UNIVERSIDAD TCNICA ESTATAL DE QUEVEDOFACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERAINGENIERA AGROINDUSTRIALNOMBRE: Prez Saldaa Braulio Douglas CURSO: VII Ciclo de AgroindustriasUNIDAD DE APRENDIZAJE: Mtodos de Anlisis de SemillasFECHA: Jueves 2 de Julio del 2!"#MTODOS DE DETECCIN DE ALIMENTOS TRANSGNICOSSe pueden considerar dos sistemas generales que ponen de manifesto lacondicindetransgnicodeunalimentobajosospecha. Por unlado, sedispone de procedimientos que detectan las nuevas protenas expresadaspor el/los transgenes introducidos , por otro, existen mtodos queidentifcan el !"# correspondiente al gen o genes introducidos.$os %rotocolos anal&ticos son mu' sensi(les) 'a *ue detectan un gen en decenas demilesdegenesdel genoma) ounanueva%rote&naentrevariosmilesde%rote&nas+Actualmente) los%rotocolos%uedendetectar uneventoogru%odeeventosenuncultivoen%articular) %eroninguno%uededetectar enun,nicoensa'otodosloseventos) %or eso no se %uede asegurar *ue una muestra est li(re de -.M) s/lo se%uede asegurar *ue est li(re de los eventos %ara los cuales se 0a'an realizado losanlisis %ertinentes $a (ase de cada ti%o de tecnolog&a de detecci/n de -.M es (uscar la di1erencia entrelavariedadnomodi1icada'la%lantatransgnica+ 23istentresmetodolog&as%aradetectar modi1icaciones genticas en los cultivos tales como so'a) algod/n) ma&z) etc+4naesmedianteladi1erenciaci/n1enot&%ica+ $aotraesanivel de%rote&nas%ortcnicas inmunol/gicas 5tiras reactivas o 2$ISA6) las cuales detectan la %resencia de%rote&nas es%ec&1icas) %or la uni/n es%ec&1ica entre el ant&geno e3%resado ' elanticuer%o(lanco+ 2l otromtodoest(asadoenladetecci/nanivel deAD7)mediante PC8+ 2stos dos ,ltimos mtodos muestran la ausencia o %resencia de un-.Men la muestra) %ero tam(in %ueden dar alguna indicaci/n de cantidad5%orcenta9e6 en una muestra tratada DETECCIN FENOTPICA.Por lo general) las %lantas genticamente modi1icadas *ue se encuentran actualmenteencam%o%resentanlacaracter&sticaderesistenciaa0er(icida':oainsectos+ $aevaluaci/ndelaresistenciaainsectosdeuna%lantaserealizamedianteensa'os(iol/gicos com%le9os ' de larga duraci/n) %or eso) esta no es una alternativa %rctica%arael anlisisdegranos+ Sinem(argo) laresistenciaa0er(icidass& %uedeserevaluada mediante ensa'os sencillos en la(oratorio ' en cam%o) %udiendo o(servarselos resultados de la evaluaci/n de la di1erencia 1enot&%ica entre una %lantagenticamente modi1icada resistente a 0er(icida ' la %lanta natural+DETECCIN INMUNOLGICA.$os-.Msestncaracterizados%orungenomaalterado) el cual %uedellevaralae3%resi/n de una nueva %rote&na; %or lo tanto) los alimentos modi1icadosgenticamente %ueden ser identi1icados detectando la %resencia de la nueva %rote&nae3%resada) codi1icada %or el material gentico 5$i%% ' cols+) 2!!"6+$osensa'osinmunol/gicos%araladetecci/n de-.M) (sicamente se desarrollancondos1ormatos< lastirasreactivasostri%sde1lu9olateral 'el 2$ISA 5ensa'odeinmunodetecci/n ligado a enzima6+ENSAYO DE INMUNODETECCIN LIGADO A ENZIMA (ELISA).$os anlisis 2$ISAdetectanomidenlacantidadde%rote&nadeinters enunamuestra *ue %uede contener numerosas %rote&nas distintas+ Se utiliza un anticuer%o1i9adoal %ocillo*ueseunees%ec&1icamenteala%rote&natransgnica) unsegundoanticuer%ocon9ugadoaunenzimacu'o%roductogenerauncolor*ueesvisi(lealaadir un sustrato determinado ' 1cilmente cuanti1ica(le (asado en la com%araci/ndeuna curva %atr/n de %rote&na de inters+Del mismo modo *ue la PC8) la tcnica de 2$ISA re*uiere de %ersonalca%acitado ' e*ui%o es%ecializado+ $as caracter&sticas claves de esta tcnica son lassiguientes< Menos sensi(le *ue la PC8) sin em(argo esto %uede ser una venta9aen algunos casos 'a *ue es menos susce%ti(le a =1alsos %ositivos>+ Se necesita desarrollar %reviamente anticuer%os *ue reconozcanes%ec&1icamente la %rote&na transgnica *ue se desee+ Por lo tanto no%uede utilizarse este mtodo como tcnica de =screening>+ Por otra %arte aun*ue el desarrollo de anticuer%os es una la(or cuantomenos tediosa) una vez desarrollados) el resto de reactivos resultanmuc0o ms econ/micos ' r%idos *ue los utilizados en la PC8+ 2stos mtodos (asados en la localizaci/n de la %roteina sona%lica(les siem%re ' cuando la %rote&na no 0a'a su1rido ningunadesnaturalizaci/n en el %roceso de mani%ulaci/n del alimento5calentamiento ' en1riamiento) %rensado) etc6+ELISA APLICADO ACTUALMENTE A LA DETECCIN DE ALIMENTOS TRANSGNICOS2l ,nico=l&mite>tcnico%arautilizarestemtodocomoanlisisrutinarioes*uesede(edeconocer *u%rote&naconcretase0a de(idomodi1icar encada caso)' sede(en desarrollar anticuer%os 1rente a esa %rote&na+2l desarrollo de estos anticuer%os es %osterior a las e3igencias marcadas %or la le')*ue en la actualidad en 2uro%a se a%lican a la %rote&na Bt?"@A del ma&z ' laCP2PSPS 58oundu% 8ead'6 e3%resada en so9a+ Actualmente se dis%one de anticuer%os %ara la detecci/n de la %rote&na modi1icada enso9a5grano) 0arina) concentrado) aislado6'en(revees%aciodetiem%osees%eradis%oner de los anticuer%os *ue reconocen la Bt?"@A del ma&z+REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)$areacci/nencadenadela%olimerasa5PC86 sirve%araladetecci/ndirectadeltransgn+ Se %ueden utilizar %rimers 5oligonucle/tidos6 %ara cual*uiera de loselementos *ue 1orman %arte de la secuencia+ Mediante un termociclador se consiguela am%li1icaci/n de los 1ragmentos) *ue se se%aran en un gel de agarosa en raz/n desutamao+ $atinci/nconuncom%uesto!"%uesto*ue1luorescecuandosee3%onealaluzultravioleta%ermiteidenti1icar el 1ragmentodeAD7(uscadocon1acilidad+ 4na variante de esta tcnica) la PC8 cuantitativa se 0a revelado como un instrumento%oderoso en la detecci/n de -M.s) %ues %ermite identi1icar en tiem%o real laam%li1icaci/n de un genoma de inters o(9eto de (,s*ueda+ Casi todas las variantes de este mtodo se (asan en la utilizaci/n de una sonda deAD7) com%lementariadeuna%artedelAD7*uese%retendeam%li1icar)lacual vaad0eridaaunamolcula1luorescente'aotrain0i(idora) sta,ltimadenominadaB*uenc0erC; de este modo) solo en el caso de *ue la sonda se des%lace de su sitio %oracci/ndela AD7?%olimerasa) lamolcula1luorescenteseli(era'1luoresceal serestimulada %or un lser+ Sim%lemente) la cuanti1icaci/n de la 1luorescencia en cada ciclo de la PC8es%ro%orcional a la cantidad de AD7 *ue se est am%li1icando ' o1rece) %or tanto) unamedida indirecta de la misma+APLICACIN DE LA PCR A LA DETECCIN DE ALIMENTOS TRANSGNICOS$aPC8esunmtodomu'sensi(le%araladetecci/ndealimentostransgnicos)'a *ue %uede localizar es%ec&1icamente cual*uier gen del *ue se conozca susecuencia+2n los alimentos transgnicos) como 'a se coment/ anteriormente) 0a'secuenciase3/genas*uecorres%ondenaun%romotor) al gendeinters'aunterminador+Cuandoseestrealizandounestudiodeunalimentodel *uesedesconoce*ugense0aintroducido) sede(erealizar unestudiode=screening> enel cual seintentarlocalizarel %romotor1recuentementeutilizado%aralainserci/ndel gen5%D#S6oelterminador 57-S6+ 2n otros casos de(en disearse iniciadores %ara localizar elgenconcreto+Ademsdeestemtodotam(insedis%onedeEitsdesarrollados%arael anlisisde cual*uier ti%o de alimentos en los *ue %uedan estar %resentes ingredientes%rocedentes de material transgnico+SOUTHERN BLOT 2s) igualmente) una tcnica mu' ,til %ara la detecci/n de genes e3traos+ A tal e1ecto)des%usdee3traer el AD7total dela%lantaenla*uese(uscael transgen) se1ragmenta con enzimas de restricci/n ' se se%ara en un gel de electro1oresis %or raz/nde su tamao molecular+ Des%us se %rocede a la trans1erencia a una mem(rana de nailon 5o seme9ante6 ' 'asolo*uedarevelarla %resencia delgen(uscado)%aralo cualse 0aceuso deunasecuencia com%lementaria %reviamentediseada conese1in)*ue 0asidomarcadacon un isoto%o radiactivo+ Finalmente s/lo *ueda detectar el com%uesto radiactivo) *ue%ermanece en la mem(rana si est %resente el gen %ro(lema) %uesto *ue de 1ormacontraria ser eliminado+Sout0ern Blot es) igualmente) una tcnica mu' ,til %arala detecci/n de genese3traos+ A tal e1ecto) des%us de e3traer el AD7 total de la %lanta en la *ue se (uscael transgen) se1ragmentaconenzimasderestricci/n'sese%araenungel deelectro1oresis %or raz/n de su tamao molecular+ Des%us se %rocede a latrans1erenciaaunamem(ranadenailon5oseme9ante6 ''asolo*uedarevelar la%resencia del gen (uscado) %ara lo cual se 0ace uso de una secuenciacom%lementaria%reviamentediseadaconese1in) *ue0asidomarcadaconunisoto%o radiactivo+ Finalmente s/lo *ueda detectar el com%uesto radiactivo) *ue%ermanece en la mem(rana si est %resente el gen %ro(lema) %uesto *ue de 1ormacontraria ser eliminado+PRINCIPALES DIFERENCIASDE LOSENSAYOS BASADOS EN LA DETECCINDE ADN Y EN LA DETECCIN DE PROTENASANEOSBIBLIOGRAFIA F+ 2l&as) Jos MG H+) -+ Car(alleira) Calle9a+ $o *ue usted de(e sa(er so(re< losalimentos transgnicos+ 2DICI-7 CAJA 2SPAIA+ 2!!D+ Hamudio) J+ 52!!#6+ 2valuaci/n de alimentos derivados de -.M+ Jozzini) A+ C+ 52!!6+ Detecci/n de -.M en la cadena alimentaria+ Mart&nez) M+ C+ 52!!26+ $a(oratorio de detecci/n de organismos genticamentemodi1icados+