INTRODUCCIÓN

La secuenciación es una técnica en la que se hace un análisis más detallado de la estructura del ADN y consiste en un conjunto de técnicas y métodos bioquímicos que nos permiten averiguar la secuencia de los nucleótidos (A, C, G, T) en el ADN (De Necochea & Canul, 2004).

Inicialmente, se pensaba que la secuenciación de los ácidos nucleicos era mucho más difícil que la de las proteínas, y muy poco progreso se hizo hasta 1960. Esto se debió, en parte, a la falta de substratos puros del tamaño adecuado, con los cuales desarrollar los métodos y en parte, a la composición de los ácidos nucleicos. Se esperaba que la interpretación de los resultados de la secuenciación de los ácidos nucleicos (cuatro monómeros) fuera más difícil que el de las proteínas (20 aminoácidos), y se tendrían que aislar productos de degradación más grandes para poder traslaparlos y deducir sus secuencias (De Necochea & Canul, 2004).

Por otro lado, el hecho de tener cuatro componentes solamente, se pensaba, haría más fáciles los analices finales. Al inicio, la dificultad predominante fue la interpretación de los resultados, pero a medida que las técnicas se fueron mejorando y que se fueron estudiando moléculas más largas, la cuestión del análisis empezó a ser más importante. Hoy, la secuenciación de ácidos nucleicos es más rápida y simple que la secuenciación de proteínas. La estrategia básica de la secuenciación de ácidos nucleicos es idéntica a la que se utiliza en la secuenciación de proteínas (Greif, S/A)

Ésta involucra:

1.- La degradación específica y el fraccionamiento de los polinucleótidos de interés a fragmentos suficientemente pequeños para ser secuenciados.

2.- La secuenciación de los fragmentos pequeños.

3.- El ordenamiento de los fragmentos a través de la repetición de los pasos anteriores, usando un procedimiento de degradación que produce una serie de fragmentos de polinucleótidos que traslapan el punto de corte en la primera serie.

Las técnicas de secuenciación empleadas actualmente de forma rutinaria están basadas en metodologías publicadas en 1977: el método de Sanger y el de Maxam–Gilbert, siendo el primero el más popular. Ambos se basan en la generación de una población de moléculas marcadas radiactivamente, que representan todos los tamaños y combinaciones posibles. El producto de cada una de las cuatro reacciones se somete, en cuatro carriles independientes, a electroforesis en gel de poliacrilamida y se revela siguiendo los métodos clásicos de autorradiografía. Las manchas aparecidas indican las bases presentes en cada posición de la secuencia. (De Necochea & Canul, 2004).

DESARROLLO

METODOS DE SECUENCIACION DE ADN

El método de degradación química (Maxam and Gilbert, 1977).

Fundamento

En este método, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5´ o 3´ de una o ambas hebras con 32P. Después, la muestra de ADN se divide en cuatro alícuotas y se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamaño (De Necochea & Canul, 2004).

Figura 1. El método de Maxam y Gilbert para secuenciar ADN. Los números de los carriles en el gel corresponden a los distintos tipos de corte que se describen en el texto (De Necochea & Canul, 2004).

Metodología de método Maxam –Gilbert

1. Corte de las purinas. Las purinas adenina y guanina se metilan con dimetil sulfato (DMS). Después, la reacción es tratada en condiciones alcalinas; la molécula de ADN se fragmenta en las purinas metiladas. Como resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras que corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 5 veces más rápido), y bandas claras que corresponden a las adeninas. Para interpretar fácilmente el patrón de bandas 18 generadas, se puede comparar contra un tratamiento que favorezca el corte de las adeninas (De Necochea & Canul, 2004).

2. Corte de adeninas. Esta reacción es una variación de la anterior. Las purinas metiladas se tratan inicialmente con un ácido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas metiladas. Después de un tratamiento alcalino las guaninas también son cortadas. Este tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que también corresponden a las adeninas, y las guaninas, respectivamente (De Necochea & Canul, 2004).

3. Corte de pirimidinas. Esta reacción utiliza el reactivo hidracina, que corta las bases citosina y timina. Posteriormente, se trata con piperidina para completar la reacción.

4. Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reacción de hidracina con tiamina, y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos que terminan en citosina

Desde que se reportó este método, no se han encontrado reactivos químicos específicos que corten las bases A o T, por lo que se utiliza la estrategia de corte descrita en la figura 4. Esta estrategia permite distinguir entre los nucleótidos que se encuentran al final de cada corte y deducir la secuencia de ADN (De Necochea & Canul, 2004).

El método enzimático (Sanger et al., 1977).

Fundamento

El método de secuenciación enzimático salió casi al mismo tiempo que el de Maxam y Gilbert, pero ha sido más utilizado. Esto se debe, en gran parte, a que se han realizado grandes avances en la automatización de esta técnica, lo cual se discutirá más adelante. El método de Sanger se basa en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminación específica. Con este método se generan fragmentos de

ADN de todos los tamaños posibles que se puedan distinguir entre sí, por el tipo de marcaje que llevan o por la incorporación de un terminador específico. Las enzimás del tipo de la ADN polimerasa requieren de un templado de ADN de cadena sencilla, y realizan la síntesis de la hebra complementaria extendiéndola a partir de un iniciador en dirección 5’ a 3’. Entre los componentes de la reacción se incluyen nucleótidos que no tienen un grupo hidroxilo en su extremo 3’ (ddNTP), para poder obtener una terminación especifica en las cadenas (Dorado, 2008).

Una vez que el ddNTP se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de ADN sintetizada continúe extendiéndose. La incorporación de los ddNTPs es al azar, de tal forma que se obtienen fragmentos de todos los tamaños posibles que terminan en un residuo especifico (Dorado, 2008).

Metodología de método de Sanger

En el método de Sanger (1977), la estrategia es hacer cuatro reacciones diferentes de síntesis de ADN, utilizando un ddNTP distinto en cada tubo. Con la mezcla del nucleótido normal (dNTP) y su 21 terminador (ddNTP), se pueden generar fragmentos complementarios de diferentes tamaños que terminan en el mismo nucleótido. Después, estos fragmentos se pueden separar en un gel de electroforesis con cuatro carriles distintos, para determinar la secuencia del templado (Dorado, 2008).

Figura 2. El método de Sanger. Cuatro reacciones con ddNTPs diferentes permiten la síntesis de distintos fragmentos con una terminación específica. Estos fragmentos se pueden separar por electroforesis y comparando los tamaños, se puede determinar la secuencia del templado.

El método de Sanger tiene varias ventajas sobre el método de MaxamGilbert (Blackburn y Gait, 1996). Las reacciones de secuenciación del método enzimático se pueden realizar en unas horas, en cambio las del método de Maxam-Gilbert tardan al menos un día. Las reacciones del método de Sanger son más “puras”, con menos contaminantes que puedan afectar la resolución del gel (Dorado, 2008).

Avances y mejoras en el método de Sanger

Método automático de secuenciación

La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de

reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción (Universidad Complutense de Madrid, 2016).

La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación (Universidad Complutense de Madrid, 2016).

Figura 3: esquema que representa en forma abreviada el método automático de secuenciación

Método de la mancha itinerante

El primero de los nuevos métodos que surgieron en esa época lleva el nombre de técnica de la mancha itinerante. A diferencia de los abordamientos anteriores de Holley y de Brownlee y Sanger, en los cuales la determinación y posterior ensamblado de las secuencias locales representaban un reto al ingenio y a la creatividad del investigador, el método de la mancha itinerante permite una determinación sistemática, en un solo proceso lineal, de la secuencia de bases dentro del polinucleotido, acotada solo por los lımites de resolución del sistema electroforético cromatografico en que se basa. Por un tiempo, el método de la mancha itinerante pareció muy prometedor para la determinación rutinaria de la secuencia de polidesoxirribonucle´otidos, pero luego fue rápidamente rebasado por los nuevos abordamientos introducidos en la segunda mitad de los 1970s, a saber la secuenciación por el método de terminadores de Sanger y el método de cercenamiento químico de Maxam y Gilbert (Levine, 2000).

Figura 4: Secuenciación con la técnica de la mancha itinerante

La técnica de la mancha itinerante se basa en un sistema eficaz de resolución en dos dimensiones, aplicable a oligonucleótidos, publicado por la reseña de Tu and Wu en 1980 resume el método. En breve, el oligonucleótido a secuenciar es enzimáticamente marcado en su terminal 5’ con un 32P-fosfato, y luego tratado con la exonucleasa de Crotalus adamanteus, enzima que actúa sobre el oligonucleotido recortando unidades nucleotıdicas secuencialmente a partir de la terminal 3’, de manera distributiva, para así producir un conjunto anidado de fragmentos, todos con la misma terminal 5’ radio marcada. La resolución de esta mezcla en dos dimensiones, con electroforesis en acetato de celulosa a pH 3.5 como primera dimensión, seguido en la segunda dimensión de homocromatografia (usando como efluente una mezcla aleatoria de oligonucleótidos sin marca isotópica) en placas de capa fina de DEAE-celulosa, produce un patrón bidimensional de

radioactividad donde cada mancha representa un miembro del conjunto anidado de fragmentos (Levine, 2000).

Secuenciación con terminadores

Una alternativa al marcado del cebador es el marcado de los terminadores de la cadena, un método conocido como "secuenciación por terminador fluorescente". La mayor ventaja de este método es que la secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción, en lugar de en cuatro reacciones como en el método del cebador marcado. En una secuenciación por terminador fluorescente se marcan cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de onda. Este método es atractivo por su gran capacidad y rapidez y actualmente es el método de referencia en la secuenciación automatizada con analizadores de secuencia controlados por computadora (PNAS, 1977).

Entre sus limitaciones potenciales están los efectos de los terminadores fluorescentes en el fragmento de ADN, que produce alturas y formas de picos desiguales en los registros de secuencia de ADN del cromatograma tras la electroforesis capilar (ver ilustración de la derecha) Este problema se ha solventado en gran medida con la introducción de nuevos sistemas enzimáticos de polimerasas de ADN y colorantes que minimizan la variabilidad de la incorporación, así como métodos para eliminar los "pegotes de colorante" producidos por ciertas características químicas de los colorantes que pueden dar lugar a artefactos en los registros de secuencia de ADN (PNAS, 1977).

El método de secuenciado por terminador fluorescente junto con analizadores de secuencia de ADN de alto rendimiento se utiliza ahora para la inmensa mayoría de los proyectos de secuenciación, puesto que

es más fácil de llevar a cabo y tiene un coste menor que los anteriores métodos de secuenciación (PNAS, 1977).

Pirosecuenciación

El primer método de secuenciado masivo o “next generation sequencing” (NGS), fue publicado en 2005 en Nature, y llevado al mercado por la empresa 454  (luego adquirida por Roche). El resumen de este artículo explica: “Describimos un método escalable, un sistema de secuenciación altamente paralelizadle con un rendimiento significativamente mayor que los instrumentos de electroforesis capilar. El aparato permite secuenciar 25 millones de bases, con 99% de precisión en una corrida de 4 horas”, este rendimiento es 100 veces superior a la cantidad de bases secuenciadas en ese tiempo en un secuenciador de 96 capilares (Margulies et al, 2005)

Figura 5: Metodología por pirosecuenciación

Metodología por pirosecuenciación (Margulies et al, 2005)

a) Partimos, como en Sanger, de una secuencia plantilla y un primer, pero con más enzimas y sustratos, y sin etiquetar los dNTPs

b) La polimerasa une un dNTP, liberando un PPi en el proceso

c) La ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP con ayuda del APS

d) La luciferasa convierte el ATP en luz, con ayuda de la luciferina

e) Medimos un pulso de luz

f) La apirasa se libra de los reactivos sobrantes para que el sistema esté limpio para el siguiente dNTP

g) El resultado final es, como en Sanger, picos de intensidad

Secuenciación por hibridación

Entre otras cosas el conocimiento de la secuencia de los genomas o los genes de los organismos también ha permitido desarrollar nuevos métodos de secuenciación. Uno de estos es la secuenciación por hibridación. Una forma en la cual puede funcionar este método es utilizando “microarrays”. Estos son soportes pequeños en los cuales se inmovilizan pequeños fragmentos de ADN en un orden conocido. Después se pasa la muestra de ADN (con secuencia desconocida) y se cuantifica el grado de hibridización, y por consecuencia el grado de identidad con las secuencias fijas en el soporte (Arredondo, 2008)

.Esto parece funcionar especialmente bien en la identificación de SNPs. Wang et al. (1998) reportaron que es posible identificar el genotipo de un individuo analizando 500 SNPs a la vez en un experimento de hibridación con un “microarray” de oligonucleotidos. Una posibilidad para la secuenciación de acidos nucleicos a futuro, que discuten los autores Cantor y Smith (1999) es el hacer hibridación contra oligonucleotidos que formen palabras de tal forma que se pueda ir determinando la secuencia sobrelapando los fragmentos (de 6-8

nucleótidos) con los cuales híbrida el fragmento secuenciado (Arredondo, 2008)

Figura 6: forma en la cual se puede utilizar la hibridación para secuenciar. La molécula de ADN se hibrida contra pequenos oligonucleótidos que son como palabras. Después se termina la secuencia

METODOS DE SECUENCIACION DE ARN

Secuenciación de ARN Paralelo al desarrollo de los métodos de secuenciación de ADN, también se reportaron avances en la secuenciación de ARN. Desde que Holley secuenció un tARN para Alanina en 1965, se han desarrollado métodos de secuenciación de ARN similares a los utilizados para secuenciar ADN. Básicamente, los métodos de secuenciación de ARN se dividen en 2 categorías (De Necochea & Canul, 2004).

Métodos indirectos

En este caso, el ARN se convierte primero a cADN con la enzima transcriptasa reversa y luego se usa el fragmento obtenido como templado para la reacción de secuenciación. En realidad, este método determina la secuencia de una molécula de ADN a partir de la cual se infiere la secuencia de la molécula de ARN. Este método indirecto es uno de los más comunes para la secuenciación de ARN porque tiene todas las ventajas de la secuenciación de ADN (De Necochea & Canul, 2004).

Métodos directos

Estos métodos se utilizan para secuenciar la molécula de ARN cuando es complicado utilizar el método indirecto. Esto suele suceder con ARNs muy pequeños, o con estructuras secundarias extensas (ribosomales, transferencia). Todas estas técnicas requieren de que el ARN este en forma pura (De Necochea & Canul, 2004).

Método enzimático

En los primeros reportes se experimentó con una forma enzimática para secuenciar ARN directamente. En este caso, los autores Brownlee y Cartwright (1977) reportaron los resultados de la secuenciación de una molécula de mARN de casi 200 pb. Utilizaron un iniciador marcado con 32P y la transcriptasa reversa. Usando reacciones similares a las del método de Sanger, los autores generaron fragmentos de cADN con una terminación específica dada por ddNTPs. Después, resolvieron el orden de los fragmentos de ADN generados en un gel de acrilamida. Se ha visto que la concentración del ARN templado influye mucho en la resolución del gel. Los autores Carpenter y Simon (1990) reportaron que cuanto mayor era la cantidad de ARN viral usado como templado, menor era la resolución obtenida en el gel de acrilamida debido a que las bandas eran anchas, complicando la interpretación del orden (De Necochea & Canul, 2004).

Ellos obtuvieron la mejor resolución utilizando 0.4 µg (0.75 pmol) de ARN como templado. En una reacción de secuenciación de rARN, Bakin y Ofengand (1992) obtuvieron la mejor resolución empleando 10 veces menos ARN, es decir, solamente 0.13 pmol. A pesar de que se generan fragmentos de ADN, el método enzimático es un método directo porque el templado es una molécula de ARN. La marca se puede incorporar a los fragmentos de ADN de maneras alternativas a la usada por Brownlee y Cartwright en 1977 (De Necochea & Canul, 2004).

El uso de ddNTPs marcados tiene la ventaja de que los fragmentos que sufren una terminación prematura no se detectan ni interfieren con la interpretación de la secuencia. La terminación prematura suele ser un problema más común en la secuenciación de ARN por la formación de estructuras secundarias que interfieren con la actividad de la transcriptasa reversa. Además, la síntesis de fragmentos de ADN a 37 ºC carece de las ventajas de las altas temperaturas que se pueden usar con otras enzimas (De Necochea & Canul, 2004).

Método químico

En 1977 se presentó un método de ruptura química del ARN similar al de Maxam y Gilbert. La molécula de ARN (en este caso ARN ribosomal) se marca con una molécula de 32P en un extremo. Después se utilizaron nucleasas para hacer digestiones de la molécula de ARN marcado en distintos lugares. La RNAsa T1 corta las guaninas, la RNAsa U2 corta las adeninas y una hidrólisis alcalina rompe todos los enlaces fosfodiéster. Se utiliza un gel de acrilamida para separar los fragmentos de estos tres tipos de ruptura, lo que permite determinar el orden de las guaninas, adeninas y pirimidinas de una molécula de ARN ribosomal (Levine, 2000)

A diferencia del método enzimático, en el que se puede usar un iniciador marcado para generar los fragmentos que serán secuenciados, el método químico requiere que la molécula de ARN sea marcada directamente. Esto se puede hacer introduciendo una marca de 32P en el extremo 5’ de la molécula con una cinasa T4, o en el extremo 3’ con una ligasa T4 (Levine, 2000)

BIBLIOGRAFIA

De Necochea C., R. Canul T. 2004. Métodos fisicoquímicos en biotecnología: secuenciación de ácidos nucleicos. Cuernavaca, Morelos

Levine, J., Suzuki, D. 2000. El secreto de la vida. Dirección General de Divulgación de la ciencia, UNAM, México

Dorado P. 2008. Secuenciación del DNA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales. Córdoba

Greif G. Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. Unidad de biología molecular. Institut pasteur. Montevideo

Biblioteca de la Universidad Complutense de Madrid. 2016. Ciudad Universitaria. Madrid

Rosenblum, B., L. Lee, S. Spurgeon, S. Khan, S. Menchen, C Heiner, and S. Chen. 1997. New dye-labeled terminators for improved DNA sequencing patterns.

PNAS. 1977. Artículo de Sanger dónde describe el método de secuenciación utilizando dideoxinucleótidos.

Margulies, M. et al. Genome sequencing in microfabricated high‐density picolitre reactors. 2005. Los autores describen el desarrollo de la primer tecnología de secuenciado masivo, y realizan el ensamblaje de novo del genoma de Mycoplasma genitualium utilizando pirosecuenciación.

Arredondo Vázquez. 2008. Tesis: estudio de un método de secuenciación de oligonucleótidos por fragmentación química. México