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Metabolismo II Bases metabólicas de utilidad para la

identificación de microorganismos Prueba de la Oxidasa Ejemplo de algunas aplicaciones:

Diferenciar aislamientos patógenos(familias) : Pseudomonadaceae de Enterobacteriaceae Diferenciar especies del mismo género: Brucella ovis: Oxidasa (-); Brucella abortus: Oxidasa (+)

Principio: Se basa en la detección de una de las enzimas que constituye el sistema citocromo oxidasa. El sistema es multienzimatico y se encuentra en bacterias con metabolismo respiratorio

¿Por que razón puede ser necesario diferenciar Enterobacteriaceae de Pseudomonadaceae?

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identificación de microorganismos Prueba de la Oxidasa

Fundamento (base metabólica en la que se sustenta esta prueba) La prueba está basada en que las bacterias con metabolismo respiratorio cuentan con sistema enzimático citocromo oxidasa constituido por un grupo de enzimas diferentes (compuestos que contienen ferroporfirinas, y se clasifican como citocromo a1; citocromo a2, citocromo a3 y citocromo o). Algunos microrganismos (especies, géneros o hasta familias enteras) pueden producir una enzima oxidasa particular (oxidasa c = suma de citoromo a1 y a3), que participa de la cadena citocromo oxidasa, y en presencia de O2 atmosférico es capaz de oxidar a un compuesto específico (oxalato de para-amino-dimetil-anilina ) generando un compuesto coloreado, el indofenol. La prueba oxidasa consiste en determinar la presencia de la enzima citocromo oxidasa c en particular, y no el resto de las enzimas del sistema o cadena respiratoria


identificación de microorganismos Prueba de la Oxidasa Realización de la prueba: .

Una alternativa estandarizada y comercialmente disponible, consiste en la utilización de discos impregnados con oxalato de para-amino-dimetil-anilina. Se puede realizar al prueba en seco o en medio acuoso. Prueba en seco: Colocar una ansada de un cultivo sólido del microorganismo a evaluar, sobre un disco de oxidasa. Esperar 1 minuto para evaluar la formación de color. Si se ha desarrollado color oscuro (violáceo, azul) la reacción es positiva, como consecuencia de que el microorganismo posee la enzima citocromo oxidasa c capaz de degradar el compuesto, liberando un componente cromogénico

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identificación de microorganismos Prueba de la Oxidasa Realización de la prueba: .

Prueba en medio acuoso: Preparar una suspensión bacteriana del microorganismo a evaluar en un tubo usando aprox o,2 ml de agua destilada, colocar luego un disco de reactivo y evaluar la producción de color lila o fucsia. La reacción debe ser inmediata, pasado el minuto de reacción la aparición de color ya no tiene significado diagnostico. Prueba sobre agar: Se colocan gotas de reactivo con el sustrato sobre colonias de un cultivo puro del microorganismo a evaluar. Si el microorganismo tuviera la enzima, en menos de un minuto la misma liberaría el cromogeno del sustrato generando color

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identificación de microorganismos Prueba de la Oxidasa

Realización de la prueba: . Una alternativa estandarizada y comercialmente disponible, consiste en la utilización de discos impregnados con oxalato de para-amino-dimetil-anilina. Se puede realizar al prueba en seco o en medio acuoso. Prueba en seco: Colocar una ansada de un cultivo sólido del microorganismo a evaluar, sobre un disco de oxidasa. Esperar 1 minuto para evaluar la formación de color. Si se ha desarrollado color oscuro (violáceo, azul) la reacción es positiva, como consecuencia de que el microorganismo posee la enzima citocromo oxidasa c capaz de degradar el compuesto, liberando un componente cromogénico

Puntos críticos: . El reactivo es muy sensible a la luz y a la alta temperatura. Debe conservarse resguardándolo de estos factores que acortan su vida útil. Usar siempre controles positivo y negativo.


identificación de microorganismos Prueba de la Catalasa

Usos: Diferenciar géneros: Staphylococcus Vs Streptococcus Bacillus Vs Clostridium Diferenciar especies: Moraxella bovis de otras especies del género

Principio: Comprobar la producción de la enzima por una bacteria en cultivo puro

Introducción: Esta enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que poseen metabolismo respiratorio aerobio, aunque hay excepciones como el género Streptococcus Esta enzima es una hidroxiperoxidasa

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Bioquímica y fisiología celular:

Glucosa-6-P

K

Acido pirúvico

O2

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Técnica: Realizar a 25 ºC con H2O2 al 30% Respetar la secuencia de pasos Agitar el H2O2 antes de usar eliminando O2 libre Resguardar el H2O2 al abrigo de luz y TºC Evitar contaminar la reacción con sangre del cultivo Estandarizar la concentración de H2O2 en cada laboratorio Hacer la prueba con cultivo fresco

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identificación de microorganismos Prueba de Citrato:

Principio: Determinar si un microorganismo es capaz de usar el citrato como única fuente de carbono.

Uso: Diferenciar géneros de enterobacterias entre sí, como parte de una batería de 4 pruebas (IMViC)

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Base bioquímica:

Glucosa-6-P

K

Acido pirúvico

Citrato

Oxalacetico + Acetil CoA = Citrato

Acido fórmico Citrato Oxalacetico Acetoina Lactato

Citritasa

Resultado de la citratasa según pH del medio

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Técnica: *Preparar un pico de flauta con el medio (citrato, sales de amonio, NaCl, indicador de pH) *Inocular un cultivo liviano *Utilizar un cultivo fresco *No arrastrar nutrientes del cultivo anterior (ej.: hacer suspensión acuosa) *Incubación hasta 4 días si da negativo *El uso del citrato como única fuente de carbono (presencia de citritasa) se pone en evidencia por al alcalinización del medio debido a la liberación de NH3.

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identificación de microorganismos Fermentación de Hidratos de Carbono:

Principio: Determinar la capacidad de un microorganismo para utilizar un hidrato de carbono específico, mediante la formación de ácido, gas o ambos como evidencia.

Objetivo: Por el uso de la glucosa: Diferenciar diferentes géneros entre sí: Staphylococcus Vs Micrococcus Diferenciar diferentes familias entre sí: Pseudomonadaceae Vs Enterobacteriacea

Por el uso de la lactosa: Diferenciar diferentes géneros entre sí: Escherichia Vs Salmonella



Bases bioquímicas: Hidratos de carbono: Monosacáridos: ribosa (5C); glucosa (6C) Disacáridos (glucósidos): sacarosa, maltosa, lactosa Trisacáridos: rafinosa Polisacáridos: Alcoholes polihídricos: manitol, sorbitol Ciclitoles: inositol

Polímero de monosacáridos

Reducción de monosacáridos

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Fermentación: Definición: Resultado de una fermentación depende de: El sustrato El arsenal enzimático del microorganismo (genoma) Factores ambientales (TºC, pH) Gases: Hidrogeno y Dióxido de C; Ácidos, Alcoholes, Cetona No todos los HdC son degradados pro todos los microorganismos No todos los microorganismos que usan los HdC, los usan en las mismas vías metabólicas Un microorganismo puede utilizar un mismo HdC generando diversos

resultados según el contexto

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identificación de microorganismos Fermentación de Hidratos de Carbono: Bases bioquímicas

PIRUVATO

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identificación de microorganismos *Pueden ocurrir 1 o varios ciclos simultáneamente, según el ambiente y capacidad genética del microorganismo (Ciclo de pentosas, glucólisis, Entner-Doudoroff)

* A partir del piruvato, existen diferentes fermentaciones:

Alcohólica: generalmente a partir de Embden-Meyerhof Láctica: homoláctica: generalmente a partir de Embden Meyerhof heteroláctica: por cualquiera de las 3 vías de generación de piruvato genera varios productos: acético, fórmico, etanol, CO2, glicerol Propiónica: característica de microorganismos anaerobios piruvato ……ac succínico …….. Ac propiónico Butílica: característica de microorganismos anaerobios (Clostridium) genera acético, alcohol butílico, acido butírico, acetona, isopropílico, CO2 y H2 Coliforme: característica de enterobacterias. 2 tipos: fermentación acido mixta y butilenglicol generalmente son mutuamente excluyentes (salvo excepciones) -fermentación ácido mixta: gran variedad de productos finales: formico, acético, láctico, succínico, etanol, CO2, H2. Nunca produce butilenglicol. Se pone en evidencia con la prueba de Rojo de Metilo -fermentación del butilenglicol: el butilenglicol es el producto principal. Se pone en evidencia con la prueba de Voges Proskauert


identificación de microorganismos

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Prueba de rojo de metilo: Determina la capacidad de un microorganismo para fermentar la glusa-6-P por la vía de fermentación acido mixta, cuyo resultado se caracteriza por un producto con pH menor

a 4,5



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Prueba de Voges Proskauert: Determina la capacidad de un microorganismo para fermentar la glusa-6-P por la vía del butilenglicol, cuyo resultado se caracteriza por la aparición de un subproducto denominado acetoína, que reacciona con hidróxido de potasio y con α naftol, dando un

producto final con color rojo ladrillo a rojo cereza



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Fermentaciones de diferentes hidratos de carbono: Re prepara una serie de tubos con medio basal libre de hidratos de carbono. A cada tubo, luego, se le agrega uno solo de una serie de hidratos de carbono de utilidad para identificar especies dentro de un genero de interés. Luego, a cada tubo se le inocula el microorganismo de interés, y tras la incubación (en condiciones apropiadas para cada microroganismo) se obtendrá un patrón de fermentación (en el caso de la figura:

Es:+; Ma:+; Ra:+; Gl:+; Xi:-; Mol:-. B=control negativo de esterilidad del medio

Y el control positivo?



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Prueba de óxido-fermentación: Es de utilidad para saber si un microorganismo es capaz de fermentar la glucosa, oxidarla en presencia de oxigeno como aceptor final, oxidarla y fermentarla, o si en su defecto el microroganismo es incapaz de usar la glucosa. Se realiza de a pares (dos tubos por cepa microbiana, uno para evaluar oxidación de glucosa y otro para evaluar fermentación, este ultimo con algún recurso para privar al microroganismo de oxigeno y obligarlo a fermentar en caso que sea capaz de hacerlo). El medio tiene un indicador de pH que, al

acidificarse, cambia de verde a amarillo.

O/F= -/- O/F= +/- O/F= +/+ O/F= -/+ Control negativo Aerobio estricto Anaerobio facultativo Anaerobio estricto



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