MICOBIOTA ALTERNATE EN MILANESAS DE SOJA Y

VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Universidad Nacional de Mar del Plata

Facultad de Ciencias Agrarias

Agosto de 2005

MICOBIOTA ALTERANTE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Monografía presentada como requisito parcial para

optar al grado de Licenciado en Ciencia y Tecnología

de los Alimentos.

Licenciatura en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Facultad de Ciencias Agrarias

Universidad Nacional de Mar del Plata.

Agosto de 2005

MICOBIOTA ALTERANTE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Director: Dr. Federico Laich ..... ........ ........ ...........

Asesor: Ing. Agr. Yolanda Andreoli .... ........ ........ ............

Asesor: Lic. Osvaldo Cuello .... ........ ........ ...........

Delegado del Decano: .... ........ ........ ...........

AGRADECIMIENTOS

• Al dueño de la empresa donde realice este proyecto. Sin

su permiso no hubiera sido posible mi trabajo.

• A Federico Laich, Yolanda Andreoli y Osvaldo Cuello,

quienes me guiaron en mi trabajo.

• A Yoli y Elsa del Laboratorio de Microbiología de Suelos

de I.N.T.A. Balcarce, quienes me ayudaron cuando el trabajo

me desbordaba.

• A la profesora Graciela Vacarezza de la Facultad de

Ciencias Veterinarias, UNICEN, Tandil, quien me permitió

utilizar el servidor de la Facultad y acceder a valiosísima

información.

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN. .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. 1

1.1. Los hongos como contaminantes y degradadores de los alimentos. ... . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. 1

1.1.1. Principales especies contaminantes. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. 3 1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la micobiota. . . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. 5

1.2. Problemas del consumo de alimentos contaminados con hongos. .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. 7

1.2.1. Principales micotoxinas y su efecto en el humano. .. . .. .. 8 1.3. Métodos de control del crecimiento de contaminantes. .12 1.4. Objetivos. ... . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .14

2. MATERIALES Y MÉTODOS. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .16

2.1. Proceso de elaboración... .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .16 2.2. Identificación de la micobiota contaminante. . .. . .. . .. . .. . .. .18

2.2.1. Muestreo. .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .18 2.2.2. Aislamiento y purif icación. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .19 2.2.3. Identif icación primaria. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .20

2.3. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. ... . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .20 2.4. Tratamiento térmico. ... . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .21 2.5. Efecto del pan rallado como contaminante. . .. . .. .. . .. . .. . .. .23 2.6. Contaminación cruzada. .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .24 2.8. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. .. .26

3. RESULTADOS. .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .27

3.1. Identificación de la micobiota contaminante. . .. . .. . .. . .. . .. .27 3.1.1. Materias primas. ... . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .27 3.1.2. Milanesas. ... . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .27 3.1.3. Ambiente. .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .30

3.2. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. ... . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .30 3.3. Tratamiento térmico. ... . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .35 3.4. Efecto del pan rallado como contaminante. . .. . .. .. . .. . .. . .. .37 3.5.Contaminación cruzada. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .38 3.6. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. .. .40

4. DISCUSIÓN FINAL. ... . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42 5. BIBLIOGRAFÍA. ... .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Escala visual de contaminación uti l izada en la evaluación de las milanesas de zapallo y cebolla. ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de cebolla y zapallo. La escala uti l izada para cuantif icar el grado de contaminación se detalla en el apartado 2.6. ........ . . . . . . . . . . . 50

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja. ........ 28

Figura 2: Esquema del ensayo aplicando un shock térmico a las milanesas una vez escaldadas. ........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de almacenamiento, después de la incubación a 25º C en cámara húmeda durante 7 días. ........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan ral lado recolectadas en diferentes t iempos del proceso de elaboración......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Figura 7: Desarrol lo de colonias fúngicas en las placas de Petri con el medio de cult ivo APA 5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado sin usar (izquierda) , pan ral lado usado (centro), y pan ral lado de las bandejas (derecha). Todas las placas corresponden a la misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas. ... 46

Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock ( izquierda) y con shock (derecha). ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock ( izquierda) y con shock (derecha). ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada). ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada). ....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Figura 12: Crecimiento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéri l evitando la contaminación cruzada. ........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

RESUMEN

Los hongos filamentosos tienen la capacidad de desarrollarse

sobre la superficie de muchos alimentos con un típico aspecto

aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado.

Si bien es cierto que ciertas especies son útiles en la

elaboración de ciertos productos alimenticios o de

componentes de los mismos, muchas especies fúngicas

intervienen en la formación de micotoxinas y en la alteración

de diferentes tipos de alimentos. En estos casos se considera

que el producto no es apto para el consumo.

El objetivo del presente trabajo fue determinar el origen de la

contaminación fúngica e identificar las especies existentes en

la elaboración de milanesas de soja y verdura en una fábrica

ubicada en el SE bonaerense. Para ello, se realizó un estudio

cuantitativo y cualitativo de diferentes especies que se

desarrollaban a través del proceso de elaboración y

almacenamiento de las milanesas. En este análisis se

determinó la micobiota existente a partir de los productos

utilizados como materia prima (harinas, pan rallado, etc.), y

sobre el producto elaborado y almacenado. Las principales

especies aisladas fueron identificadas como Penicill ium spp.,

Aspergillus spp., Rhizopus spp. Alternaria sp. y Cladosporium

spp. La presencia de hongos filamentosos en el alimento se

debió principalmente a la contaminación ambiental y al pan

rallado utilizado en el rebozado final del producto. La

aplicación de un tratamiento térmico previo al rebozado

disminuyó significativamente la concentración de levaduras en

unidades formadoras de colonia por gramo (ufc), mientras que

el recuento de ufc de hongos filamentosos se incrementó luego

del rebozado y a través del periodo de almacenamiento. Por

último, la utilización de sorbato de potasio y la conservación

de las milanesas a bajas temperaturas, incrementó

significativamente la vida útil del producto.

ABSTRACT

Moulds have the aptitude to develop on surfaces of many

food with their typical velvet or cottony aspect, sometimes

pigmented.

Though it is true that certain species are useful in the

production of food products or their components, many fungi

species intervene in the formation of mycotoxins and in the

alteration of different types of food. In these cases it is

considered that the product is not suitable for the

consumption.

The aim of the present work was to determine the origin of

the fungi spoilage and to identify the species in the production

of soybean and vegetable escalopes in a factory located in the

SE of Province of Buenos Aires. There, a quantitative and

qualitative study of different species developing during the

process of production and storage of the product was realized.

In this analysis the existing mycobiota was determined from

the products used as raw material (flours, breadcrumbs, etc.),

and from the elaborated and stored product. The principal

isolated species were identified as Penicillium spp.,

Aspergillus spp., Rhizopus spp. Alternaria sp. and

Cladosporium spp. The presence of spoilage moulds in the

food was related principally to the environmental contaminants

and to the breadcrumbs used. The application of a thermal

shock before the final rolled in breadcrumbs, decrease

significantly the yeast colony forming units per gram (cfu),

whereas moulds cfu increased after the treatment and during

storage. Finally, the application of potassium sorbate and

conservation at low temperature, increase the shelf-life of the

product.

1. INTRODUCCIÓN.

En los últimos años la dieta de los argentinos se ha visto

orientada hacia alimentos más saludables y de menor costo y

la soja ha desempeñado un papel muy importante como

reemplazante de las proteínas de origen animal, ya sea bajo la

forma de leche, milanesas o hamburguesas de soja. Si bien las

cantidades de soja que se pierden por contaminaciones

microbiológicas durante la elaboración de los alimentos son

importantes, no existen publicaciones que citen el problema y

menos aún, que traten de enumerar o explicar cuáles son los

microorganismos implicados, ni como evitar la alteración de

este tipo de alimentos.

El presente trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar

de milanesas de soja ubicada en la ciudad de Tandil. Si bien la

producción de la fábrica es pequeña y la mayoría de la

mercadería se vende en comercios de la ciudad, la intención

del propietario fue aumentar su producción y el área de venta

hacia otras ciudades. En estas circunstancias el tiempo que

transcurre entre elaboración y consumo es mayor y por lo

tanto se detectaron problemas de contaminación y desarrollo

de microorganismos. Ante esta situación la finalidad del

presente trabajo fue identificar los principales

microorganismos contaminantes, detectar su fuente de inóculo

y proponer modificaciones durante la elaboración para evitar la

aparición y desarrollo de microorganismos.

1.1. Los hongos como contaminantes y degradadores de los alimentos.

Los consumidores de los países desarrollados tienen una

actitud más crítica a la hora de elegir que comer y que beber

como consecuencia de la vida moderna. Por ende los

microbiólogos en alimentos tienen cara a cara el enorme

desafío de garantizar la frescura de los alimentos que está

implícita en la demanda de los consumidores. Los alimentos

con procesos menos severos, l ibres de aditivos, más seguros y

fáciles de preparar son buscados debido a la alta

concientización del consumidor en lo que respecta a nutrición

y salud (Loureiro y Querol, 1999).

Actualmente existe un amplio conocimiento y comprensión

de los hongos en la contaminación alimenticia. En los últimos

5-10 años se lograron los mayores progresos que han

contribuido a prevenir la contaminación causada por hongos,

remarcándose su importancia en la contaminación alimenticia

tras el descubrimiento de las micotoxinas (Filtenborg et al. ,

1996).

A pesar de las innovaciones científicas aplicadas a la

identificación de microorganismos, la mayoría de los métodos

de análisis estándar, así como otros métodos util izados en la

industria de alimentos, siguen utilizando los pasos clásicos

establecidos hace ya algunas décadas:

1) mezcla/homogeinización de la muestra; 2) dilución

decimal del homogeneizado; 3) siembra de las diluciones en el

medio apropiado 4) aislamiento, purificación e identificación

de los microorganismos. En algunos casos se necesita aplicar

técnicas de preenriquecimiento o de selección previo a la

siembra. (Loureiro y Querol, 1999).

Generalmente los alimentos no son tratados como un

ecosistema, tal vez porque no sean considerados sistemas

“naturales”. Sin embargo, si lo son, ya que los almacenes de

alimentos son vastos. Los alimentos como hábitat de

microorganismos son muy ricos en contraste del suelo, agua y

vegetales. Dadas las condiciones fisicoquímicas correctas, una

población de microorganismos será capaz de crecer y

desarrollarse en ese alimento. En los alimentos “vivientes”

como las frutas y vegetales frescos, un gran número de

mecanismos de defensa son aplicados en contra de la invasión

de microorganismos. Pero en los alimentos que se encuentran

en un estado de latencia o no vivos los factores a tener en

cuenta son actividad de agua, concentración de iones

hidrógeno, temperatura (de procesado y almacenamiento),

tensión de gases (especialmente oxígeno y dióxido de

carbono), consistencia, composición nutricional, efectos

específicos de solutos y la presencia de conservantes (Pitt y

Hocking, 1997).

1.1.1. Principales especies contaminantes.

Los mohos son capaces de crecer en todo tipo de

alimentos: cereales, carne, lácteos, frutas, vegetales, frutos

secos y productos de éstos. El crecimiento fúngico resulta en

diversos tipos de alteraciones alimenticias: flavores

desagradables, toxinas, decoloración, pudrición y formación

de propágulos patógenos o alérgenos (Chelkowski,1991;

Bigelis, 1992; Tipples, 1995). El deterioro de las propiedades

sensoriales es a menudo causada por la producción de

exoenzimas: lipasas, proteasas y carbohidratasas (Bigelis,

1992). Una vez que éstas enzimas se encuentran dentro del

alimento continúan su actividad independientemente de la

destrucción o la remoción del micelio (Tindale et al. , 1989;

Whitfield et al. , 1991; Lily y Viani,1995).

Con respecto a las levaduras, los reportes publicados hace

unos 30-40 años atrás, afirmaban que el riesgo que provocaban

las levaduras en la salud humana no era significante. Sin

embargo, a partir de la década de los 80 existen trabajos de

investigación que refieren por primera vez la necesidad de

reevaluar el impacto en la salud pública causada por las

levaduras en alimentos (Loureiro y Querol, 1999). La

contaminación producida por levaduras consiste en una

alteración de las propiedades físicas o sensoriales del

alimento como resultado de su actividad. En las bebidas

ácidas con o sin azúcar ocurren las alteraciones más

conocidas, estando caracterizadas por una abundante

producción de gas que puede llegar a deformar envases,

formar sedimentos, aromas y gustos alterados. En otro tipo de

alimentos las principales alteraciones que las levaduras

pueden provocar son el crecimiento superficial, la

decoloración, la producción de gas, la formación de biofilms,

flavores desagradables y cambios de textura (Loureiro y

Querol, 1999).

La micobiota xerofílica está caracterizada por ser la de

mayor capacidad para crecer bajo condiciones de actividades

de agua (aw) de 0,85 y es asociada muy comúnmente a

alimentos de humedad intermedia, incluyendo cereales,

nueces, especias y un amplio espectro de alimentos secos

(Hocking y Pitt, 1988). Según un estudio realizado en harinas

Australianas (Berghofer, 2003) los microorganismos más

frecuentemente detectados en las harinas fueron Bacillus spp.,

coliformes y mohos. Se aislaron 102 Unidades Formadoras de

Colonia por gramo (U.F.C./g) de levaduras y 103 U.F.C./g de

mohos, siendo los mohos más comúnmente aislados

Aspergillus, Penicillium Penicillium, Cladosporium y Eurotium

spp.

Los causantes más frecuentes de la contaminación de

panificados son los hongos y levaduras. Los géneros de

hongos más importantes aislados a partir de los panificados

españoles son Eurotium, Cladosporium y las especies mas

xerotolerantes de Penicillium Penicillium y Aspergillus

(Abellana et al. 1997b). Según Ramos (2002) a causa de la aw

de los productos panificados (0,75–0,90), los hongos alterantes

son comúnmente xerófilos, encontrándose especies de

Eurotium y Aspergillus . Estos mohos son destruidos durante el

horneado, por lo tanto la contaminación proviene de las

esporas ambientales o de las superficies que se encuentra en

contacto con el producto durante el enfriado (Seiler, 1988;

Fustier et al. 1998). El crecimiento fúngico en panificados

durante el almacenamiento es un problema serio que ocasiona

importantes pérdidas económicas. A causa de la baja aw de

estos productos (0,75-0,90), la contaminación fúngica es

comúnmente producida por las especies más xerofílicas del

género Aspergillus. Las especies de Eurotium, formalmente

conocidas como las del grupo de Aspergillus glaucus tienen un

crecimiento óptimo a 0,70-0,80 aw en sustratos que contienen

altas concentraciones de sal o azúcar (I.C.M.S.F., 1980).

En porotos de soja se ha encontrado que los mohos son

importantes contaminantes. Los géneros aislados más

frecuentemente son Penicillium, Aspergillus , Scopulariopsis ,

Mucor, Rhizopus y Cladosporium. Las especies de Aspergillus

encontradas y aisladas fueron A. candidus, A. flavus, A.

fumigatus, A. niger, A. ochraceus, A. sydowiiy y A. versicolor.

(Kacàniovà, 2003).

Rabie (1997) encontró que la micobiota de los granos de

cebada sometidos a malteado también variaba según su etapa

de proceso: los granos sin remojar dieron conteos más altos

de Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Epicoccum nigrum y

Mucor spp, sin embargo, en los granos preremojados se

obtuvieron conteos más altos de Penicillium spp.

1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la micobiota.

Anderson y Smith (1971) y Deans et al. (1980), demostraron

que la formación y germinación de conidios y esporas depende

principalmente de las condiciones de crecimiento (sustrato, aw

y temperatura), lo que revela las limitaciones de los métodos

microbiológicos basados en la enumeración de esporas

formadas para evaluar el crecimiento fúngico.

El concepto de aw introducido por Scott (1957) es la forma

más útil para expresar la disponibilidad de agua existente para

el crecimiento de microorganismos (Lacey y Magan, 1991) y su

actividad enzimática (Acker, 1963). La aw no es el único factor

ambiental que influencia el crecimiento fúngico. Su

crecimiento y sobrevivencia estarán influenciados por la

temperatura, pH, concentración de oxígeno y dióxido de

carbono, y la presencia de conservantes. Cuando uno de estos

factores es subóptimo, el efecto inhibitorio de la aw reducida

tiende a incrementarse.

Los niveles de aw correspondientes al rango de contenidos

de humedad pueden ser trazados para proveer una isoterma de

sorción de agua. Esta isoterma es muy útil, pues no sólo nos

muestra a que contenidos de humedad son conseguidos

niveles de aw deseables o indeseables, sino que también nos

indican que significativos serán pequeños cambios del

contenido de humedad en términos de aw . Por ende, es una

guía útil para determinar la longitud del periodo de

almacenamiento de alimentos conservados a temperaturas

moderadas y preservados solo por su aw reducida. El

crecimiento fúngico en alimentos inadecuadamente

almacenados puede provocar la inducción de producción de

micotoxinas (Jimenez et al. , 1991; Scudamore y Hetmanski,

1995). Las isotermas de sorción de agua de cereales y de otros

productos han sido estudiadas y publicadas por diferentes

autores: en arroz por Rahgaswami (1973), Hunt y Pixton (1974)

y Gough y King (1980); en harina de trigo por Bushuk y Winkler

(1957), Pratap et al. (1982) y Leiras e Iglesias (1991); y en

harina de arroz, harina de arroz aglutinada y arroz aglutinado

Abdullah et al. (2000).

1.2. Problemas del consumo de alimentos contaminados con hongos.

La consecuencia más grave de la presencia de mohos en los

alimentos es que éstos pueden llegar a ser capaces de

producir toxinas si las condiciones son favorables. Estas

toxinas se denominan micotoxinas y son metabolitos tóxicos

que ingeridos en cantidad suficiente, provocan intoxicación en

el hombre y animales. Una micotoxicosis es un problema

alimentario, que no es infeccioso ni contagioso (Bourgois,

1994).

Como para todas las sustancias tóxicas hay que distinguir

entre las intoxicaciones agudas que se producen por la

ingestión de una sola vez o varias veces seguidas de una dosis

relativamente elevada de toxinas, y las intoxicaciones crónicas

que se manifiestan después de la ingestión de pequeñas dosis

repetidas durante largos periodos. Estas últimas son las que

afectan en mayor grado al ser humano ya que al demostrarse

que la Aflatoxina B1 es cancerígena, las concentraciones

necesarias para producir una intoxicación son mínimas (Moss,

2002). Estas intoxicaciones provocan problemas pasajeros o

crónicos, que afectan a varias funciones del organismo:

alteraciones hepáticas, renales, de los centros nerviosos,

circulatorias, del tracto digestivo, etc.

Las micotoxinas son producto del metabolismo secundario

de los mohos y no todos las elaboran. Además el tipo de

sustrato y las condiciones ambientales juegan un papel

importante en el nivel de su producción. Es por esta razón por

la que no es suficiente detectar en un alimento una especie de

moho tóxico para considerar a un alimento peligroso.

Las micotoxinas más importantes son las: Aflatoxinas,

producidas por A. flavus y A. parasiticus; la Zearalenona

producida por especies del género Fusarium; la Ocratoxina que

es producida por A. ochraceus y P. viridicatum; los

Tricotecenos que son producidos sobre todo por especies del

género Fusarium y también por otras especies de mohos como

Stachybotris , Trichotecium, Myrothecium, Dendrodochium, etc;

la Patulina que es producida por numerosos mohos pero

principalmente por P. expansum y la Fumonicina producida

principalmente por F. moniliforme.

En la alimentación humana la diversificación de la dieta

impide la absorción regular de cantidades suficientes de

toxinas para llegar a ser peligrosas a excepción de países

castigados por el hambre. Actualmente, el consumidor tiene la

tendencia a creer que todo lo natural es bueno, pues

precisamente las micotoxinas son un ejemplo de moléculas

naturales elaboradas espontáneamente por mohos en nuestro

ambiente y que pueden ser el origen de graves intoxicaciones.

Son típicos contaminantes biológicos y por lo tanto se debe

prestar especial atención en el control de su desarrollo.

Una de las principales fuentes de contaminación de mohos

micotoxigénicos, es el aire (Cvetni et. al, 1997). En Croacia se

expusieron al aire 350 cajas de Petri durante 10 minutos y se

identificaron 3.400 colonias de 22 géneros distintos, siendo los

géneros mas frecuentes Cladosporium (44.7%), Penicillium

(34.4%), Alternaria (26.3%), Aspergillus (21.6%) y Absidia

(12.2%). Encontrándose que el 16,9 % de los aislados de los

géneros Aspergillus , Fusarium y Trichoderma eran

potencialmente productores de micotoxinas.

1.2.1. Principales micotoxinas y su efecto en el humano.

Las aflatoxinas son compuestos con efectos tóxicos

inmediatos, además de inmunosupresores, mutagénicos,

teratogénicos y carcinogénicos. El principal órgano afectado

por la carcinogénesis de las aflatoxinas es el hígado. La

evaluación de los resultados epidemiológicos y de laboratorio

llevada a cabo en 1987 por el Centro Internacional de

Investigaciones sobre el Cáncer (CIIC) determinó que existen

suficientes datos demostrativos del efecto carcinogénico de

mezclas naturales de aflatoxinas en el ser humano, las cuales

se clasifican por ello como carcinógeno del Grupo 1, salvo en

el caso de la aflatoxina M1, que se considera posiblemente

carcinogénica para el hombre (Grupo 2B) (IARC, 1987)

Se han registrado varios brotes de aflatoxicosis en países

tropicales, la mayoría entre adultos de las poblaciones rurales

con una nutrición deficiente y cuyo alimento básico era el

maíz. El cuadro clínico llevaba a sospechar una intoxicación

hepática aguda, que se confirmó por las alteraciones

morfológicas observadas en las muestras de necropsia

hepática, indicativas de hepatitis tóxica. (Tandon et. al. 1977)

Las tasas de mortalidad en la fase aguda eran del 10%-60%.

Transcurrido un año, los supervivientes no presentaban

ictericia y la mayoría se habían recuperado clínicamente. (Bhat

and Krishnarnachari, 1977).

También se han señalado a las aflatoxinas como posibles

factores etiológicos de un cuadro de encefalopatía y

degeneración grasa similar al síndrome de Reye, frecuente en

países de clima cálido y húmedo. Con degeneración grasa,

palidez y aumento de tamaño del hígado y los riñones, unidos

a edema cerebral grave.

El ácido 3-nitropropiónico (3-NPA) es un metabolito

secundario de Artbrinium sp., género de hongos considerados

causantes de una forma de intoxicación alimentaria aguda

denominada “intoxicación por la caña de azúcar mohosa” (Liu,

1988). Durante el periodo 1972-1988, resultaron afectadas 884

personas y se produjeron 88 (10%) defunciones. (Liu et al. ,

1992). El principal dato epidemiológico es el reducido número

de personas en cada brote (entre una y cinco), siendo las

víctimas en su mayoría niños y jóvenes. El periodo de

incubación suele ser de entre 2 y 3 horas a partir de la

ingestión de la caña de azúcar mohosa, y se desarrolla

principalmente con vómitos, distonía, desviación unilateral de

la mirada, convulsiones, espasmo cardopedal y coma. Entre el

10% y el 50% de los pacientes se ven afectados por un cuadro

de distonía tardía, consecuencia de la necrosis simétrica y

bilateral de los núcleos basales. En el adulto, el 3-NPA causa

síntomas gastrointestinales; no son frecuentes los signos de

encefalopatía grave. (Ludolph et al. , 1991)

Las ocratoxinas son metabolitos secundarios de cepas de

Aspergillus y Penicillium presentes en los cereales, el café y el

pan, así como en todo tipo de productos alimenticios de origen

animal en muchos países. (Speijers y Van Egmond, 1993) La

más frecuente es la ocratoxina A, que también es la más

tóxica. Se ha comprobado que tiene efectos nefrotóxicos,

inmunosupresores, carcinogénicos y teratogénicos en todos

los animales de experimentación estudiados hasta el momento

(Criterios de Salud Ambiental).

Se registró en Italia un caso de insuficiencia renal aguda

debido posiblemente a la inhalación de ocratoxina A en un

granero que había permanecido cerrado por 2 años (Di Paolo et

al., 1994). Los síntomas aparecieron al cabo de 24 horas,

durante las cuales el paciente presentó tensión epigástrica

transitoria, dificultad respiratoria y pirosis retroesternal. La

biopsia mostró una necrosis tubular aguda, pero no se

investigó la presencia de ocratoxina A en sangre. La

cromatografía de capa fina demostró cualitativamente la

presencia de la micotoxina en el trigo del granero. No existe

fase aguda; los primeros signos y síntomas son inespecíficos,

consisten en cansancio, cefaleas, pérdida de peso y palidez. A

lo largo de varios años va instaurándose una proteinuria leve

de proteínas de bajo peso molecular, sin hipertensión, pero

con anemia aplásica o normocrómica. La nefropatía endémica

se caracteriza por lesiones bilaterales y fundamentalmente

crónicas de la corteza renal (degeneración tubular, fibrosis

intersticial e hialinización glomerular). En fases avanzadas de

la enfermedad disminuye mucho el peso y el tamaño de los

riñones, que muestran una fibrosis cortical difusa, por lo

general sin signos de inflamación (Radonić et al. , 1966; Vukelić

et al. , 1992).

El CIIC clasificó la ocratoxina A como un compuesto

posiblemente carcinogénico para el ser humano (Grupo 2B)

(IARC, 1987).

Los tricotecenos son micotoxinas producidas sobre todo

por miembros del género Fusarium, aunque también las

sintetizan hongos de otros géneros (como Trichoderma,

Trichothecium, Myrothecium y Stachybotrys). Hasta la fecha se

han aislado 148 tricotecenas pero sólo unas pocas se han

detectado como contaminantes de los alimentos. De ellas las

más importantes son el desoxinivalenol (DON), conocido

también como vomitoxina, el nivalenol (NIV) y el

diacetoxicirpenol (DAS), mientras que la toxina T-2 es menos

común. (Criterios de Salud Ambiental , 1990).

Las manifestaciones habituales de la intoxicación por

tricotecenos consisten en inmunodepresión y náuseas,

acompañadas de vómitos. La primera micotoxicosis por

tricotecenos que se identificó fue la aleucía tóxica alimentaria,

en la URSS en el año 1932, con una tasa de mortalidad del 60%.

(Gajdušec, 1953).

En varios casos, la micotoxicosis por tricotecenas se debió

a una única ingestión de pan elaborado con harina tóxica

(Bhat et al., 1989) o de arroz (Ueno, 1971), (Wang et al., 1993).

En los animales de experimentación los tricotecenos son 40

veces más tóxicos por inhalación que por vía oral (98).

La zearalenona es producida principalmente por Fusarium

graminearum y especies afines, sobre todo en el trigo y el

maíz, pero también en el sorgo, la cebada y los piensos

compuestos. La zearalenona y sus derivados tienen efectos

estrogénicos en varias especies animales (inferti lidad, edema

vulvar, prolapso vaginal e hipertrofia mamaria en hembras, y

feminización de los machos, con atrofia testicular y aumento

de tamaño de las mamas) (Peraica et al., 2000).

Las fumonicinas son micotoxinas producidas en todo el

mundo por Fusarium moniliforme y especies afines cuando

crecen en maíz. Tienen importancia toxicológica las

fumonicinas B1 y B2; las demás aparecen en concentraciones

muy bajas y son menos tóxicas. En la India se informó de un

brote único de intoxicación aguda transmitida por los

alimentos y causada posiblemente por la fumonisina B1. (Bath

et al.,1987). La enfermedad se caracterizaba por dolores

abdominales, borborigmos y diarrea transitorios, que

comenzaban entre media hora y una hora después de consumir

pan ácimo preparado con sorgo o maíz mohos. Los pacientes

se recuperaron por completo al suprimir la exposición a la

toxina y no se produjeron defunciones.

Las toxinas de F. moniliforme han sido clasificadas por un

grupo de trabajo del CIIC como posiblemente carcinogénica

para el ser humano (Grupo 2B) (IARC, 1987).

1.3. Métodos de control del crecimiento de contaminantes.

Un método para prevenir la contaminación fúngica en

alimentos a medio procesar puede ser la aplicación del

"concepto barrera" o el método de conservación combinada.

Este método util iza varias “barreras”, que separadamente no

otorgan la conservación adecuada, pero combinadas brindan la

conservación conveniente. Estas barreras pueden ser cambios

en la temperatura, aw , pH, calentamiento mínimo o la adición

de conservantes. Para que éste concepto sea utilizado en

forma exitosa, la influencia de varios factores intrínsecos y

extrínsecos sobre el crecimiento fúngico necesitarán ser

cuantificados. El factor más importante dentro de los factores

ambientales que afectan la germinación, crecimiento y

establecimiento fúngico sobre sustratos ricos en nutrientes

probablemente sea la disponibilidad de agua (Magan, 1988;

Cooke y Whipps, 1993). El rango de valores de aw que permiten

la germinación de esporas es mayor a la temperatura óptima, y

generalmente es requerida una mayor aw para la formación de

la espora que para la germinación. Es por ello que el nivel de

aw es de importancia práctica para controlar la aparición y

severidad de la alteración producida por mohos. Comúnmente

se observa que los alimentos más fácilmente degradables por

la actividad de microorganismos y cambios químicos, son

usualmente los que poseen una aw mayor (Abdullah, et al. ,

2000).

La mayoría de los agentes conservantes clásicos son

ácidos débiles orgánicos. Estas moléculas inhiben el

crecimiento de células bacterianas y fúngicas. El ácido sórbico

también inhibe la germinación de esporas bacterianas (Sofos y

Busta, 1981; Blocher y Busta, 1985). Según Eklund (1983, 1985)

y Pethybridge et al. , (1983). La actividad antimicrobiana de

todos estos ácidos débiles depende principalmente de la

molécula sin disociar. Los conservantes ácido débil existen en

solución en un equilibrio dependiente del pH entre el estado

disociado y no disociado. La actividad inhibitoria es óptima a

bajo pH debido a que favorece al estado no disociado y no

cargado de la molécula. De esta forma, la molécula es

permeable a través de la membrana y por ello capaz de

ingresar a la célula. Sin embargo, la acción inhibitoria se debe

a los compuestos que atraviesan la membrana plasmática en el

estado disociado. Subsecuentemente, al encontrarse con un

pH mayor dentro de la célula, la molécula se disocia resultando

que el escape de los aniones y protones hacia el exterior de la

membrana no sea posible. Una reducción del pH desde 6,0 a

5,0-5,2 resulta en un gran incremento relativo en la proporción

de la forma no disociada (Chirife y Favetto, 1992). En

conclusión, las moléculas de conservantes difunden al interior

de la célula hasta que el equilibrio es alcanzado y provoca la

acumulación de aniones y protones dentro de la célula (Booth

y Kroll,1989). Por otro lado, se ha propuesto que la inhibición

del crecimiento por los conservantes ácido débil se debe a un

gran número de acciones, incluyendo la disrupción de la

membrana (Freese et al. , 1973; Stratford y Anslow, 1998;

Bracey et al. , 1998), inhibición de las reacciones metabólicas

esenciales, estrés en la homeostasis del pH intracelular

(Salmond et al. , 1984; Cole y Keenan, 1987; Bracey et al. , 1998)

y acumulación de aniones tóxicos (Eklund, 1985). En las

levaduras, también se ha propuesto que la acción inhibitoria

de los conservantes ácido débil es debida a la inducción de

una respuesta a un stress enérgico que atenta a restaurar la

homeostasis y resulta en la reducción de los pooles de energía

disponible para el crecimiento y otras funciones metabólicas

esenciales. Stratford y Anslow (1998) propusieron que el ácido

sórbico actúa como una sustancia activa a las membranas de

los microorganismos y no como un conservante ácido-débil.

1.4. Objetivos.

La soja es uno de los cultivos más importantes de la

Argentina tanto en superficie sembrada como en niveles de

producción. Tanto los aceites como las harinas de soja son

ampliamente consumidos en el país ya sea por sus

propiedades nutritivas como por sus bajos precios.

De las comidas con soja, la milanesa de soja es la más

conocida y aceptada en nuestro medio. Hay innumerables

variantes para este preparado. Estas recetas se publican muy

usualmente en revistas, libros e internet y van desde triturar

los porotos y formar una masa con condimentos, hasta mezclar

distintas harinas, entre ellas la harina de soja con huevo y

especias. A medida que se extendió su consumo apareció en el

mercado la venta minorista de harinas de soja en comercios

naturistas y fraccionadores. En la medida que la soja

reemplazó a otros alimentos en la dieta de los argentinos,

fueron apareciendo pequeñas empresas dedicadas a la

elaboración de milanesas de soja. Actualmente existen

innumerables pequeñas y medianas empresas (PyMES)

dedicadas exclusivamente a la elaboración de éste producto.

Además, la popularidad de éste producto es tal que figura en

las cartas de numerosos restaurantes de Argentina.

En lo que respecta a alimentos a base de soja no existen

antecedentes que describan su micobiota. Tampoco éste

producto se encuentra bajo una legislación y no es nombrado

en el Código Alimentario Argentino (C.A.A.). Sólo, existen

trabajos que enumeran los contaminantes encontrados en

productos cárnicos con agregados de proteínas o aislados de

soja.

Como se expreso anteriormente, el desarrollo del presente

trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar de milanesas de

soja ubicada en la ciudad de Tandil.

Los objetivos fueron:

1. Identificar la micobiota contaminante durante la

elaboración del producto.

2. Detectar las principales fuentes de contaminación y

los puntos críticos durante su manufactura.

3. Realizar modificaciones durante la elaboración que

permitan disminuir el desarrollo de microorganismos a

través de cambios en el proceso y mediante la adición

de conservantes.

2. MATERIALES Y MÉTODOS.

2.1. Proceso de elaboración.

En la fábrica se elaboran principalmente dos tipos de

milanesas: milanesas de soja y de verdura . Las milanesas de

soja son producidas con una mezcla de harina común, harina

aglutinada y harina de soja. En el caso de las milanesas de

verdura, la harina de soja es reemplazada por verdura fresca

hervida y triturada o por verdura deshidratada que se

reconstituye antes de formar la masa. Estos ingredientes son

inicialmente mezclados e hidratados en una amasadora de

panadería, hasta formar una masa con la consistencia deseada.

Posteriormente, la masa se estira por medio de una sobadora

eléctrica hasta obtener una lámina de medio centímetro de

espesor. Estas láminas son cortadas manualmente con un

molde que posee la forma definitiva de la milanesa. Para el

armado final se ubica una porción de queso cremoso en el

centro de dos láminas de masa y se cierra presionando sobre

los bordes. Una vez armadas las milanesas, se someten a un

proceso de escaldado en agua hirviendo. Para ello se

sumergen en el agua hasta que las mismas emergen a la

superficie. Por último, las milanesas se escurren y se rebozan

con pan rallado y una muy pequeña cantidad de orégano y

perejil deshidratado. El proceso implica gran cantidad de mano

de obra y se detalla en la figura 1.

Mezcla AguAMASA

Ma

ESTIRA

Lámi

CORTAD

Tapa

QuesCOLOCACIÓN

COLOCACIÓN

PEGADO DE

milan ALMACENADO

ESCALDADO

ALMACENADO

ENVASA

REFRIG

REBOZADO

Per

Pan Rall

Tapa

Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja.

2.2. Identificación de la micobiota contaminante.

2.2.1. Muestreo.

En todos los casos, las muestras se tomaron asépticamente

y se conservaron en placas de Petri o en tubos de ensayo

estériles para su posterior traslado al laboratorio. En el caso

de las materias primas (harinas y especias deshidratadas) se

extrajeron las muestras a partir de los recipientes que habían

recibido menor manipulación en la empresa, para determinar la

calidad microbiológica al momento de llegada a la fábrica.

Las muestras de milanesas fueron extraídas durante las

diferentes etapas del proceso de elaboración (figura 1). Se

analizaron milanesas de soja y de verdura, obteniéndose en

ambos casos las siguientes muestras:

• masa sin estirar.

• masa estirada (en el caso de la masa de soja, se obtuvo

además una muestra a las 24 h posteriores a su elaboración

y conservada en frío).

• milanesa sin cocinar.

• milanesa cocida y sin rebozar.

• milanesa cocida y rebozada.

Paralelamente, se realizó un muestreo ambiental con la

finalidad de identificar la micobiota presente en la fábrica.

Para ello se realizaron dos tipos de muestreos. En uno de ellos

se analizó la contaminación existente en el aire y en el otro la

contaminación de las superficies de trabajo. Para el primer

caso, se destaparon en diferentes lugares de la fábrica placas

de Petri conteniendo el medio de cultivo APA (papa 200 g

sometida a una decocción de 1 hora; azúcar 20 g; agar 15 g;

agua destilada 1.000 ml; pH 6,0; autoclavado a 121º C durante

20 min.) durante 5 minutos (método gravimétrico).

Posteriormente, las placas fueron incubadas en el laboratorio a

25º C durante 5 días. En el segundo caso, se realizaron

hisopados de la superficie de las mesas de trabajo y de las

bandejas donde se colocaban las milanesas a enfriar. Para

ello, se utilizaron hisopos comerciales estériles que fueron

introducidos en un tubo de ensayo con solución fisiológica

estéril (cloruro de sodio 0,85%) y posteriormente se frotaron

en un área de 10 cm2 por distintas partes de la mesa de

trabajo. Una vez recolectada la muestra, los hisopos se

conservaron dentro de la solución. A partir de ésta, se

realizaron diluciones seriadas de 1/10 y las mismas fueron

sembradas en superficie en placas de Petri con APA e

incubadas a 25º C durante 5 días.

2.2.2. Aislamiento y purificación.

Las muestras de masas y milanesas fueron incubadas en

cámaras húmedas a 25º C durante 7 días. Para ello se

utilizaron bandejas con tapa que fueron desinfectadas con

alcohol etílico comercial y ubicadas bajo luz UV en la cámara

de flujo laminar durante 10 minutos. Luego se colocaron en su

interior tres papeles de diario estériles por cámara y se

hidrataron con agua estéril .

También se dejaron en cámara húmeda 3 milanesas de soja,

con más de una semana de elaboración, que presentaban

signos de alteración fúngica con distinta micobiota

predominante.

Transcurridos los 7 días, se repicaron las colonias de

mohos y levaduras con diferencias morfológicas entre sí, en

placas de Petri con medio APA. Este procedimiento se repitió

tantas veces como fue necesario hasta obtener un cultivo

puro.

Los conidios de los diferentes aislamientos de hongos

filamentosos y las células de levaduras fueron conservados en

glicerol al 20 % a –20º C para su posterior análisis.

2.2.3. Identificación primaria.

Se realizó la identificación primaria de los aislamientos

obtenidos utilizando la clave taxonómica de Pitt y Hocking

(1997).

2.3. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas.

Debido a la diversidad de hongos filamentosos obtenidos a

partir de las muestras de milanesas, se realizó un nuevo

muestreo con la finalidad de determinar el origen de las

contaminaciones. Para ello, se obtuvieron muestras a partir de:

• Pereji l deshidratado.

• Acelga deshidratada.

• Harina de soja.

• Harina común.

• Pan rallado.

• Harina aglutinada.

• Milanesa de espinaca con queso sin cocinar.

• Milanesa de espinaca con queso cocida sin rebozar.

• Milanesa de espinaca con queso cocida y rebozada.

• Milanesa de soja sin queso sin cocinar.

• Milanesa de soja sin queso cocida sin rebozar.

• Milanesa de soja sin queso cocida y rebozada.

• Milanesa de soja con queso sin cocinar.

Cada una de las muestras fueron procesadas de la siguiente

manera: se colocaron 10 g de muestra en 90 ml de solución

fisiológica estéril dentro de recipientes cerrados

herméticamente y fueron agitados vigorosamente durante 15

min. En el caso de las muestras con muy baja densidad, como

el perejil y la acelga deshidratada, se colocó 1 g de muestra en

99 ml de solución fisiológica. A partir de las diluciones

obtenidas y después de ser agitadas se realizaron diluciones

seriadas de 1/10 en solución fisiológica estéril hasta 10 -8 .

Estas diluciones fueron sembradas por duplicado en placas de

Petri con el medio de cultivo APA e incubadas a 25º C durante

5 días, para luego realizar los recuentos de mohos y levaduras.

A partir de éstas placas se aislaron los microorganismos

predominantes de cada muestra para su posterior

identificación.

En el caso de los aislamientos que presentaron dificultades

durante la purificación como consecuencia de una

contaminación masiva con hongos Mucorales, se realizó la

siembra en el medio APA con el agregado de ácido láctico

hasta llegar a pH 5,6 y con un 5% de rosa de bengala para

inhibir el crecimiento de Rhizopus spp. y Mucor spp.

2.4. Tratamiento térmico.

Con la finalidad de disminuir el tiempo de enfriado de las

milanesas en la fábrica luego del escaldado, se realizó un

shock térmico con agua fría después de realizar el tratamiento

térmico. El tiempo de exposición de las milanesas durante el

enfriado es importante ya que en su interior se encuentran una

porción de queso que mantiene mucho el calor. Debido a ello

las milanesas se exponen durante un tiempo largo a la

contaminación ambiental ya que se enfrían a temperatura

ambiente. Con el shock térmico mediante enfriado además de

tener un efecto negativo para el desarrollo de los

microorganismos se pretendía que las milanesas estuvieran

expuestas a la micobiota ambiental el menor tiempo posible.

Para este experimento se usaron 16 muestras al azar de

milanesas de soja a medida que se desarrollaba el proceso

productivo. La mitad de estas muestras fueron expuestas a un

shock térmico llevado a cabo por inmersión en una batea de

agua fría. Cuatro milanesas con shock térmico fueron

rebozadas y cuatro se dejaron sin rebozar. Idéntico tratamiento

se realizó con las milanesas sin shock térmico. Las muestras

para el análisis de los microorganismos se extrajeron en dos

momentos: 0 h y 12 h, según se representa en la figura 2.

Figura 2: Esquema del ensayo aplicando un shock térmico a las milanesas una vez escaldadas.

Una vez realizado el ensayo, a cada una de las milanesas se

le realizaron cortes longitudinales separados entre sí por 1 cm

de longitud. Tres fragmentos al azar por milanesa fueron

Milanesa

Milanesa sin

Rebozar

Sin Shoc

Con Shoc

tiempo

tiem

incubados a 25º C en una placa de Petri ubicada dentro de una

bandeja con papel estéril embebido en agua estéril para crear

una cámara húmeda. Cada placa de Petri con sus tres cortes de

milanesa fue designado como una muestra.

Los restos de muestra que no fueron introducidos en

cámaras húmedas se conservaron a temperatura de

refrigeración para su posterior observación.

Luego de 7 días de incubación a 25º C se sacaron las placas

de Petri para su observación y se le tomaron fotografías con

una cámara digital.

2.5. Efecto del pan rallado como contaminante.

A partir de los ensayos anteriores se observó que las

milanesas al ser rebozadas incrementaban los recuentos de

UFC de mohos. Es por eso que se decidió analizar el estado

del pan rallado que llegaba a la fábrica y como progresaba su

estado al continuar el proceso de elaboración. Para realizar

este análisis se tomaron muestras al azar del pan rallado antes

de ser sacado de las bolsas en las cuáles llegan a la fábrica

(PAN SIN USAR), del pan rallado que va quedando en las

asaderas donde se rebozan las milanesas (PAN USADO), del

pan rallado que se encontraba en las bandejas donde se

almacenan las milanesas (PAN BANDEJA), y del pan que se

encontró en la mesa de trabajo (PAN MESA). Paralelamente, se

tomó una muestra de la harina común, la harina aglutinada y la

harina de soja.

Con la finalidad de poder comparar los valores de UFC/g de

pan rallado entre las diferentes muestras, se determinó el

contenido de humedad en estufa hasta peso constante y se

consideró dicho valor en el cálculo de la población microbiana.

Se tomaron muestras de 10 g que se colocaron en

recipientes estériles con 90 ml de agua destilada estéril y

fueron homogeneizadas durante 30 min con un agitador

automático. Las muestras de pan rallado se diluyeron hasta 10 -

5 para luego ser sembradas por duplicado en placas de Petri

con medio APA con el agregado de ácido láctico hasta pH 5,5,

5 % de rosa de bengala y un 2% de NaCl (para disminuir la aw

del medio de cultivo). Las muestras 10 -2 , 10 -3 y 10 -4 se

sembraron por duplicado.

Por otra parte, se quiso determinar el efecto del pan rallado

en la contaminación de origen ambiental sobre las milanesas.

Para ello, se tomaron muestras de milanesas que fueron

expuestas toda la noche. Un grupo de milanesas se las dejó

sin rebozar, otro grupo fue rebozado con pan rallado

previamente esterilizado en autoclave y un último grupo fue

rebozado con el pan rallado que se usa habitualmente. A su

vez, la mitad de las muestras de cada grupo se tomaron

inmediatamente después de elaboradas y la otra mitad se las

tomó al día siguiente luego de que hayan pasado la noche

expuestas al ambiente de la fábrica. Con este experimento se

intentó comprobar el nivel de la contaminación ambiental en el

que las milanesas pueden llegar a estar expuestas.

Las muestras una vez tomadas se llevaron refrigeradas al

laboratorio y allí fueron colocadas a 25º C durante 5 días. Se

realizó una evaluación cuali-cuantitativa visual del grado de

contaminación fúngica.

2.6. Contaminación cruzada.

A partir de los datos anteriores se observó que el escaldado

era un proceso muy eficaz a la hora de disminuir los recuentos

tanto de mohos como de levaduras. Sin embargo, después de

que las milanesas se rebocen los recuentos de levaduras se

incrementaban.

Como las bandejas utilizadas para almacenar las milanesas

una vez elaboradas, antes de escaldar y después de escaldar,

se compartían se sospechó de una contaminación cruzada.

Para ello se tomaron muestras de milanesas cocidas y

rebozadas. Se utilizaron 10 milanesas de cebolla y 10 de

zapallo. Una mitad de cada tipo de milanesa se las ubicó sobre

papel esterilizado y la otra mitad sobre las bandejas. Una vez

que el interior de las milanesas alcanzó la temperatura del

ambiente (aproximadamente 5 h), éstas fueron introducidas

dentro de placas de Petri estériles e incubadas a 10º C durante

10 días. De ésta forma se pretendió determinar el grado de

contaminación que aportaban las bandejas.

Para determinar el grado de contaminación se construyó

previamente una escala visual que ponía en evidencia los

diferentes niveles de contaminación (Tabla 1).

Tabla 1: Escala visual de contaminación utilizada en la evaluación de las milanesas de zapallo

y cebolla.

Valor

numérico Descripción de la

contaminación

1 Aparición de las primeras levaduras

2 Levaduras numerosas o aisladas

3 Aparición de los primeros hongos filamentosos

4 Los hongos blancos afectan bordes de las milanesas

5 Las colonias blancas afectan 1/3 de la superficie

6 Las colonias fúngicas blancas afectan ½ de la superficie

7 Las colonias fúngicas blancas afectan toda la superficie

8

Las colonias fúngicas blancas afectan toda la superficie y las negras y verdes ocupan por lo menos 1/5 de la superficie

9 Las colonias fúngicas blancas “blanquean” 1/3 de la superficie

10 Las colonias fúngicas blancas “blanquean” la mitad de la superficie

11 Las colonias fúngicas blancas “blanquean” casi toda la superficie

12 Las colonias fúngicas blancas “blanquean” toda la superficie

2.8. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio.

Con la finalidad de determinar el efecto del agregado de un

conservante sobre la inhibición del desarrollo de

contaminantes, se elaboró una experiencia en la cual se le

agregó a la masa un 0,66 % de Sorbato de Potasio para

asegurar un tiempo de vida útil del producto sin que éste sea

alterado por la actividad de los mohos y levaduras. Se realizó

un lote de milanesas de zapallo con un 0,66 % de sorbato de

potasio y otro sin el agregado del mismo. Las muestras una

vez enfriadas hasta temperatura ambiente se envasaron en una

bolsa de polipropileno y se colocaron en observación a 4º C y

20º C. El grupo de milanesas almacenadas a 20º C fueron

enfriadas sobre papel estéril y sobre las bandejas donde son

almacenadas habitualmente. Se tomaron 2 muestras para cada

tratamiento, lo que hace a un total de 12 milanesas de soja y

12 de zapallo. El día en que las muestras fueron envasadas se

consideró DIA 0 y a partir de allí se contaron los días hasta la

aparición de las primeras levaduras y de los primeros mohos.

Las evaluaciones se realizaron visualmente, considerando la

siguiente escala: las milanesas que presentaron desarrollo de

colonias de levaduras en su superficie fueron calificadas con

el valor 1, y las milanesas con desarrollo de colonias de mohos

se calificaron con el valor 3.

3. RESULTADOS.

3.1. Identificación de la micobiota contaminante.

3.1.1. Materias primas.

En el caso de las especias deshidratadas el número de

colonias de levaduras fue superior al de los hongos. En

cambio en las harinas, los niveles de contaminación

detectados no fueron importantes, existiendo predominio de

hongos por sobre las levaduras. Los géneros de hongos

filamentosos encontrados mas comúnmente fueron Penicillium,

Aspergillus y Rhizopus .

Con respecto al queso el microorganismo encontrado más

comúnmente fue Geotrichum candidum.

En este ensayo era de esperar que el pan rallado contuviera

altos niveles de contaminación fúngica, sin embargo, dichos

niveles no fueron lo suficientemente altos como para poder

justificar la contaminación de las milanesas. Dentro de los

mohos más comúnmente encontrados en esta materia prima se

destacan los géneros Aspergillus, Penicillium, Eurotium y

algunas levaduras filamentosas.

3.1.2. Milanesas.

Una vez realizados los aislamientos y la purificación de los

principales hongos filamentosos que se desarrollaban sobre la

superficie de las muestras de masa y milanesas (ver apartado

2.2.1.), se identificaron los mismos como:

Penicillium, Aspergillus, Geotrichum, Rhizopus, Mucor,

Cladosporium, Alternaria, Monascus y levaduras (

filamentosas y no filamentosas).

Se encontró que a medida que el proceso de elaboración

avanzaba, el número de especies contaminantes y la cantidad

presente de cada una de ellas se incrementaba. En la masa de

acelga sólo se encontraron algunas colonias aisladas de

levaduras filamentosas, sin embargo, una vez estirada la masa

el número y la diversidad morfológica de las levaduras, se

incrementó. En todos los casos la masa de soja contenía una

mayor contaminación que la masa de acelga. Algo similar

ocurrió al comparar la masa antes y después de estirarla.

Previo a éste procedimiento se encontraron colonias de

levaduras color blanco y algunas colonias de mohos, mientras

que después del estirado el número y la variedad se

incrementaron.

Todas las muestras de milanesas que fueron tomadas antes

de que éstas fueran sometidas al escaldado presentaron una

contaminación inferior al observado luego de que éstas fueran

hervidas. En este caso el producto estaba totalmente invadido.

Es probable que el escaldado elimine la población de bacterias

y transformen a los nutrientes del alimento en formas que se

presenten más disponibles para ser utilizadas por los mohos y

levaduras.

Como se expresó anteriormente, en todos los casos se

encontró que las milanesas de acelga tenían menor

contaminación que las de soja. En ambos casos las muestras

sin escaldar poseían un bajo número de colonias en superficie

de levaduras, bacterias y mohos. En las muestras ya

escaldadas el número de colonias aumentó considerablemente.

En la mayoría de los casos las muestras escaldadas estaban

prácticamente invadidas en toda la superficie por colonias de

Rhizopus spp. y por colonias de levadura blancas. Estas

últimas generalmente se desarrollaban sobre las muestras sin

escaldar en los lugares donde no se desarrollaban los mohos.

Las milanesas escaldadas y rebozadas se encontraban

invadidas por microorganismos en toda la superficie,

predominando Rhizopus spp. a excepción de algunos sectores

colonizados por levaduras blancas o de pigmentación rosada.

En el caso de las milanesas que se recolectaron en fábrica

después de transcurrida una semana de elaboración (Figura 3),

se identificaron mohos de los géneros Aspergillus, Rhizopus,

Penicillium y Geotrichum, además de levaduras color blanco o

rosa.

Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de almacenamiento, después de

la incubación a 25º C en cámara húmeda durante 7 días.

3.1.3. Ambiente.

A partir de las placas de Petri expuestas a la contaminación

ambiental (ver apartado 2.2.1.) se aislaron e identificaron

mohos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Cladosporium y

Geotrichum. En el caso de las placas de Petri ubicadas en las

bandejas, utilizadas para el enfriado de las milanesas, se

aislaron los géneros encontrados en las placas anteriores

además de algunas especies de los géneros Alternaria y

Monascus .

De los hisopados realizados en las mesas de trabajo,

mesadas y en las bandejas antes y después de ser utilizadas

se llegó a la conclusión de que las superficies de trabajo

podrían llegar a ser una fuente de contaminación importante de

levaduras. El análisis cuantitativo de dichas muestras fue

inconsistente, existiendo muestras con altísimos niveles y

otras con niveles casi nulos lo que podría estar generado en

una limpieza poco homogénea de las superficies.

3.2. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas.

A partir de las muestras de diferentes ingredientes y

milanesas recolectadas en la fábrica (ver apartado 2.3.) se

determinó que los recuentos en el pan rallado no justificaban

el incremento de la contaminación que se observaba al rebozar

las milanesas (Figura 4), a pesar de los comentarios del

fabricante. Debido a sus apreciaciones el pan rallado aparecía

como una posible fuente de contaminación importante, sin

embargo, esto no se demostró a través de los recuentos.

Otro ingrediente con altos niveles de contaminación fúngica

dentro de las materias primas utilizadas durante la

elaboración, fue el perejil deshidratado, que se utilizó junto

con el pan rallado para rebozar a las milanesas. Sin embargo,

la cantidad de pereji l deshidratado util izada como rebozador

fue ínfima, por lo que tampoco justificaría el incremento en la

contaminación de las milanesas rebozadas.

A partir del recuento de microorganismos realizado en las

harinas utilizadas en la fábrica, se observó que ninguna de las

muestras presentó concentraciones de mohos y levaduras

importantes, sin embargo, en algunas repeticiones las colonias

de bacterias impedían el desarrollo de los microorganismos

fúngicos. En la harina de soja las concentraciones de U.F.C. de

mohos duplicaron a las de las harinas comunes y las harinas

aglutinadas. Los recuentos de las U.F.C. de levaduras fueron

siempre nulos como se puede observar en la figura 4.

Si bien en el apartado 3.1.2. se expresó que los

microorganismos invadían con mayor facilidad las milanesas

ya escaldadas, en los recuentos en placa se encontró que el

número de éstos era mucho más bajo que en las milanesas sin

escaldar. Con respecto a las muestras de milanesas rebozadas

se observó una tendencia a aumentar el número de

contaminantes. Este efecto podría estar explicado por el mayor

manipuleo que recibe el producto o por una mayor exposición

a la contaminación ambiental (Figura 5).

1

10

100

1.000

10.000

100.000

1.000.000

Pereji

l Des

hidra

tado

Acelga

Des

hidra

tada

Harina

de

Soja

Harina

Aglu

tinad

a

Pan R

allad

o

Lo

g U

.F.C

. / g

Mohos Levaduras

Figura 4: Recuento de mohos y levaduras en diferentes materias primas.

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

10000000

100000000

M. espinaca s/cocinar

M. espinacacocinada

M. espinacarebozada

M. Soja s/cocinar

M. Sojacocinada

M. SojaRebozada

U.F

.C. /

g

mohos levaduras

Figura 5: Recuento de mohos y levaduras en milanesas de espinaca con queso y

milanesas de soja con queso durante el proceso.

Al comparar las milanesas de espinaca y de soja antes de

ser cocinadas se puede observar que los recuentos de mohos

de las milanesas de espinaca son menores que los de soja. Es

muy posible que la espinaca contenga naturalmente alguna

sustancia que inhiba el crecimiento fúngico. Una vez

escaldadas las milanesas, presentaron una fuerte disminución

de los recuentos de mohos y más aun de levaduras que

llegaron a ser casi nulos. Sin embargo, se pudo observar una

importante recontaminación después de rebozar con pan

rallado las milanesas, lo que indicaría que algunas de las

materias primas utilizadas en el rebozado, como el pan rallado

o el perejil deshidratado, están fuertemente contaminadas o

bien la fuente de esta contaminación podría ser atribuida al

medio ambiente en el cual se rebozan.

1

10

100

1.000

10.000

100.000

1.000.000

Pan sin Usar Pan Usado Pan Bandeja Pan Enfriado Pan Enfriado Pan Mesa

Estado del Pan

Lo

g. U

.F.C

. / g

Hongos totales Hongos xerofilos Aspergillus / Eurotium Levaduras totales Levaduras filamentosas

Se desarrollaron bacterias que inhibieron el desarrollo fúngico

Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan rallado recolectadas en diferentes

tiempos del proceso de elaboración.

En la figura 6 se puede observar los géneros que prevalecen

en la micobiota presente del pan rallado a medida que éste va

avanzando en las etapas del proceso de producción.

Un dato que llama la atención es el nivel de U.F.C. de

levaduras del pan de las bandejas. Las bandejas son utilizadas

para almacenar las milanesas una vez terminadas y luego de

ser cocidas vuelven a ser depositadas sobre las mismas

bandejas, para su enfriado.

En el Pan Mesa los recuentos fueron nulos por estar los

medios de cultivo totalmente contaminados por bacterias que

podrían haber interferido en el crecimiento de posibles hongos

contaminantes.

En la Figura 7 se observan las diferencias en el tipo de

población contaminante que se desarrollan en las distintas

muestras de pan rallado. La fotografía de la izquierda

representa el pan rallado sin usar y en este caso se observan

50 colonias de mohos, de los cuales 40 pertenecen al género

Eurotium. La fotografía del centro representa al pan rallado

usado. En la misma se observan 25 colonias de mohos, donde

solamente 6 corresponden al género Eurotium . Finalmente la

fotografía de la derecha corresponde al pan de las bandejas, la

cual presenta muy pocos mohos y un gran predominio de las

levaduras.

Figura 7: Desarrollo de colonias fúngicas en las placas de Petri con el medio de cultivo APA

5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado

sin usar (izquierda) , pan rallado usado (centro), y pan rallado de las bandejas (derecha). Todas

las placas corresponden a la misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas.

3.3. Tratamiento térmico.

En este ensayo se le aplicó un enfriado mediante inmersión

en agua fría a un lote de milanesas (shock térmico). Luego se

tomaron muestras rebozadas y sin rebozar de milanesas con y

sin shock (ver apartado 2.4.).

A partir de las muestras (cortes de milanesas) ubicadas en

cámara húmeda se observó que:

• No existió diferencias entre las muestras con y sin

shock .

• Cuando las milanesas fueron rebozadas no se observó

diferencias entre las muestras del tiempo 0 y 12 h.

• Cuando las milanesas no fueron rebozadas las muestras

recolectadas a las 12 h presentaron mayor contaminación

que las del tiempo 0.

En las figuras 8 y 9 se observa el desarrollo fúngico sobre

las milanesas incubadas a 25º C durante 7 días en cámara

húmeda.

Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock (izquierda) y con shock (derecha).

0 12 0 12

Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock (izquierda) y con shock (derecha).

Al no existir diferencias entre las muestras con y sin shock

pero si entre las muestras rebozadas y sin rebozadas, sumado

a que los recuentos en pan rallado no son tan elevados como

eran de esperar, se consideró la posibilidad de que el pan

rallado podría ejercer un efecto adicional con respecto a la

captación de contaminantes.

0 0 12 12

3.4. Efecto del pan rallado como contaminante.

Para comprobar la existencia de algún fenómeno físico del

pan rallado que origine una mayor captación de esporas del

medio ambiente, se realizó la siguiente experiencia. Se

utilizaron milanesas sin rebozar, rebozadas con pan rallado

previamente esterilizado y rebozadas con pan rallado común.

De los resultados obtenidos se observó que:

• Las muestras rebozadas con pan estéril tenían una

contaminación similar a las milanesas sin rebozar.

• Las milanesas rebozadas con pan rallado común estaban

mucho más contaminadas y totalmente colonizadas.

• Las diferencias entre las muestras tomadas en el

momento y las tomadas 12 h después, no fueron

significativas.

• Los principales contaminantes identificados fueron

Penicillium spp. y Rhizopus spp.

De todos los resultados anteriores se concluyó que ninguna

de las materias primas poseía niveles de contaminación de

levaduras importantes como así tampoco niveles de mohos

suficientes como para justificar los encontrados en las

milanesas una vez rebozadas. La materia prima con recuentos

más altos de levaduras que se pudo hallar fue el Pan Rallado

de las bandejas. Esto podría indicar una posible contaminación

cruzada en ese punto del proceso, lo que incrementaría

significativamente las U.F.C. de levaduras en la superficie de

las milanesas.

3.5.Contaminación cruzada.

Debido a que las bandejas donde se dejaban enfriar las

milanesas escaldadas eran las mismas donde se almacenaban

las milanesas antes de ser escaldadas, se decidió comprobar

si existía una posible contaminación cruzada. Para ello se

realizó un ensayo que consistió en enfriar sobre papel estéril y

sobre las bandejas util izadas habitualmente en fábrica,

milanesas de cebolla y de zapallo escaldadas y rebozadas (ver

apartado 2.6.). En la tabla 2 se representan los resultados.

Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de cebolla y zapallo. La escala

utilizada para cuantificar el grado de contaminación se detalla en el apartado 2.6.

Nivel de contaminación de las milanesas almacenadas a 10ºC

Día 1

Día 2

Día 3

Día 4

Día 5

Día 6 Día 7 Día 8

Cebolla en

papel estéril

0,00 0,00 0,00 0,60 3,00 5,80 7,00 9,00

Cebolla en

bandeja 0,00 0,00 0,80 2,00 4,80 6,40 8,40 10,40

Zapallo en

papel estéril

0,00 0,00 0,00 0,40 5,00 6,40 7,20 11,00

Zapallo 0,00 0,00 0,00 2,00 6,80 11,40 12,00 12,00

en bandeja

Se pudo observar que las milanesas de cebolla tuvieron una

tendencia a inhibir el crecimiento de los mohos ya que su

crecimiento se ve retardado con respecto a las milanesas de

zapallo. Este efecto inhibitorio de la cebolla sobre el

desarrollo de microorganismos fue reportado por Mei-chin y

Shih-ming (1999) y por Abdel-Hafez y El-Said (1997). Benkeblia

(2004) encontró que las cepas de Aspergillus niger, Penicillium

cyclopium fueron fuertemente inhibidas por bajas

concentraciones de aceites esenciales de cebolla y ajo.

Fusarium oxysporum presentó una menor sensibil idad a los

extractos de estos aceites esenciales.

En la figura 10 y 11 se exponen fotografías que

corresponden a milanesas en el sexto día de incubación.

Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones).

En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se

enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin

contaminación cruzada).

Repeti Repeti

Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones).

En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se

enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin

contaminación cruzada).

Repeti Repeti

3.6. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio.

Se elaboraron milanesas de zapallo con el sistema

habitualmente util izado en fábrica y con el agregado de 0,66 %

de sorbato de potasio. Las milanesas fueron enfriadas sobre

las bandejas y sobre papel estéril, según se expresa en el

apartado 2.8.

Las muestras se incubaron a 4 y a 20º C y se registraron los

niveles de contaminación en la escala explicada en el apartado

2.8.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Días

Niv

el d

e C

on

tam

inac

ión

Sin Sorbato Con Sorbato Con Sorbato Sobre Papel

Figura 12: Crecimiento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y

con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Días

Niv

el d

e C

on

tam

inac

ión

Sin Sorbato Con Sorbato Con Sorbato Sobre Papel

Figura 13: Crecimiento fúngico a 4º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.

De los resultados obtenidos (Figuras 12 y 13) se observa

que:

1. Las milanesas tratadas con sorbatos (enfriadas en

bandejas o en papel estéril) e incubadas a 4º C,

permanecieron durante más tiempo sin la aparición de

mohos en superficie.

2. El enfriamiento de las milanesas (con sorbato e

incubadas a 4º C) sobre papel estéril retardó 3 días la

aparición de las levaduras.

3. La disminución de la temperatura de almacenamiento a

4º C provocó un retraso en la aparición de los

contaminantes mayor al observado por el agregado de

sorbato.

4. En todas las muestras excepto las que no estuvieron

en contacto con las bandejas, las levaduras se

desarrollaron antes que los mohos.

5. Al evitar la contaminación cruzada a 4º C, el desarrollo

de microorganismos se retarda 3 días.

4. DISCUSIÓN FINAL.

Antes de dar comienzo a la pasantía se visitó la fábrica para

conocer la problemática y mediante una observación general

del proceso se sugirió al fabricante envasar las milanesas a

20º C y no a mayores temperaturas debido a que el vapor que

condensaba dentro del envase generaba humedad que podría

ser uti lizada por los microorganismos. Además, se propuso

reemplazar el material de envase se polietileno por uno de

polipropileno.

Durante el desarrollo de la presente pasantía se l levaron a

cabo dos etapas de trabajo claramente diferenciadas. En la

primera, el objetivo principal fue detectar el origen de las

contaminaciones fúngicas a través del análisis de las materias

primas utilizadas durante la elaboración de las milanesas

(harinas, especias, pan rallado, etc) y el análisis de la

población ambiental. En una segunda etapa se detectaron los

puntos críticos de contaminación y se llevaron a cabo

modificaciones en el proceso productivo para mejorar la

calidad sanitaria y vida útil del producto final.

Durante el desarrollo de la primera etapa, se determinó que

muchos de los microorganismos presentes en las materias

primas también lo estaban en los productos intermedios. Sin

embargo, a medida que el proceso de elaboración avanzaba, se

incrementaba el número de especies y sus concentraciones. El

tratamiento térmico o escaldado a que son expuestas las

milanesas durante su elaboración, provocó una importante

disminución de la población de microorganismos. No obstante,

el producto final contenía un número de especies mucho mayor

y concentraciones más altas de microorganismos que los

productos intermedios o las milanesas recién escaldadas. Este

hecho podía deberse principalmente a dos motivos:

contaminación de las materias primas utilizadas después del

escaldado o contaminación ambiental.

Por tal motivo se realizaron una serie de muestreos y

ensayos que permitieran determinar el origen concreto de los

microorganismos aislados. El pan rallado utilizado en el

rebozado, fue la materia prima más estudiada debido a que

parecía ser una posible fuente de contaminación. A través de

los análisis se determinó que el pan rallado contenía un

importante número de mohos, pero éstos no parecían ser

suficientes para causar la contaminación producida en las

milanesas rebozadas. Por otro lado, a partir de este

ingrediente no se aislaron levaduras y sin embargo, éstas eran

frecuentemente aisladas desde muestras de milanesas. Debido

a esto, se comenzaron los estudios de contaminación

ambiental. En este caso se encontró que en el aire y en las

bandejas de enfriamiento existían las mismas especies que

fueron encontradas en las milanesas. Además, a partir de

muestras recogidas en la superficie de las bandejas donde se

colocaban las milanesas sin escaldar y que más tarde se

colocaban las milanesas ya rebozadas, se aislaron las mismas

colonias de levaduras que se desarrollaban en las milanesas.

De esta forma se comprobó que la contaminación cruzada en

las bandejas donde se enfrían las milanesas y la exposición al

medio ambiente, eran los causales de la mayor parte de la

micobiota asociada o crítica.

Una vez detectado el origen de las contaminaciones se

inició con la segunda etapa del trabajo. En este caso se

realizaron una serie de experimentos que permitieron

confirmar y evitar la contaminación cruzada en las bandejas.

Por tal motivo, la sugerencia principal que se realizó al

fabricante fue la de mantener una estricta limpieza de las

bandejas y evitar compartir las mismas con milanesas

escaldadas y sin escaldar. A su vez, es importante mencionar

que en el caso de que se use el mismo carro para colocar

milanesas crudas y cocidas, las bandejas donde se colocan las

cocidas se deberán encontrar en la parte superior del carro ya

que de lo contrario las esporas fúngicas, restos de pan rallado

y otras materias contaminadas, podrían caer sobre las

milanesas ya escaldadas.

Para disminuir el nivel de contaminación ambiental, se

sugiere la colocación de un presurizador de aire. Este

artefacto tomará el aire del exterior, lo filtrará y lo enviará al

interior. De esta manera siempre que una puerta o ventana se

abra el aire saldrá y nunca podrá ingresar. La importancia de

que no entre aire sin filtrar radica en que de esta forma se

evita el ingreso de partículas de polvo con esporas fúngicas y

células de microorganismos adheridas a él. En caso de no ser

posible crear una presión positiva dentro de la fábrica se

deberán evitar las corrientes de aire dentro de la misma. De

esta forma se disminuirá la cantidad de partículas de polvo en

el aire que vehiculizan a los microorganismos presentes en el

aire.

Con el objetivo de aumentar la vida útil del producto, se

realizaron pruebas adicionando un conservante a la mezcla de

las milanesas. Para ello se utilizó un inhibidor del desarrollo

fúngico, como es el sorbato de potasio. De acuerdo a las

características del producto y al mercado al cual está

orientado, este conservante es el que mejor se adapta ya que a

bajas concentraciones su sabor es indetectable y es

considerado GRAS (Generalmente Reconocido Como Seguro)

por el Codex Alimentario. Sin embrago, se debe recalcar la

importancia de prevenir la contaminación antes de inhibirla

con conservantes ya que según Steels (2000) la concentración

inhibitoria mínima aumenta con el tamaño del inóculo. Altas

concentraciones de células requieren concentraciones de

conservantes considerablemente mayores para evitar el

crecimiento. Es por esto que la recomendación final que se

realizó al fabricante, fue aplicar una dosis de 0,10 a 0,66% de

sorbato, mantener la temperatura de las milanesas

almacenadas a 4º C y evitar la contaminación cruzada

producida por las bandejas de enfriamiento.

Otra alternativa a considerar es el agregado de una pequeña

cantidad de ácido cítrico para aumentar la eficiencia del

sorbato de potasio. Marin et al. (2002) encontró que en los

panificados españoles el sorbato de potasio actúa más

eficientemente a valores bajos de pH (Blocher and Busta,

1985) y de aw .

Es indispensable que el envasado del producto se realice a

una temperatura inferior a 20°°°° C. De esta forma el agua de las

milanesas se terminará de evaporar y no se producirán

condensaciones dentro del envase que podrían llevar al

desarrollo de colonias de microorganismos.

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