus, 1750’s
ANIMALIA
comen
fungi PLANTAE
se mueven
respiran
se mueren
✓
✓
✓
rápido no tanto
X
X
X
levadurasdentrodeloseucariotes
Arabidopsis
H.sapiens D.melanogaster C.elegans
Dycostelium
P.falciparum (malaria) Toxoplasma
T.cruzi (Chagas) Leishmania
Archaebacteria Bacteria
Baldauf, Science 2003
S.cerevisiae S.pombe
algas, kelp, plankton
Trichomonas Giardia
LUCA
Aspergillusniger(patógenodeplantas),biotech)
Candidaalbicans(oportunista)
S.cerevisiaeS.pombePneumocysLsjirovecii
Cryptococcusneoformans(oportunista)
Paracoccidioidesbrasiliensis(patógenoemergente)Histoplasmacapsulatum(patógenooportunista)
Neurosaporacrassa(Tatum&Beadle,1941PNAS&1958NobelPrize)Ascomycota
Basidiomycota
ChytridiomycotaMucoromycota
Microsporidia
dentrodeloshongos
Rhizopogonrubescens(ectosimbionte)
encontramoslevadurasenAscomicotayBasidiomicota
Saccharomycesqueconocemos
Boynton &Greig, Yeast, 2014
“lagers”
“ales”
651cepasdeS.cerevisiae
Legras et al Mol Ecol, 2007
Libkind & col, PNAS, 2011
Bing & col, Curr Biol, 2014
7especiesdeSaccharomyces
Saccharomycescerevisiae
5µm
Vol: 50-120 fl PSF 0.3 fl E. coli 1fl linfocito B 200 fl COS-7 2000 fl
núcleo 6-11% vacuola 3-14% mitocondria 0.2-1.5%
otras levaduras: Vol: 30-2.500 fl Formas: esféricas (Debaryomyces), cilíndricas (S. pombe), dimórficas (Cándida albicans)
5µm 25-27ºC 37-40ºC
Saccharomycescerevisiaepared celular
25% peso seco
2 capas: interna (β 1-3 glucanos + quitina) de función mecánica externa (manoproteínas) protección e interacciones: sexo, biofilms, floculación: alta (cerveza pilsner) o baja (cervezas ales)
blanco p drogas (cercosporamida, equinocandina)
en constante remodelado
no se densensambla durante la mitosis
núcleo
sin lámina
2 membranas
continuo al RE
25-30 poros
Feldmann, Yeast, Mol and Cell Biol, 2nd ed.
FisiologíayMetabolismodelevaduras
• Sonorganismosprincipalmenteaerobios,• Sonmeso`licas(22-48ºC),aunqueexistecrio`licas• Mediana/altatasasdecrecimiento(td60…360min)• pHóp7mo4.5-5.5(toleranpH3-10)• toleranetanol6-14%(v/v)• xerotolerantes(bajadisponibilidaddeH2O)• secretanenzimas,an7bió7cos,etc.• Lamayoríau7lizanazúcarescomofuentesdeC(principalmente
hexosas,tambienpentosasytriosas)• ComofuentedeNaceptancompuestossimplestalescomosalesde
NH4+yNO3
-
• ComofuentedePPO43-ydeSS042-
• Muchasprecisanvitaminas(e.g.bio7na,7amina,ácidonicomnico)
Saccharomycescerevisiae
• habita en ¿? las bodegas y viñedos, insectos, suelos
• acompaña al hombre desde hace ~ 10,000 años -> domesticada
• tolera un amplio rango de condiciones:
– ~0 a ~55°C, crece a ~12°C - 40°C, pH 2.8 to 8.0
– tolera la desecación (commercial dry yeast)
– tolera y crece aún en 3M glucosa y 20% etanol (produce, acumula, consume)
– a 30ºC duplica cada 90min (si está en crecimiento “tipo exponencial”
• plasticidad metabólica relativamente amplia
• es un organismo GRAS (generally recognized as safe, por la FDA)
• Maquinaria de recombinación homóloga del ADN muy activa
• Crece en un medio sintético definido
genomadeS.cerevisiae(conocidodesde1996,másde200cepastotalmentesecuenciadasyanotadas)
dispensable&transformable
intronesensoloel5%delosgenes
promotores(500-1000bp)&los3’UTR(150-500bp)son…cortos
genomadeS.cerevisiae(conocidodesde1996,hoy>200cepascompletamentesecuenciadasyanotadas
7podeelementogené7co:
procesobiológico:
…
S.cerevisiaesedivideporgemación(buddingyeast)
célulamadre
célulahija
90min
crecimientovegeta7voS.cerevisiae
Delobel&TesnierePLoSONE,2014
LAG(1)COMIENZODELCRECIMIENTO(2)LOGARÍTMICA(3)dN/dt=αN->N=N0eαdt->ln(N/N0)=αdt->td=ln2/α,N=N0eln2dt/td->N=N02dt/tdDEENLENTECIMIENTO(4)ESTACIONARIA(5)
CICLOCELULAR
segumientoporturbidimetría(AbsDO600nm)
lasdis7ntasfasesdelciclocelularpuedenseguirsemediantecitometríadeflujo
Delobel&TesnierePLoSONE,2014
CICLOCELULAR
lasdis7ntasfasesdelciclocelularpuedenseguirsemediantecitometríadeflujo
Delobel&TesnierePLoSONE,2014
CICLOCELULAR
ciclodevidadelevaduras
S.cerevisiae S.pombe
DavidM.Bedwell,UniversityofAlabamaatBirmingham
Saccharomycescerevisiaeenlanaturaleza
pormásqueaislehaploidesseformandiploides
¿Paraquequierohaploides?
Gammie et al., Mol Biol Cell 1998 Aguilar et al. Trends in Genetics, 2013
apareamientodeS.cerevisiae
envejecimientoymuerte2escenariosdeestudio
LAG(1)COMIENZODELCRECIMIENTO(2)LOGARÍTMICA(3)DEENLENTECIMIENTO(4)ESTACIONARIA(5)
>1000años
dis7ntosmodelospestudiarelenvejecimiento
levaduras:rápida,barataymaleable
limitadatambien
pero
muchosmecanismosdeenvejecimientoestanconservados
Longo,Shadel,KaeberleinandKennedy,CellMetab2012
enlevaduras
Longo,Shadel,KaeberleinandKennedy,CellMetab2012
• todaslaslevadurasu7lizanazúcares• GLUCOSAeslamásu7lizada
CATABOLISMODECARBONO
glucosa-6-P
DHAP/G3P
piruvato
ATPNADH
glicerol
acetaldehído+CO2
ENAUSENCIADEO2:FERMENTACIÓN
etanol
acetato
PDC
ADH
glucosa
ALD
GPP1/2 lavíaEMPescentral
muchosazúcaresentranporDIFUSIÓNFACILITADA
glucosa-6-P
DHAP/G3P
piruvato
ATPNADH
Ac-CoA
O2
glucosa
ENPRESENCIADEO2:RESPIRACIÓN
piruvato TCA
CO2ATPNADHFADH2
FOSFORILACIÓNOXIDATIVA
ATP
PDC CO2
CATABOLISMODECARBONO• enpresenciadeoxígenoelpiruvatoesoxidadoaC02atravésdelTCAgenerando
tambienpoderreductor• lafosforilaciónoxida7vaconsumeO2,poderreducturygeneraATP
glucosa-6-P
DHAP/G3P
piruvato
ATPNADH
Ac-CoA
O2
glucosa
piruvato TCA
CO2ATPNADHFADH2
FOSFORILACIÓNOXIDATIVA
ATP
PDC CO2
ATPNADH
glicerol
etanol
acetato
PDC
ALD
GPP1/2
acetaldehído+CO2
metabolismo ejemplos
aerobiasobligadas respiratorio Cryptococcus,Kluyveromycesaestuarii,Rhodotorulaglu7nis
faculta7vas(ligeramayoría)
ambos S.cerevisiae,C.albicans,S.pombe,Pichiapastoris
fermentadorasobligadas(raras)
fermenta7vo Candidapintolopesii,
CATABOLISMODECARBONOdisLntaslevaduraspresentandisLntoscomportamientos
puedencrecerenanaerobiosis
aerobiasestrictas
dentrodeunmismocomplejo(sacaromicetales)existeampliadiversidadmetabólica
Mericoetal.,FEBS2007
S.cerevisiae
glucosa
anaerobiosis aerobiosis
víasppales EMP EMP
aceptore- etanol etanol
6C->? catabolismoparcial parcial
ATP/Glc 2 2
membranas comprome7das ergosterol+AGI
efectoCrabtree
glucosa
glucosa
sostenidopordis7ntosmecanismosrepresivos(glucosa-yotrasmoléculas-dependientes)de:*ac7vidadesenzimá7cas*expresióndegenesvinculadosalarespiración
noobstante,encondicionesdeaerobiosis,S.cerevisiaeman7eneunes7lodevidafermenta7vo(Crabtree+)
glucosa
SaccharomycesLachanceaSchizosaccharomycesDekkera
Piskuretal.,TRENDSinGene7cs2006
KluyveromycesCandidaPichiaYarrowia
Saccharomyces- consumeglucosaaaltavelocidad- estoleranteaaltasconcentracionesdeetanol- puedeuZlizaretanolcomofuentedeC
estrategiade“produce->acumula->consume”seimponeenunnichoricoenglucosa
existenlevadurasCrabtree(+)yCrabtree(–)
elusodeetanolesta,enparte,permi7doporlaac7vidaddelaenzimaADH2,productodeunaduplicacióngénicaancestral(≈80ma),elgenADH2esreprimidoporGlc
glucosa-6-P
DHAP/G3P
piruvato
ATPNADH
Ac-CoA
O2
glucosa
piruvato TCA
CO2ATPNADHFADH2
FOSFORILACIÓNOXIDATIVA
ATP
PDC CO2
ATPNADH
glicerol
etanol
acetato
PDC
ALD
GPP1/2
acetaldehído+CO2
ADH1
ADH2
glucosa-6-P
DHAP/G3P
piruvato
ATPNADH
Ac-CoA
O2
glucosa
piruvato TCA
CO2ATPNADHFADH2
FOSFORILACIÓNOXIDATIVA
ATP
PDC CO2
ATPNADH
glicerol
etanol
acetato
PDC
ALD
GPP1/2
acetaldehído+CO2
ADH1
ADH2
efectoCrabtree
glucosa
glucosaefectoPasteur:
O2
fermentación
Sellickycol,IntRevCellMolBiol,2008
GAL1GAL10
GAL7 GAL10
xlavíaLeloir
Capu[oycol,JBC.1949,1950Cardiniycol,Nature,1950Cabibycol,JBC,1953CabibyLeloir,JBC,1955
GALACTOSA
Gal2
laslevadurasaceptanunaampliavariedaddefuentesdeC
DISACÁRIDOS(maltosa,sacarosa,etc.)Generalmentesonclivadosprimerofueradelacélula(e.g.invertasa)PENTOSAS(xilosanoescatabolizadaporS.cerevisiae,siporK.lac7sTRIOSASÁCIDOSGRASOSETANOLMETANOLGLICEROL…
lalevaduras(comomuchoseucariotas):acumulanglucógenoacumulantrealosa(α,α-1,1diglucosa)producendis7ntosaminoazúcares(e.g.GlcNAc,GalNac)producenderivadosdeinositol(e.g.I3P)
laslevadurasaceptanunaampliavariedaddefuentesdeC
lalevaduras,comomuchoseucariotas:puedenu7lizarlípidoscomofuentesdeE(β-oxidación)
METABOLISMODELÍPIDOSS.cerevisiae
compartencasielmismorepertoriodelípidosdecélulasdemamíferos:TAGglicerolípidosfosfoinosí7dosesterolesesfingolípidosyceramidas
mamíferos
levaduras(yplantas)
puedenu7lizarfuentesdeNtantoorgánicas(e.g.glutamato,arginina)comoinorgánicas(NH4+)puedensinte7zartodoslosaminoácidos,pirimidinasypurinas tomanPO4
3-comoppalfuentedePpuedenalmacenardis7ntosinositolpirofosfatosyadenosinpolifosfatostomanSO4
2-comoppalfuentedeSpuedensinte7zarbio7na,7amina,piridoxina,riboflavinayotrasvitaminasycofactores
METABOLISMODEN,PySlevaduras
enresumen,laslevaduraspresentanunaampliadiversidadmetabólica,abracandogranpartedelmetabolismoconocidoeneucariotassuperiores
estadiversidadesactualmenteexplotadaenlaindustria
metabolismoenlevadurasS.cerevisiae
80%
laenergíamundialactualmentesebasaencombus7blesfósiles CO2
COMBUSTIBLES
QUÍMICOS
FÁRMACOS
80%
quepuedenserreemplazadosporbiomasa CO2
+
COMBUSTIBLES
QUÍMICOS
FÁRMACOS
dis7ntaslevadurassonu7lizadascomoFÁBRICASCELULARES
ALIMENTOSBebidasalcohólicasPan,lácteos,chocolateCafé
FARMACÉUTICAAn7bió7cosHormonasAn7cancerígenosUS$109
COMBUST.YQCA.Bioetanolácidocítrico1,2propanodiol….US$3x1012
Nielsen&Jewe[FEMSYeastRes,2008
pre-tratamiento
procesosmetabólicosdelevadurassonmanipuladosparalaproducciónindustrial
cereales fábricacelular
madera azúcares
fermentación
COMBUSTIBLESetanolbutanoldieselQUÍMICOSlisinaácidolác7coácidosuccínico….
CADENADEVALOR
materiasprimas combus7bles,químicos,etc.pre
tratamiento purificación formulaciónfermentación
I+D
COSTOS:10-50106US$
CONSORCIOSDEEMPRESAS
rutabiosinté7cadevalina
adi7vona�aslacas
pinturas
adi7vona�asp/avionessolventesperfumes
rutabiosinté7cadeergosterol
solventepolímeroselás7cos
4hidroxibu7rato(ferm.glucosa)
laslevadurasnaturalmenteproducenetanol,CO2ymáslevadurasperopuedensermodificadasparaproducirunaampliavariedadde
moléculas
INGENIERÍAMETABÓLICA
enINGENIERÍAMETABÓLICAunavariableprincipalesel7empodedesarrollodenuevascepas
Hong&Nielsen,Cell.Mol.LifeSci.,2012
h[p://biochemical-pathways.com/#/map/1
S.cerevisiae:>1500reaccionesmetabólicasasociadasa>900genesH.sapiens::>8000reaccionesmetabólicasasociadasa>3000genes
(altadiversidadycomplejidad)
Nielsen,2013Bioengineered4:4,207–211
1980’S
1750’S2000’S
1960-1970
ciclodeI+Dp/levadurasindustriales
BiologíadeSistemas
BiologíaSinté7ca
MALARIA• EnfermedadcausadaporelparásitoPlasmodiumfalciparum(introducido
porpicadurasdemosquitosAnofelesinfectados)• 50%delapoblaciónmundialenriesgodeinfectarse• 2015:214x106casos,438.000muertes,costosdirectosUS$12x109/año• 2000->2015métodosdeprevenciónycontrolbajaronsuincidenciaun60%• Tratamiento:artemisininacombina7ontherapy(ACT)US$0.5,desde
2004
desde2012sedetectancepasdeP.falciparumresistentes
MALARIA• EnfermedadcausadaporelparásitoPlasmodiumfalciparum(introducido
porpicadurasdemosquitosAnofelesinfectados)• 50%delapoblaciónmundialenriesgodeinfectarse• 2015:214x106casos,438.000muertes,costosdirectosUS$12x109/año• 2000->2015métodosdeprevenciónycontrolbajaronsuincidenciaun60%• Tratamiento:artemisininacombina7ontherapy(ACT)US$0.5,desde
2004
delaplantaArtemisiaannuausadaenmedicinachinadesde-200(AD)iden7ficadaenlos1972(guerradeVietnam,Mao)
desde2012sedetectancepasdeP.falciparumresistentes
Artemisia annua:
0.25 US$
9 años 150 personas/año
25M US$
pre-tratamiento
variosprocesosfermenta7vos(bioetanol)sonmáseficientesaTº35-42ºC
cereales fábricacelular
madera azúcares
fermentación
COMBUSTIBLESetanolbutanoldieselQUÍMICOSlisinaácidolác7coácidosuccínico….
laTºóp7madeS.cerevisiaees30ºC
Caspetaetal.,Science2014
600generacionescreciendoaaltaTº
EVOLUCIÓNADAPTATIVA(enellaboratorio)
comprobaciónfenompica
secuenciaciónmasivaeiden7ficacióndemutacionesmutacionespuntualesenERG3
lascepasevolucionadas7enenunperfildeesterolescambiado
1MUTACIÓNPUNTUALTIENEEFECTOSMÚLTIPLES(dificildepredecirlamedianteanálisismetabólico)
otraslevaduras• DebaryomyceshanseniiOsmotoleranteyhalotolerante
Aceitedeoliva,quesos,embu7dosProduccióndebioetanolapar7rdepentosas vegeta7vas ascos
• KluyveromyceslacLsymarcianusQuesos,yoghur,kefir,café,cacaoProteínasrecombinantes
eficienteusodelactosa,Crabtree(-),GRAS
cacaoenlavaina microorgdurantelafermentacióndelcacao
otraslevaduras• YarrowialypolíLcaOsmotoleranteyhalotolerante
gotaslipídicas
Xieetal.ApplMicrobiolBiotechnol2015
eficienteusodeglucosa,fructosa,glicerolyácidosgrasosGRASbuencrecimientoenfermentadores(100gpesoseco/lt)“oleaginosas”hastaun30%delpesosecosonlípidos
USD1200/Kg
• Candidaalbicans
otraslevaduras
DimórficoEstadoteleomorfoaúndesconocidoResidentenormalenpielymucosasPatógenooportunista(10%infeccionesintrahospitalarias)
5µm
25-27ºC 37-40ºC
• Cryptococcusneoformans,gaLiHábitatsmuydiversosEstadoteleomorfoFilobasidiellaneoformans,Capsulado,pigmentadoPatógenooportunista(SNC,piel,víasrespiratorias)
• ParacoccidioidesbrasiliensisDimórficoResidentenormalensuelos(cul7varesdecafé)PatógenoemergenteennuestrazonaInfeccionescutáneasydelasviasrespiratoriasEstadoteleomorfoaúndesconocido