Metabolómica in vivo y ex vivo enel control de la Actividad

FarmacológicaB. Celda1,2,3, D. Monleón2,3,4, MC. Martínez1,2,3,V. Esteve1,2,3, B. Martínez1,3, E. Piñeiro1,R. Ferrer11Dept. Química Física-SCSIE, Universitat de Valencia,2Laboratorio Imagen Molecular (UCIM)3CIBER Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina, ISC III4Fundación de Investigación del Hospital ClínicoUniversitario de Valencia

(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)

EsquemaEsquemaMetabolómicaMetabolómica y y ActividadActividad FarmacológicaFarmacológica

1.- Introducción1.- Introducción2.- Precisión diagnóstico 2.- Precisión diagnóstico Selección Terapia Selección Terapia

in vivo, ex vivo e in in vivo, ex vivo e in vitrovitro3.- Sistemas Modelo3.- Sistemas Modelo

in vivo, ex vivo e in in vivo, ex vivo e in vitrovitro4.- Desarrollo 4.- Desarrollo BioinformáticoBioinformático

BIONÓMICABIONÓMICA

ADNADN GenómicaGenómica 40.000 genes40.000 genes

ARNARN TranscriptómicaTranscriptómica 101055 transcripciones transcripciones

ProteínasProteínas ProteómicaProteómica 101099 proteínas proteínas

MetabolitosMetabolitos MetabolómicaMetabolómica 3000 metabolitos3000 metabolitos MetabonómicaMetabonómica estructura conocidaestructura conocida

ConocimientoConocimientoLimitadoLimitado

ConocimientoConocimientoAdecuadoAdecuado(RMN)(RMN)

Chips ADN Chips ADN SCSIE+UCIMSCSIE+UCIM

Chips ADNChips ADNSCSIE+UCIMSCSIE+UCIM

MALDI-MALDI-TofTofRMNRMN SCSIESCSIE

RMN Alto CampoRMN Alto CampoSCSIE+UCIMSCSIE+UCIM

B.Celda

Aplicaciones Moleculares al Aplicaciones Moleculares al Diagnóstico, Pronóstico y Selección TerapiaDiagnóstico, Pronóstico y Selección Terapia

Medicina Medicina TranslacionalTranslacional

MetabolómicaMetabolómica (in vivo y ex vivo)(in vivo y ex vivo)

GenómicaGenómica ((TranscriptómicaTranscriptómica y y GenotipadoGenotipado))

ProteómicaProteómica (Funcional y Estructural)(Funcional y Estructural)

B.Celda

INTRODUCCIONNMR ApplicationsNMR Applications

MRI +MRI + 9,6 - 100 9,6 - 100 0,25 - 3,0 0,25 - 3,0 < 100 < 100 5 5 human humanMRS MRS bodybody((clclíínicalnical))

MRI +MRI + 41 - 300 41 - 300 1,0 - 7,1 1,0 - 7,1 < 30 < 30 22 smallsmall animalsanimalsMRSMRS ( (rabitsrabits,, mousesmouses……))((biomedicinebiomedicine))

MiniimagingMiniimaging 300 - 400 300 - 400 7,1 - 9,4 7,1 - 9,4 < 12 < 12 0,005 0,005 mousesmouses

NMR NMR 200 - 600 200 - 600 4,7 - 14,1 < 2,5 4,7 - 14,1 < 2,5 0,00005 0,00005 insectsinsects,,MicroscopyMicroscopy materialsmaterials,,

embrionsembrions

NMRNMR 400 - 900 400 - 900 9,4 - 21 9,4 - 21 < 40 < 40 ÅÅ proteproteíínsns, DNA,, DNA,multidimensional multidimensional tissuestissues......

TypeType 11H(H(MHzMHz)) MagneticMagnetic SizeSize SpatialSpatial ApplicationApplicationresonanceresonance FieldField ( (cmcm) ) resolutionresolution SystemSystem

frequencyfrequency IntensityIntensity (T) (T) (mm (mm33))

B.Celda

Laboratorio Imagen MolecularUCIM (UVEG)

Espacio Espacio IntraIntra y extracelular, y extracelular, Fluidos corporales Fluidos corporales

Fluidos CorporalesFluidos Corporales

MetabolomaMetaboloma MetabonomaMetabonoma

MetabolómicaMetabolómica Plantas PlantasMetabolómicaMetabolómica Mamíferos Mamíferos

MetabolómicaMetabolómica humanos: humanos: Cerebro Cerebro

Corazón Corazón Hígado: Hígado:

HepatocitoHepatocito Riñón Riñón Próstata Próstata Cáncer Mama Cáncer MamaTejido Tejido parenquimalparenquimalTejido MédulaTejido Médula

Líquido Líquido CefalorráquideoCefalorráquideo

Sangre:Sangre: Plasma Plasma Suero SueroBilisBilis

Fluido SeminalFluido Seminal

OrinaOrina

PERFIL BIOQUÍMICOPERFIL BIOQUÍMICO

Exposición por enfermedad, cambio micro-flora, fármacos, tóxicos ...Exposición por enfermedad, cambio micro-flora, fármacos, tóxicos ...

RMNRMN

B.Celda

In vivo + ex vivo In vivo + ex vivo MetabolismMetabolism

GeneticGenetic profileprofile ( (transcriptomicstranscriptomics))

ProteinProtein expressionexpression ( (ProteomicsProteomics))

MetabolismMetabolism ( (MetabolomicMetabolomic))

PrecedsPreceds toto tissuetissue physiologicalphysiological changeschanges

B.Celda

Brain Tissue Metabolite Profile by SV 1H MRS

B.Celda

NAANAA

CrCrCoComImI

NAANAACrCr

CrCr

AlzheimerAlzheimerTE = 31 TE = 31 msms

TE = 136 TE = 136 msms

NAANAA ; mI ; mINAA/mINAA/mI

NAA/NAA/CrCr

NAA/mI 2,32

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 0.2 0.4 0.6 0.8 11 - Espe cificidad (fals os positivos)

Sens

ibili

dad

RMI

ERMGlobal

Europ.J.Neurology2004: 11; 89-98

B.Celda

A B

NAACrCo NA

Lac

MRSI vs. PETMRSI vs. PET

Metastatic Cystic

1

2

3

4

5

66

77

A B

C

MRSI vs. PETMRSI vs. PET

High Grade Glioma

Brain tumour Diagnosis MRSI + SV

http:// www.etumour.net, M.C. Martínez-Bisbal et al. ESMRMB (2005); # 114 and Rev.Neurol. (2002), 34(4); 309C. Majós et al. AJNR (2004), 25; 1696; http://www.carbon.uab.es/INTERPRET,

SV location of AIIaccording Cho High levelprevious 2D TSITE 272 msTR 2s 1.5 T

2

34

Grade

MMB/Cr

MMA/Cr

Gliomas grading by twoTE (31 + 136 ms) SVquantitative analysisprevious SV locationby 2D TSI high levelCholine image(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)

B.Celda

Brain primary tumour vs metastasis MRSI2D TSI at 272 ms 1.5 T

Brain secondary lesionmetastasis (MT)

Brain brimary tumour(GBM)

(Cho/Cr)MT<(Cho/Cr)GBM

http:// www.etumour.net, (FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)

B.Celda

Brain tumour patient outcome and follow-up by Perfusion MRI and MRS

M. Law et al. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 13 (2005); 330

Kaplan-Meier survival curves

Cerebral Blood Volume (CBV) predicts more accurately the Low Grade Gliomas (LGG) progression than initial histopathology grading Longer survival CBV<1.75 Shorter survival CBV>1.75

Follow-up of AII by 1H MRS SV at 1.5 T

NAACho Cr

TE 136 ms

MRS study number

B.Celda

Normal tissue

Necrosis

Tumour tissue Infiltration

A B

Guided Therapy; Guided Therapy; Radiotherapy, Radiotherapy, QuimioQuimio

T. Laudatio, MC. Martínez-Bisbal et al., NMR Biomedicine, in press (2006)

B.Celda

Brain tumour radionecrosis vs. recurrence MRSI

Co

Radiation injury (RI)

Tumour Recurrence (TR)

(Cho/NAA)TR >(Cho/NAA)RI

http:// www.etumour.net, (FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)

Cho

Saggital2D TSI 1.5 T TE 272 ms TR 2 s

Transverse2D MRSI 1.5 TTE 31 ms TR 2 s

B.Celda

Breast cancer diagnosis (MRS/CSI)

J. Hu et al. Proc.Intl.Soc.Mag.Reson.Med. 13 (2005); 134

High Cho levels active tumour by histology

Gd-enhanced areasabsence of viable tumour

2D PRESS MRSI (CSI) with k-space sampling1.5 T TE = 270 ms 16 x 16 11:40 min8 averagesTwo independent CHESS optimized pulsesfor water and lipid suppression

2D 1H MRSI study after 5 days no Cho

Liver treatment response by 19F MRSI at 3 Tof Capacitabine colorectal cancer drug

D.W. Klomp.et al. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 13 (2005); 128

19F CSI of liver of a patient treated with oral Capecitabine FABL imaging

Capecitabine

Capecitabine 5’ deoxy-5’ fluorocytidine 5’ deoxy-5’ fluorouridine -fluor- -alanineOral drug 5’ DFUR 5’ DFCR FBAL

Ex Vivo 1H MRSEx Vivo 1H MRS

Germinoma

GBMlip

Tau????

??

NAA

Leu

Val

Lac

Ala

Leu

IleNAAGlx

AspNAACr

PCr

PCho

Cho

mI

GlyIleLeu

BiopsyBiopsystudystudy by byHR-MASHR-MAS((ex vivoex vivo))

PCA

HR-MAS

PCA

HR-MAS129

T=0 C (4 C inner)4500 Hzca. 20 mg of tissueCylindrical rotor(50 l)(PCA ca. 2g)D2O field homogeneityand mobility

NMR in NMR in BiomedicineBiomedicine, Martínez-, Martínez-BisbalBisbal et al. 2004;17:191-205 et al. 2004;17:191-205B.Celda

Brain tumour characterization ex vivo (HR-MAS)

http:// www.etumour.net; D. Monleón et al., ESMRMB (2005) #325(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)

M.C. Martínez-Bisbal et al. NMR Biomed.(2005), 17; 1

Met

Men

GBM

Ast

B.Celda

Brain tumour biopsies ex vivo metabolic profile

NMR NMR BiomedBiomed. 2004;17:191-205. 2004;17:191-205

Brain tumour characterization ex vivo (HR-MAS)

http:// www.etumour.net; D. Monleón et al., ESMRMB (2005) #325(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)

M.C. Martínez-Bisbal et al. NMR Biomed.(2005), 17; 1

B.Celda

Fle 158Metastasis

In vivo ERM 30 ms a 1,5 T

in vivo ERM 30 ms a 1,5 T

ex vivo HR-MAS a 11,5 T

ex vivo HR-MAS a 11,5 T

Fle 153Ganglioglioma

Perfil Metabólico ex vivo Biopsias Hígado

NMR NMR BiomedBiomed. 2006;19:90-100. 2006;19:90-100

Glucosa /LipI

p = 0,01 p = 0,026

Lip I/LipII Alanina/Lisina

p < 0,001

Breast cancer diagnosis and invasion High-Resolution 1H NMR

C.E. Mountford et al. Chem. Rev. (2004), 104; 3677C.E. Mountford et al. Br. J. Surg. (2001), 88; 1234C. Lean et al., J. Women´s Imaging (2000), 2; 19

1H NMR spectra at 8.5 T, 37 C ofbreast fine needle aspiration biopsy

benign vs malignantAccuracy 96% (Cho/Cr) lymph node vascular invasionAccuracy 95% 94%

malignant bening

1H NMR spectra at 8.5 T, 37 C ofbreast ductal carcinoma in situ (DCIS)fine needle biopsy

Breast cancer grading and lymph node status (HR-MAS)

B. Sitter et al. NMR in Biomedicine 2002; 15: 327T.F. Bathen et al., Proc. Intl. Soc. Reson. Med., 13 (2005), 130L.R. Jensen et al., Proc. Intl. Soc. Reson. Med., 13 (2005), 131

1H HR-MAS CPMGPRaliphatic region of a breasttumour tissue at 14 T

• Breast cancer grading for invasive ductal carcinoma IDC

IDC I IDC II IDC IIISensitivity 100% 84% 81%Specificity 100% 83% 86%

B) Breast cancer lymph node status prediction by HR-MAS

Actual negative Actual PositiveSensitivity 92% 97%Specifity 97% 92%

Cervical cancer diagnosis in vivo MRS + ex vivo (HR-MAS)

M.M. Mahon et al. NMR Biomed. (2004), 17; 1

normal control

normal control

10 cm3 squamouscell carcinoma

Invasive cervicalcarcinomasagittal T2 TSEendovaginal coil 1.5 TTR 2 s TE 80 ms

1H MRS SV 3.4 cm3 PRESS spectraTR 1600 msTE 135 ms

normal uterine tissue

squamous cell carcinomauterine cervix

ChoCr

TriglycerideCH2

1H presat HR-MAS alipahtic region at 11.7 T 25Clipid and Choline levels markedly increased insquamous cell carcinoma biopsy

biomarker ofinvasive cervicaltumour (74% oftumours NOT incontrol p<0.001)

-CH2

GBM

MEN

MET

OLIGO

A II

Not supervised analysisHierarchical cluster

GBM, OA, AII, MET, MEN.

Supervised LDA analysis

PangenomicPangenomic DNA DNA microarraysmicroarrays eTUMOUReTUMOUR protocols protocols

Gly Cho Cr Ala Lac

Lung Metastases

CPMG

PCA

Lung Metastases vs Breast Metastases

Breast Metastases

CPMG

GBM high lipids content vs GBM lower lipid amount

GBM with high lipidscontent

GBM with lower lipidcontent and higherintensity for mobilemetabolites

PCA

Perfil metabólico Plasma

Lipoprotein diameter (nm)

Rel

ativ

e N

MR fre

quen

cy (

Hz)

LIPOPROTEIN PANEL

Des irableOptimal B orderline-High High Risk

1100 - 1399 great er than 18001400 - 1799les s t han 1100

Coronary Heart Disease (CHD) Risk Categories

Posit ive Ris k Factor

less than 21

Negative R isk Fac tor

greater than 40

Intermedi ate

40 - 21

Higher-R iskgreatert han 27

Intermedi ate7 - 27

Lower-Ris kless than 7

*

LipoMe d, Inc. 0 4/99

LipoMed, Inc.3009 New Bern Avenue

Raleigh, NC 27610www. lipoprof ile.com

Prod uced und er pa tent licensesto U. S. Paten t Nos. 4,933 ,844an d 5,34 3,389

Page 1 of 2Pat ient Name

Specimen ID

Dat eCo llect ed

Pa tien t ID

Sex Age

Date Received Dat eReported

Bir th Dat e

PhysicianN ame& Address

Phone: ( )FA X: ( )

M

7-29-36

8-24-99 8-25-99 8-26-99

LM018820

63

Comments

Pat tern A (large LDL)

Lower-Risk22.0 - 20.6

Pat tern B (small LDL)

Higher-Ri sk20.5 - 19.0

LDL Particles 1654nmol/L

16mg/dL

Large HDL

35mg/dL

Large VLDL

19.1nm

LDL Size

RISK ASSESSMENT PANEL

ElevatedLDL Particles

>1400 nmol/L

AtherogenicDyslipidemia

2 traitsSmal l LD LPattern B

( 20.5 n m)

Ele vatedLarge VLDL

(> 27 mg/dL)

Re duce dLarge HDL

(< 21 mg/dL)

Diagnostic Traits of Atherogenic Dyslipidemia

NMR LipoProfile NMR LipoProfile

(mg/ dL Tr igly cer ide) (mg/dLC holestero l)

(mg/dL Choles terol)

-

(35)

(0)(5)

(16)

(21)

(107)

(18)

(H1+H2)(L1 )(L2)( L3)(V1+V2)(V3+ V4)(V5+ V6 ) (H3+H4 +H5)

Lar geVLDL

MediumVLDL

Smal lVLDL

LargeLDL

MediumLDL

SmallLDL

LargeHDL

Smal lHDL

SUBCLASS LEVELS

IDL

VLDL Subclasses LDL Subclasses HDL Subclasses

LipoM ed, Inc. 0 4/99

LipoMed, Inc.3009 New Bern Avenue

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Prod uced un der p atent license sto U.S. Paten t Nos. 4,93 3,844a nd 5,34 3,389

Pag e 2 of 2

D es ira b le Bo r de r line -H igh H ig h

le ss th an 2 00 20 0 - 2 3 9 2 40 o r g r ea te r18 5m g/d L

18 1

3 7

112m g/d L

m g/d L

m g/d L

Ne ga tiv e R isk Fac to r I nt er m ed ia te P osi tive Ri sk Fa ct or

6 0 or g re at er 5 9 - 35 les s t ha n 35

De sir a ble Bo rd e rlin e- Hig h H igh

le ss tha n 2 00 20 0 - 4 0 0 4 00 - 1 ,0 00

Current NCEP Risk CategoriesNMR LIPID PANEL

De sir a bleO pt im al Bo rd e rlin e- Hig h H igh R isk

1 00 - 1 29 g re at er th a n 1 6 01 30 - 15 9le ss th an 1 00

Total Cholesterol

Triglycerides

LDL Cholesterol

HDL Cholesterol

*

Pat ien t Na m e

LM018820 08-26-99

Spe cim en ID Da te Rep or te d

(0 )

Rat urines afterRat urines afterdosage ofdosage ofliver- andliver- andkidney-toxinskidney-toxins

600 MHz-1H600 MHz-1Hnoesypr1dnoesypr1d64scans64scans

Sprague Sprague DawleyDawley + +Han-Han-WistarWistarare standardisedare standardisedlaboratory rat strainslaboratory rat strains

HexachloroHexachloro-- butadiene butadiene

ThioThio--acetamidacetamid

HydrazinHydrazin

SpragueSprague DawleyDawley control control

HanHan WistarWistar control control

Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))

CoomansCoomansPlotPlotshowingshowing95%95%confidenceconfidencelevellevelofofclassificlassifi--cationcation

normal ratnormal raturinesurinesversusversustoxin treatedtoxin treatedurinesurines

Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))

Classification of hydrazine induced Classification of hydrazine induced hepatotoxicityhepatotoxicity against againstrenal corticalrenal corticaltoxicity andtoxicity andcontrolscontrolsbased onbased onrat urinerat urine1D-NMR1D-NMRspectraspectra

Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))

Time course Time course in rat urines in rat urines after dosage after dosage ofofa-a-naphtylisonaphtyliso--thiocyanatthiocyanat(ANIT,(ANIT,liver toxin)liver toxin)

96-120h96-120h

lactatelactate72-96 h72-96 h

acetateacetate48-72 h48-72 h

32-48 h32-48 h

bile acidsbile acids24-32 h24-32 h

glucoseglucose8-24 h8-24 h

0-8 h0-8 h

controlcontrol

Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))

Metabolomic of gene alterations from DNAreparation

1D 1H spectracomparison ofbreast cellcultures withBRCA geneblocked and notblocked

The mostsignificantchanges in themetabolite profileare marked

ColaborationColaboration withwithDra. Dra. ArmengodArmengodFVIBFVIB

Cell Culture differences CONTROL/AICAR

Sample 124

Lactate

Lípids Lípids

Choline

Alanine

Creatine?Lysina?Asparagine?

Lípidos

Lactate

Glucose,amino acidsbetaine

Glucose,amino acids

ColaboraciónProf. JM. EspluguesF. Medicina

Breast Cancer HR-MAS

Visualización Apoptosis RMNa) Evolución temporal de 1H-ERMde un glioma transfectado HSV-tktratado in vivo con glanciclovirb) RMI convencional de un glioma notratado.c) Imagen de microscopía electrónica detransmisión (x5000) de célulastumorales no tratadasd) Gotas de lípidos flechas vacías;cuerpos de apoptosis triángulos negrosen células tumorales no tratadas

e) En tumores tratados (4 días) gotasricas en ácidos grasos poliinsaturadosseñaladas mediante flechas abiertas.

Hakumäki y Brindle, Trends in Pharmac. Sci. ,24,3 (2003)

Visualización Apoptosis RMN

Hakumäki y Brindle, Trends in Pharmac. Sci. ,24,3 (2003

Imágenes de 1H RMI de un tumor de ratón tratado con glanciclovir posteriores a lainyección del agente de contraste C2-SPIO. (a) imagen previa a contraste; (b), (c), (d),(e) a 11, 47, 77 y 107 min después. Las áreas de apoptósis, captan contraste, áreas depérdida de intensidad (flecha blanca). Imágenes inferiores sustracciones.

CLASclasificación module

ProteinsProteins vsvs MetabolitesMetabolites(0.1-3KDa)(0.1-3KDa)

MetabonomicMetabonomic ofof Folicular Fluid Folicular Fluid

Contribución Clínica y Biomédica RMN Alto CampoContribución Clínica y Biomédica RMN Alto Campo

•• Diagnóstico Clínico BiofluidosDiagnóstico Clínico Biofluidos•• Diagnóstico Clínico TejidosDiagnóstico Clínico Tejidos•• Estudios Biomédicos Líneas CelularesEstudios Biomédicos Líneas Celulares•• Estudios Estudios FarmacocinéticosFarmacocinéticos:: TejidosTejidos BiofluidosBiofluidos•• Desarrollo Desarrollo BiomarcadoresBiomarcadores:: DiagnósticoDiagnóstico Diseño FármacosDiseño Fármacos•• Mejora Compresión Bioquímica PatologíasMejora Compresión Bioquímica Patologías

NMR ApplicationsNMR Applications

MRI +MRI + 9,6 - 100 9,6 - 100 0,25 - 3,0 0,25 - 3,0 < 100 < 100 5 5 human humanMRS MRS bodybody((clclíínicalnical))

MRI +MRI + 41 - 300 41 - 300 1,0 - 7,1 1,0 - 7,1 < 30 < 30 22 smallsmall animalsanimalsMRSMRS ( (rabitsrabits,, mousesmouses……))((biomedicinebiomedicine))

MiniimagingMiniimaging 300 - 400 300 - 400 7,1 - 9,4 7,1 - 9,4 < 12 < 12 0,005 0,005 mousesmouses

NMR NMR 200 - 600 200 - 600 4,7 - 14,1 < 2,5 4,7 - 14,1 < 2,5 0,00005 0,00005 insectsinsects,,MicroscopyMicroscopy materialsmaterials,,

embrionsembrions

NMRNMR 400 - 900 400 - 900 9,4 - 21 9,4 - 21 < 40 < 40 ÅÅ proteproteíínsns, DNA,, DNA,multidimensional multidimensional tissuestissues......

TypeType 11H(H(MHzMHz)) MagneticMagnetic SizeSize SpatialSpatial ApplicationApplicationresonanceresonance FieldField ( (cmcm) ) resolutionresolution SystemSystem

frequencyfrequency IntensityIntensity (T) (T) (mm (mm33))

B.Celda FIHCV-06

AknowledgmentsHospital La Ribera-AlziraDr. J. PiquerDr. E. MolláDr. A. RevertDr. P. FerrerIVO- ValenciaDr. J. CerveraDr. A. MarhuendaDr. A MenendezF. Medicina (UVEG)-ValenciaProf. F. PallardóProf. J.M. RodrigoProf. M. CerdáDr. M. MataHospital Clínico-ValenciaDr. J. Del OlmoDr. J. TalamantesFundación Investigación H.ClínicoClínica QuirónDr. L. Martí-BonmatíBruker Biospin Lab of ApplicationsDr. M. PiottoDr. O. Assemat

eTUMOUR Consortium Prof. C. Arús (UAB-Barcelona)Dr.F. Howe (SGHMS-London)Prof. A. Heerschap (UMCN-Nijmengen)Prof. L. Buydens (KUN-Nijmengen)Dr. C. Segerbart (INSERM-Grenoble)Mr. M Lluch (Microart-Barcelona)Dr. A. Capdevilla (HSJD-Barcelona)Dr. G. D’Incerti (PQE-Milan)Dr. L. Visani (PQE-Milan)Prof. S. Van Huffel (KUL-Leuven)Dr. P. Kreisler (Siemens-Etlinger)Dr. A. Klaasen (SCITO-Paris)Dr. M. Robles (UPVLC-Valencia)Dr. S. Wolfhard (DKFZ-Heidelberg)Dr. C. Brevard (Bruker-Biospin-Wissembourg)Dr. R. Grundy (BU-Birmimghan)Dr. F. Berger (INSERM-Grenoble)Dr. J. Calvar (FLENI-Buenos Aires)Dr. W. Gajewicz (MUL-Lodz)

UVEG-ValenciaDr. V. Esteve; MB Martínez-GranadosE. Piñero; R. Ferre

B.Celda IIIGERMN