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METODOS ANALÌTICOS APLICADOS EN LA CUANTIFICACIÓN DE LA
BIODEGRADACION DE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETROLEO
CHRISTIAN JOSE PIZARRO RESTREPO
Monografía presentada como requisito para optar al título de:
Químico
DIRECTORA:
DORA HELENA NORIEGA CABRIA
M.Sc. En Biotecnología
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
MONTERÍA
2021
Contenido 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 7
2. LAS MATRICES SUELO Y AGUA .................................................................................. 9
2.1. EL SUELO ...................................................................................................................... 9
2.2. EL AGUA ...................................................................................................................... 12
2.2.1. Contaminación de agua por petróleo ................................................................... 13
3. EL PETRÓLEO................................................................................................................ 16
3.1. COMPOSICIÓN GENERAL DEL PETRÓLEO CRUDO ........................................ 17
3.1.1. Grupos de hidrocarburos .......................................................................................... 17
3.1.1.1. Las parafinas ................................................................................................................. 17
3.1.1.2. Naftenos ................................................................................................................ 19
3.1.1.3. Aromáticos ............................................................................................................ 20
3.1.2. Hidrocarburos complejos .......................................................................................... 22
3.1.3. Compuestos heteroatómicos o no hidrocarburos .................................................... 23
4. CONTAMINACIÓN DEL AMBIENTE POR PETRÓLEO ......................................... 26
5. BIODEGRADACIÓN DE PETRÓLEO ......................................................................... 29
5.1. FACTORES QUE AFECTAN LA BIODEGRADACIÓN .......................................................... 32
5.1.1. La presencia de oxígeno ............................................................................................ 32
5.1.2. Concentración de nutrientes ..................................................................................... 33
5.1.3. Diversidad microbiana ............................................................................................... 34
5.1.4. Temperatura .............................................................................................................. 34
6. TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LA BIORREMEDIACIÓN DE
HIDROCARBUROS DE PETRÓLEO ............................................................................................... 35
6.1. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS .......................................................................... 39
6.1.1. Cromatografía de gases .......................................................................................... 41
6.1.1.1. Principios de la cromatografía de gases .............................................................. 42
1.1.1.1. Volumen de retención ............................................................................................ 42
1.1.1.2. Cromatogramas ...................................................................................................... 44
1.1.2. Cromatógrafos de gases ......................................................................................... 45
1.1.2.1. Gas portador ............................................................................................................ 46
1.1.2.2. Sistema de inyección .......................................................................................... 47
1.1.2.3. Configuración de la columna ............................................................................ 47
1.1.3. Sistemas de detección ............................................................................................ 48
1.1.3.1. Detector de ionización de llama ........................................................................... 48
1.1.3.2. Cromatografía de gases/espectrómetro de masas ......................................... 49
1.1.4. Cromatografía de gases multidimensional ......................................................... 51
1.2. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA ................................... 53
1.2.1. Principios generales de la cromatografía en fase líquida .................................. 54
1.2.1.1. Adsorción ................................................................................................................. 55
1.2.1.2. Partición ............................................................................................................... 55
1.2.1.3. Intercambio iónico ............................................................................................. 56
1.2.1.4. Exclusión por tamaño ........................................................................................ 57
1.2.1.5. Afinidad................................................................................................................ 57
1.2.2. Fase estacionaria y fase móvil ............................................................................... 58
1.2.3. Componentes de un sistema HPLC ...................................................................... 60
1.3. CUANTIFICACIÓN DE TPH’s POR CROMATOGRAFÍA ..................................... 61
1.3.1. GC-FID ..................................................................................................................... 61
1.3.1.1. Degradación microbiana de hidrocarburos de petróleo en una corriente
tropical contaminada ............................................................................................................. 64
1.3.1.2. Biodegradación del hidrocarburo total de petróleo por bacterias
heterótrofas aerobias aisladas de las aguas salobres contaminadas con petróleo crudo
de Bodo Creek ......................................................................................................................... 64
1.3.2. GC-MS ...................................................................................................................... 65
1.3.2.1. Biodegradación de un petróleo crudo por tres consorcios microbianos de
diferentes orígenes y capacidades metabólicas. ................................................................. 66
1.3.2.2. Efectos de la bioacumulación y bioestimulación microbianas locales en la
bioremediación de hidrocarburos totales de petróleo (TPH) en suelos contaminados
con petróleo crudo en base a observaciones de laboratorio y de campo. ....................... 67
1.3.3. GC multidimensional ............................................................................................. 68
1.3.3.1. Caracterización de las capacidades de biodegradación de microfloras
ambientales para gasóleo mediante cromatografía de gases bidimensional integral ... 70
2. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS .............................................................................. 71
2.1. BASES GENERALES DEL ANÁLISIS CUANTITATIVO MEDIANTE
ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ................................................................................. 74
2.1.1. Curvas de calibración ............................................................................................. 78
2.2. ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA, VISIBLE Y DE FLUORESCENCIA ...... 81
2.2.1. Espectroscopía UV-Vis: Principios ...................................................................... 81
2.2.2. Espectroscopía UV-Vis: Instrumentación ........................................................... 82
2.2.2.1. Fuente de radiación ............................................................................................ 83
2.2.2.2. Monocromador ................................................................................................... 84
2.2.2.3. Detector ................................................................................................................ 85
2.2.2.4. Dispositivo de lectura de datos ......................................................................... 86
2.2.3. Espectroscopía de fluorescencia ........................................................................... 87
2.3. ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA ......................................................................... 91
2.3.1. Principios de la espectroscopía IR ....................................................................... 92
2.3.2. Instrumentación ..................................................................................................... 95
2.3.3. Espectroscopía IR – cromatografía ...................................................................... 96
2.3.4. Aplicaciones cualitativas ........................................................................................ 98
2.3.5. Aplicaciones cuantitativas ..................................................................................... 99
2.4. ESPECTROSCOPÍA VIS/NIR ................................................................................. 101
2.5. CUANTIFICACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN DE TPH’s POR
ESPECTROSCOPÍA .............................................................................................................. 102
2.5.1. Espectroscopia infrarroja .................................................................................... 102
2.5.1.1. Biorremediación de suelos contaminados con combustibles por inyección
múltiple secuencial de microorganismos nativos: procesos a escala de campo en
Polonia 102
2.5.1.2. Inoculantes y biodegradación del petróleo crudo que flota en los
sedimentos de pantano ........................................................................................................ 103
2.5.2. Espectroscopia VIS/NIR ..................................................................................... 105
2.5.2.1. Evaluación de una remediación de bioslurry de sedimentos contaminados
con hidrocarburos de petróleo mediante análisis químicos, matemáticos y
microscópicos ........................................................................................................................ 105
3. MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS .................................................................................. 106
3.1. PRINCIPIOS DEL ANÁLISIS GRAVIMÉTRICO ................................................. 106
3.1.1. Métodos físicos de separación y cálculos .......................................................... 107
3.1.2. Alteración química y separación del analito ..................................................... 108
3.2. INSTRUMENTACIÓN ............................................................................................. 109
3.3. ANÁLISIS GRAVIMÉTRICO DE TPH’s ................................................................ 112
3.4. CUANTIFICACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN DE TPH’s POR ANÁLISIS
GRAVIMÉTRICO.................................................................................................................. 113
3.4.1. Degradación bacteriana del petróleo crudo por análisis gravimétrico ......... 114
3.4.2. Potencial de biorremediación in situ de un consorcio bacteriano de
degradación de lodos aceitosos .................................................................................... 115
4. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………….116
5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………………………………………………………………..119
Índice de Tablas
Tabla N° 1 Caracterización de los diferentes métodos
cromatográficos……………………………………………………..……………..………………………39
Tabla N° 2 Frecuencias de absorción de varios grupos funcionales
orgánicos……………………………………………………………………………………………………..97
Índice de Figuras
Figura N° 1. Horizontes del Suelo……………………………………………………………......…10
Figura N° 2. Modelo Molecular de la estructura del agua…………………..……………...13
Figura N°3. Hidrocarburos saturados comunes o parafinas……………………………...18
Figura N° 4. Hidrocarburos saturados comunes o cicloalcanos………………………….20
Figura N° 5. Hidrocarburos aromáticos comunes……………………………………………..21
Figura N° 6. Ejemplos estructurales de aromáticos polinucleares………………………23
Figura N° 7. Algunos de los Hidrocarburos heteroatómicos………………………………26
Figura N° 8. Esquema representativo de un cromatograma durante diferentes fases
del análisis……………………………………………………………………………………………………43
Figura N° 9. Esquema representativo de un cromatógrafo de gases……………………44
Figura N° 10. Cromatógrafo de gases Perkin Elmer Clarus 68o con detector MS..45
Figura N° 11. Diagrama de bloques de los componentes principales de un
espectrómetro de masas.………………………………..……………………………………………..49
Figura N° 12. Esquema representativo de un cromatógrafo de gases acoplado a
espectrómetro de masas………………………………………………………………………………..50
Figura N° 13. Esquema representativo de un equipo de HPLC………………..………...60
Figura N° 14. Absorción de radiación por una solución…………….……………………...74
Figura N° 15. Disposición de componentes en un espectrofotómetro de absorción
UV-Vis simple de haz único……………………………………………………………………………82
Figura N° 16. Diagrama esquemático para un fluorómetro o espectrofluorómetro
representativo….…………………………………………………………………………………………..87
Figura N° 17. Modos vibracionales de la molécula de agua………………..……………...92
Figura N° 18. Espectro infrarrojo del poliestireno……………………………………………93
Figura N° 19. Interferómetro de Michelson……………………………………………………..95
Figura N° 20. Balanza analítica……………………………………………………………………..110
7
1. INTRODUCCIÓN
Los productos derivados del petróleo son la principal fuente de energía para la
industria y la vida cotidiana, sin embargo, fugas y derrames accidentales se
producen regularmente durante la exploración, la producción, refinación,
transporte y almacenamiento de petróleo y sus derivados, conllevando a resultados
adversos sobre el medio ambiente. Solo en las filtraciones naturales de petróleo
crudo se estima una cantidad de 600.000 toneladas métricas por año con un rango
de incertidumbre de 200.000 toneladas métricas por año. (Kvenvolden & Cooper,
2003) La liberación de hidrocarburos en el medio ambiente ya sea accidental o
debido a actividades humanas es la causa principal de la contaminación del agua y
el suelo. (Holliger et al., 1997)
La contaminación del suelo con hidrocarburos provoca daños de sistema local, ya
que la acumulación de contaminantes en animales y tejidos vegetales puede causar
la muerte o mutaciones (Chikere et al., 2019). La tecnología de uso común para la
recuperación de suelos que incluye mecánica, enterrado, evaporación, dispersión, y
el lavado, sin embargo, estas tecnologías son costosas y pueden conducir a la
descomposición incompleta de los contaminantes. En particular, El proceso de
biorremediación (término también conocido como biodegradación), se define como
el uso de microorganismos para desintoxicar o eliminar los contaminantes debido a
sus capacidades metabólicas diversas; es un método en evolución para la
eliminación y la degradación de muchos contaminantes ambientales incluyendo los
productos de la industria del petróleo. (Medina-Bellver et al., 2005) Además, la
8
tecnología de biorremediación se cree que es no invasiva y relativamente rentable
(Sharma, 2019)
La biodegradación por poblaciones de microorganismos representa uno de los
principales mecanismos por los cuales el petróleo y otros contaminantes de
hidrocarburos se pueden quitar del medio ambiente (Ulrici, 2000) y es más barato
que otras tecnologías de remediación. (Leahy & Colwell, 1990) El éxito de la
biorremediación de derrames de petróleo depende de la capacidad para establecer
y mantener condiciones que favorezcan la mejora de la tasa de biodegradación del
petróleo en el medio ambiente contaminado.
Numerosos artículos de revisión científica han cubierto diversos factores que
influyen en la velocidad de biodegradación del petróleo (Hassanshahian et al.,
2020; Hazen et al., 2016; Prince et al., 2017), sin embargo, existen pocas fuentes
bibliográficas que compilen la diversidad de métodos analíticos aplicados en la
cuantificación de la biodegradación de hidrocarburos. Ya que es un área
importante que aún sigue en crecimiento, investigadores y científicos podrían
facilitar su trabajo contando con un documento de apoyo que contenga
información sobre las técnicas analíticas para los propósitos mencionados, por
ende, en este documento se propone el desarrollo de una monografía que
proporcione información actualizada sobre las técnicas analíticas para la
cuantificación de la biodegradación de los contaminantes de hidrocarburos de
petróleo hacia la mejor comprensión de los desafíos de biorremediación. El
presente trabajo se llevará a cabo mediante una ardua búsqueda bibliográfica de
artículos de revisión y de investigación que aporten información importante
9
referente a los métodos analíticos de cuantificación de la biodegradación de
hidrocarburos, el cual servirá para que equipos de trabajos se fundamenten y
empleen estos métodos de acorde a las características que se presenten.
2. LAS MATRICES SUELO Y AGUA
2.1. EL SUELO
El suelo es un recurso natural definido generalmente como la capa superior de la
corteza terrestre, está formado por partículas de minerales, materia orgánica, agua,
aire y allí nacen y se desarrollan miles de seres vivos, desde microorganismos hasta
plantas y animales superiores. Los suelos se clasifican en distintos tipos de acuerdo
al porcentaje de cada uno de los componentes mencionados (Strawn et al., 2019).
Los suelos se constituyen en capas, llamadas horizontes (no todos los horizontes se
encuentran en todos los suelos). Cada horizonte difiere en una o más características
del superior o del inferior. Usualmente se reconocen cinco tipos de horizontes. Los
horizontes se observan en la figura 1, con una breve descripción de sus
características primordiales (Strawn et al., 2019).
El suelo cumple un rol muy importante y esencial para el sustento de la vida en este
planeta. Entre las propiedades del suelo están: (Coleman et al., 2017)
• Ser fuente de alimentos para la producción de biomasa
• Ser actuar como medio filtrante y buffer
10
• Ser hábitat de miles de organismos
• Ser el escenario donde ocurren los ciclos biogeoquímicos
• Ser fuente de materia prima indispensable para el ser humano como los minerales
• Ser el lugar donde se realizan la mayoría de las actividades humanas como por
ejemplo la agricultura y las actividades forestales.
Horizonte O: primeros centímetros del suelo Horizonte A: generalmente rico en materia orgánica
.Horizonte B: contiene elementos minerales Finos trasladados por la acción percolante del agua. De coloración más intensa que el horizonte superior
Horizonte C: formado por las fragmentaciones de la roca madre
Figura 1: Horizontes del Suelo (tomado de
https://es.wikipedia.org/wiki/Estructura_del_suelo)
Dentro de las propiedades nombradas del suelo, está su capacidad de actuar como
tampón y de servir de acopio de materiales, ambas características dependen
fuertemente del contenido de materia orgánica presente, correspondiendo a la
propiedad de “vertedero” antes nombrada. Esta propiedad se aplica, no solo al
11
agua, sino también a los minerales, gases e incluso a una gran cantidad de
sustancias químicas, incluidos algunos contaminantes (Strawn et al., 2019).
Cuando la capacidad de almacenar del suelo, se ve sobrepasada, ocurren muchos de
los desastres naturales como son las inundaciones; en particular cuando se excede
la dosificación de reactivos, o bien derrames, se impide el correcto actuar de la
capacidad tampón que presenta el suelo, convirtiéndose en un riesgo para la salud
no solo de las personas, sino también de todos los organismos que dependen y
viven en él. (Coleman et al., 2017)
Como se menciona, la materia orgánica es uno de los componentes centrales del
suelo y juega un rol muy importante, pues se encarga de mantener las funciones del
suelo, en particular la capacidad de resistir a la erosión y de mantener la fertilidad
del suelo. Además de asegurar la capacidad tampón mencionada y de adhesión que
posee el suelo, primordial para limitar la difusión de contaminantes. El suelo
además es un medio rico en vida, con una gran diversidad de microorganismos que
viven en él, siendo esto central para todas las funciones naturales que posee. La
riqueza en diversidad otorga la estructura y fertilidad del suelo, incluida la
producción de alimentos. (Coleman et al., 2017)
A pesar de haber sido considerado por muchos años un recurso infinitamente
renovable, por su apariencia sana, el suelo superior es netamente un recurso no
renovable, y actualmente posee altas tasas de degradación y tasas extremadamente
lentas de regeneración debida principalmente a la acción humana. (Hillel, 2013)
12
2.2. EL AGUA
El 97% del agua en la Tierra es agua salada y solo el tres por ciento es agua dulce;
un poco más de dos tercios de esta se congela en glaciares y casquetes polares. El
agua dulce no congelada restante se encuentra principalmente como agua
subterránea, con solo una pequeña fracción presente sobre el suelo o en el aire. Los
usos del agua incluyen actividades agrícolas, industriales, domésticas, recreativas y
ambientales. Todos los seres vivos requieren agua para crecer y reproducirse.
(Pimentel et al., 2004)
El agua dulce es un recurso renovable, sin embargo, el suministro mundial de agua
subterránea está disminuyendo constantemente, y el agotamiento ocurre de
manera más prominente en Asia, América del Sur y América del Norte, aunque
todavía no está claro cuánto equilibra la renovación natural este uso y si los
ecosistemas están amenazados. (Gleeson et al., 2012)
Desde el punto de vista químico, el agua (H2O) (Figura 2) es un compuesto
inorgánico polar que a temperatura ambiente es un líquido insípido e inodoro, que
es casi incoloro aparte de un toque inherente de azul. Es, con mucho, el compuesto
químico más estudiado y se describe como el "solvente universal" y el "solvente de
la vida". (Pohorille & Pratt, 2012) Es la sustancia más abundante en la Tierra
(Weingärtner et al., 2000) y la única sustancia común que existe como sólido,
líquido y gas en la superficie de la Tierra. (UV, s. f.) También es la tercera molécula
más abundante en el universo. (Weingärtner et al., 2000)
13
Las moléculas de agua forman enlaces de hidrógeno entre sí y son fuertemente
polares. Esta polaridad le permite disociar iones en sales y unirse a otras sustancias
polares como alcoholes y ácidos, disolviéndolos. Su enlace de hidrógeno provoca
sus muchas propiedades únicas, como tener una forma sólida menos densa que su
forma líquida, un punto de ebullición relativamente alto de 100°C para su masa
molar y una alta capacidad calorífica. (UV, s. f.; Weingärtner et al., 2000)
Figura 2. Modelo molecular de la estructura del agua. (tomado de http://www.biologiaescolar.com/2014/04/el-agua-propiedades-caracteristicas.html)
2.2.1. Contaminación de agua por petróleo
La contaminación del agua subterránea y superficial como resultado de la fuga de
petróleo crudo y productos de petróleo refinado durante las operaciones de
extracción y procesamiento es un problema ambiental grave y creciente en varios
lugares del mundo (Ojewumi et al., 2018).
14
Los hidrocarburos son, por su naturaleza química, uno de los tipos de
contaminantes que afectan a la calidad del agua de manera importante. En los
océanos, los derrames de petróleo suelen ser más frecuentes de lo esperado,
dejando en él estelas de contaminación de efectos a muy largo plazo. La formación
de una película impermeable de crudo sobre el agua en las zonas de derrame afecta
rápida y directamente a las aves y a los mamíferos acuáticos ya que obstruye el
intercambio gaseoso y desvía los rayos luminosos que deberían ser aprovechados
por el fitoplancton para llevar a cabo los procesos de fotosíntesis. («Contaminación
del agua por petróleo», s. f.)
La contaminación de agua por petróleo crudo o por petróleo refinado
(combustóleo, gasolina, y otros productos obtenidos por destilación fraccionada y
procesamiento químico del petróleo crudo) es ocasionada principalmente de
manera accidental desde diferentes fuentes. Algunos investigadores consideran que
la contaminación por petróleo proviene de los accidentes de los buque-tanques y de
las fugas en los equipos de perforación marina, sin embargo, otros consideran que
es cuestión de propaganda, ya que casi el 50 % del petróleo que llega a los mares y
los océanos proviene de tierra firme, debido a las actividades humanas que generan
desechos que luego son arrastrados por las corrientes fluviales hasta terminar en el
océano. («Contaminación del agua por petróleo», s. f.)
Una gran proporción de la contaminación del mar por petróleo, se debe a los
desechos de los barcos que recorren constantemente los mares. En 1970, la
expedición Ra a través del océano Atlántico reportó que de los 57 días que duró el
recorrido, en 43 de ellos el mar mostró señales de contaminación debido a trozos
15
de petróleo solidificado, aceite y otros desechos. Se calcula que alrededor de 1500
millones de toneladas de petróleo son transportadas al año a través de los mares y
que en el proceso de carga y descarga se pierde el 0.1% de ese petróleo. Además es
práctica común que los tanques cisterna utilicen como lastre agua de mar y la
regresen contaminada con petróleo. Otros buque-tanques bombean el petróleo de
desecho al mar en forma de desperdicio. Se calcula que por estas dos formas se
arrojan al mar cerca de 3.5 millones de toneladas de petróleo. Otra forma de
contaminación del mar por petróleo proviene de la perforación de pozos de gas y
petróleo en las aguas costeras y de las fugas de las tuberías subacuáticas.
(«Contaminación del agua por petróleo», s. f.)
En la explotación del petróleo se derrama casi la mitad en el área de perforación, lo
que acarrea grandes pérdidas y la consecuente contaminación del aire, agua y
suelo. La manera tradicional de extraer o recuperar el petróleo es mediante
bombeo con agua, lo cual representa una pérdida considerable de este recurso. Por
ejemplo, en 1979, en el Golfo de México ocurrió el mayor escape de petróleo al mar
del pozo petrolero Ixtoc-1 cuando tardaron 8 meses en tapar la fuga y se
derramaron cerca de 700 millones de litros de petróleo en las aguas del golfo, de lo
cual se hizo gran propaganda. Sin embargo, el volumen de petróleo por derrames
ocasionales es menor que el volumen de petróleo arrojado desde los pozos durante
las operaciones normales, del lavado de los buque-tanques con agua marina, del
transporte de petróleo en los buque-tanques y del agua contaminada con petróleo
arrastrado por el océano. También los brotes naturales de petróleo liberan grandes
cantidades al océano en varios sitios. («Contaminación del agua por petróleo», s. f.)
16
De lo anteriormente discutido, se evidencia que la contaminación del agua por
petróleo y sus desechos representa uno de los problemas con mayor impacto
ambiental, de ahí que, ha surgido la necesidad de explorar diferentes mecanismos
de remediación para el tratamiento de agua contaminada por petróleo. En
particular, son de interés los procesos de biorremediación en los que se utilizan
bacterias y hongos para biodegradar hidrocarburos de petróleo presentes en
cuerpos de agua o en sedimento.
3. EL PETRÓLEO
El petróleo es el producto de la degradación anaeróbica de materia orgánica,
durante largos períodos de tiempo y bajo condiciones de alta presión y
temperatura, que la convierte en gas natural, crudo y derivados del petróleo. El
petróleo crudo es una mezcla extremadamente compleja y variable de compuestos
orgánicos, donde la mayoría de ellos son hidrocarburos, que varían en peso
molecular desde el gas metano hasta los altos pesos moleculares de alquitranes y
bitúmenes. Estos hidrocarburos pueden presentarse en un amplio rango de
estructuras moleculares: cadenas lineales y ramificadas, anillos sencillos,
condensados o aromáticos. Los dos grupos principales de hidrocarburos
aromáticos son los monocíclicos, el benceno, tolueno y xileno (BTEX) y los
hidrocarburos policíclicos (HAPs) tales como el naftaleno, antraceno y fenantreno.
La degradación microbiana constituye el principal proceso de descontaminación
natural (Suja et al., 2014a). Este proceso se puede acelerar y/o mejorar mediante la
aplicación de tecnologías de biorremediación (Hazen et al., 2016). El crudo de
petróleo se caracteriza por ser una matriz contaminante que contiene una elevada
17
diversidad de compuestos, por lo que es un sustrato ideal para evaluar el potencial
catabólico de cepas o consorcios microbianos de interés en biorremediación.
3.1. COMPOSICIÓN GENERAL DEL PETRÓLEO CRUDO
Los compuestos en el petróleo crudo son esencialmente hidrocarburos o
hidrocarburos sustituidos en los cuales los elementos principales son carbono al
85% –90% e hidrógeno al 10% –14%, y el resto con elementos no hidrocarbonados:
azufre (0.2% –3% ), nitrógeno (<0.1–2%), oxígeno (1% –1.5%) y compuestos
organometálicos de níquel, vanadio, arsénico, plomo y otros metales en trazas (en
partes por millón o partes por billón de concentración) . Las sales inorgánicas de
cloruro de magnesio, cloruros de sodio y otras sales minerales también se
acompañan con petróleo crudo del pozo, ya sea por el agua de la formación o por el
agua y los químicos inyectados durante la perforación y la producción. (Chaudhuri,
2016).
3.1.1. Grupos de hidrocarburos
Los compuestos hechos únicamente de carbono e hidrógeno se denominan
hidrocarburos. Estos hidrocarburos se agrupan como parafinas, naftenos,
aromáticos y olefinas. El petróleo crudo contiene estos hidrocarburos en diferentes
proporciones, excepto las olefinas, que se producen durante el procesamiento.
3.1.1.1. Las parafinas
Son hidrocarburos saturados. Un hidrocarburo saturado es un compuesto donde
los cuatro enlaces de un átomo de carbono están unidos a cuatro átomos separados.
18
Los ejemplos son metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, con la fórmula
molecular genérica de CnH2n+2, donde n es el número de átomos de carbono en ese
compuesto. La serie homóloga de estos hidrocarburos se llama alcanos (Figura 3)
Figura 3. Hidrocarburos saturados comunes o parafinas. Adaptado del libro de
Chaudhuri (Chaudhuri, 2016).
La serie comienza con metano, que tiene la fórmula química CH4. Los alcanos son
relativamente poco reactivos en comparación con los aromáticos y las olefinas. A
temperatura ambiente, los alcanos no se ven afectados por el ácido sulfúrico
humeante concentrado, los álcalis concentrados o los agentes oxidantes potentes
como el ácido crómico. Realizan reacciones de sustitución lentamente con cloro a la
luz solar y con bromo en presencia de un catalizador. Las parafinas están
19
disponibles tanto en forma normal como iso-parafínicas. Las parafinas normales
son compuestos de cadena lineal y las iso-parafinas son compuestos ramificados.
Normal e iso-parafina tienen la misma fórmula (es decir, el mismo número de
átomos de carbono e hidrógeno), pero difieren ampliamente en sus propiedades
físicas y químicas debido al isomerismo. El número de isómeros de parafina
normal aumenta con el número de átomos de carbono en la parafina. Por ejemplo,
las parafinas con números de carbono de cinco, seis y ocho tendrán iso-parafinas
de tres, cinco y dieciocho, respectivamente. Las iso-parafinas son más reactivas que
las parafinas normales y son deseables en aplicaciones de motores. Las parafinas
normales se pueden convertir en iso-parafinas mediante procesos térmicos o
catalíticos. Esto se conoce como la reacción de isomerización. (Chaudhuri, 2016)
3.1.1.2. Naftenos
Los naftenos son hidrocarburos cíclicos saturados con la fórmula general, como
olefinas, de CnH2n, también conocidos como cicloalcanos. Como están saturados,
son relativamente inactivos, como parafinas. Los naftenos son compuestos
deseables para la producción de compuestos aromáticos y de base de aceite
lubricante de buena calidad. Algunos de estos se muestran en la figura 4.
(Chaudhuri, 2016).
20
Figura 4. Hidrocarburos saturados comunes o cicloalcanos. Adaptado del libro
de Chaudhuri (Chaudhuri, 2016).
3.1.1.3. Aromáticos
Los aromáticos, a menudo llamados bencenos, son químicamente muy activos en
comparación con otros grupos de hidrocarburos. Su fórmula general es CnH2n-6.
Estos hidrocarburos en particular son atacados por el oxígeno para formar ácidos
orgánicos. Los naftenos se pueden deshidrogenar a compuestos aromáticos en
presencia de un catalizador de platino. Los aromáticos inferiores, como el benceno,
21
el tolueno y los xilenos, son buenos solventes y precursores de muchos productos
petroquímicos. Los aromáticos de los productos derivados del petróleo se pueden
separar mediante extracción con disolventes como fenol, furfurol y dietilenglicol.
Algunos de estos se presentan en la figura 5.
Figura 5. Hidrocarburos aromáticos comunes. Adaptado del libro de
Chaudhuri (Chaudhuri, 2016).
22
3.1.2. Hidrocarburos complejos
El petróleo crudo también contiene una gran cantidad de hidrocarburos que no
entran en la categoría de parafinas, olefinas, naftenos o aromáticos, pero pueden
ser el grupo combinado de dos o más grupos de parafinas, naftenos o
hidrocarburos aromáticos. Al unir dos o más anillos de nafteno o combinar anillos
de nafteno y aromáticos, cadenas de parafina con anillos aromáticos (alquil-
aromáticos), etc., se puede formar una amplia gama de hidrocarburos complejos.
Ejemplos de estos compuestos son decalina, naftaleno y difenilo. Las fracciones
más pesadas de petróleo crudo contienen este tipo de hidrocarburos. Los
aromáticos multinucleares (anillos múltiples) o los aromáticos polinucleares (PNA)
son bien conocidos en el petróleo crudo y sus productos residuales. Los PNA son
los precursores del coque, que se forma debido al efecto térmico. Estos no se
pueden descomponer fácilmente, incluso por craqueo hidroeléctrico severo.
23
Figura 6. Ejemplos estructurales de aromáticos polinucleares. Adaptado del
libro de Chaudhuri (Chaudhuri, 2016).
3.1.3. Compuestos heteroatómicos o no hidrocarburos
Los heteroátomos comunes en los hidrocarburos son azufre, oxígeno, nitrógeno y
átomos metálicos. Los compuestos de azufre están presentes en el petróleo crudo
como mercaptanos, mono y disulfuros con la fórmula general R-SH, R-S-R1, R-S-S-
R1, donde R y R1 son los radicales alquilo. Los mercaptanos son muy corrosivos,
mientras que los mono y disulfatos no lo son. Ejemplos de compuestos de azufre
cíclicos son tiofenos y benzotiofeno. El gas sulfuro de hidrógeno (H2S) está
asociado con el petróleo crudo en forma disuelta y se libera cuando se calienta. El
H2S es corrosivo a altas temperaturas y en presencia de humedad. El petróleo
24
crudo que contiene grandes cantidades de H2S se llama crudo agrio. El azufre
presente en los productos de combustible de petróleo también forma varios óxidos
de azufre (SOx) durante la combustión, que son contaminantes ambientales
fuertes. El H2S puede eliminarse de los gases mediante absorción en una solución
de amina. En los destilados ligeros, el azufre puede estar presente como H2S,
mercaptanos y tiofenos, pero en las fracciones más pesadas de petróleo crudo, el
80% -90% del azufre generalmente está presente en la compleja estructura de
anillo de los hidrocarburos. En esta combinación, el átomo de azufre es muy estable
y no reactivo. Como resultado, el azufre del petróleo más pesado no puede
eliminarse sin una reacción destructiva, como reacciones térmicas o catalíticas
severas. Hoy en día, el azufre se recupera durante la refinación y se vende como
producto. El azufre también tiene un efecto de envenenamiento en varios
catalizadores.
Los compuestos de nitrógeno en los hidrocarburos generalmente se encuentran en
las partes más pesadas del petróleo crudo. Estos son responsables del color y la
inestabilidad del color y el envenenamiento de ciertos catalizadores. El nitrógeno
en los combustibles derivados del petróleo provoca la generación de óxidos de
nitrógeno (NOx), que también son contaminantes fuertes de la atmósfera. El
nitrógeno se puede eliminar de los productos derivados del petróleo mediante
hidrogenación catalítica. Al igual que el azufre, el nitrógeno en las partes más
pesadas del petróleo no se puede eliminar sin reacciones severas de craqueo o
hidrogenación.
25
Compuestos de oxígeno: el petróleo crudo puede contener compuestos que
contienen oxígeno, como ácidos nafténicos, fenoles y cresoles, que son
responsables de las actividades corrosivas. El oxígeno también actúa como un
veneno para muchos catalizadores. Esto se puede eliminar por hidrogenación
catalítica. El exceso de compuestos de oxígeno puede incluso provocar una
explosión.
Los compuestos metálicos de vanadio, níquel, plomo, arsénico, etc., también se
encuentran en el petróleo crudo. El vanadio y el níquel se encuentran en forma de
compuestos organometálicos, principalmente en las fracciones más pesadas del
petróleo crudo, donde los átomos metálicos se distribuyen dentro del compuesto en
una forma compleja llamada porfirinas. Los combustibles de petróleo que
contienen estos compuestos metálicos pueden dañar los quemadores, las líneas y
las paredes de las cámaras de combustión. Algunos de los hidrocarburos
heteroatómicos son mostrados en la Figura 7. (Chaudhuri, 2016)
26
Figura 7. Algunos de los hidrocarburos heteroatómicos. Adaptado del libro de
Chaudhuri (Chaudhuri, 2016).
4. CONTAMINACIÓN DEL AMBIENTE POR PETRÓLEO
Los accidentes por contaminación con hidrocarburos se han convertido hoy en día
en un fenómeno común y han causado catástrofes ecológicas y sociales. Además de
27
la contaminación accidental del ecosistema, la gran cantidad de lodo de petróleo
generado en las instalaciones de los sistemas de separación de agua y aceite y la
acumulación de residuos de materiales oleosos en el fondo del tanque de
almacenamiento de petróleo crudo plantean graves problemas porque muchos de
los procesos de tratamiento estándar utilizados para descontaminar el suelo y el
agua subterránea han sido limitados en su aplicación, son prohibitivamente caros o
pueden ser solo parcialmente efectivos. (K. Das & Mukherjee, 2007)
Los hidrocarburos de petróleo (PHC) son prominentes entre los contaminantes
orgánicos que con frecuencia se depositan en el medio marino en concentraciones
más bajas en forma de escorrentías urbanas, desechos de automóviles, aguas
pluviales, efluentes industriales o desechos domésticos y ocasionalmente en
concentraciones más altas como un gran derrame de petróleo. Los principales
componentes de estos PHC son los aceites crudos degradados, los combustibles
fósiles quemados y los alcanos normales. Por lo general, son menos solubles en
agua, pero se adsorben fácilmente sobre partículas y posteriormente se eliminan
del sedimento del fondo, que se ha convertido en un depósito para varios
contaminantes hidrofóbicos. El peligro en la sedimentación de estos contaminantes
orgánicos es su tendencia a acumularse y bioconcentrarse con el tiempo en
organismos acuáticos. (Adeniji et al., 2017a)
Un derrame de petróleo crudo en la tierra introduce hidrocarburos a base de
petróleo (PHC’s), que afectan negativamente las características biológicas,
químicas y físicas del suelo. Los resultados de varios estudios ambientales
realizados en áreas de derrames de petróleo muestran niveles asombrosos de
28
contaminación ambiental y efectos adversos sobre la biota debido a la naturaleza
peligrosa de los PHC’s. (Okparanma & Mouazen, 2013a)
Hidrocarburos totales de petróleo (TPH) es el término generalmente utilizado para
describir la cantidad de hidrocarburos derivados del petróleo extraídos y
cuantificados por un método particular en una matriz ambiental (Adeniji et al.,
2017a). Los métodos analíticos de TPH varían en gran medida, y cada uno
proporciona resultados dentro de un rango particular, mientras que algunos no son
específicos. Por lo tanto, comprender cómo se llevó a cabo el análisis es crucial para
la correcta interpretación de resultados. Los métodos con diferentes eficiencias de
extracción podrían producir diferentes concentraciones de TPH para una misma
muestra. Por lo tanto, resultados generados usando diferentes procedimientos son
siempre difíciles de comparar porque están involucrados diferentes estándares de
calibración y solventes de extracción. (Adeniji et al., 2017)
El crudo es la fuente principal de PH (hidrocarburos de petróleo), y la
concentración de cada compuesto varía según la fuente. Cuatro grupos
estructurales principales representan los componentes principales de los PH. El
componente saturado o la fracción alifática que contiene alcanos y cicloalcanos y se
extiende desde C1 (gas metano) hasta C40; el componente aromático que se
clasifica en función del número de anillos de benceno; el componente de asfaltenos
que incluye cetonas, fenoles y ésteres; y el componente de resina que incluye
sulfóxidos, piridinas y amidas (Colwell et al., 1977). Si bien la mayoría de los
componentes de PH son combustibles, difieren en sus características
fisicoquímicas, como el color, el olor y los puntos de ebullición y evaporación.
29
Los PH ingresan al medio ambiente a través del transporte, derrames y fugas de
petróleo, actividades industriales y uso privado. Se mueven a través del suelo,
mientras que algunos compuestos pueden adherirse a las partículas del suelo,
mientras que otros alcanzan el agua subterránea y, por lo tanto, afectan a todo el
ecosistema, incluidos los humanos. Por lo tanto, para evaluar los riesgos asociados
con la APS en cualquier ecosistema, es importante investigar el destino de PH al
ingresar al medio ambiente. Muchos factores afectan la propagación, la infiltración
y la biodegradación del PH en el suelo. Algunos de estos factores están relacionados
con contaminantes, como la cantidad, la composición química y la viscosidad de la
fracción de PH, mientras que otros factores están relacionados con el sitio, como el
tipo, la porosidad, la permeabilidad y el tamaño de partícula del suelo.
La biodegradación del PH se lleva a cabo a través de la fracción de degradación de
hidrocarburos de la comunidad microbiana natural, luego del derrame inicial de
petróleo en el medio ambiente, aunque la microflora del suelo se debe encontrar
muy afectada por la presencia del contaminante. La cantidad de microorganismos
que degradan los hidrocarburos, así como la concentración y biodisponibilidad de
la fracción de PH afectan la tasa de degradación, además de muchos otros factores,
como la temperatura, el contenido de humedad y la concentración de nutrientes
(Alvaro et al., 2017).
5. BIODEGRADACIÓN DE PETRÓLEO
La biorremediación es la aplicación de agentes biológicos para descomponer y
naturalizar contaminantes ambientales. Las bacterias, hongos y plantas son los
30
organismos más comunes utilizados en la biorremediación de suelos contaminados
con hidrocarburos de petróleo debido a su capacidad de degradar los hidrocarburos
de petróleo (Medina-Bellver et al., 2005). La aplicación de la biorremediación
comenzó el siglo pasado cuando se informaron las capacidades de utilización de
hidrocarburos de muchos microorganismos indígenas. Sin embargo, desde el
comienzo del siglo XXI, la investigación se ha centrado ampliamente en la
biorremediación y su aplicación. (Khudur et al., 2018)
Se pueden aplicar muchas estrategias de biorremediación para tratar muestras
ambientales contaminadas con hidrocarburos; Estas estrategias incluyen:
a) La atenuación natural: puede definirse como la biodegradación del
contaminante por la microflora autóctona del suelo, sin ninguna
participación humana (Yu et al., 2005). La tasa de degradación del
contaminante puede ser lenta porque depende de la presencia de microbios
que degradan los hidrocarburos, la disponibilidad de nutrientes y el nivel de
contaminación (Iwamoto & Nasu, 2001). Esta estrategia requiere monitoreo
periódico pero tiene la ventaja de no perturbar los hábitats ecológicos
sensibles.
b) La bioestimulación es una estrategia de biorremediación ampliamente
utilizada en la que el proceso de degradación de un contaminante se acelera
mediante la adición de nutrientes a la microflora del suelo. Muchos
nutrientes están involucrados en el proceso de bioestimulación, como el
carbono, el fósforo, el nitrógeno y el oxígeno (Andreolli et al., 2015). Muchos
estudios han demostrado que la bioestimulación ha aumentado
31
significativamente la biodegradación de la hidrocarburos de petróleo (PH)
(Andreolli et al., 2015; Khudur et al., 2018; Suja et al., 2014b). Sin embargo,
la concentración elevada de los nutrientes añadidos puede causar un
desequilibrio de la diversidad microbiana natural en el suelo, lo que resulta
en una capacidad de biodegradación reducida.
c) La bioacumulación es el aumento de la biomasa de los degradadores de
hidrocarburos al agregar inóculos microbianos nativos y, por lo tanto,
aumenta la tasa de degradación del contaminante. El efecto de la
bioacumulación en el aumento de la tasa de degradación de la PH se ha
informado en muchos estudios (Wu et al., 2016). Sin embargo, otros
estudios han demostrado que la bioacumulación no tiene ningún efecto
sobre la degradación de hidrocarburos (Yu et al., 2005). Esta adición de
especies microbianas exógenas en el suelo contaminado podría alterar la
composición natural de la diversidad microbiana en el ambiente tratado
(Festa et al., 2016).
d) La fitorremediación está definida para usar la planta y los microorganismos
asociados para degradar, eliminar o limpiar los ambientes. Con respecto a la
PH, las raíces de las plantas y su rizosfera desempeñan el papel más
importante que se define como rizoremediación. Los informes muestran que
muchos compuestos de PH como el diesel y los hidrocarburos aromáticos
policíclicos (PAH) pueden estar sujetos a fitorremediación (Shahsavari et al.,
2013, 2015). Sin embargo, la toxicidad asociada con la mayoría de los APS
hacia las plantas puede afectar la eficacia de la fitorremediación.
32
La capacidad de las microfloras para utilizar los PH como fuente de energía se
informó por primera vez en 1946 (Zobell, 1946). Desde entonces, se han realizado
investigaciones para investigar la degradación biológica de hidrocarburos de
petróleo. Aunque la mayoría de los agentes biológicos hidrocarburo-degradadores
son bacterias que actúan como degradadores primarios en el caso de un derrame de
petróleo (Varjani, 2017), la microflora degradante de hidrocarburos también
incluye hongos y levaduras, los cuales están ampliamente distribuidos en el medio
ambiente. Muchos de estos organismos han sido aislados de diferentes muestras
ambientales, como suelo, agua marina y dulce (Prince et al., 2017). La degradación
aeróbica de PH es el proceso más completo (N. Das & Chandran, 2011). Los
procesos oxidativos de la oxigenasa y la peroxidasa catalizan el paso inicial de las
vías periféricas de degradación del PH. Los hidrocarburos se convierten en
metabolitos intermedios, como los que se encuentran comúnmente en el ciclo del
ácido tricarboxílico (TCA), y finalmente se asimilan en la biomasa celular.
5.1. FACTORES QUE AFECTAN LA BIODEGRADACIÓN
5.1.1. La presencia de oxígeno
La degradación microbiana de PH tiene lugar de manera óptima en condiciones
aeróbicas. En presencia de oxígeno, puede producirse una degradación completa
del contaminante (N. Das & Chandran, 2011). Durante este proceso, el
contaminante orgánico es atacado por oxigenasas y peroxidasas intracelulares
activadas y transferido a sustancias orgánicas simples, como agua, dióxido de
carbono y biomasa. La degradación también puede tener lugar en condiciones
33
anaeróbicas, pero a un ritmo mucho más lento en comparación con las condiciones
aeróbicas (Wentzel et al., 2007). En muchos casos, cuando se introducen grandes
cantidades de aceite en el medio ambiente, aumenta la tasa de consumo de
oxígeno, lo que crea condiciones anaeróbicas. En tales condiciones, los
microorganismos utilizarán otros receptores de electrones como fuente de energía,
como sulfato, hierro o nitrato, que producirán mucha menos energía que el uso de
oxígeno como receptor de electrones, lo que ralentizará la velocidad de degradación
del contaminante (Thapa et al., 2012). La degradación del PHC puede alcanzar el
90% en condiciones aeróbicas, mientras que la degradación no puede superar el
25% en condiciones anaeróbicas (Grishchenkov et al., 2000).
5.1.2. Concentración de nutrientes
Se requieren nutrientes para la biodegradación de PH (Hassanshahian et al.,
2020). La gran mayoría de los microorganismos requieren carbono (C) como
nutriente esencial para su metabolismo. Sin embargo, muchos otros
micronutrientes, como el nitrógeno (N) y el fósforo (P), también son necesarios
para optimizar el crecimiento de los microorganismos. Los microorganismos que
degradan los hidrocarburos requieren todos estos elementos, y la relación molar de
nutrientes óptima para C: N: P para la mayoría de los microorganismos es 100: 10:
1 (Straube et al., 2003). La disponibilidad de una concentración limitada de
nutrientes conduce a bajas tasas de degradación microbiana. Además, los niveles
excesivos de nutrientes, como el nitrógeno y el fosfato, pueden reducir la tasa de
degradación del PH (Chen et al., 2019). Además, cualquier alteración en el
equilibrio natural de los nutrientes en el medio ambiente podría conducir a
34
cambios en las comunidades naturales de microflora y la relación ecológica entre
ellas (Hays et al., 2015).
5.1.3. Diversidad microbiana
En un ecosistema naturalmente equilibrado, los microorganismos producen una
variedad de sustancias (por ejemplo, enzimas) que son esenciales para su
metabolismo y proliferación. La relación sinérgica entre las diferentes
comunidades microbianas les ayuda a adaptar y modificar los cambios en su
entorno, creando así las condiciones ideales para un mayor crecimiento (Sabra
et al., 2010). Aunque algunas especies han adoptado una variedad de mecanismos
para descomponer los contaminantes que ingresan a su entorno, los
microorganismos individuales solo pueden metabolizar una pequeña gama de
hidrocarburos. Por lo tanto, otros microorganismos en el mismo ecosistema
ofrecen relaciones simbióticas al producir moléculas que ayudan a los
degradadores contaminantes. Por ejemplo, los tensioactivos secretados (p. Ej.,
Rhamnolípidos) aumentan la biodisponibilidad de los hidrocarburos a los
degradadores de hidrocarburos (Gkorezis et al., 2016).
5.1.4. Temperatura
La temperatura es el factor ambiental más crucial que influye en la tasa de
degradación de la APS. El papel de la temperatura es muy importante ya que afecta
directamente la biodisponibilidad de los hidrocarburos durante la biodegradación
al cambiar sus velocidades de viscosidad, volatilización y difusión (Coulon et al.,
2007). Además, la diversidad de las comunidades microbianas también está
35
influenciada por la temperatura; generalmente la mayor diversidad se detecta entre
30 y 50 ° C. Además, las temperaturas elevadas influyen en la actividad de las
enzimas bacterianas involucradas en la degradación del PH (Abed et al., 2015).
6. TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LA BIORREMEDIACIÓN DE HIDROCARBUROS DE PETRÓLEO
Los hidrocarburos de petróleo constituyen un número muy grande de compuestos
químicos, los mismos se pueden agrupar según grupos de compuestos o bien
productos industriales. Para determinar esta diversidad de compuestos se pueden
utilizar varias técnicas analíticas. Tanto en suelo como en agua los hidrocarburos
deben ser extraídos con un solvente adecuado y posteriormente los compuestos que
han sido solubilizados son analizados por varios métodos. El tipo de hidrocarburo
que se desee analizar indicará el solvente a utilizar, ya que este debe solubilizar el o
los hidrocarburos en consideración. Todas tienen ventajas y desventajas, las cuales
deben ser evaluadas antes de su selección para el uso. Se deben tener en cuenta la
acción de interferentes y también de pérdidas de compuestos durante la toma de
muestras y transporte de las mismas, que pueden invalidar los análisis posteriores.
Ahora bien, la efectividad de la biodegradación se mide por cuantificación de las
cantidades de HTPs en matrices sometidas al efecto de microorganismos. Uno de
los procedimientos para cuantificación de los HTPs en suelo consiste en extraer los
hidrocarburos con Soxhlet utilizando hexano como solvente de extracción, y luego
determinar la cantidad de HTPs gravimétricamente, tal como ha sido
implementado por Singh y Colaboradores (Singh et al., 2016). En general, los
métodos gravimétricos emplean un paso inicial de extracción con solvente frío y un
36
paso final de diferencia de peso. En el protocolo puede haber otro paso que consiste
en limpieza con gel de sílice para eliminar el material biogénico. Si no implica un
paso de limpieza, se denomina método de aceite y grasa; de lo contrario, se
denomina método HTP. (Okparanma & Mouazen, 2013b) En el 2012, Latha y
Kalaivani (Latha & Kalaivani, 2012) utilizaron el método gravimétrico de
cuantificación para evaluar el potencial de biodegradación de varias cepas
bacterianas sobre muestras de suelo contaminadas con crudo. Más recientemente,
Chithra y Shenpagam (Chithra & Shenpagam, 2014) aplicaron también métodos
gravimétricos de análisis para determinar el porcentaje de crudo biodegradado por
una serie de 10 bacterias aisladas, siendo la cepa Pseudomonas aeruginosa la que
exhibió la mayor eficacia para biorremediación (88.75%).
Otro método altamente eficaz para análisis de HTPs es la cromatografía de gases
acoplada a detector de ionización por llama (GC-FID, por sus siglas en inglés). La
técnica GC-FID se prefiere para aplicaciones de laboratorio porque proporciona
buena selectividad y sensibilidad, y está reconocido por la Environmental
Protection Agency (EPA), la British Standard Institution (BSI) y la International
Organization for Standardization (ISO). (Okparanma & Mouazen, 2013b) GC-FID
se utiliza para aplicaciones cuantitativas y cualitativas, incluido el cribado de
muestras ambientales, (Saari et al., 2007; Vallejo et al., 2001) desentrañando el
tipo y la identidad del aceite fresco a ligeramente degradado en muestras
ambientales para el reconocimiento de patrones de hidrocarburos de petróleo
(Daling et al., 2002; Wang & Fingas, 2003) y caracterizar y resolver el perfil de
mezclas complejas no resueltas en sedimentos contaminados con petróleo. En
particular, Chikere y colaboradores, (Chikere et al., 2009) caracterizaron una
37
comunidad bacteriana que habita en el sedimento de Orillas del río Nembe Port
Harcourt, en Nigeria, así como su potencial de biodegradación de hidrocarburos de
petróleo, para lo cual, los hidrocarburos en la muestra de sedimento se
cuantificaron usando un cromatógrafo de gases equipado con detector de
ionización por llama (GC-FID).
Con el paso del tiempo, se han desarrollado un par de alternativas al FID para
análisis más detallado de una gama más amplia de matrices de muestra debido a la
selectividad del FID para los hidrocarburos. (Wang & Fingas, 1995) La alternativa
más utilizada es la técnica de detección de espectrometría de masas (MSD). MSD
básicamente utiliza los espectros de masas característicos de iones moleculares y /
o fragmentados producidos después del impacto iónico para identificar compuestos
en la muestra. (Masucci & Caldwell, 2004) El espectrómetro de masas se ha
descrito como un detector universal debido a su versatilidad en la medición de
HTPs. Usando este esquema de trabajo, Yan y colaboradores, (Yan et al., 2013)
aislaron diez cepas bacterianas de muestras de suelo contaminado con petróleo a
largo plazo, y midieron la capacidad de biodegradación de las cepas cuantificando
los hidrocarburos remanentes tras el proceso de biorremediación. De acuerdo a los
autores, (Yan et al., 2013) el análisis GC-MSD mostró que todas las cepas probadas
podrían degradar totalmente los hidrocarburos con cadena entre C11 ~ C18, y
degradar parcialmente los hidrocarburos de cadena C19 ~ C24.
Entre las técnicas emergentes, aparecen los ensayos inmunológicos (IMA, por sus
siglas en inglés), que son métodos inmunoquímicos de campo en el que se utilizan
anticuerpos para que se unan selectivamente a componentes específicos del
38
petróleo. (Weisman, 1998) El principio subyacente de los métodos IMA es variable
dependiendo de la etiqueta vinculada utilizada para la detección de respuesta. Los
más destacados son el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el
inmunoensayo de fluorescencia y el inmunoensayo electroquímico (ECIA).
Recientemente, Mousa (Mousa, 2016) utilizó un sistema híbrido de electro-
bioreemediación sobre muestras de agua contaminadas por petróleo, y determinó
las cantidades de HTPs calorimétricamente según el método de inmunoensayo.
Otra de las herramientas analíticas utilizadas para la cuantificación de la
biodegradacion de hidrocarburos totales de petróleo es la espectroscopia infrarroja
(IR, por sus siglas en inglés). Este método aprovecha los espectros de las
vibraciones de estiramiento y flexión asociadas con una molécula cuando absorbe
energía en la región IR del espectro electromagnético para la elucidación de
propiedades. (Weisman, 1998) Almeida y colaboradores, (Almeida et al., 2013)
implementaron este método para cuantificar HTPs en procesos de biodegradación
de hidrocarburos de petróleo en sedimentos marinos, en particular, mediante
espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR). Si bien ha sido
reportado que mediante espectroscopia Raman (RS) es posible detectar y
cuantificar algunos de los hidrocarburos presentes en el petróleo, (Okparanma &
Mouazen, 2013b) al momento de realizar el presente manuscrito no se han
encontrado aún estudios asociados con procesos de biorremediación donde se
utilicen técnicas basadas RS, sin embargo, todavía se continua en etapa de
búsqueda bibliográfica.
39
Entre las posibles técnicas de medición rápida que pueden llevarse a cabo en el
sitio, la espectroscopia de reflectancia, que incluye el infrarrojo visible y cercano
(vis-NIRS) y los rangos del infrarrojo medio, es una de las técnicas más
prometedoras para detectar y cuantificar HTPs. (Okparanma & Mouazen, 2013b)
Sin embargo, hasta la fecha se pueden encontrar en la literatura estudios muy
limitados sobre el uso de la espectroscopia de reflectancia para los análisis de HTPs
en el suelo. (R. K. Douglas et al., 2018) Por ejemplo, en los trabajos de Chakraborty
(Chakraborty et al., 2015) y Douglas (R. K. Douglas et al., 2018), se utilizó vis-NIRS
para cuantificar HTPs.
A continuación se realiza un desglose de cada una de las téncnicas analíticas
anteriormente discutidas, así como una breve discusión de algunos ejemplos de su
implementación para la cuantificación de hidrocarburos totales de petróleo (TPH).
6.1. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
La cromatografía es un término general aplicado a una amplia variedad de técnicas
de separación basadas en la división o distribución de una muestra (soluto) entre
una fase móvil o móvil y una fase fija o estacionaria. La cromatografía puede verse
como una serie de equilibrios entre la fase móvil y la estacionaria. La interacción
relativa de un soluto con estas dos fases se describe mediante el coeficiente de
partición (K) o distribución (D) (relación de concentración de soluto en fase
estacionaria a concentración de soluto en fase móvil). La fase móvil puede ser un
gas (GC) o líquido (LC) o un fluido supercrítico (SFC). La fase estacionaria puede
40
ser un líquido o, más habitualmente, un sólido. El campo de la cromatografía se
puede subdividir según las diversas técnicas aplicadas, o según los principios
fisicoquímicos implicados en la separación (ver tabla 1). (Nielsen, 2010)
Tabla 1. Características de los diferentes métodos cromatográficos
Método Fases
móvil/estacionaria
La retención varía con
Cromatografía gas-
líquido (GC)
Gas/líquido Tamaño
molecular/polaridad
Cromatografía gas –
sólido
Gas/sólido Tamaño
molecular/polaridad
Cromatografía de
fluido supercrítico
Fluido supercrítico/sólido Tamaño
molecular/polaridad
Cromatografía de fase
reversa
Líquido polar/líquido (o
sólido) no polar
Tamaño
molecular/polaridad
Cromatografía de fase
normal
Líquido menos
polar/líquido (o sólido)
más polar
Tamaño
molecular/polaridad
Cromatografía de
intercambio iónico
Líquido polar/sólido iónico Carga eléctrica molecular
Cromatografía de
exclusión por tamaño
Líquido/sólido Tamaño molecular
Cromatografía de
interacción
Líquido polar/líquido (o
sólido) no polar
Tamaño
molecular/polaridad
41
hidrofóbica
Cromatografía de
afinidad
Agua/sitios de unión Estructura específica
En lo que concierne a la cuantificación de la biodegradación de hidrocarburos
totales de petróleo por cromatografía, solamente la cromatografía de gases y la
cromatografía líquida de alta eficacia son de interés.
6.1.1. Cromatografía de gases
De acuerdo a la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC), la
cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase
estacionaria) mientras que la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección
definida. En términos descriptivos, la cromatografía de gases es un método de
separación en el que los componentes de una muestra se dividen entre dos fases:
una de estas fases es un lecho estacionario con una gran superficie y el otro es un
gas que se filtra a través del lecho estacionario. La muestra es vaporizada y
transportada por la fase gaseosa móvil (el gas portador) a través de la columna. Las
muestras se dividen (equilibran) en la fase líquida estacionaria, en función de sus
solubilidades a la temperatura dada. Los componentes de la muestra (llamados
solutos o analitos) se separan entre sí en función de sus presiones de vapor
relativas y sus afinidades por el lecho estacionario. Este tipo de proceso
cromatográfico se llama elución. (McNair et al., 2019)
42
En cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de
una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil
de un gas inerte (gas portador). A diferencia de la mayoría de los otros tipos de
cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas de analito; su
función es solo transportar la muestra a lo largo de la columna. El analito queda
distribuido entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la
superficie de un sólido inerte.(Skoog et al., 2017)
6.1.1.1. Principios de la cromatografía de gases
1.1.1.1. Volumen de retención
Para tener en cuenta los efectos de la presión y temperatura en GC, resulta más
apropiado considerar los volúmenes de retención en lugar de los tiempos de
retención. La relación entre los dos es:
R RV t F (1)
M MV t F (2)
Donde F es el caudal promedio dentro de la columna, V y t son los volúmenes de
retención y tiempos de retención, respectivamente, y los subíndices R y M se
refieren a las especies retenidas y no retenidas. El caudal promedio se determina
como:
43
2( )H OC
m
P PTF F
T P
(3)
Donde CT es la temperatura de la columna en kelvin, T es la temperatura en el
medidor, mF es el caudal medido, P es la presión del gas a la salida de la columna,
y 2H OP es la presión de vapor del agua. Los volumenes de retención netos y ,
correspondientes a los volumenes asociados con la presión promedio de la
columna, se obtienen a partir de las siguientes ecuaciones:
0
R RV jt F ; 0
M MV jt F (4)
2
3
3[( / ) 1]
2[( / ) 1]
i
i
P Pj
P P
(5)
Donde j es el factor de corrección de caída de la presión, iP y P son las presiones
de entrada y de salida (atmosférica), respectivamente. El volumen de retención
específico ( gV ), se calcula entonces como:
( ) 273R Mg
C
jF t tV
W T
(6)
Donde W es la masa de la fase estacionaria. El volumen de retención específico
también puede relacionarse con el coeficiente de distribución del soluto K
mediante la expresión:
44
273g
S C
KV
T
(7)
S
M
cK
c
(8)
Siendo Sc y Mc las concentraciones molares de soluto en la fase estacionaria y fase
móvil respectivamente. (Skoog et al., 2017)
1.1.1.2. Cromatogramas
Al final de una columna cromatográfica se ubica un detector que responde a la
concentración del soluto a través de una señal. Si se registra tal señal en función del
tiempo se obtienen una serie de picos dando lugar a un gráfico conocido como
cromatograma (figura 8).
Figura 8. Esquema representativo de un cromatograma durante diferentes fases
del análisis. Tomado del libro de Skoog, Holler y Nieman. (Skoog et al., 2017)
La posición de los picos en el eje del tiempo se utiliza para identificar los
componentes de la muestra; y las áreas bajo los picos ayudan a cuantificar cada
45
componente, teniendo en cuenta también los cromatogramas de patrones de
concentración conocida del analito. (Skoog et al., 2017)
1.1.2. Cromatógrafos de gases
Los componentes elementales de un equipo para cromatografía de gases se
muestran en la figura 9. En este esquema, se observa que el caudal de gas se
fracciona antes de ingresar en la columna. Este formato de disposición se emplea
cuando el detector mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la
presencia del analito. Sin embargo, usualmente no se utilizan divisores de caudal
con otros tipos de detectores. (Skoog et al., 2017)
Figura 9. Esquema representativo de un cromatógrafo de gases. Tomado del
46
libro de Skoog, Holler y Nieman. (Skoog et al., 2017)
Figura 10. Cromatógrafo de gases Perkin Elmer Clarus 680 con detector MS
(espectrómetro de masas). Tomado de
https://www.directindustry.es/prod/perkinelmer/product-14711-438334.html
1.1.2.1. Gas portador
El sistema de gas portador contiene un gas químicamente inerte (helio, nitrógeno o
hidrógeno) que arrastra la muestra a lo largo de la columna, medidores de caudal y
de presión, además de un tamiz molecular que ayuda a eliminar el agua y demás
impurezas. El gas portador es elegido dependiendo del sistema de detección.
(Skoog et al., 2017)
47
1.1.2.2. Sistema de inyección
La inyección de la muestra (líquida o gaseosa) se realiza mediante una microjeringa
a través de un diafragma de silicona en una cámara de vaporización instantánea
ubicada en la cabeza de la columna. Columnas analíticas ordinarias requieren
cantidades de muestra que van desde pocas décimas de microlitro hasta 20 μL,
mientras que columnas capilares las muestras son mucho menores (aprox. 10-3 μL).
1.1.2.3. Configuración de la columna
Rutinariamente, las columnas rellenas han sido las más utilizadas en CG, sin
embargo, el uso de columnas abiertas cobra cada vez más importancia. La longitud
de las columnas varía desde menos de 2 m hasta los 50 m de longitud, incluso mas.
Son construidas a base de acero inoxidable, vidrio, teflón o sílice fundida. Siendo la
temperatura una variable preponderante en CG, la columna normalmente es
introducida en horno termoregulador cuya temperatura se fija dependiendo del
punto de ebullición de la muestra y del grado de separación deseado.
Normalmente, la temperatura óptima de separación se establece igual o
ligeramente mayor a la temperatura de ebullición. Sin embargo, se ha demostrado
que los cromatogramas mejoran sustancialmente con programación de
temperatura en comparación con las separaciones isotérmicas. (Skoog et al., 2017)
48
1.1.3. Sistemas de detección
La degradación de hidrocarburos de petróleo en suelos biotratados generalmente
se controla con el tiempo mediante la recolección de una muestra de suelo mixta
que se analiza mediante GC con detectores de ionización de llama (FID) y / o GC
con detector espectrómetro de masas (MS) (Adeniji et al., 2017b). Con GC/FID solo
se puede obtener información limitada de degradación: hidrocarburos totales de
petróleo (TPH), fracciones de punto de ebullición de TPH y pocos hidrocarburos
individuales como n-alcanos. Esta limitación puede superarse parcialmente
mediante el acoplamiento del espectrómetro de masas (MS) al GC. (Skoog et al.,
2017)
1.1.3.1. Detector de ionización de llama
El detector de ionización de llama (FID) es el más ampliamente utilizado en las
separaciones cromatográficas de fase gaseosa. En este, el efluente de la columna es
mezclado con hidrógeno y aire para luego ser encendidos eléctricamente. Al ser
pirolizados a la temperatura de combustión de hidrógeno/aire, la mayoría de
compuestos orgánicos forman iones y desprenden electrones que pueden conducir
la electricidad a través de la llama. Al aplicar un voltaje entre el extremo del
quemador y el electrodo colector (ubicado por encima de la llama), la corriente que
resulta pasa por un amplificador operacional de alta impedancia para la medida
respectiva. Ya que el número de iones producidos es relativamente proporcional al
número de átomos de carbono reducidos en la llama, el FID responde al número de
carbonos que entran en él por unidad de tiempo, siendo así un sistema de detección
49
sensible a la masa más que a la concentración. La insensibilidad del FID al agua lo
convierte en un sistema particularmente útil para el análisis de contaminantes en
aguas naturales. Además, la alta sensibilidad de FID, su amplio intervalo de
respuesta lineal y bajo ruido lo convierten en el detector más utilizado para el
análisis de la mayoría de compuestos orgánicos, con la única desventaja de que
destruye la muestra. (Nielsen, 2010)
1.1.3.2. Cromatografía de gases/espectrómetro de masas
La espectrometría de masas (MS) funciona colocando una carga en una molécula,
convirtiéndola en un ion en un proceso llamado ionización. Los iones generados se
resuelven de acuerdo con su relación masa-carga (m/z) sometiéndolos a campos
electrostáticos (analizador de masas) y finalmente se detectan. Se puede incluir una
etapa adicional de fragmentación iónica antes de la detección para obtener
información estructural en una técnica conocida como MS en tándem. El resultado
de la generación de iones, la separación, la fragmentación y la detección se
manifiesta como un espectro de masas que puede interpretarse para generar
información estructural o de peso molecular. La singularidad de este proceso
permite que el método se utilice tanto para la detección como para la identificación
de un compuesto desconocido. (Skoog et al., 2017)
Debido a los recientes avances en diseño de instrumentos, electrónica y
computadoras, la MS se ha convertido en rutina en muchos laboratorios analíticos.
Probablemente, la aplicación más común es la interfaz del espectrómetro de masas
(MS) con la cromatografía de gases en la que MS se usa para confirmar la
50
identidad de los compuestos a medida que eluyen de la columna GC. El uso de la
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con la MS también se ha vuelto
más rutinario debido a los avances realizados en las interfaces de interconexión.
La MS realiza tres funciones básicas. Debe haber una manera de ionizar las
moléculas, lo que ocurre en la fuente de iones mediante una variedad de técnicas
como el impacto de electrones, la desorción láser asistida por matriz o la ionización
a presión atmosférica. El ion molecular cargado y sus fragmentos deben separarse
de acuerdo con su m/z, y esto ocurre en la sección del analizador de masas (por
ejemplo, cuadrupolos, trampas de iones, transformada de Fourier). Finalmente, los
fragmentos cargados y separados deben ser monitoreados por un detector. El
diagrama de bloques en la figura 11 representa los diversos componentes de un
equipo de MS. (Nielsen, 2010)
Figura 11. Diagrama de bloques de los componentes principales de un
espectrómetro de masas. Adaptado del libro de Nielsen. (Nielsen, 2010)
Es común el acople de equipos de cromatografía de gases con distintos tipos de
espectrómetros de masas de barrido rápido. El caudal de las columnas capilares
suele ser lo suficientemente bajo como para que la salida de la columna pueda
introducirse directamente en la cámara de ionización de un espectrómetro de
masas (ver figura 12). En el caso de columnas rellenas y megacapilares, se utiliza
51
un separador de chorro para eliminar la mayor cantidad de gas portador que
acompaña al analito.
Figura 12. Esquema representativo de un cromatógrafo de gases acoplado a
espectrómetro de masas. Tomado del libro de Skoog, Holler y Nieman. (Skoog
et al., 2017)
Equipos de espectrometría de masas con transformada de Fourier también han
sido acoplados a cromatógrafos de gases, su alta sensibilidad y rapidez son
particularmente ventajosos para este tipo de aplicaciones.
1.1.4. Cromatografía de gases multidimensional
Incluso cuando se usa MS como sistema de detección, la alta complejidad de la
composición del crudo impide una identificación totalmente confiable. Además, el
análisis cuantitativo puede ser especialmente difícil con GC/MS. Para resolver el
problema, se necesita una cromatografía de gases multidimensional. Por ejemplo,
52
Penet y col. (Penet et al., 2006) aplicaron GC bi-dimensional para determinar las
capacidades de biodegradación del gasóleo por tres tipos de microorganismos.
El análisis multidimensional en cromatografía se puede considerar como cualquier
técnica que combine dos o más pasos distintos de separación/análisis, donde al
menos uno de los pasos o dimensiones implica una separación cromatográfica. Por
lo tanto, LC (cromatografía líquida)-GC, GC-GC y GC-detección espectroscópica
son métodos multidimensionales típicos. (P. Marriott & Shellie, 2002). En efecto,
una forma de mejorar el poder de separación de un sistema GC de manera efectiva
es acoplar, a través de una interfaz, dos columnas independientes (MDGC). La
superioridad de tal GC bidimensional (2D) sobre 1D-GC ya ha sido demostrada
(Tranchida et al., 2016) En la gran mayoría de los casos, las aplicaciones son del
tipo heart-cutting: solo una o algunas fracciones estrechas del eluato de la primera
columna se transportan a la segunda columna para una separación adicional. En
otras palabras, la técnica se puede recomendar, y es muy exitosa, si se requiere
información sobre solo unas pocas fracciones que contienen a todos los analitos de
interés, generalmente una situación de análisis objetivo (Tranchida et al., 2016).
Sin embargo, cada vez que el objetivo principal es el análisis de una muestra
completa (es decir, cuando las especies desconocidas juegan un papel importante),
el MDGC se convierte en una técnica extremadamente laboriosa, consumiendo
además mucho tiempo, con un fraccionamiento que requiere mucho cuidado, un
largo análisis de todas las fracciones y la reconstrucción de los cromatogramas. Es
claro que no se puede encontrar una salida al aumentar el ancho de las fracciones
de la primera columna: el uso de fracciones más anchas simplemente desmejora la
resolución de la primera columna (Tranchida et al., 2016). Una alternativa más
53
razonable ha sido someter la muestra a una separación integral 2D-GC (GC×GC):
en lugar de separarse en unas pocas fracciones, la muestra completa ahora se
separa en dos columnas diferentes, las fracciones se mantienen estrechas para
garantizar información obtenida durante la primera separación no se pierda y,
ciertamente en GC, en oposición a la cromatografía líquida (LC), la configuración
instrumental se construye para garantizar que la separación 2D total se complete
dentro del tiempo de ejecución del análisis de primera dimensión. En otras
palabras, en comparación con MDGC, GC×GC promete producir una resolución
sustancialmente mejorada para todos los componentes de la muestra sin pérdida
de tiempo. Por lo general, se utilizan dos separaciones GC basadas en mecanismos
de separación claramente diferentes, con una interfaz entre ellas llamada
modulador (Tranchida et al., 2016). Sus funciones principales son cortar y
reenfocar las fracciones adyacentes estrechas del eluato de la primera columna, y
después del enfoque, liberarlas rápidamente en la segunda columna. Mientras se
completa este proceso, continúa la separación de primera dimensión. En principio,
la separación de la segunda dimensión debe finalizar antes de la liberación-
inyección de la siguiente fracción. (P. J. Marriott et al., 2004) Este es el objetivo
principal de todos los trabajos GC×GC.
1.2. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA
Originalmente, HPLC era el acrónimo de cromatografía líquida de alta presión,
debido a las altas presiones operativas generadas por las primeras columnas. Sin
embargo, a fines de la década de 1970, la cromatografía líquida de alta eficacia se
54
había convertido en el término preferido, enfatizando las separaciones efectivas
que se lograron. De hecho, las columnas y los materiales de empaque más nuevos
ofrecen un alto rendimiento a presión moderada (aunque sigue siendo alta la
presión en relación con la cromatografía líquida de flujo por gravedad). La HPLC se
puede aplicar al análisis de cualquier compuesto que sea soluble en un líquido que
pueda ser usado como fase móvil. Aunque con mayor frecuencia se emplea como
técnica analítica, HPLC también se puede usar en un modo preparativo. La HPLC
ofrece muchas ventajas sobre la tradicional cromatografía líquida en columna de
baja presión, entre ellas: (Reuhs & Rounds, 2010)
a) Velocidad (se pueden realizar muchos análisis en 30 minutos o menos)
b) Una amplia variedad de fases estacionarias
c) Resolución mejorada
d) Mayor sensibilidad (se pueden emplear varios detectores)
e) Fácil recuperación de muestra
1.2.1. Principios generales de la cromatografía en fase líquida
Los principios fisicoquímicos básicos que subyacen a todas las separaciones
cromatográficas líquidas son: adsorción, partición, intercambio iónico, exclusión
por tamaño y afinidad. Aunque es más conveniente describir cada uno de estos
fenómenos por separado, debe enfatizarse que más de un mecanismo puede estar
involucrado en un fraccionamiento dado. Por ejemplo, muchos casos de
cromatografía de partición también implican adsorción. A continuación se
presenta una breve descripción de cada uno de estos mecanismos. (Nielsen, 2010)
55
1.2.1.1. Adsorción
La fase estacionaria (adsorbente) se elige para permitir la interacción diferencial
con los componentes de la muestra a resolver. Las fuerzas intermoleculares que se
consideran las principales responsables de la adsorción cromatográfica incluyen las
siguientes: fuerzas de Van der Waals, fuerzas electrostáticas, enlaces de hidrógeno,
e interacciones hidrofóbicas. Un modelo propuesto para explicar el mecanismo de
la cromatografía líquido-sólido es que las moléculas de soluto y solvente compiten
por sitios activos en el adsorbente. Por lo tanto, a medida que aumenta la adsorción
relativa de la fase móvil, la adsorción del soluto debe disminuir. Los solventes se
pueden clasificar en orden de su fuerza de adsorción en un adsorbente particular.
(Masucci JA,2016)
1.2.1.2. Partición
Al utilizar una columna de material de soporte inerte finamente dividido junto con
una fase líquida (fase estacionaria) inmóvil, y empleando un segundo líquido
inmiscible (fase móvil) para fluir sobre la fase estacionaria, ocurre un reparto del
soluto (analito) entre las fases líquidas presentes. Los solutos se dividen entre las
dos fases líquidas de acuerdo con sus coeficientes de reparto. Un sistema de
partición se manipula cambiando la naturaleza de las dos fases líquidas,
generalmente mediante la combinación de solventes o el ajuste de pH de los
tampones. A menudo, el más polar de los dos líquidos se mantiene estacionario
sobre el soporte inerte y el disolvente menos polar se usa para eluir los
56
componentes de la muestra (cromatografía en fase normal). La reversión de esta
disposición, utilizando una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar, se
conoce como cromatografía de fase inversa. (Masucci JA,2016)
1.2.1.3. Intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico puede considerarse como un tipo de
cromatografía de adsorción en la que las interacciones entre el soluto y la fase
estacionaria son principalmente de naturaleza electrostática. La fase estacionaria
(intercambiador de iones) contiene grupos funcionales fijos que tienen carga
negativa o positiva. Los contraiones intercambiables preservan la neutralidad de la
carga. El grupo funcional de la fase estacionaria determina si se intercambian
cationes o aniones. Los intercambiadores de cationes contienen grupos funcionales
cargados negativamente unidos covalentemente, mientras que los
intercambiadores de aniones contienen grupos unidos cargados positivamente. La
naturaleza química de estos residuos ácidos o básicos determina cómo se ve
afectada la ionización en fase estacionaria por el pH de la fase móvil.
Las separaciones cromatográficas por intercambio iónico se basan en diferencias
en la afinidad de los intercambiadores por los iones (o especies cargadas) a separar.
Los factores que gobiernan la selectividad de un intercambiador para un ion
particular incluyen la valencia iónica, el radio y la concentración del ion; la
naturaleza del intercambiador (incluido su contraión desplazable); y la
composición y el pH de la fase móvil. Para ser útil como intercambiador de iones,
un material debe ser de naturaleza iónica y altamente permeable. (Almeida, 2013)
57
1.2.1.4. Exclusión por tamaño
Idealmente, en los sistemas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) las
moléculas se separan únicamente en función de su tamaño, no se produce
interacción entre solutos y la fase estacionaria. En el caso de que ocurran
interacciones soluto/soporte, el modo de separación se denomina SEC no ideal. La
fase estacionaria en SEC consiste en un material de relleno de columna que
contiene poros de tamaño comparable a las moléculas a fraccionar. Los solutos
demasiado grandes para entrar en los poros viajan con la fase móvil en el espacio
intersticial (entre partículas) fuera de los poros. Por lo tanto, las moléculas más
grandes se eluyen primero de una columna SEC. A medida que las dimensiones del
soluto disminuyen, acercándose a las de los poros de empaquetamiento, las
moléculas comienzan a difundirse en las partículas de empaquetamiento y, en
consecuencia, se desplazan más lentamente. (Masucci JA,2016)
1.2.1.5. Afinidad
La cromatografía de afinidad es la única en que la separación se basa en la
interacción reversible específica entre una molécula de soluto y un ligando
inmovilizado en la fase estacionaria cromatográfica. La cromatografía de afinidad
generalmente involucra materiales biológicos inmovilizados como la fase
estacionaria. Estos ligandos pueden ser anticuerpos, inhibidores enzimáticos,
lectinas u otras moléculas que se unen selectiva y reversiblemente a moléculas de
analito complementarias en la muestra. Aunque tanto los ligandos como las
58
especies a aislar son generalmente macromoléculas biológicas, el término
cromatografía de afinidad también abarca otros sistemas, como la separación de
pequeñas moléculas que contienen grupos cis-diol a través de restos de ácido
fenilborónico en la fase estacionaria. (Masucci JA,2016).
Un ligando, elegido en función de su especificidad y fuerza de interacción con la
molécula a aislar (analito), se inmoviliza en un material de soporte adecuado. A
medida que la muestra pasa a través de esta columna, las moléculas que son
complementarias al ligando unido se adsorben mientras que otros componentes de
la muestra se eluyen. El analito unido se eluye posteriormente mediante un cambio
en la composición de la fase móvil. Después del reequilibrio con la fase móvil
inicial, la fase estacionaria está lista para ser utilizada nuevamente. (Nielsen, 2010)
1.2.2. Fase estacionaria y fase móvil
En la HPLC de fase normal, la fase estacionaria es un adsorbente polar, como sílice
u otros materiales basados en sílice con grupos funcionales no iónicos (hidroxilo,
nitro, ciano (nitrilo) o amino). Estas fases son moderadamente polares y la
superficie es más uniforme, lo que da como resultado mejores formas de pico. Por
otro lado, la fase móvil consiste en un solvente no polar, como el hexano, al cual se
le agrega un modificador más polar, como el cloruro de metileno, para controlar la
fuerza y la selectividad del solvente. La fuerza del disolvente se refiere a la forma en
que un disolvente afecta la velocidad de migración de la muestra. Los solventes
débiles aumentan la retención y los solventes fuertes disminuyen la retención.
(Reuhs & Rounds, 2010)
59
Sin embargo, más del 70 % de todas las separaciones por HPLC se llevan a cabo en
el modo de fase inversa, que utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil
polar. Las fases unidas a octadecilsililo (ODS), con una cadena octadecilo (C18)
[-(CH2)17CH3], son los materiales de empaquetamiento de fase inversa más
populares, aunque los hidrocarburos de cadena más corta [por ejemplo, octilo (C8)
o butilo (C4)] o grupos fenilo también se utilizan. Muchas columnas de fase inversa
basadas en sílice están disponibles comercialmente. Las diferencias en su
comportamiento cromatográfico resultan de la variación en el tipo de grupo
orgánico unido a la matriz de sílice o la longitud de la cadena de la estructura
orgánica. La HPLC de fase inversa utiliza fases móviles polares, generalmente agua
mezclada con metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. Los solutos se retienen
debido a las interacciones hidrofóbicas con la fase estacionaria no polar y se eluyen
en orden de hidrofobicidad creciente (polaridad decreciente). El aumento del
componente polar (acuoso) de la fase móvil aumenta la retención de solutos,
mientras que el aumento del contenido de solvente orgánico de la fase móvil
disminuye la retención. Varios aditivos pueden cumplir funciones adicionales. Por
ejemplo, aunque los compuestos iónicos a menudo se pueden resolver sin ellos, los
reactivos de pares de iones se pueden usar para facilitar la cromatografía de
especies iónicas en columnas de fase inversa. Estos reactivos son tensioactivos
iónicos, como el ácido octanosulfónico, que puede neutralizar los solutos cargados
y hacerlos más lipofílicos. Este tipo de cromatografía se conoce como fase inversa
de par iónico. (Reuhs & Rounds, 2010)
60
1.2.3. Componentes de un sistema HPLC
Los principales componentes de un sistema HPLC son la bomba, el inyector, la
columna, el detector y el procesador de datos.
La bomba entrega fase móvil a través del sistema. Un inyector permite colocar la
muestra en la fase móvil que fluye para introducirla en la columna. La columna de
HPLC consta de acero inoxidable o hardware de polímero lleno de un material de
embalaje de separación. Se pueden usar varias columnas auxiliares,
particularmente columnas de protección, antes de la columna analítica. Los
detectores utilizados en HPLC incluyen absorción UV-Vis, fluorescencia, índice de
refracción (RI), electroquímica y dispersión de luz, así como sistemas analíticos
acoplados, como un espectrómetro de masas. La sensibilidad o especificidad de
detección a veces se puede mejorar mediante la derivatización química del analito.
Los sistemas de estaciones de datos controlados por computadora ofrecen
capacidades de recopilación y procesamiento de datos, y pueden ejecutar el
instrumento cuando se necesita un sistema automatizado. (Reuhs & Rounds, 2010)
61
Figura 13. Esquema representativo de un equipo de HPLC. Tomado del libro de
Skoog, Holler y Nieman. (Skoog et al., 2017)
1.3. CUANTIFICACIÓN DE TPH’s POR CROMATOGRAFÍA
1.3.1. GC-FID
En el método GC-FID, las muestras tal como se reciben primero se refrigeran a 4°C
hasta la extracción y se secan químicamente (usando un agente de secado
adecuado, por ejemplo, sulfato de sodio anhidro) o físicamente en un horno a
105°C durante 24 h para eliminar Cualquier humedad residual. Los compuestos de
62
TPH en las muestras secas se extraen empleando disolventes de elución (p. Ej.,
Acetona, diclorometano, hexano o pentano) y diferentes formas de adsorbentes (p.
Ej., Gel de sílice, alúmina o Florisil [Fisher Scientific Ltd., Loughborough, Reino
Unido] ) se utilizan para la limpieza y fraccionamiento del extracto en alifáticos y
aromáticos (Wang & Fingas, 1995) antes de la inyección en una columna
cromatográfica. Los extractos de muestra se introducen en la columna capilar por
espacio de cabeza, purga y trampa (para compuestos volátiles en el intervalo de C6
a C25 o C36), o métodos de inyección directa (para las fracciones menos volátiles). A
medida que la temperatura de la columna aumenta gradualmente, los compuestos
de TPH se separan de acuerdo con sus puntos de ebullición a medida que migran
hacia el final de la columna hacia el detector de ionización de llama. En el detector,
el efluente de alta concentración que eluye la columna queda atrapado e ionizado al
quemarse en una llama de hidrógeno-aire u oxígeno, lo que hace que el gas en el
detector conduzca corriente eléctrica, y la conductividad se mide mediante un
electrodo colector ubicado por encima de la llama. (Okparanma & Mouazen, 2013)
Las respuestas del detector en un rango dado se integran para dar la concentración
total de hidrocarburos con referencia a estándares de hidrocarburos externos y / o
internos (Sherma, 1972; Weisman, 1998).
GC-FID se prefiere principalmente para aplicaciones de laboratorio porque
proporciona selectividad y sensibilidad relativas (Aparicio-Ruiz et al., 2018) y está
reconocido por la EPA, la British Standard Institution (BSI) e ISO. El método EPA
8015 (EPA, 1996b) se usa para determinar TPH, BS ISO 15009: 2002 (ISO/TC
190/SC 3, 2007a) es para hidrocarburos volátiles aromáticos y halogenados, y BS
ISO 16703: 2004 (ISO/TC 190/SC 3, 2007b) se usa para determinar el contenido
63
de hidrocarburos en el rango de C10 a C40 (n-alcanos) en sólidos, incluidos suelos y
desechos. GC-FID se utiliza para aplicaciones cuantitativas y cualitativas, incluido
el cribado de muestras ambientales (Saari et al., 2007; Snape et al., 2005; Vallejo
et al., 2001), elucidadndo el tipo y la identidad del aceite fresco a ligeramente
degradado en muestras ambientales para el reconocimiento de patrones de
hidrocarburos de petróleo (Risdon et al., 2008; Wang & Fingas, 2003) y
caracterizar y resolver el perfil de mezclas complejas no resueltas en sedimentos
contaminados con petróleo (Frysinger et al., 2003). La constante de velocidad de
biodegradación de los hidrocarburos de petróleo en un sitio contaminado es muy
variable y difícil de evaluar debido a las condiciones variables del sitio. Sin
embargo, GC-FID se ha utilizado para desarrollar un modelo de correlación simple
para estimar la constante de velocidad de degradación de bioventilación de la
gasolina en varios suelos sin tener que realizar experimentos largos y costosos
(Eyvazi & Zytner, 2009). Los límites de detección para GC-FID dependen del
método y la matriz de la muestra con valores típicos de 10 mg/kg en el suelo
(Weisman, 1998). Sin embargo, los altos costos analíticos y el tiempo operativo, los
problemas de calibración del instrumento los efectos de la matriz de muestra y el
impacto de las condiciones operativas del GC son algunos de los desafíos del
método (Aparicio-Ruiz et al., 2018). Aún así, GC-FID ha sido utilizado desde hace
tiempo para ayudar a cuantificar la taza de biodegradación de TPH, como se
evidencia en los trabajos de Yeung y colaboradores (P. Y. Yeung et al., 1997; P. Y. P.
Yeung et al., 1994).
64
1.3.1.1. Degradación microbiana de hidrocarburos de petróleo en
una corriente tropical contaminada
En este trabajo publicado en el 2021 por Adebusoye y colaboradores (Adebusoye
et al., 2007), Se implementó una estrategia de bioaumentación en dos pasos (TSBS)
mediante el uso de un consorcio bacteriano autóctono para mejorar la degradación
de los hidrocarburos totales de petróleo (TPH) de los lodos de refinería de petróleo
(PRS). El estudio GC-FID confirmó que el TPH presente en el PRS fue degradado
efectivamente por el consorcio bacteriano con TSBS.
1.3.1.2. Biodegradación del hidrocarburo total de petróleo por
bacterias heterótrofas aerobias aisladas de las aguas
salobres contaminadas con petróleo crudo de Bodo Creek
Bodo Creek se encuentra en el área del gobierno local de Gokana del estado de
Rivers y se caracteriza por el agua salobre que está muy contaminada con petróleo
crudo. Las muestras de agua recolectadas del arroyo fueron llevadas al Laboratorio
de Microbiología Ambiental de la Universidad de Portharcourt para el aislamiento
de bacterias heterotróficas aeróbicas. Este estudio, conducido por Ichor y otros
investigadores (Ichor et al., 2014), tuvo como propósito aislar e identificar
bacterias heterotróficas aeróbicas de aguas salobres del arroyo Bodo contaminado
con hidrocarburos y evaluar su potencial de biodegradación, para lo cual se utilizó
65
cromatografía gaseosa con detector de ionización por llama (GC-FID) para hacer el
monitoreo de las cantidades de TPH durante el proceso de bioremediación.
La degradación total de hidrocarburos de petróleo como se observó en este estudio
proporcionó evidencia de que el consorcio de bacterias aisladas del petróleo crudo
contaminado y el sitio no contaminado utilizado como control poseen una
capacidad inherente para la biodegradación del petróleo según se monitoreó
usando GC-FID. La reducción en TPH se observó más creciente para el tratamiento
y control durante los primeros siete días, lo que implica que los componentes
volátiles del petróleo crudo se habían evaporado.
1.3.2. GC-MS
A lo largo de los años, se han desarrollado un par de alternativas al FID para un
análisis más detallado de una gama más amplia de matrices de muestra debido a la
selectividad del FID para los hidrocarburos (Wang & Fingas, 1995). La más
utilizada es la técnica de detección de espectrometría de masas (MSD). El
espectrómetro de masas se ha descrito como un detector universal debido a su
versatilidad en la medición de hidrcarburos totales de petróleo (TPH) e
hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) para una amplia variedad de muestras
ambientales (Poster et al., 2006) y es recomendado por la EPA para la
determinación de TPH y PAH (EPA métodos 8270 y 625) (Kuppusamy et al., 2020;
Method 625.1: Base/Neutrals and Acids by GC/MS (2016), 2016, p. 1) selectivo de
MS para la mayoría de los análisis ambientales se debe a su especificidad y
capacidades de monitoreo discreto, particularmente cuando se opera en el modo de
66
iones selectivos (Poster et al., 2006). El análisis químico cuantitativo con GC-MS
basado en laboratorio es indudablemente exhaustivo y, como GC-FID, implica
protocolos de extracción largos y laboriosos y costosos análisis basados en GC, y no
es económico en la evaluación de la contaminación a gran escala que implica un
muestreo denso para el mapeo de zonas que requieren remediación (Peterson et al.,
2002).
1.3.2.1. Biodegradación de un petróleo crudo por tres consorcios
microbianos de diferentes orígenes y capacidades
metabólicas.
Entre los trabajos realizados a principios de la década pasada sobre éste ámbito,
cabe resaltar el trabajo de Viñas y colaboradores, (Vinas et al., 2002) quienes
estudiaron la biodegradación de petróleo crudo por tres comunidades microbianas
de diferentes orígenes y capacidades metabólicas sobre muestras de suelo
contaminado, utilizando diversos métodos de análisis para los analitos, incluyendo
GC-MS, gravimetría y HPLC. Entre las condiciones para el análisis GC-MS se
tuvieron la siguientes: La temperatura de la columna se mantuvo a 35°C durante 2
minutos y luego se programó a 310°C a 4°C / min. Esta temperatura final se
mantuvo durante 10 minutos. Las temperaturas del inyector, la línea de
transferencia y el analizador se establecieron en 280, 280 y 300°C,
respectivamente. La inyección se realizó en modo sin división manteniendo la
válvula dividida cerrada durante 30 s. Los datos se obtuvieron en el modo de
impacto de electrones (70 eV), rango de escaneo m/z 50-650 a 1 s por década de
67
masa. Se añadió naftaleno-d8 a los extractos de la muestra en diclorometano como
patrón interno.
Las áreas de pico de n-alcanos, pristano y fitano en el cromatograma de iones
totales para la fracción alifática (F1) se usaron para determinar la tasa de
biodegradación de estos compuestos mediante la comparación de cultivos y
controles. El análisis de la fracción aromática (F3) se realizó a través de GC-MS que
funcionó en modo de monitoreo de iones (SIM) seleccionado. Se diseñaron dos
ventanas (0–27.6 y 27.6–70 min) y los objetivos para el análisis fueron naftaleno,
fenantreno y sus derivados de alquilo C1 – C4; fluoreno, dibenzotiofeno y sus
derivados de alquilo C1-C3; y fluoranteno, pireno y criseno. Para determinar la
biodegradación de cada analito, se obtuvieron los cromatogramas iónicos
reconstruidos correspondientes y se compararon las áreas de los compuestos en
cultivos y en controles.
1.3.2.2. Efectos de la bioacumulación y bioestimulación
microbianas locales en la bioremediación de hidrocarburos
totales de petróleo (TPH) en suelos contaminados con
petróleo crudo en base a observaciones de laboratorio y de
campo.
Este estudio investigó factores que mejoran el rendimiento de la biorremediación
de hidrocarburos totales de petróleo (TPH) en suelo contaminado con petróleo
crudo en observaciones de laboratorio y de campo. El proceso de bioacumulación
utilizó consorcios microbianos locales combinados con los procesos de
68
bioestimulación de adición de nutrientes. (Suja et al., 2014b) En general, el análisis
cinético mostró que una combinación de bioestimulación y biacumulación en la
columna del suelo logró la tasa más rápida de degradación de crudo.
Para la cuantificación de los TPH’s, se adoptó un método modificado de USEPA
8015. Los análisis de TPH se realizaron utilizando un GC-MS (Perkin Elmer-Clarus
500) equipado con un detector de espectrómetro de masas y una columna capilar
de sílice fundida (30,0 m × 0,32 μm × 0,25 μm). El inyector se mantuvo a 320 ° C,
y la temperatura del horno se programó de la siguiente manera: una retención de
40 ° C durante 3 min, una aceleración de 10 °C/min a 320 ° C, y una retención a
320 ° C durante 9 min. Se usó nitrógeno como gas portador a un caudal de 1,00 ml
/ min. (Suja et al., 2014b)
1.3.3. GC multidimensional
La identificación de hidrocarburos recalcitrantes a la biodegradación es un
verdadero desafío para una evaluación detallada de las capacidades de degradación
de las microfloras. La cromatografía de gases (GC) se ha convertido en la
herramienta elegida para el análisis de hidrocarburos. Sin embargo, GC no logra
separar todos los hidrocarburos individuales de los cortes de petróleo como los del
diesel. (Penet et al., 2006) Para superar las limitaciones de la GC convencional, en
los últimos años se realizaron procedimientos analíticos que condujeron a una
cromatografía de gases bidimensional integral (GC×GC) (Mondello et al., 2002). La
técnica GC×GC se basa en el acoplamiento de dos columnas GC con diferentes
69
propiedades de selectividad. Un dispositivo, llamado modulador, toma muestras
del efluente de la primera columna y enfoca pequeñas porciones de solutos que se
liberan en una segunda columna para una separación adicional. (Frysinger et al.,
2003)
El enfoque GC×GC es verdaderamente completo, ya que no se pierde información
obtenida en la primera separación durante la segunda. Suponiendo que n1 y n2 son
las capacidades pico individuales de la primera y segunda columnas
respectivamente, la capacidad pico resultante del sistema GC×GC completo será
n1×n2. La eficiencia de resolución se logra seleccionando en la primera dimensión
una columna no polar, que proporciona una separación basada en la volatilidad de
los analitos (separación del punto de ebullición). Todos los analitos eluyen de la
primera columna a diferentes temperaturas, pero las propiedades de volatilidad
son muy similares en un tiempo de retención dado. La segunda separación
generalmente se realiza usando una columna polar y es lo suficientemente rápida
como para considerarse esencialmente isotérmica a cualquier temperatura de
elución de la columna de primera dimensión. La segunda separación está
completamente determinada por el coeficiente de actividad que puede estar
relacionado con la polaridad, la geometría molecular y el tamaño (Wei et al., 2018).
Como resultado, se descubrió que GC×GC es una técnica analítica poderosa para la
caracterización de hidrocarburos en matrices complejas desde una descomposición
de acuerdo con el número de átomos de carbono y la clase química (alcanos, mono,
di y tri-romáticos). Se logra fácilmente. Teniendo en cuenta el análisis de petróleo
crudo, GC×GC se aplicó con éxito a la caracterización de la llamada "mezcla
compleja no resuelta" (UCM) de sedimentos contaminados con petróleo, UCM que
70
describe la elevación del pico de referencia observado en los cromatogramas de
petróleo (Frysinger et al., 2003).
1.3.3.1. Caracterización de las capacidades de biodegradación de
microfloras ambientales para gasóleo mediante
cromatografía de gases bidimensional integral
En suelos contaminados, la eficiencia de la atenuación natural o la biorremediación
de ingeniería depende en gran medida de las capacidades de biodegradación de las
microfloras locales. En este estudio, las capacidades de biodegradación de varias
microfloras hacia el diesel se determinaron en condiciones de laboratorio. (Penet
et al., 2006) La recalcitración de los hidrocarburos en las pruebas se caracterizó
mediante cromatografía de gases (GC) y cromatografía de gases bidimensional
integral (GC×GC).
Las capacidades generales de degradación de las microfloras de suelo
contaminadas y no contaminadas se determinaron mediante pruebas de
degradación realizadas en sistemas cerrados. Para caracterizar la recalcitrancia de
los hidrocarburos, los compuestos residuales se identificaron y cuantificaron
mediante GC×GC con detección de ionización de llama (FID).
GC×GC se ha aplicado raramente para resolver problemas ambientales (Frysinger
et al., 2003). En este estudio, ésta técnica se utilizó para discriminar entre alcanos
y compuestos aromáticos en el UMC del gasóleo. Se demostró la capacidad de
71
GC×GC para resolver cientos o más de los hidrocarburos constituyentes de gasóleo.
Los hidrocarburos de C8 a C32 se resolvieron claramente en la primera dimensión,
mientras que los alcanos se separaron de los hidrocarburos mono, di y
triaromáticos en la segunda. Los resultados cuantitativos obtenidos coincidieron
con otros métodos clásicos menos discriminatorios. Se descubrió que GC×GC es
una herramienta notable para detallar la biodegradabilidad del gasóleo. (Penet
et al., 2006)
2. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
La espectroscopia se ocupa de la producción, medición e interpretación de
espectros derivados de la interacción de la radiación electromagnética con la
materia. Hay muchos métodos espectroscópicos diferentes disponibles para
resolver una amplia gama de problemas analíticos. Los métodos difieren con
respecto a las especies a analizar (como la espectroscopía molecular o atómica), el
tipo de interacción radiación-materia a monitorear (como la absorción, emisión o
difracción) y la región del espectro electromagnético utilizado en el análisis. Los
métodos espectroscópicos son muy informativos y se utilizan ampliamente tanto
para análisis cuantitativos como cualitativos.
La absorción de radiación por un átomo o molécula es el proceso en el cual la
energía de un fotón de radiación electromagnética se transfiere a la especie
absorbente. Cuando un átomo o molécula absorbe un fotón de luz, su energía
interna aumenta en una cantidad equivalente a la cantidad de energía de ese fotón
72
en particular. Por lo tanto, en el proceso de absorción, la especie pasa de un estado
de energía más bajo a un estado más excitado. En la mayoría de los casos, la
especie se encuentra en el estado fundamental antes de la absorción. Dado que el
proceso de absorción puede considerarse cuantitativo (es decir, toda la energía del
fotón se transfiere a la especie absorbente), el fotón que se absorbe debe tener un
contenido de energía que coincida exactamente con la diferencia de energía entre
los niveles de energía a través de los cuales ocurre la transición. Esto es
consecuencia de la cuantización de la energía a escala atómica y molecular. En
consecuencia, si se traza una gráfica de la energía de los fotones frente a la
absorbancia relativa de la radiación compuesta únicamente por fotones de esa
energía, se observa un espectro de absorción característico, cuya forma está
determinada por la capacidad de absorción relativa de los fotones de energía
diferente. La capacidad de absorción de un compuesto es una constante de
proporcionalidad dependiente de la longitud de onda que relaciona la
concentración de especies absorbentes con su absorbancia medida
experimentalmente en condiciones definidas. La variable independiente de un
espectro de absorción se expresa más comúnmente en términos de las propiedades
de onda (longitud de onda, frecuencia o números de onda) de la radiación.
(Nielsen, 2010)
La emisión es esencialmente lo inversa del proceso de absorción, ocurre cuando la
energía de un átomo o molécula se libera en forma de un fotón de radiación.
Típicamente, una molécula llevada a un estado excitado permanecerá en el estado
excitado durante un período de tiempo muy corto antes de relajarse de nuevo al
estado fundamental. Existen varios procesos de relajación a través de los cuales
73
una molécula excitada puede disipar energía. El proceso de relajación más común
es que la molécula excitada disipe su energía a través de una serie de pequeños
pasos provocados por colisiones con otras moléculas. La energía se convierte así en
energía cinética, siendo el resultado neto la disipación de la energía en forma de
calor. En condiciones normales, el calor disipado no es suficiente para afectar de
manera medible al sistema. En algunos casos, las moléculas excitadas por la
absorción de luz UV o Vis perderán una parte de su exceso de energía a través de la
emisión de un fotón. Este proceso de emisión se denomina fluorescencia o
fosforescencia, dependiendo de la naturaleza del estado excitado. (Nielsen, 2010)
El análisis espectroquímico, una rama de la espectroscopía, abarca una amplia
gama de técnicas utilizadas en laboratorios analíticos para el análisis cualitativo y
cuantitativo de la composición química de diversos tipos de muestras. Los métodos
de análisis espectroquímicos comunes incluyen espectroscopía de absorción UV
(ultravioleta), Vis (visible) e IR (espectroscopía infrarroja); espectroscopía de
fluorescencia molecular; y espectroscopía de RMN (Resonancia Magnética
Nuclear). En cada uno de estos métodos, el analista intenta medir la cantidad de
radiación absorbida o emitida por el analito. Todos estos métodos se basan en que
el contenido energético de la materia se cuantifica y que los fotones de radiación
pueden ser absorbidos o emitidos por la materia si la energía asociada con el fotón
es igual a la diferencia de energía para las transiciones permitidas de esa especie
dada. Los métodos anteriores difieren entre sí con respecto a las longitudes de
onda de radiación utilizadas en el análisis o la naturaleza molecular vs. atómica del
analito. No obstante, solamente los análisis tipo espectroscopia IR, espectroscopia
de fluorescencia y la espectroscopia Vis-NIR (visible-infrarrojo cercano), son de
74
interés en el presente trabajo, ya que han sido estos los reportados en trabajos de
cuantificación de la biodegradación de hidrocarburos de petróleo. (Nielsen, 2010)
2.1. BASES GENERALES DEL ANÁLISIS CUANTITATIVO
MEDIANTE ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN
El objetivo de la espectroscopía de absorción cuantitativa es determinar la
concentración de analito en una solución dada de alguna muestra. La
determinación se basa en la medición de la cantidad de luz absorbida a partir de un
haz de referencia a medida que pasa a través de la solución de muestra. La
presencia de analito en la solución afectará la cantidad de radiación transmitida a
través de la solución y, por lo tanto, la transmitancia o absorbancia relativa de la
solución puede usarse como un indicador de la concentración del analito. (Nielsen,
2010)
En la práctica, la solución a analizar se deposita en una celda de absorción y se
coloca en la trayectoria de radiación de una o varias longitudes de onda
seleccionadas. La cantidad de radiación que pasa a través de la muestra se mide en
relación a una muestra de referencia. La cantidad relativa de luz que pasa a través
de la muestra se usa para estimar la concentración del analito. El proceso de
absorción puede representarse como se observa en la figura 14. (Nielsen, 2010)
75
Figura 14. Absorción de radiación por una solución. Adaptado del libro de
Nielsen. (Nielsen, 2010)
La radiación incidente en la celda de absorción, 0P , tendrá una potencia radiante
significativamente mayor que la radiación que sale del lado opuesto de la celda, P .
La disminución de la potencia radiante a medida que el haz pasa a través de la
solución se debe a la captura (absorción) de fotones por las especies absorbentes.
La relación entre la potencia de los haces incidentes y los que salen, normalmente
se expresa en términos de transmitancia o de absorbancia de la solución. La
transmitancia (T) de una solución se define de acuerdo a la ecuación 9. La
transmitancia también puede expresarse en términos de porcentaje como se indica
en la ecuación 10.
0
PT
P
(9)
0
% 100P
TP
(10)
76
donde %T es el porcentaje de transmitancia. Sin embargo, T y %T no son
directamente proporcionales a la concentración del analito en la solución de
muestra. La relación no lineal entre transmitancia y concentración es un
inconveniente ya que los analistas generalmente están interesados en las
concentraciones de analitos. Un segundo término utilizado para describir la
relación entre P y 0P es la absorbancia (A), definida como se muestra en la
ecuación 11.
0logP
AP
(11)
En la práctica, la absorbancia suele calcularse mediante otras relaciones más útiles
como:
log 2 log %A T T (12)
La absorbancia es una expresión conveniente porque, en condiciones apropiadas,
es directamente proporcional a la concentración de las especies absorbentes en la
solución. De hecho, La relación entre la absorbancia de una solución y la
concentración de las especies absorbentes se conoce como la ley de Beer,
matemáticamente expresada como:
A c l (13)
77
donde es la capacidad de absorción molar (absortividad), c es la concentración y
l es la longitud de la celda que contiene a la muestra. No hay unidades asociadas
con la absorbancia, ya que es el cociente de las potencias de dos haces. El término
de concentración, c , suele expresarse en molaridad (M). La longitud de la celda, l ,
está en unidades de cm. La absortividad, , de una especie dada es una constante
de proporcionalidad que depende de las propiedades moleculares de la especie, de
la longitud de onda de análisis, y puede variar dependiendo del entorno químico
(pH, fuerza iónica, disolvente, etc.) en el que se encuentra la especie absorbente.
Las unidades de son (cm)-1 (M)-1.
En la práctica, se utiliza una celda de referencia para corregir el efecto del entorno
químico del analito sobre el proceso de absorción. Una celda de referencia es
aquella que, en teoría, coincide exactamente con la celda de absorción de muestra
con la excepción de que no contiene analito. Una celda de referencia a menudo se
prepara agregando agua destilada a una celda de absorción. Esta celda de
referencia se coloca luego en el camino del haz de luz, y la potencia de la radiación
que sale de la celda de referencia se mide y se toma como 0P para la celda de
muestra. Este procedimiento supone que todos los procesos, excepto la absorción
selectiva de radiación por parte del analito, son equivalentes para la muestra y las
celdas de referencia. Por lo tanto, la absorbancia realmente medida en el
laboratorio se aproxima a la ecuación:
0log logsolvente
solución
P PA
P P
(14)
78
Normalmente, el analista deberá elegir una longitud de onda adecuada para
realizar las mediciones de absorbancia. Si es posible, es mejor elegir la longitud de
onda a la que el analito demuestra la absorbancia máxima y donde la absorbancia
no cambia rápidamente con los cambios en la longitud de onda. Esta posición
generalmente corresponde al vértice del pico de absorción más alto. Tomar
medidas en este vértice tiene dos ventajas: (1) sensibilidad máxima, definida como
el cambio de absorbancia por unidad de cambio en la concentración de analito, y
(2) mayor adherencia a la ley de Beer ya que la región espectral que compone el haz
de radiación está compuesta de longitudes de onda con diferencias relativamente
pequeñas en sus absorciones molares para el analito que se está midiendo.
2.1.1. Curvas de calibración
En la mayoría de los casos, es aconsejable utilizar curvas de calibración para
mediciones cuantitativas. La curva de calibración se usa para establecer la relación
entre la concentración de analito y la absorbancia. Esta relación se establece
experimentalmente a través del análisis de una serie de muestras de concentración
de analito conocida. Las soluciones estándar se preparan con los mismos reactivos
y al mismo tiempo que las soluciones de concentración desconocidas. El rango de
concentración cubierto por las soluciones estándar debe incluir el esperado para la
muestra problema. Se espera obtener curvas de calibración lineales para aquellos
sistemas que obedecen la ley de Beer.
En muchos casos, los estándares de calibración verdaderamente representativos no
se pueden preparar debido a la complejidad de la muestra desconocida. Se debe
79
suponer este escenario cuando no hay suficiente información disponible sobre el
alcance de los compuestos que interfieren en la muestra. Los compuestos
interferentes incluyen aquellos que absorben radiación en la misma región
espectral que el analito, aquellos que influyen en la absorbancia del analito y
aquellos compuestos que reaccionan con reactivos modificadores que
supuestamente son específicos para el analito. Esto significa que las curvas de
calibración están potencialmente en error si la muestra y los estándares difieren
con respecto al pH, la fuerza iónica, la viscosidad, los tipos de impurezas y otros.
En estos casos, es aconsejable calibrar el sistema de ensayo utilizando un protocolo
de adición estándar. Uno de estos protocolos es el siguiente: a una serie de
matraces, se agrega un volumen constante de la muestra ( uV ), a la cual se está
tratando de determinar la concentración de analito ( uC ). A continuación, a cada
matraz individual se agrega un volumen conocido ( sV ) de una solución de analito
estándar de concentración conocida sC , de modo que cada matraz reciba un
volumen único de estándar. La serie resultante de matraces contendrá volúmenes
idénticos de la muestra y diferentes volúmenes de la solución estándar. A
continuación, se diluyen todos los matraces al mismo volumen total, tV . Cada uno
de los matraces se somete al análisis espectrofotométrico bajo las mismas
condiciones. Si el sistema bajo estudio obedece la ley de Beer, la absorbancia
medida de cada matraz será proporcional a la concentración total de analito como
se define en la ecuación:
80
s s u u
t
V C V CA k
V
(15)
siendo k una constante de proporcionalidad (longitud de la celda por
absortividad).
Los resultados de los ensayos se grafican luego con el volumen del estándar
agregado a cada matraz ( sV ) como la variable independiente y la absorbancia
resultante ( A ) como la variable dependiente. Suponiendo que se cumple la ley de
Beer, la gráfica lineal que describe la relación se ajustará a la ecuación 15, en la que
todos los términos que no sean V y A son constantes. Tomando la relación de la
pendiente de la ecuación de la línea trazada (ecuación 16) respecto a la ecuación
del intercepto (ecuación rr), y reorganizando se obtiene la ecuación 18, a partir de
la cual se puede calcular la concentración de analito en la muestra problema, uC , ya
que sC y uV se definen experimentalmente como constantes. (Nielsen, 2010)
s s u u
t
V C k V C kA
V
(15)
/s tPendiente C k V (16)
/u u tIntercepto V C k V (17)
su
u
Intercepto CC
Pendiente V
(18)
81
2.2. ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA, VISIBLE Y DE
FLUORESCENCIA
La absorción de UV y Vis y la espectroscopía de fluorescencia se utilizan
ampliamente en el análisis de diversos tipos de muestras. Estas técnicas pueden
usarse para mediciones cualitativas o cuantitativas. Las mediciones cualitativas se
basan en la premisa de que cada analito tiene un conjunto único de espacios de
energía que determinarán su espectro de absorción/emisión. Por lo tanto, los
ensayos cualitativos generalmente se basan en el análisis del espectro de absorción
o emisión del analito. En contraste, los ensayos cuantitativos con mayor frecuencia
se basan en la medición de la absorbancia o fluorescencia de la solución de analito
a una longitud de onda. Los ensayos de absorción cuantitativa se basan en la
premisa de que la absorbancia de la solución de prueba será función de la
concentración de analito de la solución. (Nielsen, 2010)
2.2.1. Espectroscopía UV-Vis: Principios
La espectroscopía en el rango ultravioleta-visible (UV-Vis) es una de las técnicas de
laboratorio más comúnmente empleadas para el análisis. La señal analítica en la
que se basa el ensayo es la emisión o absorción de radiación en el rango UV-Vis.
Esta señal puede ser inherente al analito, como la absorbancia de radiación en el
rango visible por pigmentos, o el resultado de una reacción química que involucra
al analito.
82
La radiación electromagnética en la porción UV-Vis del espectro va desde
longitudes de onda de aproximadamente 200 nm hasta 700 nm. El rango UV va de
200 a 350 nm y el rango Vis de 350 a 700 nm. El intervalo UV es incoloro para el
ojo humano, mientras que las diferentes longitudes de onda en el rango visible
tienen un color característico, que varía desde el violeta en el extremo del espectro
de longitud de onda corta hasta el rojo en el extremo del espectro de longitud de
onda larga. La espectroscopia que utiliza radiación en el rango UV-Vis puede
dividirse en dos categorías generales, espectroscopía de absorbancia y de
fluorescencia, según el tipo de interacción radiación-materia que se está
monitoreando. Cada uno de estos dos tipos de espectroscopía puede subdividirse
en técnicas cualitativas y cuantitativas. (Nielsen, 2010)
2.2.2. Espectroscopía UV-Vis: Instrumentación
Hay muchas variaciones de espectrofotómetros disponibles para la
espectrofotometría UV-Vis. Algunos instrumentos están diseñados para funcionar
solo en el espectro visible, mientras que otros abarcan tanto el rango UV como el
Vis. Los instrumentos pueden diferir con respecto al diseño, la calidad de los
componentes y la versatilidad. Un espectrofotómetro básico se compone de cinco
componentes esenciales: la fuente de luz, el monocromador, el soporte de
muestra/referencia, el detector de radiación y un dispositivo de lectura. Se requiere
una fuente de alimentación para el funcionamiento del instrumento. En la figura 15
se muestra un esquema que representa las interrelaciones de los componentes.
83
Figura 15. Disposición de componentes en un espectrofotómetro de absorción
UV-Vis simple de haz único. Adaptado del libro de Nielsen. (Nielsen, 2010)
2.2.2.1. Fuente de radiación
Las fuentes de luz utilizadas en los espectrofotómetros deben emitir continuamente
una fuerte banda de radiación que abarque todo el rango de longitud de onda para
el que está diseñado el instrumento. La potencia de la radiación emitida debe ser
suficiente para una respuesta adecuada del detector, y no debe variar bruscamente
con los cambios en la longitud de onda o la deriva significativamente en la escala de
tiempo experimental.
La fuente de radiación más común para los espectrofotómetros Vis es la lámpara de
filamento de tungsteno. Estas lámparas emiten radiación adecuada que cubre la
región de longitud de onda de 350 a 2500 nm. En consecuencia, las lámparas de
filamento de tungsteno también se emplean en la espectroscopía de infrarrojo
cercano. Las fuentes de radiación más comunes para mediciones en el rango UV
son las lámparas de descarga eléctrica de deuterio. Estas fuentes proporcionan un
84
espectro de radiación continuo de aproximadamente 160 nm a 375 nm. Estas
lámparas emplean ventanas de cuarzo y deben usarse junto con soportes de
muestra de cuarzo, ya que el vidrio absorbe significativamente la radiación por
debajo de 350 nm. (Nielsen, 2010)
2.2.2.2. Monocromador
El componente que funciona para aislar el grupo específico, estrecho y continuo de
longitudes de onda que se utilizará en el ensayo espectroscópico es el
monocromador. El monocromador se llama así porque la luz de una sola longitud
de onda se denomina monocromática. Teóricamente, la radiación policromática de
la fuente ingresa al monocromador y se dispersa de acuerdo con la longitud de
onda, y la radiación monocromática de una longitud de onda seleccionada sale del
monocromador. En la práctica, la luz que sale del monocromador no es de una sola
longitud de onda, sino que consiste en una banda estrecha y continua de longitudes
de onda. Un monocromador típico está compuesto por rendijas de entrada y salida,
espejo (s) cóncavo (s) y un elemento dispersante (la rejilla). La luz policromática
ingresa al monocromador a través de la ranura de entrada y luego es culminada por
un espejo cóncavo. La radiación policromática culminada luego se dispersa, siendo
la dispersión la separación física en el espacio de radiación de diferentes longitudes
de onda. La radiación de diferentes longitudes de onda se refleja desde un espejo
cóncavo que enfoca las diferentes longitudes de onda de luz secuencialmente a lo
largo del plano focal.
85
La radiación que se alinea con la ranura de salida en el plano focal se emite desde el
monocromador. La radiación que emana del monocromador consistirá en un rango
estrecho de longitudes de onda presumiblemente centradas alrededor de la
longitud de onda especificada en el control de selección de longitud de onda del
instrumento. (Nielsen, 2010)
2.2.2.3. Detector
En una medición espectroscópica, la luz transmitida a través de la celda de
referencia o muestra se cuantifica por medio de un detector. El detector está
diseñado para producir una señal eléctrica cuando es golpeado por fotones. Un
detector ideal daría una señal directamente proporcional a la potencia radiante del
haz que lo golpea; tendría una alta relación señal/ruido; y tendría una respuesta
relativamente constante a la luz de diferentes longitudes de onda, de modo que
fuera aplicable a una amplia gama del espectro de radiación. Hay varios tipos y
diseños de detectores de radiación actualmente en uso. Los detectores más
comunes son el fototubo, el tubo fotomultiplicador y los detectores de fotodiodos.
Todos estos detectores funcionan convirtiendo la energía asociada con los fotones
entrantes en corriente eléctrica. El fototubo consiste en un cátodo semicilíndrico
cubierto con una superficie fotoemisiva y un ánodo de alambre, los electrodos
alojados al vacío en un tubo transparente. Todos estos detectores funcionan
convirtiendo la energía asociada con los fotones entrantes en corriente eléctrica.
86
2.2.2.4. Dispositivo de lectura de datos
La señal del detector generalmente se amplifica y luego se muestra de forma
utilizable al analista. La forma final en la que se muestra la señal dependerá de la
complejidad del sistema. En el caso más simple, la señal analógica del detector se
muestra en un medidor analógico a través de la posición de una aguja en una cara
del medidor calibrada en porcentaje de transmisión o absorbancia. Las lecturas
analógicas son adecuadas para la mayoría de los propósitos analíticos de rutina; sin
embargo, los medidores analógicos son algo más difíciles de leer y, por lo tanto, se
espera que los datos resultantes tengan una precisión algo menor que la obtenida
en una lectura digital (suponiendo que la lectura digital se dé en suficientes
puntos). Las lecturas digitales expresan la señal como números en la pantalla de un
medidor. En estos casos, existe un requisito obvio para el procesamiento de la señal
entre la salida analógica del detector y la pantalla digital final. En prácticamente
todos los casos, el procesador de señal es capaz de presentar la lectura final en
términos de absorbancia o transmitancia. Muchos de los instrumentos más nuevos
incluyen microprocesadores capaces de manipulaciones de datos más extensas en
la señal digitalizada. Por ejemplo, las lecturas de algunos espectrofotómetros
pueden estar en unidades de concentración, siempre que el instrumento haya sido
calibrado correctamente con los estándares de referencia apropiados. (Nielsen,
2010)
87
2.2.3. Espectroscopía de fluorescencia
La técnica de espectroscopía de fluorescencia es generalmente de 1 a 3 órdenes de
magnitud más sensible que los métodos de espectroscopía de absorción. En la
espectroscopía de fluorescencia, la señal que se mide es la radiación
electromagnética que emite el analito a medida que se relaja de un nivel de energía
electrónica excitado a su estado fundamental correspondiente. El analito se activa
originalmente al nivel de energía más alto por la absorción de radiación en el rango
UV o Vis. Los procesos de activación y desactivación ocurren simultáneamente
durante una medición de fluorescencia. Para cada sistema molecular único, habrá
una longitud de onda de radiación óptima para la excitación de la muestra y otra,
de mayor longitud de onda, para controlar la emisión de fluorescencia. Las
respectivas longitudes de onda para la excitación y la emisión dependerán de la
química del sistema en estudio. (Skoog et al., 2017)
La instrumentación utilizada en la espectroscopía de fluorescencia está compuesta
esencialmente por los mismos componentes que la instrumentación
correspondiente utilizada en la espectroscopía de absorción UV-Vis. Sin embargo,
existen diferencias definitivas en la disposición de los sistemas ópticos utilizados
para los dos tipos de espectroscopía (ver figura 16).
88
Figura 16. Diagrama esquemático para un fluorómetro o espectrofluorómetro
representativo. Adaptado del libro de Nielsen. (Nielsen, 2010)
En fluorómetros y espectrofluorómetros, se necesitan dos selectores de longitud de
onda, uno para el haz de excitación y otro para el haz de emisión. En algunos
fluorómetros simples, ambos selectores de longitud de onda son filtros de manera
que las longitudes de onda de excitación y emisión son fijas. En
espectrofluorómetros más sofisticados, las longitudes de onda de excitación y
emisión se seleccionan mediante monocromadores de rejilla. El detector de fotones
de la instrumentación de fluorescencia generalmente está dispuesto de tal manera
89
que la radiación emitida que incide en el detector se desplaza en un ángulo de 90°
con respecto al eje del haz de excitación. Esta ubicación del detector minimiza la
interferencia de la señal debido a la radiación de la fuente transmitida y la
radiación dispersada desde la muestra. (Skoog et al., 2017)
El poder radiante del haz de fluorescencia ( FP ) emitido por una muestra
fluorescente es proporcional al cambio en el poder radiante del haz fuente a medida
que pasa a través de la celda de la muestra (ecuación 19). Expresando esto de otra
manera, la potencia radiante del haz de fluorescencia será proporcional al número
de fotones absorbidos por la muestra.
0( )FP P P (19)
donde es una constante de proporcionalidad, 0P y P siguen siendo las
potencias de los haces incidente y emitido desde la muestra.
La constante de proporcionalidad utilizada en la ecuación 19 se denomina
eficiencia cuántica ( ), que es específica para cualquier sistema dado. La eficiencia
cuántica es igual a la relación entre el número total de fotones emitidos y el número
total de fotones absorbidos. La combinación de la ecuación 11 y la ecuación 13
permite definir P en términos de la concentración de analito y 0P , como se indica
en la ecuación 20.
0 10 l cP P (20)
90
La sustitución de la ecuación 20 en la ecuación 19 da una expresión que relaciona la
potencia radiante del haz fluorescente con la concentración de analito y 0P , como
se muestra en la ecuación 21. A bajas concentraciones de analito, lc < 0.01, la
ecuación 21 puede reducirse a la expresión de la ecuación 22. Una mayor
agrupación de términos conduce a la expresión de la ecuación 23, donde k
incorpora todos los términos que no sean 0P y c .
0(1 10 )l c
FP P (21)
0 2.303FP P lc (22)
0FP kPc (23)
La ecuación 23 es particularmente útil porque enfatiza dos puntos importantes que
son válidos para las condiciones asumidas al derivar la ecuación, particularmente el
supuesto de que las concentraciones de analito se mantienen relativamente bajas.
Primero, la señal fluorescente será directamente proporcional a la concentración de
analito, suponiendo que otros parámetros se mantengan constantes. Esto es muy
útil porque una relación lineal entre la señal y la concentración de analito
simplifica el procesamiento de datos y la resolución de problemas del ensayo. En
segundo lugar, la sensibilidad de un ensayo fluorescente es proporcional a 0P , la
potencia del haz incidente, lo que implica que la sensibilidad de un ensayo
fluorescente puede modificarse ajustando la salida de la fuente. (Nielsen, 2010)
91
Las ecuaciones 22 y 23 eventualmente perderán sentido si las concentraciones de
analito se incrementan a valores relativamente altos. Por lo tanto, el rango de
concentración lineal para cada ensayo debe determinarse experimentalmente. La
porción no lineal de la curva a concentraciones de analito relativamente altas
resulta de disminuciones en el rendimiento de fluorescencia por unidad de
concentración. El rendimiento de fluorescencia para cualquier muestra dada
también depende de su entorno. La temperatura, el disolvente, las impurezas y el
pH pueden influir en este parámetro. En consecuencia, es imperativo que estos
parámetros ambientales se tengan en cuenta en el diseño experimental de los
ensayos de fluorescencia. Esto puede ser particularmente importante en la
preparación de estándares de referencia apropiados para el trabajo cuantitativo.
(Nielsen, 2010)
2.3. ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA
La espectroscopía infrarroja (IR) se refiere a la medición de la absorción de
diferentes frecuencias de radiación IR por sólidos, líquidos o gases. La radiación
infrarroja, o radiación IR es un tipo de radiación electromagnética, de mayor
longitud de onda que la luz visible, pero menor que la de las microondas.
Consecuentemente, tiene menor frecuencia que la luz visible y mayor que las
microondas. Su rango de longitudes de onda va desde unos 0,7 hasta los 1000
micrómetros. (Iskander, 2013) La luz infrarroja se clasifica, de acuerdo a su
longitud de onda, en infrarrojo cercano (de 800 nm a 2500 nm), infrarrojo medio
(de 2.5 µm a 50 µm) e infrarrojo lejano (de 50 µm a 1000 µm). (Iskander, 2013;
Skoog et al., 2017)
92
2.3.1. Principios de la espectroscopía IR
La radiación IR se puede medir en términos de su frecuencia, que es útil porque la
frecuencia está relacionada directamente con la energía de la radiación por la
relación siguiente: (Nielsen, 2010)
E h (24)
donde E es la energía del fotón, h es la constante de Planck (6.62607015×10-34
J s ) y es la frecuencia en Hertz ( 1s ). Las frecuencias se expresan comúnmente
como números de onda ( , en cm−1). Los números de onda se calculan de la
siguiente manera:
1
(25)
siendo la longitud de onda de la radiación expresada en cm.
Una molécula puede absorber la radiación IR si vibra de tal manera que su
distribución de carga y, por lo tanto, su momento dipolar eléctrico, cambie durante
la vibración. Aunque hay muchas vibraciones posibles en una molécula
poliatómica, las vibraciones más importantes que producen un cambio en el
momento dipolar son los movimientos de estiramiento y flexión (tijera, balanceo,
torsión, meneo). En la figura 17 se muestran ejemplos de estas vibraciones para la
molécula de agua. Los movimientos de estiramiento vibran a frecuencias más altas
93
que el movimiento de tijera. Además, los estiramientos asimétricos tienen más
probabilidades de provocar un cambio en el momento dipolar, con la absorción
correspondiente de radiación IR. (Nielsen, 2010)
Figura 17. Modos vibracionales de la molécula de agua. Tomado del libro de
Nielsen. (Nielsen, 2010)
Si una molécula tiene átomos terminales diferentes, entonces los dos modos de
estiramiento ya no son vibraciones simétricas y asimétricas de enlaces similares,
sino que tendrán proporciones variables del movimiento de estiramiento de cada
grupo (acoplamiento). Se observarán muchas vibraciones diferentes incluso para
moléculas bastante simples. La complejidad de un espectro infrarrojo surge del
acoplamiento de vibraciones sobre una gran parte o sobre la molécula completa
(vibraciones del esqueleto molecular). Es probable que las bandas asociadas con las
vibraciones del esqueleto molecular se ajusten a un patrón o huella digital de la
94
molécula como un todo, en lugar de un grupo específico dentro de la molécula.
(Stuart, 2000)
Una gráfica de la intensidad medida de la luz infrarroja versus una propiedad de la
luz se llama espectro infrarrojo. Un ejemplo de espectro infrarrojo se muestra en la
figura 18. Por convención, el eje x de un espectro infrarrojo se traza con un número
de onda alto a la izquierda y un número de onda bajo a la derecha. (Smith, 2011)
Figura 18. Espectro infrarrojo del poliestireno. Tomado del libro de Smith.
(Smith, 2011)
Los valores de absorbancia ( A ) representados en el eje Y del espectro son
determinados por el instrumento IR a partir de la relación:
0logI
AI
(26)
95
donde I es la intensidad de la luz con una longitud de onda específica tras haber
atravesado una muestra (intensidad de la luz transmitida), e 0I es la intensidad de
la luz antes de entrar a la muestra (intensidad de la luz incidente). (Smith, 2011)
2.3.2. Instrumentación
Se utilizan dos tipos de espectrómetros para la espectroscopia de IR medio:
instrumentos dispersivos e instrumentos de transformada de Fourier (FT). Casi
todos los instrumentos más nuevos son del tipo FT. En los instrumentos de
transformada de Fourier (FT), la radiación no se dispersa, sino que todas las
longitudes de onda llegan al detector simultáneamente y se utiliza un tratamiento
matemático, llamado FT, para convertir los resultados en un espectro IR típico. En
lugar de un monocromador, el instrumento utiliza un interferómetro. En un
interferómetro de Michelson, que es el diseño más utilizado, se divide un haz IR y
luego se recombina reflejando los haces divididos con espejos (figura 19). Si se
varía la longitud de la trayectoria de un haz moviendo su espejo, los dos haces
interferirán de manera constructiva o destructiva a medida que se combinan,
dependiendo de su diferencia de fase. Por lo tanto, la intensidad de la radiación que
llega al detector varía en función de la diferencia del camino óptico, y el patrón de
intensidad de energía obtenida en función de la diferencia del camino óptico se
denomina interferograma. Cuando se coloca una muestra en el haz recombinado
delante del detector, las moléculas de la muestra absorben a sus frecuencias
características y, por lo tanto, la radiación que llega al detector se modifica por la
96
presencia de la muestra. Este interferograma que muestra la intensidad frente a la
longitud del camino se convierte luego mediante transformación de Fourier en un
espectro IR que proporciona absorbancia frente a frecuencia. Una computadora
permite que la transformación matemática se complete rápidamente. Debido a que
todas las longitudes de onda se miden a la vez, los instrumentos FT pueden generar
espectros más rápidamente, con una relación señal/ruido mejorada, en
comparación con los instrumentos dispersivos. (Nielsen, 2010)
Figura 19. Interferómetro de Michelson. Adaptación del libro de Smith. (Smith,
2011)
2.3.3. Espectroscopía IR – cromatografía
El desarrollo de componentes modulares para espectrómetros ha ampliado el uso
de técnicas combinadas en espectroscopía. La espectroscopía infrarroja se puede
97
combinar con cada una de las técnicas cromatográficas posibles, siendo la
espectroscopía infrarroja por cromatografía de gases (GC-IR) la más utilizada. GC-
IR permite la identificación de los componentes que se eluyen desde un
cromatógrafo de gases. En GC, la muestra en una fase móvil gaseosa se pasa a
través de una columna que contiene una fase estacionaria líquida o sólida. La
retención de la muestra depende del grado de interacción con la fase estacionaria y
su volatilidad: cuanto mayor es la afinidad de la muestra por la fase estacionaria,
más se divide la muestra en esa fase y más tiempo tarda antes de pasar El
cromatógrafo. La muestra se introduce en la columna alojada en un horno
mediante inyección en un extremo y un detector monitorea el efluente en el otro
extremo. Un método común para acoplar un cromatógrafo de gases a un
espectrómetro FTIR es usar un tubo de luz: una celda de flujo calentada que
permite la exploración continua del efluente que emerge para la columna GC. La
naturaleza de esta técnica requiere que los interferogramas se recojan en intervalos
cortos de tiempo. Los datos se pueden mostrar en tiempo real y comúnmente se
monitorean como el espectro cambiante del efluente GC y la absorción infrarroja
cambiante en función del tiempo. (Stuart, 2000)
La cromatografía líquida (LC) también se puede usar junto con la espectroscopía
infrarroja. El efluente de un cromatógrafo de líquidos puede pasar a través de una
celda de flujo de líquido. La cromatografía de fluido supercrítico (SFC), donde el
CO2 supercrítico se usa comúnmente como una fase móvil, se usa con un
espectrómetro FTIR para mejorar los límites de detección. (Stuart, 2000)
98
2.3.4. Aplicaciones cualitativas
Las frecuencias centrales y las intensidades relativas de las bandas de absorción
pueden usarse para identificar grupos funcionales específicos presentes en una
sustancia desconocida, por ejemplo, con ayuda de la información dada en la tabla
2.
Tabla 2. Frecuencias de absorción de varios grupos funcionales orgánicos.
(Nielsen, 2010)
Grupo funcional Característica absorbente Frecuencia (cm-1)
Alcanos Estiramiento y flexión –CH
Flexión –CH2 y –CH3
3000-2800
1470-1420 y 1380-1340
Alquenos Estiramiento olefínico –CH 3100-3000
Alquinos Estiramiento acetilénico –CH 3300
Aromáticos Estiramiento aromático –CH
Estiramiento –C=C–
3100-3000
1600
Alcoholes Estiramiento –OH
Flexión –OH
Estiramiento C–O
3600-3200
1500-1300
1220-1000
Éteres Estiramiento asimétrico C–O 1220-1000
Aminas Estiramiento –NH 1° y 2° 3500-3300
Aldehídos y cetonas Estiramiento C=O 1735-1700
99
Doblete –CH 2850-2700
Ácidos carboxílicos Estiramiento C=O 1740-1720
Amidas Estiramiento C=O
Estiramiento –NH
Flexión –NH
1670-1640
3500-3100
1640-1550
También se puede identificar una sustancia al comparar su espectro IR medio con
un conjunto de espectros estándar y determinar la coincidencia más cercana.
(Nielsen, 2010)
2.3.5. Aplicaciones cuantitativas
La ley de Beer-Lambert demuestra que la absorbancia de una solución es
directamente proporcional al “espesor” de la muestra y a la concentración de un
analito: (Stuart, 2000)
A c l (13)
En esta relación, A es la absorbancia de la solución, es la capacidad de absorción
molar (absortividad), c es la concentración y l es la longitud de la celda que
contiene a la muestra. La ley de Beer-Lambert muestra que una gráfica de
absorbancia contra concentración debe ser lineal, pasar por el origen, y tener
pendiente l . Para analizar una solución de concentración desconocida, es
necesario preparar soluciones de concentración conocida, elegir una banda
100
adecuada, medir la absorbancia a este número de onda y trazar un gráfico (curva)
de calibración. La concentración del compuesto en solución puede leerse en el
gráfico de calibración, dado que se conoce su absorbancia. Las mediciones
cuantitativas deben realizarse en espectros de absorbancia, por lo que los espectros
de transmitancia deben convertirse en espectros de absorbancia. (Stuart, 2000)
Las mezclas sólidas simples también pueden analizarse cuantitativamente. Son
más susceptibles a errores debido a la dispersión de la radiación. Estos análisis
generalmente se llevan a cabo con discos de KBr. Se agrega una cantidad constante
conocida de un estándar interno a todas las muestras y estándares de calibración.
La curva de calibración se obtiene trazando la relación entre la absorbancia del
analito y la del patrón interno frente a la concentración del analito. La absorbancia
del estándar interno varía linealmente con el grosor de la muestra y, por lo tanto,
compensa este parámetro. Los discos deben hacerse exactamente en las mismas
condiciones para evitar cambios de intensidad o cambios en las posiciones de la
banda. Algunos estándares comunes utilizados incluyen carbonato de calcio, azida
de sodio, naftaleno y tiocianato de plomo. (Nielsen, 2010; Smith, 2011; Stuart,
2000)
La introducción de software que puede manejar el análisis de grandes cantidades
de datos ha llevado al uso generalizado del análisis estadístico y la expansión de la
espectroscopía infrarroja cuantitativa. Los ejemplos de los métodos estadísticos
más utilizados en la espectroscopía infrarroja son los mínimos cuadrados clásicos
(CLS), los mínimos cuadrados parciales (PLS) y la regresión de componentes
principales (PCR).
101
2.4. ESPECTROSCOPÍA VIS/NIR
La espectroscopía visible y de infrarrojo cercano (VIS/NIR) se refiere a
configuraciones experimentales donde la muestra se ilumina con radiación de la
región VIS/NIR registrando el espectro de luz VIS/NIR emitido por la muestra. En
espectroscopía VIS/NIR las longitudes de onda de trabajo oscilan entre 400 y 2500
nm. Esto cubre las regiones visibles (400–700 nm) e infrarrojo cercano (700–2500
nm). (Rehbein & Oehlenschlager, 2009)
Cuando la luz se hace pasar a través de la muestra, se trata de una transmisión o
una medición de transmitancia, y la cantidad de luz que ingresa a la unidad del
detector depende de las características de dispersión y absorción de la muestra, así
como del grosor de la muestra y las características de la lámpara. Cuando la unidad
de iluminación y detector se encuentra en el mismo lado de la muestra, la medición
se denomina reflexión o medición de reflectancia. En este caso, la cantidad de luz
que ingresa a la unidad del detector depende del patrón de iluminación y la
geometría, y la reflectividad de la muestra. En la espectroscopía VIS/NIR
tradicional, la medición de la muestra da como resultado un espectro en la región
visible y / o infrarroja cercana. Además de la información espectral, esta técnica
también proporciona información espacial de la muestra. En otras palabras, en
cada ubicación de la muestra se registra un espectro completo. (Rehbein &
Oehlenschlager, 2009)
102
2.5. CUANTIFICACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN DE TPH’s POR
ESPECTROSCOPÍA
2.5.1. Espectroscopia infrarroja
2.5.1.1. Biorremediación de suelos contaminados con combustibles
por inyección múltiple secuencial de microorganismos
nativos: procesos a escala de campo en Polonia
Łebkowska y colaboradores (Lebkowska et al., 2011) llevaron a cabo una
investigación para estimar el impacto de la bioacumulación múltiple en el
tratamiento de suelos contaminados por combustibles: petróleo diesel y
combustible para aviones. Las bacterias utilizadas para inocular las parcelas de
remediación se aislaron del suelo contaminado y proliferaron en condiciones de
campo.
El contenido total de hidrocarburos de petróleo (TPH) se determinó mediante
espectroscopía IR. Una muestra de suelo (15-20 g) se secó con Na2SO4 anhidro y se
extrajo (6 h) con CCl4 en un aparato Soxhlet. Después de secar con Na2SO4, el
extracto se concentró a 2-3 ml por evaporación en un aparato Kuderna-Danish,
luego se introdujo en una columna llena de Florisil (previamente acondicionado 2 h
a 250°C) de 8 mm de diámetro y 100 mm de altura del lecho. Los hidrocarburos se
eluyeron con 20 ml de CCl4. El contenido de hidrocarburos se midió con un
espectrómetro UR 20 a 2928 cm−1 (cubeta de 10 mm). Las soluciones de
103
calibración se prepararon por dilución de la solución estándar de n-hexadecano +
isooctano + benceno (37.5% + 37.5% + 25%) en CCl4.
El contenido total de sustancias extraídas por CCl4 (extracto de TES-CCl4) se midió
utilizando el mismo procedimiento (espectrometría IR) excepto por el
procedimiento de limpieza. El resultado se asumió como el contenido total de
hidrocarburos y productos de degradación de baja polaridad.
2.5.1.2. Inoculantes y biodegradación del petróleo crudo que flota
en los sedimentos de pantano
Neralla y Weaver, en el año 2010 investigaron la eficacia de diez productos
comerciales de biorremediación para mejorar la biodegradación del petróleo crudo
en el laboratorio a 10 o 30 ° C durante 90 días con y sin nitrógeno y fósforo
suplementarios.
Se analizaron dos réplicas de cada tratamiento a los 45 y 90 días para determinar el
contenido de hidrocarburos. El aceite y el agua sobre la superficie del suelo se
vaciaron en un vaso de precipitados que contenía diclorometano y se agitó
vigorosamente a mano hasta que el aceite se disolvió en el diclorometano y el agua
flotó en la parte superior. La capa de agua se eliminó por absorción en un papel de
filtro seco sumergido en la capa de agua. El aceite que se asoció con la superficie del
suelo durante el análisis se extrajo enjuagando la superficie del suelo dos veces con
20 ml de diclorometano y mezclándolo completamente en el suelo y decantando.
104
La superficie interna de la jarra también se enjuagó a fondo con diclorometano y
todos los extractos se combinaron y pasaron a través de un filtro dedal para
eliminar las partículas de tierra suspendidas; Se evaporaron 10 ml de la mezcla
final hasta sequedad a temperatura ambiente y se determinó gravimétricamente el
contenido de aceite y grasa. La eficiencia de extracción de aceite, determinada
mediante la adición de una cantidad conocida de aceite a un sistema similar y la
extracción del aceite, fue superior al 95%. Después del procedimiento de
extracción, las muestras de suelo de algunas réplicas del experimento se eligieron al
azar y se sometieron a extracción de soxhlet, pero no se extrajo aceite adicional del
suelo y el agua. El diclorometano en la mezcla se dejó evaporar y el aceite extraído
se disolvió en Freon-113 de grado reactivo.
La mezcla de aceite y freón se pasó luego a través de una columna de gel de sílice
construida en laboratorio (2 cm de diámetro y 2 cm de profundidad) llena con gel
de sílice de grado 200 de 922 mallas (previamente lavado con diclorometano) para
sorbir compuestos polares. Esto fue seguido por 3 ml de freón para asegurar la
elución de todo el TPH presente en la columna. La cantidad de TPH se cuantificó
por espectrofotometría infrarroja (U.S.EPA. 1979), y los resultados se compararon
con la curva de calibración estándar. La curva de calibración de siete puntos se
preparó usando concentraciones de TPH de 5, 50, 1oo, 200, 300, 400 y 500 ppm
en el aceite usado para los experimentos. Los tratamientos de control no
modificados con aceite fueron sometidos al mismo procedimiento de extracción y
comparados con los tratamientos modificados con aceite para evaluar los niveles de
fondo de hidrocarburos presentes en el suelo.(Almeida, 2013)
105
2.5.2. Espectroscopia VIS/NIR
2.5.2.1. Evaluación de una remediación de bioslurry de sedimentos
contaminados con hidrocarburos de petróleo mediante
análisis químicos, matemáticos y microscópicos
En general, la información cromatográfica proporciona una fuerte evidencia de que
las ubicaciones estudiadas sufren de insumos de petróleo. Pero, es aconsejable
apoyar esta evidencia con un método de análisis alternativo. Por lo cual se utiliza el
análisis espectral UV. Los espectros revelaron que todas las muestras tenían casi el
mismo perfil. Cada uno tenía una fuerte banda de absorción a aproximadamente
228 nm y la banda característica de HAP a aproximadamente 256 nm se detectó
muy bien. La presencia de la banda de 228 nm probablemente indica altas
concentraciones de alquilbencenos derivados de hidrocarburos algo más ligeros
originalmente presentes en los aceites crudos y / o debido a los productos de
fotooxidación y descomposición de compuestos aromáticos superiores. Los
hidrocarburos aromáticos policíclicos más grandes que los alquil-naftalenos
también tienen máximos de absorción fuertes en longitudes de onda superiores a
230 nm. En consecuencia, la absorción a las regiones de 230-270 nm para todos los
espectros estudiados probablemente indicó la presencia de tales compuestos
cancerígenos. Según Hwang y Foster, estos compuestos son más resistentes al
proceso de meteorización ambiental.
106
La relación del valor R (228/256 nm) es un parámetro bien conocido para los
estudios de contaminación por hidrocarburos, independiente de la concentración
de hidrocarburos y refleja relativamente el peso molecular de los componentes
aromáticos presentes en el hidrocarburo. Las relaciones registradas fueron: 3.08,
4.35 y 4.47 para S1, S2 y S3, respectivamente. Estos valores relativamente altos se
pueden tomar como una fuerte indicación de concentraciones más altas de
hidrocarburos aromáticos de bajo peso molecular (LPAH), que pueden ser los
productos de descomposición de los aromáticos de mayor peso molecular (HPAH).
(Weisman, 2010)
3. MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS
En diversos estudios sobre procesos de biodegradación de hidrocarburos totales de
petróleo se ha empleado el análisis gravimétrico (Okparanma & Mouazen, 2013)
para cuantificar los TPH’s posterior a la acción de los microorganismos.
3.1. PRINCIPIOS DEL ANÁLISIS GRAVIMÉTRICO
Básicamente, la gravimetría incluye todos los métodos analíticos en los que la señal
analítica es una medida de masa o un cambio de masa. La masa es la más
fundamental de todas las mediciones analíticas, y la gravimetría es sin duda la
técnica analítica cuantitativa más antigua. (Harvey, 2000) El análisis gravimétrico
se caracteriza por el hecho de que la medición del peso es la medición primaria,
107
generalmente la única medición realizada en la muestra, sus componentes o sus
productos de reacción. Por lo tanto, las mediciones de peso se utilizan en el cálculo
de los resultados y, a menudo, son las únicas mediciones utilizadas en este cálculo.
(Kenkel, 2013)
Generalmente, los métodos de análisis gravimétrico proceden con los siguientes
pasos: i) se obtiene el peso o el volumen de la muestra preparada, ii) el analito se
separa físicamente de la matriz de muestra o se altera químicamente y su derivado
se separa de la matriz de muestra, y iii) se obtiene el peso del analito separado o su
derivado. Los datos así obtenidos se utilizan para calcular los resultados deseados.
(Kenkel, 2013)
3.1.1. Métodos físicos de separación y cálculos
El método por el cual un analito se separa físicamente de la matriz varía según la
naturaleza de la muestra y la forma en que se encuentra el analito en relación con
su matriz. Por ejemplo, el analito o su matriz pueden ser suficientemente volátiles
para que uno u otro se pueda separar por evaporación a una temperatura
alcanzable por hornos o quemadores de laboratorio. En ese caso, el peso del analito
se mide por la pérdida de peso de la muestra si el analito se ha evaporado o
directamente si la matriz se ha evaporado. En cualquier caso, el peso de un
contenedor también puede estar involucrado. (Kenkel, 2013) En particular, esta es
la forma en la que se aplica el método gravimétrico para el análisis de TPH’s en
muestras de suelo.
108
En otros casos, el analito puede ser filtrado o tamizado (separado según el tamaño
de partícula) de la matriz. Si la muestra es una suspensión líquida, primero se mide
su volumen. Esto es seguido por un paso de filtrado o tamizado húmedo para
capturar el material sólido deseado. El medio o unidad de filtrado o tamizado se
pesa primero y, por lo tanto, el peso del analito se determina a partir del aumento
de peso que se produce como resultado del filtrado o tamizado. Si la muestra es
sólida, se mide su peso y la muestra se tamiza en seco (a través de una pila de
tamices metálicos anidados con orificios de diferentes tamaños) o se disuelve de
manera que se filtre la materia insoluble. En el caso del tamizado, el aumento de
peso de cada tamiz es el peso del analito para ese tamaño de partícula. En el caso
de la materia insoluble, la ganancia de peso del filtro es el peso del analito.
En cada uno de estos casos, a menudo se calcula el porcentaje del analito. El
porcentaje en peso de un analito en una muestra se calcula utilizando la definición
de porcentaje en peso:
% 100i
t
wpeso
w
(27)
% 100a
m
wanalito
w
(28)
Donde, iw es el peso de interés, tw es el peso total, aw es el peso del analito y mw es
el peso total de la muestra. (Kenkel, 2013)
3.1.2. Alteración química y separación del analito
109
La separación física de un analito de una muestra para poder medir su peso, puede
ser difícil, si no imposible de lograr. Es importante reconocer que en muchos casos
no hay medios físicos por los cuales tal separación pueda tener lugar. Por ejemplo,
si desea determinar el sulfato de sodio presente en una mezcla con cloruro de
sodio, no sería posible separarlo del cloruro de sodio por medios físicos para
determinar su peso. Sin embargo, aún se podría usar un procedimiento
gravimétrico si se emplea una reacción química para convertir el analito a otra
forma química que pueda separarse limpiamente y pesarse con precisión. En el
ejemplo de determinación de sulfato de sodio en presencia de cloruro de sodio, se
puede disolver la mezcla en agua y precipitar el sulfato con cloruro de bario para
formar sulfato de bario insoluble. El cloruro de sodio no reaccionaría. El peso del
precipitado después de filtrar, lavar y secar se puede medir sin ninguna influencia
del NaCl y convertir al peso del analito con el uso de un factor gravimétrico y
calcular su porcentaje en la muestra. Un factor gravimétrico es un número utilizado
para convertir, por multiplicación, el peso de un químico al peso de otro, tomando
generalmente relaciones estequiométricas como criterio de conversión. (Kenkel,
2013)
3.2. INSTRUMENTACIÓN
El instrumento de laboratorio construido para medir el peso se llama balanza. El
nombre se deriva de dispositivos mecánicos que utilizan pesos conocidos para
equilibrar el objeto que se pesará en un punto de apoyo, como un balancín. La
mayoría de las balanzas en uso hoy en día son electrónicas, en lugar de mecánicas.
110
Una balanza electrónica es aquella que utiliza un electroimán para equilibrar el
objeto a pesar en una sola bandeja. Las balanzas mecánicas más antiguas también
utilizan un concepto de bandeja única, pero también utilizan el diseño de balanceo,
por lo que son mecánicas y no electrónicas.
Una balanza que se utiliza para obtener cuatro o cinco dígitos a la derecha del
punto decimal en el laboratorio analítico se llama balanza analítica, cuya precisión
es ± 0.1 o ± 0.01 mg. El laboratorio moderno utiliza balanzas analíticas electrónicas
de bandeja única casi exclusivamente para este tipo de precisión. La Figura 20
muestra una balanza analítica electrónica moderna. Se trata de una balanza de
bandeja única con la bandeja cerrada. La cámara que aloja la sartén tiene paredes
transparentes para una fácil visualización. Las puertas correderas en los lados
derecho e izquierdo y en la parte superior hacen que la bandeja sea accesible para
cargar y manipular muestras. La razón para encerrar la bandeja de esta manera es
evitar el efecto de las corrientes de aire sobre el peso. La mayoría de las balanzas
analíticas modernas también tienen la característica de tara. Tarar significa que la
balanza simplemente se pone a cero con el papel de pesar en la bandeja, u otro
material utilizado para contener la muestra.
111
Figura 20. Balanza analítica. Tomado de:
https://sc01.alicdn.com/kf/HTB1Xdqob1GSBuNjSspbq6AiipXaf/Excel-
Precision-Lab-Analytical-Electronic-Balance-0.jpg
El operador de una balanza analítica debe tener en cuenta que este instrumento es
extremadamente sensible y, por lo tanto, debe manejarse con cuidado y
correctamente. Además, esta discusión supone que, si es necesario, la muestra se
ha secado (como en un horno de secado de laboratorio) y se ha mantenido seca
(como al almacenarla en un desecador) antes de pesarla. (Kenkel, 2013)
112
3.3. ANÁLISIS GRAVIMÉTRICO DE TPH’s
Los métodos gravimétricos emplean un paso inicial de extracción con solvente frío
y un paso final de diferencia de peso. En el medio puede haber otro paso de
limpieza con gel de sílice para eliminar el material biogénico. Si no implica un paso
de limpieza, se denomina método de aceite y grasa; si lo hace, se denomina método
TPH. (Weisman, 1998) En el método de TPH gravimétrico general (método EPA
1664), (EPA, 1999) las muestras de suelo se clasifican uniformemente por
tamizado, se secan en exceso a 105 ° C durante 12 h, y los compuestos de TPH se
eluyen con n-hexano. El extracto líquido (eluato) se pone en contacto con gel de
sílice para eliminar los materiales polares biogénicos y luego se evapora. El residuo
se retiene y se pesa, y la diferencia de peso se informa como un porcentaje de la
muestra total de suelo en peso seco. Debido a la presencia de sólidos en
suspensión, el método EPA 1664 (EPA, 1999) recomienda usar un filtro de 0,45
µm. (Weisman, 1998) Entre los primeros métodos desarrollados, aunque
obviamente es una de las opciones de rápido declive, (Villalobos et al., 2008) los
métodos gravimétricos se han utilizado ampliamente para determinar los TPH en
suelos contaminados. Antes de que Villalobos y colaboradores (Villalobos et al.,
2008) terminaran su trabajo, los métodos gravimétricos se describieron como
métodos rápidos y económicos, pero, en su estudio reciente, el largo tiempo
requerido para la evaporación completa del hexano, de no menos de 60 minutos,
"eleva los costos energéticos del procedimiento general" y se producen pérdidas
analíticas en tiempos más altos que causan errores de análisis. (Okparanma &
Mouazen, 2013a) La última limitación corrobora hallazgos similares en estudios
113
anteriores (Rhodes et al., 1990; White & Irvine, 2017; Whittaker et al., 1995). La
eficiencia de extracción de los métodos gravimétricos, aunque deficiente, se ve muy
afectada por el tipo de disolvente de elución utilizado (Agency (USEPA), 1978; G. S.
Douglas et al., 1992). El hexano tiene una eficiencia de extracción pobre para
compuestos de petróleo de mayor peso molecular (Weisman, 1998) y baja
polaridad, lo que provoca la coextracción de materia orgánica natural que contiene
múltiples grupos funcionales polares (EPA, 1996a; Essington, 2004). En
consecuencia, otros compuestos clorados como el cloroformo (Ahmed et al., 2015)
y el tolueno (MOHAMMED, s. f.) se han utilizado como extractores líquidos. Es
bien sabido que tanto el cloroformo como el tolueno tienen serias implicaciones
para la salud, como se evidencia en las frases de riesgo publicadas en sus
respectivas hojas de datos de seguridad. Además, los métodos gravimétricos son
inespecíficos porque no brindan información sobre el tipo de hidrocarburo
presente (Villalobos et al., 2008; Weisman, 1998). El método es más adecuado para
la detección de TPH en lodos muy aceitosos o muestras que contienen
hidrocarburos de peso molecular muy pesado porque los hidrocarburos ligeros
(<C15) se volatilizan fácilmente a temperaturas por debajo de 70 a 85° C durante el
paso de evaporación (Weisman, 1998). Se han informado límites de detección para
TPH de aproximadamente 50 mg/kg en suelos utilizando análisis gravimétrico.
(Weisman, 1998)
3.4. CUANTIFICACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN DE TPH’s POR
ANÁLISIS GRAVIMÉTRICO
114
El método gravimétrico utiliza n-hexano como disolvente de extracción para la
determinación de aceites y grasas, así como los materiales no polares, éste se ha
convertido en una opción recurrente, a pesar de no ser adecuado para componentes
volátiles debido a su inminente evaporación.
3.4.1. Degradación bacteriana del petróleo crudo por análisis
gravimétrico
Lata y Kalaivani,en el año 2013 mostraron la eficacia de Bacillus subtilis y
Pseudomonas aeruginosa, para crecer y biodegradar altas fracciones de crudo en
un sitio contaminado. En este estudio se investigó el aislamiento de las bacterias
del sitio contaminado con petróleo crudo y se cuantificó la taza de biodegradación
mediante análisis gravimétrico.
Para examinar la degradación del petróleo, se utilizó medio Bushnell Haas (BHM)
suplementado con 5 g / l de petróleo crudo. Se dispensaron aproximadamente 50
ml de medio en matraces cónicos de 250 ml. Los medios se inocularon con 0,1 ml
de bacterias degradantes de petróleo crudo (bacterias obtenidas mediante
detección de bacterias degradantes de petróleo crudo) y se incubaron a 28 ° C
durante 7 días en un batido rotativo a 175 rpm. Para la estimación de las tasas de
degradación del crudo mediante análisis gravimétrico, se añadieron 5 ml de n-
hexano a los matraces anteriores. Los contenidos se transfirieron a un embudo de
separación y se extrajeron. La extracción se realizó dos veces para asegurar la
recuperación completa del petróleo. El extracto se trató con 0,4 g de sulfato de
sodio anhidro para eliminar la humedad y se decantó en un vaso de precipitados
115
dejando sulfato de sodio. Esto se evaporó a sequedad en un evaporador rotativo a
presión reducida. La cantidad de aceite residual se midió después de extraer el
crudo del medio y evaporarlo a sequedad en un evaporador rotatorio a 40 ° C bajo
presión reducida. El volumen de aceite extraído se dedujo del vaso de precipitados
previamente pesado.
El % de degradación se calculó como sigue:
% 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑒𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒𝑜 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑜 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑑𝑜
𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑜 𝑠𝑢𝑝𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜× 100
(29)
Siendo la masa de crudo degradada igual a la masa de crudo adicionada en el
medio menos la masa residual de crudo. La cantidad residual de crudo se
determinó restando el peso del beaker vació de la masa del beaker conteniendo el
crudo extraído.
3.4.2. Potencial de biorremediación in situ de un consorcio
bacteriano de degradación de lodos aceitosos
Se realizó un estudio a escala de campo en una parcela de 4000 m2 de tierra
contaminada con un lodo aceitoso mediante el uso de un consorcio bacteriano de
degradación de hidrocarburos a base de vehículo para la biorremediación. La tierra
pertenecía a una refinería de petróleo. (Mishra et al., 2001)
La aplicación del consorcio bacteriano (1 kg de consorcio bacteriano a base de
vehículo / área de 10 m2) y nutrientes degradaron el 90.2% de los TPH’s en 120
116
días. Para evaluar la velocidad a la que se degradaron los TPH’s, se tomó una
muestra de cada bloque de tratamiento en 10 puntos. Las muestras se recogieron
en el momento cero (justo antes de iniciar la biorremediación), 55 días después y al
final del estudio (120 días después de iniciar el proceso). Los hidrocarburos totales
de petróleo de 10 g de suelo se extrajeron consecutivamente con hexano, cloruro de
metileno y cloroformo (100 ml cada uno). Los tres extractos se agruparon y se
secaron a temperatura ambiente por evaporación de disolventes bajo una corriente
de nitrógeno suave en una campana extractora. Después de la evaporación del
disolvente, la cantidad de TPH residual se determinó gravimétricamente. (Mishra
et al., 2001)
117
CONCLUSIONES
Se consiguió recopilar diferentes métodos analíticos aplicados en la cuantificación
de la biodegradación de hidrocarburos totales de petróleo y así desarrollar una
fuente bibliográfica de consulta.
Además de conocer la descripción detallada de cada método, lo que permitirá
seleccionar una técnica eficaz y adecuada para la manipulación y homogeneización
de la muestra, y así evitaremos cometer errores y obtener datos reales.
Como sabemos existen diferentes métodos para cuantificar hidrocarburos del
petróleo, sin embargo estos métodos presentan interferencias por compuestos de la
muestra, además tienden a arrastrar errores humanos. Por lo tanto para la
escogencia de un método de cuantificación se hace necesario tener en cuenta
ciertos criterios como, contar con el conocimiento de las principales características
y factores del suelo que pueden afectar el análisis de hidrocarburos, además de la
complejidad e interferencias en el proceso.
Basados en lo anterior:
- el método instrumental “Cromatografia de Gases” permite realizar análisis
más específicos y precisos que la convierten en una muy importante técnica
en la cuantificación de hidrocarburos del petróleo, ya que esta técnica es
capaz de diferenciar aquellos componentes que provienen de la materia
orgánica del suelo productos generados durante el tratamiento. Su principal
ventaja es que provee información acerca del tipo de hidrocarburo en la
118
muestra, además de su cuantificación. Su principal desventaja es que las
muestras deben estar libres de disolventes polares ya que pueden dañar la
columna y el detector; además de no poder detectar cuantitativamente
compuestos debajo de C6 ( son altamente volátiles, interfieren con el pico
del solvente) y de hidrocarburos polares (contengan moléculas de N, O y S2-
); es recomendable para analizar mezclas de hidrocarburos de C10 a C24 y
los 16 HPAs y concentraciones de 10 hasta 200 mgL-1
- la cuantificación de TPH por gravimetría es como el método más adecuado
ya que ofrece una cuantificación gruesa que no requiere equipo sofisticado,
es un procedimiento sencillo, barato y rápido, que trabaja muy bien con
concentraciones mayores a 50 000 mg/kg. Aunque presenta inconvenientes
con la muestra, en la cual se debe incluir etapas de limpieza con silica gel, y
así remover el material biogenico y evitar interferencias, además de no ser
aplicables en hidrocarburos ligeros (volátiles a temperaturas por debajo de
70-85°C)
- la cuantificación de HTPs por Espectroscopia de infrarrojo es una técnica
relativamente rápida para determinar concentraciones aproximadas
presentes en el suelo; es rápido, simple y barato; pero su mayor desventaja
es que su precisión y exactitud es limitada, ya que no da información
referente al tipo de HTPs en la muestra, además que los enlaces C-H
provenientes de fuentes que no son petróleo entre esos lípidos y acidos
grasos, que alteran los resultados. Su límite de detección va de 10 a 600 mg
kg-1 de HTPPs y en extractos muy concentrados se debe realizar diluciones
hasta obtener mediciones de absorbancia entre 0,1 y 0,8.
119
En fin para elegir el método más factible se necesita determinar las
características del medio o muestra y las posibles interferencias y así se reduce
gastos y aumente eficacia.
120
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abed, R. M., Al-Kindi, S., & Al-Kharusi, S. (2015). Diversity of bacterial communities along a
petroleum contamination gradient in desert soils. Microbial ecology, 69(1), 95-105.
Adebusoye, S. A., Ilori, M. O., Amund, O. O., Teniola, O. D., & Olatope, S. O. (2007). Microbial
degradation of petroleum hydrocarbons in a polluted tropical stream. World journal of
Microbiology and Biotechnology, 23(8), 1149-1159.
Adeniji, A. O., Okoh, O. O., & Okoh, A. I. (2017a). Analytical methods for the determination of the
distribution of total petroleum hydrocarbons in the water and sediment of aquatic
systems: A review. Journal of Chemistry, 2017.
Adeniji, A. O., Okoh, O. O., & Okoh, A. I. (2017b). Analytical methods for the determination of the
distribution of total petroleum hydrocarbons in the water and sediment of aquatic
systems: A review. Journal of Chemistry, 2017.
Agency (USEPA), U. S. E. P. (1978). Test Method for Evaluating Total Recoverable Petroleum
Hydrocarbon, Method 418.1 (Spectrophotometric, Infrared). Government Printing Office
Washington, DC, USA.
Ahmed, R., Sinnathambi, C. M., & Eldmerdash, U. (2015). N-hexane, methyl ethyl ketone and
chloroform solvents for oil recovery from refinery waste. Applied Mechanics and
Materials, 699, 666-671.
Almeida, R., Mucha, A. P., Teixeira, C., Bordalo, A. A., & Almeida, C. M. R. (2013). Biodegradation of
petroleum hydrocarbons in estuarine sediments: Metal influence. Biodegradation, 24(1),
111-123.
Alvaro, C. E. S., Arocena, L. A., Martínez, M. Á., & Nudelman, N. E. S. (2017). Biodegradación
aerobia de fracciones de hidrocarburos provenientes de la actividad petrolera en un suelo
121
de la región Patagonia Norte, Argentina. Revista internacional de contaminación
ambiental, 33(2), 247-257.
Andreolli, M., Lampis, S., Brignoli, P., & Vallini, G. (2015). Bioaugmentation and biostimulation as
strategies for the bioremediation of a burned woodland soil contaminated by toxic
hydrocarbons: A comparative study. Journal of environmental management, 153, 121-131.
Aparicio-Ruiz, R., García-González, D. L., Morales, M. T., Lobo-Prieto, A., & Romero, I. (2018).
Comparison of two analytical methods validated for the determination of volatile
compounds in virgin olive oil: GC-FID vs GC-MS. Talanta, 187, 133-141.
Chakraborty, S., Weindorf, D. C., Li, B., Aldabaa, A. A. A., Ghosh, R. K., Paul, S., & Ali, M. N. (2015).
Development of a hybrid proximal sensing method for rapid identification of petroleum
contaminated soils. Science of the Total Environment, 514, 399-408.
Chaudhuri, U. R. (2016). Fundamentals of petroleum and petrochemical engineering. Crc Press.
Chen, F., Li, X., Zhu, Q., Ma, J., Hou, H., & Zhang, S. (2019). Bioremediation of petroleum-
contaminated soil enhanced by aged refuse. Chemosphere, 222, 98-105.
Chikere, C. B., Mordi, I. J., Chikere, B. O., Selvarajan, R., Ashafa, T. O., & Obieze, C. C. (2019).
Comparative metagenomics and functional profiling of crude oil-polluted soils in Bodo
West Community, Ogoni, with other sites of varying pollution history. Annals of
Microbiology, 69(5), 495-513.
Chikere, C. B., Okpokwasili, G. C., & Ichiakor, O. (2009). Characterization of hydrocarbon utilizing
bacteria in tropical marine sediments. African Journal of Biotechnology, 8(11).
Chithra, S., & Shenpagam, H. N. (2014). Biodegradation of crude oil by gravimetric analysis. Int J
Adv Tech in Eng Science, 2(11), 372-376.
Coleman, D. C., Callaham, M. A., & Crossley Jr, D. A. (2017). Fundamentals of soil ecology.
Academic press.
122
Colwell, R. R., Walker, J. D., & Cooney, J. J. (1977). Ecological Aspects of Microbial Degradation of
Petroleum in the Marine Environment. CRC Critical Reviews in Microbiology, 5(4), 423-445.
https://doi.org/10.3109/10408417709102813
Contaminación del agua por petróleo. (s. f.). Agua.org.mx. Recuperado 10 de agosto de 2019, de
https://agua.org.mx/biblioteca/contaminacion-del-agua-por-petroleo/
Coulon, F., McKew, B. A., Osborn, A. M., McGenity, T. J., & Timmis, K. N. (2007). Effects of
temperature and biostimulation on oil-degrading microbial communities in temperate
estuarine waters. Environmental Microbiology, 9(1), 177-186.
Daling, P. S., Faksness, L.-G., Hansen, A. B., & Stout, S. A. (2002). Improved and standardized
methodology for oil spill fingerprinting. Environmental Forensics, 3(3-4), 263-278.
Das, K., & Mukherjee, A. K. (2007). Crude petroleum-oil biodegradation efficiency of Bacillus
subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum-oil contaminated
soil from North-East India. Bioresource technology, 98(7), 1339-1345.
Das, N., & Chandran, P. (2011). Microbial degradation of petroleum hydrocarbon contaminants:
An overview. Biotechnology research international, 2011.
Douglas, G. S., McCarthy, K. J., Dahlen, D. T., Seavey, J. A., Steinhauer, W. G., Prince, R. C., &
Elmendorf, D. L. (1992). The use of hydrocarbon analyses for environmental assessment
and remediation. Soil and Sediment Contamination, 1(3), 197-216.
Douglas, R. K., Nawar, S., Alamar, M. C., Mouazen, A. M., & Coulon, F. (2018). Rapid prediction of
total petroleum hydrocarbons concentration in contaminated soil using vis-NIR
spectroscopy and regression techniques. Science of the Total Environment, 616, 147-155.
EPA. (1996a). Method 4030. Soil screening for petroleum hydrocarbons by Immunoassay.
Government Printing Office Washington, DC.
123
EPA, U. (1996b). Method 8015B: Nonhalogenated Organics Using GC/FID. United States
Environmental Protection Agency, Research Triangle Park, North Carolina http://www.
caslab. com/EPA-Methods/PDF/8015b. pdf.
EPA, U. (1999). Method 1664, Revision A: N-Hexane Extractable Material (HEM; Oil and Grease)
and Silica Gel Treated N-Hexane Extractable Material (SGT-HEM; Non-polar Material) by
Extraction and Gravimetry. Environmental Protection Agency Washington.
Essington, M. E. (2004). Soil Salinity and Sodicity. Soil and Water Chemistry An Integrative
Approach. CRC Press, Boca Raton, FL, 499-521.
Eyvazi, M. J., & Zytner, R. G. (2009). A correlation to estimate the bioventing degradation rate
constant. Bioremediation Journal, 13(3), 141-153.
Festa, S., Coppotelli, B. M., & Morelli, I. S. (2016). Comparative bioaugmentation with a
consortium and a single strain in a phenanthrene-contaminated soil: Impact on the
bacterial community and biodegradation. Applied Soil Ecology, 98, 8-19.
Frysinger, G. S., Gaines, R. B., Xu, L., & Reddy, C. M. (2003). Resolving the unresolved complex
mixture in petroleum-contaminated sediments. Environmental science & technology,
37(8), 1653-1662.
Gkorezis, P., Daghio, M., Franzetti, A., Van Hamme, J. D., Sillen, W., & Vangronsveld, J. (2016). The
interaction between plants and bacteria in the remediation of petroleum hydrocarbons:
An environmental perspective. Frontiers in microbiology, 7, 1836.
Gleeson, T., Wada, Y., Bierkens, M. F., & van Beek, L. P. (2012). Water balance of global aquifers
revealed by groundwater footprint. Nature, 488(7410), 197.
Grishchenkov, V. G., Townsend, R. T., McDonald, T. J., Autenrieth, R. L., Bonner, J. S., & Boronin, A.
M. (2000). Degradation of petroleum hydrocarbons by facultative anaerobic bacteria
under aerobic and anaerobic conditions. Process Biochemistry, 35(9), 889-896.
124
Harvey, D. (2000). Modern analytical chemistry. McGraw-Hill.
Hassanshahian, M., Amirinejad, N., & Behzadi, M. A. (2020). Crude oil pollution and
biodegradation at the Persian Gulf: A comprehensive and review study. Journal of
Environmental Health Science and Engineering, 18(2), 1415-1435.
Hays, S. G., Patrick, W. G., Ziesack, M., Oxman, N., & Silver, P. A. (2015). Better together:
Engineering and application of microbial symbioses. Current opinion in biotechnology, 36,
40-49.
Hazen, T. C., Prince, R. C., & Mahmoudi, N. (2016). Marine oil biodegradation. ACS Publications.
Hillel, D. (2013). Fundamentals of soil physics. Academic press.
Holliger, C., Gaspard, S., Glod, G., Heijman, C., Schumacher, W., Schwarzenbach, R. P., & Vazquez,
F. (1997). Contaminated environments in the subsurface and bioremediation: Organic
contaminants. FEMS Microbiology Reviews, 20(3-4), 517-523.
Ichor, T., Okerentugba, P. O., & Okpokwasili, G. C. (2014). Biodegradation of total petroleum
hydrocarbon by aerobic heterotrophic bacteria isolated from crude oil contaminated
brackish waters of bodo creek. Journal of Bioremediation & Biodegredation, 5(5), 1.
Iskander, M. F. (2013). Electromagnetic fields and waves. Waveland Press.
ISO/TC 190/SC 3. (2007a). ISO 15009:2002, Soil quality—Gas chromatographic determination of
the content of volatile aromatic hydrocarbons, naphthalene and volatile ... Purge-and-trap
method with thermal desorption. Multiple. Distributed through American National
Standards Institute.
ISO/TC 190/SC 3. (2007b). ISO 16703:2004, Soil quality—Determination of content of hydrocarbon
in the range C10 to C40 by gas chromatography. Multiple. Distributed through American
National Standards Institute.
125
Iwamoto, T., & Nasu, M. (2001). Current bioremediation practice and perspective. Journal of
bioscience and bioengineering, 92(1), 1-8.
Kenkel, J. (2013). Analytical chemistry for technicians. CRC Press.
Khudur, L. S., Shahsavari, E., Aburto-Medina, A., & Ball, A. S. (2018). A review on the
bioremediation of petroleum hydrocarbons: Current state of the art. En Microbial Action
on Hydrocarbons (pp. 643-667). Springer.
Kuppusamy, S., Maddela, N. R., Megharaj, M., & Venkateswarlu, K. (2020). Methodologies for
analysis and identification of total petroleum hydrocarbons. En Total Petroleum
Hydrocarbons (pp. 29-55). Springer.
Kvenvolden, K. A., & Cooper, C. K. (2003). Natural seepage of crude oil into the marine
environment. Geo-Marine Letters, 23(3-4), 140-146.
Latha, R., & Kalaivani, R. (2012). Bacterial degradation of crude oil by gravimetric analysis.
Advances in Applied Science Research, 3(5), 2789-2795.
Leahy, J. G., & Colwell, R. R. (1990). Microbial degradation of hydrocarbons in the environment.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 54(3), 305-315.
\Lebkowska, M., Zborowska, E., Karwowska, E., Miaśkiewicz-Pęska, E., Muszyński, A., Tabernacka,
A., Naumczyk, J., & Jęczalik, M. (2011). Bioremediation of soil polluted with fuels by
sequential multiple injection of native microorganisms: Field-scale processes in Poland.
Ecological Engineering, 37(11), 1895-1900.
Marriott, P. J., Massil, T., & Hügel, H. (2004). Molecular structure retention relationships in
comprehensive two-dimensional gas chromatography. Journal of Separation Science,
27(15-16), 1273-1284. https://doi.org/10.1002/jssc.200401917
126
Marriott, P., & Shellie, R. (2002). Principles and applications of comprehensive two-dimensional
gas chromatography. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 21(9), 573-583.
https://doi.org/10.1016/S0165-9936(02)00814-2
Masucci, J. A., & Caldwell, G. W. (2004). Techniques for gas chromatography/mass spectrometry.
Modern practice of gas chromatography, 4.
McNair, H. M., Miller, J. M., & Snow, N. H. (2019). Basic gas chromatography. John Wiley & Sons.
Medina-Bellver, J. I., Marín, P., Delgado, A., Rodríguez-Sánchez, A., Reyes, E., Ramos, J. L., &
Marqués, S. (2005). Evidence for in situ crude oil biodegradation after the Prestige oil spill.
Environmental microbiology, 7(6), 773-779.
Method 625.1: Base/Neutrals and Acids by GC/MS (2016). (2016). 60.
Mishra, S., Jyot, J., Kuhad, R. C., & Lal, B. (2001). In Situ Bioremediation Potential of an Oily Sludge-
Degrading Bacterial Consortium. Current Microbiology, 43(5), 328-335.
https://doi.org/10.1007/s002840010311
MOHAMMED, Q. Y. (s. f.). Estimation of sediments in crude oil and lubricating oils by extraction
method.
Mondello, L., Lewis, A. C., & Bartle, K. D. (2002). Multidimensional chromatography. John Wiley &
Sons.
Mousa, I. E. (2016). Total petroleum hydrocarbon degradation by hybrid electrobiochemical
reactor in oilfield produced water. Marine pollution bulletin, 109(1), 356-360.
Nielsen, S. S. (2010). Food analysis. Springer.
Ojewumi, M. E., Okeniyi, J. O., Ikotun, J. O., Okeniyi, E. T., Ejemen, V. A., & Popoola, A. P. I. (2018).
Bioremediation: Data on Pseudomonas aeruginosa effects on the bioremediation of crude
oil polluted soil. Data in brief, 19, 101-113.
127
Okparanma, R. N., & Mouazen, A. M. (2013a). Determination of total petroleum hydrocarbon
(TPH) and polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) in soils: A review of spectroscopic and
nonspectroscopic techniques. Applied Spectroscopy Reviews, 48(6), 458-486.
Okparanma, R. N., & Mouazen, A. M. (2013b). Determination of Total Petroleum Hydrocarbon
(TPH) and Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH) in Soils: A Review of Spectroscopic and
Nonspectroscopic Techniques. Applied Spectroscopy Reviews, 48(6), 458-486.
https://doi.org/10.1080/05704928.2012.736048
Penet, S., Vendeuvre, C., Bertoncini, F., Marchal, R., & Monot, F. (2006). Characterisation of
biodegradation capacities of environmental microflorae for diesel oil by comprehensive
two-dimensional gas chromatography. Biodegradation, 17(6), 577-585.
Peterson, G. S., Axler, R. P., Lodge, K. B., Schuldt, J. A., & Crane, J. L. (2002). Evaluation of a
fluorometric screening method for predicting total PAH concentrations in contaminated
sediments. Environmental monitoring and assessment, 78(2), 111-129.
Pimentel, D., Berger, B., Filiberto, D., Newton, M., Wolfe, B., Karabinakis, E., Clark, S., Poon, E.,
Abbett, E., & Nandagopal, S. (2004). Water resources: Agricultural and environmental
issues. BioScience, 54(10), 909-918.
Pohorille, A., & Pratt, L. R. (2012). Is water the universal solvent for life? Origins of Life and
Evolution of Biospheres, 42(5), 405-409.
Poster, D. L., Schantz, M. M., Sander, L. C., & Wise, S. A. (2006). Analysis of polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) in environmental samples: A critical review of gas chromatographic
(GC) methods. Analytical and bioanalytical chemistry, 386(4), 859-881.
Prince, R. C., Butler, J. D., & Redman, A. D. (2017). The rate of crude oil biodegradation in the sea.
Environmental science & technology, 51(3), 1278-1284.
128
Rehbein, H., & Oehlenschlager, J. (2009). Fishery products: Quality, safety and authenticity. John
Wiley & Sons.
Reuhs, B. L., & Rounds, M. A. (2010). High-performance liquid chromatography. En Food analysis
(pp. 499-512). Springer.
Rhodes, I. A. L., Olvera, R. Z., & Leon, J. A. (1990). Determination of gasoline range total petroleum
hydrocarbon and approximate boiling point distribution in soil by gas chromatography.
Lewis Publishers, MI, USA.
Risdon, G. C., Pollard, S. J., Brassington, K. J., McEwan, J. N., Paton, G. I., Semple, K. T., & Coulon, F.
(2008). Development of an analytical procedure for weathered hydrocarbon contaminated
soils within a UK risk-based framework. Analytical chemistry, 80(18), 7090-7096.
Saari, E., Perämäki, P., & Jalonen, J. (2007). Effect of sample matrix on the determination of total
petroleum hydrocarbons (TPH) in soil by gas chromatography–flame ionization detection.
Microchemical journal, 87(2), 113-118.
Sabra, W., Dietz, D., Tjahjasari, D., & Zeng, A.-P. (2010). Biosystems analysis and engineering of
microbial consortia for industrial biotechnology. Engineering in Life Sciences, 10(5), 407-
421.
Shahsavari, E., Adetutu, E. M., Anderson, P. A., & Ball, A. S. (2013). Tolerance of selected plant
species to petrogenic hydrocarbons and effect of plant rhizosphere on the microbial
removal of hydrocarbons in contaminated soil. Water, Air, & Soil Pollution, 224(4), 1495.
Shahsavari, E., Adetutu, E. M., Taha, M., & Ball, A. S. (2015). Rhizoremediation of phenanthrene
and pyrene contaminated soil using wheat. Journal of environmental management, 155,
171-176.
Sharma, J. (2019). Advantages and limitations of in situ methods of bioremediation. Recent Adv
Biol Med, 5(2019), 10941.
129
Sherma, J. (1972). Principles and techniques. CRC Handbook of Chromatography: General Data and
Principles, 2, 1-101.
Singh, K. K., Gautam, K., & Vaishya, R. C. (2016). Bioremediation of Petroleum Hydrocarbons from
Crude Oil contaminated site by Gravimetric Analysis. International Journal of Scientific
Progress & Research, 22(2), 75-78.
Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage
learning.
Smith, B. C. (2011). Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. CRC press.
Snape, I., Harvey, P. M., Ferguson, S. H., Rayner, J. L., & Revill, A. T. (2005). Investigation of
evaporation and biodegradation of fuel spills in Antarctica I. A chemical approach using
GC–FID. Chemosphere, 61(10), 1485-1494.
Straube, W. L., Nestler, C. C., Hansen, L. D., Ringleberg, D., Pritchard, P. H., & Jones-Meehan, J.
(2003). Remediation of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) through landfarming with
biostimulation and bioaugmentation. Acta Biotechnologica, 23(2-3), 179-196.
Strawn, D. G., Bohn, H. L., & O’Connor, G. A. (2019). Soil chemistry. John Wiley & Sons.
Stuart, B. (2000). Infrared spectroscopy. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 1-18.
Suja, F., Rahim, F., Taha, M. R., Hambali, N., Razali, M. R., Khalid, A., & Hamzah, A. (2014a). Effects
of local microbial bioaugmentation and biostimulation on the bioremediation of total
petroleum hydrocarbons (TPH) in crude oil contaminated soil based on laboratory and
field observations. International Biodeterioration & Biodegradation, 90, 115-122.
Suja, F., Rahim, F., Taha, M. R., Hambali, N., Razali, M. R., Khalid, A., & Hamzah, A. (2014b). Effects
of local microbial bioaugmentation and biostimulation on the bioremediation of total
petroleum hydrocarbons (TPH) in crude oil contaminated soil based on laboratory and
field observations. International Biodeterioration & Biodegradation, 90, 115-122.
130
Thapa, B., Kc, A. K., & Ghimire, A. (2012). A review on bioremediation of petroleum hydrocarbon
contaminants in soil. Kathmandu university journal of science, engineering and technology,
8(1), 164-170.
Tranchida, P. Q., Franchina, F. A., Dugo, P., & Mondello, L. (2016). Comprehensive two-
dimensional gas chromatography-mass spectrometry: Recent evolution and current
trends. Mass spectrometry reviews, 35(4), 524-534.
Ulrici, W. (2000). Contaminated soil areas, different countries and contaminants, monitoring of
contaminants. Biotechnology: Environmental Processes II, 11, 5-41.
UV, I. (s. f.). Properties of water.
Vallejo, B., Izquierdo, A., Blasco, R., del Campo, P. P., & de Castro, M. D. L. (2001). Bioremediation
of an area contaminated by a fuel spill. Journal of Environmental Monitoring, 3(3), 274-
280.
Varjani, S. J. (2017). Microbial degradation of petroleum hydrocarbons. Bioresource technology,
223, 277-286.
Villalobos, M., Avila-Forcada, A. P., & Gutierrez-Ruiz, M. E. (2008). An improved gravimetric
method to determine total petroleum hydrocarbons in contaminated soils. Water, air, and
soil pollution, 194(1-4), 151-161.
Vinas, M., Grifoll, M., Sabate, J., & Solanas, A. M. (2002). Biodegradation of a crude oil by three
microbial consortia of different origins and metabolic capabilities. Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology, 28(5), 252-260.
Wang, Z., & Fingas, M. (1995). Differentiation of the source of spilled oil and monitoring of the oil
weathering process using gas chromatography-mass spectrometry. Journal of
Chromatography A, 712(2), 321-343.
131
Wang, Z., & Fingas, M. F. (2003). Development of oil hydrocarbon fingerprinting and identification
techniques. Marine pollution bulletin, 47(9-12), 423-452.
Wei, O., Xu, X., Zhang, Y., Yang, B., Ye, Q., & Yang, Z. (2018). Multidimensional Gas
Chromatography–Mass Spectrometry Method for Fingerprinting Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons and Their Alkyl-Homologs in Crude Oil. Analytical Letters, 51(4), 483-495.
Weingärtner, H., Teermann, I., Borchers, U., Balsaa, P., Lutze, H. V., Schmidt, T. C., Franck, E. U.,
Wiegand, G., Dahmen, N., & Schwedt, G. (2000). Water, 1. Properties, Analysis, and
Hydrological Cycle. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1-40.
Weisman, W. (1998). Analysis of petroleum hydrocarbons in environmental media (Vol. 1).
Amherst Scientific Publishers.
Wentzel, A., Ellingsen, T. E., Kotlar, H.-K., Zotchev, S. B., & Throne-Holst, M. (2007). Bacterial
metabolism of long-chain n-alkanes. Applied microbiology and biotechnology, 76(6), 1209-
1221.
White, D. M., & Irvine, R. L. (2017). Analysis of bioremediation in organic soils. En Fundamentals
and Applications of Bioremediation (pp. 185-220). Routledge.
Whittaker, M., Pollard, S. J., & Fallick, T. E. (1995). Characterisation of refractory wastes at heavy
oil-contaminated sites: A review of conventional and novel analytical methods.
Environmental Technology, 16(11), 1009-1033.
Wu, M., Dick, W. A., Li, W., Wang, X., Yang, Q., Wang, T., Xu, L., Zhang, M., & Chen, L. (2016).
Bioaugmentation and biostimulation of hydrocarbon degradation and the microbial
community in a petroleum-contaminated soil. International Biodeterioration &
Biodegradation, 107, 158-164.
132
Yan, S., Wang, Q., Qu, L., & Li, C. (2013). Characterization of oil-degrading bacteria from oil-
contaminated soil and activity of their enzymes. Biotechnology & Biotechnological
Equipment, 27(4), 3932-3938.
Yeung, P. Y., Johnson, R. L., & Xu, J. G. (1997). Biodegradation of Petroleum Hydrocarbons in Soil as
Affected by Heating and Forced Aeration. Journal of Environmental Quality, 26(6), 1511-
1516. https://doi.org/10.2134/jeq1997.00472425002600060009x
Yeung, P. Y. P., Johnson, R. L., & Acharya, S. N. (1994). An Improved Procedure for Determining Oil
Content in Wet Soil Samples. Analysis of Soils Contaminated with Petroleum Constituents.
https://doi.org/10.1520/STP12651S
Yu, K. S. H., Wong, A. H. Y., Yau, K. W. Y., Wong, Y. S., & Tam, N. F. Y. (2005). Natural attenuation,
biostimulation and bioaugmentation on biodegradation of polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) in mangrove sediments. Marine pollution bulletin, 51(8-12), 1071-
1077.
Zobell, C. E. (1946). Action of microörganisms on hydrocarbons. Bacteriological reviews, 10(1-2), 1.