métodos de estudio y cultivo de virus
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Métodos de estudio y
cultivo de virus Dra. Ana Marta de los
Ángeles Lobo Sánchez
Zaira Guerrero González
Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el
laboratorio son:
1.Animales de experimentación
2.Embriones animales
3.Cultivos celulares artificiales
1935.virus gripal
Cultivo en huevo fértil de ave
1929. Ernest
William
Goodpasture y
Woodruff
cuerpos intracelulares
Viruela aves
tripsina
estudio y propagación
patógeno para los pollos
Replicación en células vivas
Huésped específico
Tropismo
ℭ𝑒𝑙. y mem.
extraembrionarias
sustratos variados
Componentes
Agua
Proteínas
Aminoácidos (AA)
Carbohidratos
Lípidos / Grasas
Vitaminas Liposolubles
Vitaminas Hidrosolubles
Minerales
Otros Componentes
Embrión de pollo
Desarrollo del Embrión del Pollo
Viabilidad del embrión
Ubicación del embrión
Cámara de aire
Infección: lesión tisular
local (pústula)
Intraperitoneal, o intracerebral
Dilución Tiempo de incubación
Temperatura
Cantidad del inóculo
Vías de inoculación
Inoculación por saco alantoideo
• Con colorante se observa: liquido
alantoideo, albumina y cámara de aire
teñidos
• Liquido alantoideo: virus hemaglutinantes
o producción de hemaglutininas
• Embrión de 9-12 días, inoculo de 0.1-
0.2ml
1cm
3 mm
45 °
Inoculación en saco amniótico
• Con colorante: líquido amniótico, cámara
de aire
• Primoaislamiento de cepas de influenza
• Embrión de 7-15 días, inoculo de 0.1-
0.2ml
Inoculación en saco vitelino
• Con colorante: Saco vitelino, Cámara de
aire
• Cultivo de clamidias y ricketsias
• Embriones de 5-8días, inoculo de 0.2-1ml
Inoculación en saco vitelino
Inoculación en Membrana corioalantoidea (MCA)
• Con colorante: membrana
corioalantoidea
• Permite cuantificar aquellos grupos
virales que producen lesiones localizadas
• Embrion de 10-12 días, inoculo de 0.1-
0.5ml
Inoculación de membrana
corioalantoidea (MCA)
MEMBRANA VIRUS TIPO DE
EMBRIÓN
CANTIDAD DE
INOCULACIÓN
SIGNOS DE
CRECIMIENTO
Saco vitelino Herpes simple
Neumonía y
Rickettsias
Se emplean
embriones de
5 – 8 días
0.2 – 1 ml Muerte
Cariolantoíes Herpes simple
Poxvirus
Sarcoma de Rous
Varicela
Virus de
Laringotraqueitis
aviar
Enfermedad de
Beyer
Se emplean
embriones de 10 –
12 días
0.1 – 0.5 ml Muerte
Pústulas
Pústulas
Focos o pústulas
fácilmente visibles
Alantoides Influenza
New Castle
Virus de la
bronquitis infecciosa
Se emplean
embriones de
9 – 12 días
0.1 – 0.2 ml Hemoglutinación
Amniótica Parotiditis
Virus de la Gripe
7 – 15 días 0.1 – 0.2 ml Muerte
Intravenosa Virus de la
Leucemia
10 - 15 días 0.02 - 0.05 ml. Pústulas
Intracerebral Virus del herpes
Rabia
8 – 14 días 0.01 – 0.02 ml
Alteraciones
cerebrales
VENTAJAS DESVENTAJAS
Control preciso y fino del medio ambiente
(fácil manipulación)
Caracterización y homogeneidad de la
muestra
Economía
No es necesario el espacio ni el cuidado que
requieren los animales.
Mantenimiento de los cultivos celulares.
Se pueden cuantificar aveces al correlacionar el
numero de pustulas con la dilución viral inoculada.
(Herpes y vaccinia).
Se emplea para preparar vacunas (influenza, fiebre
amarilla)
Aislamiento para diagnostico (viruela, herpes,
influenza)
Hacer ensayos de nuevos agentes virales
técnica sensible
calidad y costos
Inestabilidad
Apreciación difícil durante los tres
primeros días de edad del embrión
Capacidad de anclaje
Monocapa Suspención
clasificación
Lineas celulares
Discontinuas
(t° limitado)
Cultivos primarios
Células diploides
Continuas Multiplicación
indefinida
La inoculación en animales de experimentación de
muestras clínicas o de virus para su aislamiento o
propagación.
Poco usada
Se emplea únicamente cuando se trata de propagar
virus cuya replicación en los otros sistemas no es
posible.
Los animales más utilizados:
monos, los cobayos y los ratones
lactantes
La inoculación animal sigue siendo un método de gran valor para estudiar:
La oncogénesis viral La patología de los padecimientos virales La respuesta inmune a los virus El efecto de los factores ambientales sobre infecciones virales
• cambios bioquímicos y moleculares,
morfológicos y de viabilidad celular,
visibles a microscopía óptica,
causados durante el ciclo de
replicación viral.
• Aunque todos los virus líticos
producen efecto citopático, puede
observarse una gran diversidad de
manifestaciones
En células infectadas en cultivo, en las que se aprecia:
• pérdida de adherencia al sustrato
• inhibición por contacto
• redondeamiento celular
• formación de sincitios
• cuerpos de inclusión citosólicos
• transformación celular
• lisis, etc.
• Es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen, secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
• Muchos tipos de virus
inducen la aparición
de estructuras
membranosas en el
citoplasma, en
algunos casos en
forma de grandes
vacuolas
citoplasmáticas o
pequeñas.
• Los sincicios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada
• Es una alteración en el crecimiento normal de las células en cultivo con evidentes manifestaciones morfológicas.
• Se asocia a una serie de cambio moleculares y está especialmente ligada a virus que insertan su genoma en el de la célula infectada, pudiendo causar mutagénesis insercional al interrumpir antioncogenes o activar pro-oncogenes, o alterando la correcta regulación de la expresión génica celular.
• Las alteraciones bioquímicas son muy diversas y específicas de cada virus, si bien pueden señalarse las más importantes a nivel general.
• Algunos virus son capaces de mostrar esta inhibición en etapas tempranas de la infección pero la mayoría de los virus animales lo hacen en etapas tardías. El efecto más drástico suele producirse en la inhibición de la expresión de proteínas celulares por traducción preferente o casi exclusiva de proteínas virales.
• 1.- Inhibición de la síntesis de proteínas
celulares
• 2.- Inhibición de la síntesis de DNA
celular
• 3.- Inhibición de la síntesis de RNA
celular
• Cambios en la actividad de enzimas
presentes en las membranas.
• Modificaciones en la funcionalidad del
sistema vesicular.
• Aumento de la permeabilidad de la
membrana plasmática.