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1
DETERMINACIÓN DE LA SAPOGENINA MAYORITARIA OBTENIDA DE LAS
SAPONINAS DE HOJAS DE UGNI MOLINAE, TURCZ. (MURTILLA) Y EVALUACIÓN
DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE GLICÓGENO FOSFORILASA A
Memoria para optar el título de Químico Farmacéutico
MARCELO EDGARDO PEÑA CERDA
Profesora Patrocinante
DRA. CARLA DELPORTE VERGARA
Depto. de Química Farmacológica y
Toxicológica
Directora de Tesis
DRA. CARLA DELPORTE VERGARA
Depto. de Química Farmacológica y
Toxicológica
Santiago, Chile
2011
UNIVERSIDAD DE CHILE
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica
2
A mis padres y mi novia
3
Agradecimientos
Debo primero agradecer a Dios por todas las oportunidades que me ha dado y la vida
hermosa que me ha entregado.
Agradezco a mis padres, Enrique Peña Garrido y Delia Cerda González por apoyarme en
todo momento, por guiarme y enseñarme que la vida es más que caminar y observar, que debo
tomar decisiones, que debo elegir y darme la madurez para hacerlo de buena manera, y por sobre
todo, por ser los pilares que sostuvieron cada movimiento que realice.
Agradecer eternamente a la Profesora Carla Delporte, por ser un apoyo incondicional en
el desarrollo de esta memoria, su preocupación por mi persona, por los gratos momentos
entregados, por su paciencia y por siempre haber creído en mí.
A Pamela Zapata, por ser el tercer pilar que he tenido durante estos cinco años de
carrera, por siempre estar ahí cuando he necesitado su compañía, por todo su cariño, amor y toda
la comprensión entregada en este tiempo.
A toda mi familia, por la constante preocupación mostrada durante el desarrollo de esta
memoria y de la carrera en general.
A mis amigos de la Universidad, Carolina Villagrán, Sebastián Salgado, Daniel Palma,
Christian Herbage, Camila Velásquez, Pamela Naranjo, Andrés Jeanmaire, Pablo Baeza, Paulina
Parada, Felipe Pinto, María Magdalena Penna, Katherin Larenas y Carolina Mayer les agradezco
cada momento vivido y las sonrisas compartidas.
A toda la familia del Laboratorio de Productos Naturales, por haberme acogido y tratado
como un igual. Agradezco especialmente a María José Queupil, Gabriela Valenzuela, Carlos
Cartagena, Consuelo Castro, Patricio Torres, León Goity, Yaidelin Piña y David Aravena,
personas que me han ayudado de manera especial en este tramo final de la carrera.
4
Financiamiento
Esta tesis fue financiada por el Proyecto FONDECYT N° 1100750 dirigido por la Dra. Carla
Delporte Vergara.
I
Índice general
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………………. V
ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………………… VII
ÍNDICE DE ANEXOS……………………………………………………………………….. VIII
ABREVIATURAS……………………………………………………………………………... IX
RESÚMEN…………………………..………………………………………………………… XI
ABSTRACT……….………………..………………………………………………………… XII
I. INTRODUCCIÓN……………………………..…………….………………………..………. 1
II. HIPÓTESIS………..………………………………….………………………………..…….. 4
III. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………. 4
III.1. Objetivos generales…………………………………………………………….…. 4
III.2. Objetivos específicos……………………………………………………………… 4
IV. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………… 5
IV.1. Reactivos………………………………………………………………………….. 5
IV.2. Material Vegetal…………………………………………………………………... 5
IV.3. Estudio Químico……………………………………………………………..……. 5
IV.3.i. Preparación de los extractos………………………………………….…. 5
IV.3.ii. Extracción líquido-líquido…………………………………………….... 6
II
IV.3.ii.a. Primer procedimiento para la obtención de saponinas mediante
sucesivas extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH…………………… 6
IV.3.ii.b. Segundo procedimiento para la obtención de saponinas
mediante sucesivas extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH en medio
alcalino………………………………………………………………………….. 7
IV.3.ii.c. Tercer procedimiento para la obtención de saponinas mediante
sucesivas extracciones líquido-líquido con EP: BuOH y BuOH en medio
alcalino………………………………………………………………………….. 8
IV.3.iii. Cuarto procedimiento para la obtención de saponinas mediante
extracción por Soxhlet………………………………………….…………..…………… 8
IV.3.iv. Procesos de eliminación de Taninos………….………………..……… 9
IV.3.iv.a. Precipitación con acetato de plomo……………………….… 9
IV.3.iv.b. Precipitación con Cafeína………………………………...... 10
IV.3.iv.c. Precipitación con Albúmina……………………………….. 10
IV.3.iv.e. Elución del EET por columna de poliamida……………….. 10
IV.3.iv.e.i. Recuperación del adsorbente de poliamida.……... 11
IV.3.v. Verificación de la eliminación de Taninos…………………………..... 12
IV.3.vi. Metodología final para la obtención del crudo de Saponinas (CS)…... 12
IV.3.vii. Análisis químico-cualitativo de las fracciones obtenidas………..….. 13
IV.3.viii. Análisis de CS mediante CLAE…………………………………….. 14
IV.3.ix. Hidrólisis de CS y obtención de CSH……………………….……….. 15
IV.3.x. Análisis de FSH mediante CLAE……………………………..………. 16
III
IV.4. Ensayo de inhibición de la GPa………………………………………………….. 16
IV.4.i. Preparación de los reactivos…………………………..……………….. 16
IV.4.ii. Protocolo del ensayo………………………………….………………..18
IV.5. Análisis Estadístico………………………………………………………..…….. 21
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES……………………………………………...…………. 22
V.1. Estudio Químico………………………………………………………………….. 22
V.1.i. Obtención de los extractos…………………………………..…………. 22
V.1.ii. Extracción líquido-líquido………………….………………………….. 22
V.1.ii.a. Primer procedimiento para la obtención de saponinas mediante
sucesivas extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH…………………. 22
V.1.ii.b. Segundo procedimiento para la obtención de saponinas
mediante sucesivas extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH en medio
alcalino………………………………………………………………………… 24
V.1.ii.c. Tercer procedimiento para la obtención de saponinas mediante
sucesivas extracciones líquido-líquido con EP: BuOH y BuOH en medio
alcalino………………………………………………………………………… 25
V.1.iii. Cuarto procedimiento para la obtención de saponinas mediante
extracción por Soxhlet…………………………………………………………………. 26
V.1.iv. Procesos de eliminación de Taninos…………………………………... 28
V.1.iv.a. Precipitación con acetato de plomo………………………… 28
V.1.iv.b. Precipitación con Cafeína……………………………..……. 29
V.1.iv.c. Precipitación con Albúmina………………………………… 29
IV
V.1.iv.e. Elución del EET por columna de poliamida……….……….. 30
V.1.v. Metodología final para la obtención del crudo de Saponinas (CS)……. 32
V.1.vi. Análisis de CS mediante CLAE………………………………………. 34
V.1.vii. Hidrólisis de CS y obtención de CSH………………………………... 35
V.1.viii. Análisis de CSH mediante CLAE…………………………………… 35
V.2. Ensayo de inhibición de la GPa…………………………………………………... 37
V.3. Análisis Estadístico……………………………………………………………….. 40
VI. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………. 41
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………. 42
V
INDICE DE FIGURAS Página
FIGURA 1: Fotografía de Ugni molinae Turcz. (Murtilla)……………………………….……. 1
FIGURA 2: Ejemplo estructural de una saponina, el asiaticósido…………………………….... 2
FIGURA 3: Esquema del primer procedimiento de obtención de saponinas mediante sucesivas
extracciones líquido-líquido con AcOEt y n-BuOH…………………………………..………… 6
FIGURA 4: Esquema del segundo procedimiento de obtención de saponinas mediante sucesivas
extracciones líquido-líquido con AcOEt y n-BuOH en medio alcalino…………………………. 7
FIGURA 5: Esquema del cuarto procedimiento de obtención de saponinas mediante extracción
por Soxhlet……………………………………………………………….……………………… 9
FIGURA 6: Esquema del procedimiento determinado para la obtención de CS………..….…. 13
FIGURA 7: Representación de la microplaca y distribución de las muestras en ella en el ensayo
de inhibición frente a GPa…………………………………………………………………… 19
FIGURA 8: CCF del primer procedimiento de obtención de saponinas utilizando una mezcla de
BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como fase móvil y PAS como reactivo
revelador………………………………………………………………………………….…… 23
FIGURA 9: CCF del segundo procedimiento de obtención de saponinas utilizando una mezcla
de BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como fase móvil y PAS como reactivo
revelador……………………………………………………………………………………….24
FIGURA 10: CCF del tercer procedimiento de obtención de saponinas utilizando una mezcla de
BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como fase móvil y PAS como reactivo
revelador………………………………………………………………………………………. 26
FIGURA 11: Análisis por CCF de las fracciones obtenidas mediante extracción por Soxhlet
utilizando una mezcla de BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como fase móvil y PAS
como reactivo revelador……………………………………………………………………… 27
VI
FIGURA 12: Reacción con FeCl3 de la muestra remanente obtenida mediante defecación…... 28
FIGURA 13: Formación del precipitado tanino-albúmina……………………………………. 29
FIGURA 14: Soluciones obtenidas de forma posterior a la centrifugación del precipitado con
albúmina………………………………………………………………………………………... 30
FIGURA 15: Reacción de cada fracción con FeCl3 en papel para analizar la presencia de taninos
remanentes tras la precipitación con albúmina…………………………………………………. 30
FIGURA 16: Muestra de 5 fracciones obtenidas por elución en CC de poliamida con MeOH
analizada por CCF utilizado PAS como reactivo revelador y BAW como fase móvil………… 31
FIGURA 17: Fracción EETft con FeCl3 para determinar la presencia de taninos……………... 31
FIGURA 18: Crudo de saponinas obtenido a partir del EET de las hojas de Ugni molinae….. 33
FIGURA 19: Análisis por CCF de CS utilizando PAS como reactivo revelador y una mezcla de
BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como fase móvil…………………………………… 33
FIGURA 20: Cromatograma obtenido de CS mediante CLAE a 201 nm. Columna Hiber 250-4
Purospher STAR RP-18 (5 m), flujo de 0,6 mL/min, una mezcla de acetonitrilo: ácido fórmico
0,1% = 60:40 como fase móvil y un volumen de inyección de 20 L………………………… 34
FIGURA 21: Hidrolizado (CSH) obtenido de CS……………………………………………... 35
FIGURA 22: Cromatograma obtenido de CSH mediante CLAE a 201 nm. Columna Hiber 250-
4 Purospher STAR RP-18 (5 m), flujo de 0,6 mL/min, una mezcla de acetonitrilo: ácido
fórmico 0,1% = 60:40 como fase móvil y un volumen de inyección de 20 L……………….. 36
VII
INDICE DE TABLAS
TABLA 1: Concentraciones de albúmina utilizadas en la precipitación de taninos…………... 10
TABLA 2. Condiciones cromatográficas para identificar saponinas, sapogeninas y flavonoides
por CCF………………………………………………………………………………………… 14
TABLA 3: Prueba de solubilidad en DMSO de CS y de CSH………………………………… 20
TABLA 4: Tabla resumen del ensayo de inhibición sobre GPa……………………………….. 20
TABLA 5: Rendimiento de los extractos obtenidos de las hojas de murtilla………………….. 22
TABLA 6: Áreas de cada pico obtenido en los cromatogramas de CS y de CSH…………….. 37
TABLA 7: Resultados de las absorbancias obtenidas en el ensayo frente a la GPa…………… 37
TABLA 8: Porcentajes de inhibición obtenidos tras en el ensayo con las muestras…………... 38
TABLA 9: Gráfico de comparación de los efectos inhibitorios de las muestras evaluadas y el
compuesto de referencia………………………………………………………………………... 40
TABLA 10: Test de comparaciones múltiples de Tukey……………………………………… 40
VIII
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1: Cromatogramas obtenidos por CLAE…………………………………………….. 45
ANEXO 1.a: Cromatograma CLAE obtenido para CS……………………………….. 45
ANEXO 1.b: Cromatograma CLAE obtenido para CSH……………………………... 46
ANEXO 2: Resúmenes de Congresos asistidos………………………………………………... 47
ANEXO 2.a: “Metabolitos secundarios responsables de la actividad antiinflamatoria de
las hojas de Ugni molinae (murtilla)”, XXXIII Congreso Anual de la Sociedad Chilena de
Farmacología (SOFARCHI)……………………………………………………………………. 47
ANEXO 2.b: “Obtención de un crudo de saponinas de las hojas de Ugni molinae y
evaluación de su efecto inhibitorio sobre la Glicógeno fosforilasa a”, XII Congreso Nacional de
Estudiantes de Química y Farmacia……………………………………………………………. 48
ANEXO 2.c: “Madecassic acid in the chilean Ugni molinae”, 52nd
Annual meeting of
the American Society of Pharmacognosy (San Diego, California)…………………………….. 49
ANEXO 2.d: “Obtención de un crudo de saponinas triterpénicas desde las hojas de Ugni
molinae”, XII Jornada de investigación en ciencia y tecnología, Facultad de Cs. Químicas y
Farmacéuticas de la Universidad de Chile……………………………………………………... 50
IX
Abreviaturas
A: Absorbancia obtenida por espectrofotometría
AcOEt: Acetato de etilo
AET: Fase acuosa obtenida mediante extracción por Soxhlet del EET
AETlt: Fase acuosa obtenida mediante extracción por Soxhlet del EET eluído
previamente través de una columna de poliamida
B: Blanco en el ensayo de inhibición frente a GPa
BuOH: Butanol
CC: Columna cromatográfica
CCF: Cromatografía en capa fina
CHCl3: Cloroformo
CH3COOH: Ácido acético
CLAE: Cromatografía líquida de alta eficiencia
CN: Control negativo en ensayo de inhibición frente a GPa
CNE: Control no enzimático en ensayo de inhibición frente a GPa
CS: Crudo de Saponinas obtenido desde las hojas de murtilla
CSH: Hidrolizado del crudo de saponinas obtenido desde las hojas de murtilla
DCM: Diclorometano
DMSO: Dimetilsulfóxido
EDCM: Extracto diclorometano de hojas de murtilla
EAE: Extracto acetato de etilo de hojas de murtilla
EET: Extracto etanólico de hojas de murtilla
EETlt: Extracto etanólico libre de taninos
EGTA: Ácido tetracético de etilenglicol
EH: Extracto hexánico de hojas de murtilla
EP: Éter de petróleo
F-AcEt: Fase acetato de etilo obtenida en el primer procedimiento de obtención de
saponinas
F-AcEtb: Fase acetato de etilo obtenida en el segundo procedimiento de obtención de
saponinas
X
F-But: Fase butanólica obtenida en el primer procedimiento de obtención de saponinas
F-Butb: Fase butanólica obtenida en el segundo procedimiento de obtención de saponinas
FeCl3: Tricloruro férrico
FO1: Fase orgánica 1 obtenida en la extracción con EP: n-BuOH en el tercer
procedimiento de obtención de saponinas
FO2: Fase orgánica II obtenida en la extracción con n-BuOH en el tercer procedimiento
de obtención de saponinas
G-1-P: Glucosa-1-fosfato
GPa: Glicógeno fosforilasa a
HCl: Ácido clorhídrico
HCOOH: Ácido Fórmico
KCl: Cloruro de potasio
M: Muestra evaluada en ensayo de inhibición frente a GPa
MeOH: Metanol
MgCl2: Cloruro de magnesio
Na2CO3: Carbonato de sodio
NaOH: Hidróxido de sodio
NH3: Amoniaco
NP/PEG: Reactivo revelador Natural Product/Polietilenglicol
PAS: p-anisaldehido sulfúrico
PbSO4: Sulfato de plomo
R-AET: Residuo remanente luego de la extracción por Soxhlet del EET
Rf: Factor de retardo en CCF
RP-18: Columna de fase reversa con relleno de C18
SAE: Sub-extracto obtenido mediante extracción por Soxhlet con acetato de etilo del
EET
SD: Solución de detención utilizada en ensayo de inhibición frente a GPa
SDCM: Sub-extracto obtenido por extracción Soxhlet con diclorometano de EET
SET: Sub-extracto obtenido mediante extracción por Soxhlet con etanol de EET
Tr: Tiempo de retención en CLAE
UV: Luz ultravioleta
XI
Resumen
La murtilla (Ugni molinae), Myrtaceae es un arbusto nativo, de gran importancia debido
a la exportación de sus frutos. Diversos estudios han comprobado la actividad analgésica y anti-
inflamatoria de las hojas de esta planta, siendo la más reciente, que las sapogeninas de esta
especie poseen efecto inhibitorio sobre la enzima glicógeno fosforilasa a (GPa).
Esto define los objetivos de este estudio, los cuales son: la obtención de un crudo de
saponinas (CS), la determinación de la sapogenina mayoritaria obtenida de la hidrólisis de CS
mediante CLAE y la posterior evaluación del efecto inhibitorio sobre GPa de CS y de su
hidrolizado (CSH).
Con este fin, se prepararon distintos extractos de hojas de murtilla con solventes de
polaridad creciente, siendo uno de ellos el extracto etanólico (EET). El EET fue eluído a través
de una columna de poliamida con MeOH, obteniéndose EETlt, el cual se secó para obtener su
rendimiento, y luego fue extraído con ayuda de un equipo soxhlet con agua, obteniéndose AET.
El sub-extracto AET fue filtrado, extraído con n-BuOH y rotavaporado, obteniéndose el
crudo de saponinas (CS), y comprobándose la presencia de saponinas mediante CCF (utilizando
p-anisaldehido como revelador). El CS fue redisuelto en HCl 2 N, y calentado a reflujo por 2
horas, el residuo obtenido fue filtrado y luego secado en estufa a 50° C, llamándose CSH.
Posteriormente, tanto CS como CSH, fueron analizados y comparados mediante CLAE,
lo que permitió determinar la sapogenina mayoritaria del hidrolizado, la cual resultó ser el ácido
asiático.
El efecto inhibitorio sobre GPa de FS y FSH fue evaluado mediante espectrofotometría,
utilizando cafeína como compuesto de referencia. De los resultados se obtuvo que el CS a altas
concentraciones presenta un efecto inhibitorio de un 60%, pero para el hidrolizado, el método no
fue capaz de determinar la inhibición por la alta absorbancia que presenta la muestra por si sola.
Estos resultados, permitieron contribuir al trabajo realizado en el laboratorio, y al mismo
tiempo permiten ampliar el conocimiento químico-farmacológico de esta planta nativa.
XII
Summary
“DETERMINATION OF THE MAYOR SAPOGENIN OBTAINED FROM THE
LEAVE´S SAPONINS OF UGNI MOLINAE, TURCZ. (MURTILLA) AND
EVALUATION OF THE INHIBITORY EFFECT AGAINST GLYCOGEN
PHOSPHORYLASE A”
The murtilla (Ugni molinae), Myrtaceae is a native shrub, with great relevance due to the
fruit´s exportation. Several studies have demonstrated the analgesic and anti-inflammatory
activity of the leaves, being the most recent, that sapogenins of this species have inhibitory effect
against glycogen phosphorylase a enzyme (GPa).
This defines the objectives of this study: to obtain a crude saponin fraction (CS), to
establish the mayor sapogenin obtained from the hydrolysis process, and to evaluate the
inhibitory effect of the CS and the hydrolysis product against GPa.
For this purpose, several murtilla leaves extracts were prepared with solvents of
increasing polarity, being one of them, the ethanolic extract (EET). The EET was eluted trough a
polyamide column with MeOH, yielding EETft, which was dried and then extracted with a
Soxhlet with water, obtaining AET.
The AET sub-extract was filtered and then extracted with n-BuOH and the solvent was
evaporated, obtaining a crude saponin fraction called FS, establishing the saponins presence by
TLC (using p-anisaldehyde as developer). The CS was dissolved in HCl 2 N, and heated to
reflux for 2 h, the obtained residue was filtrated and then dried in an oven at 50° C, obtaining
CSH. Both CS and CHS, were analyzed and compared by HPLC, which permits to determine
the mayor sapogenin obtained from the hydrolysis process, which turns out to be the asiatic acid.
The inhibitory effect of CS and CHS against GPa was assessed by spectrophotometry,
using caffeine as reference compound. From the results, it was determined an inhibitory effect of
about 60% for the CS at high concentrations, but the method wasn´t suitable enough to
determine the inhibitory effect of CSH, due to the high absorbance this fraction have for itself.
This memory, contributes significantly to the expansion of chemical and
pharmacological study of this native plant.
1
I. INTRODUCCIÓN
La murtilla (Ugni molinae, Turcz.), es una especie nativa perteneciente a la familia de
las Myrtaceae, la cual crece de forma arbustiva en los faldeos cordilleranos de las zonas centro-
sur del país. Actualmente, su cultivo ha ido adquiriendo gran importancia para el país, debido a
que sus frutos pequeños, de aspecto globoso y con agradable sabor y aroma, se han hecho muy
atractivos en repostería y licorería, lo que ha generado estudios de mejoramiento genético
(FONDEF, 2011) para lograr aumentar su exportación a países como Australia, Reino Unido
(Pastenes et al., 2003) y otros países de Europa y Norteamérica (FONDEF, 2011).
FIGURA 1: Fotografía de Ugni molinae Turcz. (Murtilla)
Al igual que otras plantas nativas, sus hojas han sido utilizadas principalmente por la
industria cosmética en la elaboración de diversos productos (Rubilar et al., 2006) debido a sus
propiedades anticelulíticas, astringentes y antioxidantes, lo que permite regenerar la piel y
neutralizar el stress oxidativo. Pero también han sido una alternativa terapéutica para la medicina
folclórica, siendo los infusos de sus hojas utilizados en el tratamiento de afecciones inflamatorias
y distintos tipos de dolor (Montenegro, 2000).
2
Mediante diversos estudios químico-farmacológicos realizados en el laboratorio de
Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de
Chile, se ha logrado comprobar la actividad analgésica (Delporte et al., 2007) y anti-inflamatoria
de diversos extractos seriados de Ugni molinae obtenidos en forma secuencial con hexano,
diclorometano, acetato de etilo y etanol (Aguirre et al., 2006). Aislándose por estudios químicos
bioguiados, diversos componentes triterpenoides como lo son los ácidos betulínico, corosólico,
alfitólico, asiático y la mezcla de los ácidos ursólico y oleanólico (Aguirre et al., 2006)
Estos compuestos se suman a otros triterpenoides obtenidos en estudios paralelos a esta
memoria, como son los ácidos madecásico y maslínico.
Las saponinas son un grupo de compuestos naturales cuyo núcleo principal puede ser de
naturaleza triterpénica como los anteriormente mencionados, unido covalentemente a uno o más
grupos glucosídicos. Su nombre proviene del latín sapo, el cual significa jabón, y que refleja
directamente la amplia habilidad de este tipo de compuestos de formar una espuma estable en
soluciones acuosas (Hostettman and Marston, 1995).
FIGURA 2: Ejemplo estructural de una saponina, el asiaticósido
Aunque el rol biológico de las saponinas en las plantas no está completamente
entendido, han sido generalmente consideradas como parte de su sistema de defensa, debido a
sus actividades antimicrobianas, fungicidas, alelopáticas e insecticidas (Francis et al., 2002;
Sparg et al., 2004).
O
O
OH
OH
OH
OO
OH
OH
CH2OH
OO
OHOH
CH3
OH
O
CH3
H3C
HCH3HO
HO
HO CH3H
H CH3
CH3
3
Por último, otros estudios revelan la presencia de polifenoles en los extractos polares de
las hojas de murtilla como flavonoides derivados de quercetina, mirecetina, canferol y
epicatequina, con sus respectivas capacidades antioxidantes comprobadas mediante estudios de
DPPH (Rubilar et al., 2006). Además, se ha comprobado en otros trabajos la presencia tanto de
taninos gálicos y catéquicos (a los que se les atribuye la propiedad astringente), y también de
antocianinas (Aguirre, 2007).
Estudios recientes han demostrado que algunos compuestos de naturaleza triterpenoide
como los ácidos oleanólico, asiático, corosólico, maslínico y ursólico (Wen, 2005) presentan
actividad inhibitoria sobre una enzima clave en la degradación del glicógeno, la glicógeno
fosforilasa a (GPa) (Chen et al., 2006), la cual se encuentra en dos isoformas, una forma activa,
llamada GPa, y una inactiva llamada GPb (Baker et al., 2005).
Glicógeno (n residuos) + Pi Glucosa-1-fosfato + Glicógeno (n-1 residuos)
La inhibición de la GPa, tiene grandes proyecciones para el tratamiento de cuadros
hiperglicémicos como los presentados en la diabetes, ya que permitiría disminuir y estabilizar a
niveles normales, la cantidad de azúcar presente en la sangre (Baker et al., 2005). Esto último
mencionado, sumado a la capacidad anti-inflamatoria y antioxidante ya determinadas para los
extractos, ha sido la motivación del estudio completo realizado en este laboratorio con el fin de
demostrar la eventual utilidad de la murtilla en la diabetes.
Estudios paralelos realizados en el laboratorio, han permitido observar la capacidad de
inhibición sobre la GPa, de los distintos extractos de la murtilla y de un sub-extracto rico en
triterpenoides (SAE).
Basándonos en los estudios previos señalados anteriormente, en esta memoria, la
investigación se centró en la determinación de la sapogenina mayoritaria obtenida del proceso de
hidrólisis de un crudo de saponinas (CS), evaluando la capacidad inhibitoria frente a la GPa del
CS y de su producto de hidrólisis (CSH). Contribuyendo de esta forma a expandir el
conocimiento químico y farmacológico de las hojas de U. molinae.
Glicógeno fosforilasa
a
4
II. HIPÓTESIS
La implementación de una técnica analítica por CLAE permitirá determinar la
sapogenina mayoritaria proveniente de la hidrólisis de las saponinas presentes en las hojas de
Ugni molinae.
La naturaleza triterpénica de las saponinas presentes en las hojas de murtilla, las hace
activas como inhibidores de la glicógeno fosforilasa a, al igual que su producto de hidrólisis.
III. OBJETIVOS
III.1. Objetivos generales
Contribuir al conocimiento químico y farmacológico de esta especie nativa,
determinando la sapogenina mayoritaria proveniente de la hidrólisis de un crudo de saponinas
obtenido desde las hojas de Ugni molinae, además de demostrar el efecto inhibitorio del crudo
de saponinas y del producto de hidrólisis sobre la glicógeno fosforilasa a, contribuyendo al
conocimiento químico y farmacológico de esta especie nativa.
III.2. Objetivos específicos
Obtener y estandarizar la metodología adecuada para obtener un crudo purificado de
saponinas desde las hojas de Ugni molinae.
Hidrolizar el crudo de saponinas para determinar por CLAE la sapogenina mayoritaria
presentes en las hojas.
Determinar la capacidad inhibitoria sobre la glicógeno fosforilasa a del crudo de
saponinas y de su producto de hidrólisis.
5
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
IV.1. Reactivos
Acetonitrilo y metanol para CLAE, ácido fórmico 98-100%, ácido clorhídrico 37%
fumante, solventes de grado de laboratorio para las extracciones, columnas cromatográficas de
poliamida, cromatofolios para cromatografía en capa fina, además de solventes p.a., para la
reacción enzimática como HCl 37% fumante p.a. o DMSO, fueron adquiridos en Merck
(Damstadt, Alemania).
El agua milli-Q fue preparada empleando un sistema Milipore Mili-Q Plus (Milipore,
Bedford, MA, USA).
Sustancias de referencia como cafeína, enzima glicógeno fosforilasa a (P1261-10MG),
glicógeno (G088G-1G), glucosa-1-fosfato (G7018-1G) y HEPES (H3375-100MG), además del
patrón de ácido asiático (546712-500MG) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Oakville, ON,
USA).
Sustancias como la albúmina bovina fracción V (P1503-25G) fue adquirida de
GibcoBRL (Grand Island, NY, USA).
IV.2. Material Vegetal
Las hojas de Ugni molinae Turcz., Myrtaceae fueron recolectadas en abril en la
localidad de Cauquenes, Región del Maule, Chile (35° 41´S; 71° 40´O) e identificadas
botánicamente por la Dra. Carla Delporte. Un testigo herbario fue almacenado (SQF-22462) en
la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile.
IV.3. Estudio Químico
IV.3.i.- Preparación de los extractos
El material vegetal seco (4500 g) fue extraído sucesivamente a temperatura ambiente
con solventes de polaridad creciente: hexano, diclorometano, acetato de etilo y etanol,
obteniéndose los extractos hexánico (EH), diclorometánico (EDCM), de acetato de etilo (EAE) y
etanólico (EET). Cada extracción fue realizada hasta el total agotamiento de las hojas, llevando a
sequedad el material vegetal remanente, antes de agregar el siguiente solvente.
6
Los extractos obtenidos fueron concentrados con la ayuda de un evaporador rotatorio
Büchi a presión reducida, y luego llevados a sequedad total mediante una corriente de aire
caliente. Finalmente, cada extracto seco, fue molido y posteriormente almacenado en un
recipiente plástico adecuado y debidamente etiquetado.
IV.3.ii. Extracción líquido-líquido
IV.3.ii.a. Primer procedimiento de extracción de saponinas mediante sucesivas
extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH
Se pesaron 4,0 g del EET de Ugni molinae, los cuales fueron llevados a un vaso de
precipitado de 600 mL, disueltos en 500 mL de H2O destilada con ayuda de un sonicador por 15
min y finalmente filtrados.
El filtrado obtenido fue llevado a un embudo de decantación de 1000 mL, y extraído
sucesivamente con 4 volúmenes de 200 mL de AcOEt y 4 volúmenes de 200 mL de BuOH.
Cada fracción respectiva, fue recolectada en un balón de fondo redondo, y concentrada con la
ayuda de un evaporador rotatorio Büchi a presión reducida. Finalmente, el concentrado fue
llevado a sequedad total, mediante el uso de una corriente de aire caliente. El polvo obtenido fue
almacenado en un frasco y etiquetado debidamente.
FIGURA 3: Esquema del primer procedimiento de obtención de saponinas mediante
sucesivas extracciones líquido-líquido con AcOEt y n-BuOH
AcOEt
n-BuOH
7
IV.3.ii.b. Segundo procedimiento de obtención de saponinas mediante sucesivas
extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH en medio alcalino
Se pesaron 4,0 g del EET de Ugni molinae, los cuales fueron llevados a un vaso de
precipitado de 600 mL, disueltos en 500 mL de H2O destilada con ayuda de un sonicador por 15
min, y finalmente filtrados.
Al filtrado obtenido, se le agregó 1,0 g de NaOH (para desplazar la solubilidad de los
compuestos polifenólicos hacia la fase acuosa), y agitado hasta total disolución, obteniéndose
una solución de color negro. La solución fue llevada a un embudo de decantación de 1000 mL, y
extraída sucesivamente con 4 volúmenes de 200 mL de AcOEt y 4 volúmenes de 200 mL de
BuOH. Ambas fracciones obtenidas fueron recolectadas en un balón de fondo redondo, y
concentradas con la ayuda de un evaporador rotatorio a presión reducida. Finalmente, el
concentrado fue llevado a sequedad total, mediante el uso de una corriente de aire caliente. El
polvo obtenido fue almacenado en un frasco y etiquetado debidamente.
FIGURA 4: Esquema del segundo procedimiento de obtención de saponinas
mediante sucesivas extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH en medio alcalino
F-AcEtb
F-Butb
NaOH
8
IV.3.ii.c. Tercer procedimiento de obtención de saponinas mediante sucesivas extracciones
líquido-líquido con éter de petróleo: BuOH y BuOH en medio alcalino
Para este procedimiento, 5,0 g del EET se disolvieron en H2O con ayuda de un sonicador
durante 15 min, para finalmente ser filtrados.
La solución fue extraída sucesivamente con 4 volúmenes de 200 mL de una mezcla que
contenía éter de petróleo (EP): BuOH = 5:1, y 4 volúmenes de 200 mL de BuOH, las respectivas
fracciones fueron recolectadas en un balón de fondo redondo, y concentradas con un evaporador
rotatorio.
Las soluciones concentradas fueron traspasadas a un frasco pequeño, rotuladas
debidamente, y llevadas a sequedad total con una corriente de aire caliente.
IV.3.iii. Cuarto procedimiento de obtención de saponinas mediante extracción por Soxhlet
Con el fin de realizar una extracción de manera más exhaustiva, se probó una extracción
en un equipo Soxhlet.
Para realizar este proceso, 5,0 g del EET de Ugni molinae, fueron pasados a un cartucho
de celulosa y colocados en el interior del extractor Soxhlet con 400 mL de H20 destilada,
llevándose a cabo la extracción hasta cumplir 9 ciclos (aprox. 1 hora por ciclo) hasta observar
que el agua utilizada para solubilizar el contenido del cartucho se encuentra transparente.
De esta manera, se obtiene una fase acuosa a la que llamaremos AET, por su parte, el
sólido remanente en el cartucho, se denominó R-AET y fue extraído sucesivamente con
diclorometano, AcOEt y EtOH, obteniéndose los sub-extractos denominados SDCM, SAE y
SET respectivamente.
Al sub-extracto AET, se le agregó 1,0 g de NaOH y se disolvió completamente hasta
obtener una solución negra.
El sub-extracto AET será sometido a extracciones sucesivas con 4 volúmenes de 200 mL
de AcOEt y BuOH. Las respectivas fracciones serán recolectadas en un balón de fondo redondo
y concentradas en un rotavapor giratorio a presión reducida, para finalmente ser llevadas a
sequedad total con el uso de una corriente de aire caliente.
9
FIGURA 5: Esquema del cuarto procedimiento de obtención de saponinas mediante
extracción por Soxhlet
IV.3.iv. Procesos de eliminación de taninos desde el EET
Con el fin de obtener un CS purificado, se procedió a buscar una manera de retirar los
taninos presentes en gran cantidad en el EET, característica de las mirtáceas.
IV.3.iv.a. Precipitación con acetato de plomo
Se pesaron 3,0 g del EET los que fueron disueltos en 3 mL de etanol caliente, y sobre
esta solución se vertieron 3 mL de una solución que contenía acetato de plomo 4% y ácido
acético al 0,5%, observándose la aparición de un precipitado verde de manera instantánea.
La mezcla obtenida fue centrifugada varias veces, obteniéndose el sobrenadante, el cual
fue recolectado, llevado a sequedad en rotavapor giratorio, y reconstituido con MeOH.
Para verificar la presencia de plomo en la muestra, se tomaron dos tubos de ensayo, a
uno se le agregó 1 mL de muestra y en el otro 1 mL de una solución de PbSO4 al 1% p/v (tubo
control) y se ajustaron a pH 9 con amoníaco diluido (10 %).
A cada tubo se le adicionó 1 mL de Na2CO3 al 1% p/v y se observó la presencia de un
precipitado blanco.
Este último control es importante, dado que los extractos son utilizados para realizar
pruebas biológicas, en las cuales el plomo pudiese actuar como un agente interferente de los
ensayos.
AcOEt
BuOH
F-AcEts
F-BuOHs
NaOH
10
IV.3.iv.b. Precipitación con Cafeína
En dos tubos de ensayo, se añadieron 1,0 g de EET a cada uno, y se disolvieron en 5 mL
de H2O, para luego ser filtrados. Posteriormente, a cada tubo se le agregó 0,5 g de cafeína,
verificándose la formación de un precipitado.
IV.3.iv.c. Precipitación con Albúmina
Se disolvieron 3,5 g de EET en 50 mL de H20, y luego se filtraron con papel filtro
Whatman N°1. De esta solución, se tomaron 8 alícuotas de 5 mL cada una, las que fueron
colocadas en tubos de ensayo.
A cada tubo, se les agregó una cantidad creciente de albúmina bovina como se muestra
en la Tabla 1:
TABLA 1: Concentraciones de albúmina utilizadas en la precipitación de taninos
N° Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
Albumina (mg) 0 20 40 60 80 100 150 200
Cada tubo se agitó, dejándolos reposar durante 3 h, para luego ser centrifugados y
separado el sobrenadante para análisis posteriores.
IV.3.iv.e. Elución del EET por columna de poliamida
Se utilizó una jeringa de 4 mL, colocándose en su base un filtro microsphere de 0,22 m
y rellenándola con 1,5 cm de poliamida. Por esta mini-columna se eluyeron 2 mL de AET
proveniente del equipo Soxhlet, recolectándose un líquido transparente, el cuál se analizó
mediante CCF.
En base a este mini-ensayo, se confeccionó una columna cromatográfica (CC) con las
siguientes especificaciones:
Cabeza: 2 cm
Cuerpo: 10 cm x 5,5 cm
Fase Móvil: MeOH
11
La CC fue confeccionada con 5,0 g del EET, con este fin se mezclaron los 5,0 g de EET
con poliamida y la mezcla se disolvió en MeOH hasta formar una papilla, Finalmente la cabeza
fue secada con la ayuda de una corriente de aire caliente, obteniéndose un polvo café
homogéneo, el cual se agregó a la cabeza de la CC.
Conectado al vacío, se eluyeron por la CC, volúmenes de 100 mL de MeOH, cada
fracción obtenida en el matraz kitasato se trasvasijó a un balón de fondo redondo, y se llevó a
sequedad con ayuda de un evaporador giratorio.
Las muestras se reconstituyeron con MeOH, y fueron pasadas a un frasco pequeño,
siendo rotuladas debidamente.
Cada fracción fue monitoreada mediante CCF, utilizando una mezcla de CHCl3:
CH3COOH: MeOH: H2O = 64: 32: 12: 8 como fase móvil y p-anisaldehído sulfúrico (PAS)
como reactivo revelador.
IV.3.iv.e.i. Recuperación del adsorbente de poliamida
El adsorbente utilizado en la preparación de la columna se puede recuperar para ser
reutilizado en otros estudios.
Para realizar esto, se retiró el adsorbente de la columna y se trasladó a un vaso de
precipitado, donde se suspendió en agua y se agregó un pequeño volumen (depende de la
cantidad de poliamida) de una mezcla que contiene hidróxido de amonio al 30% y agua
oxigenada al 30%, dejándose reposar la mezcla durante 24 hrs.
Al día siguiente, la suspensión se filtró y se lavó seguidamente con agua destilada hasta
que el sobrenadante sea incoloro, luego se lavó con acetona y el adsorbente se secó a 50° C en
una estufa.
12
IV.3.v. Reacción de verificación para corroborar la ausencia de Taninos
Para analizar la presencia de taninos en las fracciones obtenidas, se realizó la reacción
con FeCl3.
Para la reacción en papel, se colocaron 5 gotas de cada muestra en un cuadrado de papel
filtro Whatman N°1, y se colocaron 5 gotas de FeCl3 encima de la muestra, observando un
cambio en la coloración.
IV.3.vi. Metodología final para la obtención del crudo de Saponinas (CS)
Con todas las pruebas realizadas, se procedió a obtener un CS, lo más puro posible. En
base a esto, se determinó que la mejor manera de lograrlo, es mediante la siguiente secuencia:
1. Elución del EET por columna de poliamida
2. Unión de las fracciones que contienen saponinas y obtención de EETlt
3. Extracción mediante equipo Soxhlet con H2O y obtención de AETs
4. Extracción líquido-líquido con n-BuOH
Para realizar este proceso descrito, se pesaron 5,0 g de EET y se procedió como en el
punto IV.3.iv.e.
Mediante el análisis por CCF en gel de sílice, se determinaron las fracciones que
contienen saponinas y se juntaron en un balón de fondo redondo, para luego ser llevadas a
sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida, obteniéndose EETlt (extracto etanólico
libre de taninos).
EL EETlt, fue reconstituido con MeOH, y secado en un vidrio reloj, donde se evaporó el
MeOH con una corriente de aire caliente, quedando un polvo café claro, el cual fue raspado con
una espátula pequeña y pasado a un frasco, donde se obtuvo su rendimiento.
A continuación, se pesaron 2,0 g de EETlt y se colocaron en un cartucho de celulosa,
para realizar una extracción mediante un equipo Soxhlet con H2O, hasta completar 9 ciclos. La
solución resultante, fue filtrada, obteniéndose el AET.
13
s
El sub-extracto AETs fue extraído con 4 volúmenes de 150 mL de BuOH, las fracciones
butanólicas fueron reunidas y llevadas a sequedad con un evaporador rotatorio a presión
reducida, a una temperatura de 70° C, obteniéndose CS.
El CS fue reconstituido con 15 mL de MeOH, traspasado a un frasco pequeño, rotulado
debidamente y se determinó su rendimiento.
FIGURA 6: Esquema del procedimiento final determinado para la obtención del CS
IV.3.vii. Análisis químico-cualitativo de las fracciones obtenidas
Las fracciones obtenidas a lo largo de todas las pruebas y procesos, se llevó a cabo
mediante el uso de CCF en cromatofolios de gel de sílice Merck F-254.
Cabe mencionar que los ácidos asiático y madecásico, están presentes también en
Centella asiatica, cuyo extracto estandarizado ha sido utilizado en esta investigación como
patrón de referencia en cromatografía en capa fina (CCF) y cromatografía líquida de alta
eficiencia (CLAE). La fase móvil utilizada en las CCF fueron de acuerdo con Brinkhaus et al
(2000).
Debemos mencionar además, que dicho extracto de C. asiática contiene saponinas
triterpénicas, de forma similar que las hojas de murtilla.
EETlt
n-BuOH
CS
14
La utilización de distintas fases móviles y reveladores, dependía del tipo de compuesto
que se quería pesquisar, lo que se encuentra documentado en la Tabla 2.
TABLA 2. Condiciones cromatográficas para identificar saponinas, sapogeninas y
flavonoides por CCF.
Tipo de
Compuesto Fase Móvil utilizada Revelador utilizado
Saponinas
CHCl3: CH3COOH: MeOH: H2O
= 64: 32: 12: 8
BuOH: CH3COOH: H2O = 4: 1: 5
(BAW)
p-anisaldehído sulfúrico
(PAS)
Reactivo de Lieberman-
Burchard
Sapogeninas
BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60:
40: 5: 10
AcOEt: DCM = 80: 20
AcOEt: DCM = 1:1
p-anisaldehído sulfúrico
Reactivo de Lieberman-
Burchard
Flavonoides AcOEt: HCOOH: CH3COOH:
H2O: 10: 1,1: 1,1: 2,6 NP/PEG / UV 366 nm
Tanto los reveladores PAS, como el reactivo de Lieberman-Burchard, necesitan la
aplicación de calor (T° = 100° C) para que se observe la aparición de colores en el cromatofolio.
IV.3.viii. Análisis de CS mediante CLAE
La inclusión de una técnica cromatográfica eficaz y sensible, nos permitió determinar de
manera precisa y con poca cantidad de muestra, los compuestos presentes en el CS, y a la vez
pesquisar después del proceso de hidrólisis, la aparición de nuevas sapogeninas o un aumento de
las señales de las sapogeninas presentes antes de la hidrólisis.
La detección fue realizada a 201 nm para determinar la presencia de triterpenoides, y no
de polifenoles, estos últimos metabolitos secundarios por sus características moleculares,
absorben a mayores longitudes de onda.
15
Todos los análisis se llevaron a cabo en un equipo CLAE Waters 486 acoplado a un
detector UV/Visible Waters con arreglo de diodos.
Las características del equipo utilizado, se describen a continuación:
Columna Hiber 250-4 Purospher STAR RP-18 (5 m)
Flujo: 0,6 mL/min
Fase Móvil; Acetonitrilo: Ácido Fórmico 0,1% = 60: 40
Volumen de inyección: 20 L
Longitud de onda: 201 nm
Con estas características definidas, en un matraz aforado de 25 mL, se hizo una solución
de un CS de 3 mg/mL, la cual fue filtrada directamente a un vial, mediante un filtro Microsphere
de 0,22 m, quedando lista para el análisis.
Los cromatogramas del CS y del CSH fueron comparados con los cromatogramas de las
sapogeninas patrones y con el perfil cromatográfico del EET determinado previamente en el
laboratorio.
IV.3.ix. Hidrólisis del CS y obtención del CSH
La hidrólisis consiste en el proceso de ruptura del enlace glucosídico de la genina con el
heterósido. No hay estudios científicos que hayan identificado las saponinas presentes en las
hojas de murtilla. En esta memoria, la hidrólisis nos permitirá determinar la sapogenina
mayoritaria proveniente de dichos heterósidos.
Para llevar a cabo la hidrólisis, se disolvieron en 300 mL de HCl 2 N, 300 mg del CS,
los cuales fueron traspasados a un balón de fondo redondo, y colocados en un equipo de
calentamiento a reflujo para realizar la hidrólisis.
Luego de 3 h de calentamiento a reflujo constante, el equipo se apaga, se espera que se
enfríe a temperatura ambiente, y la solución obtenida se filtra al vacío, obteniéndose un residuo
café oscuro (CSH), el cual se lava de manera abundante con H2O para eliminar azúcares
remanentes.
16
El CSH se trasladó a un frasco pequeño, debidamente rotulado, para obtener el
rendimiento de la hidrólisis.
IV.3.x. Análisis de CSH mediante CLAE
Se llevó a cabo con las mismas características descritas en el punto IV.3.viii. Al igual
que en CS, se creó una solución de 3 mg/mL de FSH, la que filtrada directamente a los viales del
CLAE mediante un filtro Microsphere de 0,22 m, quedando lista para el análisis.
El análisis de los resultados se llevó a cabo en base a los picos observados y sus áreas,
comparándolas con el cromatograma obtenido en el análisis de CS.
IV.4. Ensayo de inhibición de la GPa
La actividad inhibitoria sobre la enzima glicógeno fosforilasa a (GPa) de músculo de
conejo fue determinada basándonos en el método descrito anteriormente por Martin et al. (1998).
Mediante este método, y al contrario de lo que ocurre en el organismo, se determina
colorimétricamente la liberación de fosfato desde glucosa-1-fosfato en la dirección de la síntesis
de glicógeno.
IV.4.i. Preparación de los reactivos
Para la preparación de todos los reactivos se debe tener la precaución de que no haya
iones fosfatos en el medio que no hayan sido generados por la actividad enzimática. Para lograr
esto, se lavaron todos los materiales con jabones libres de fosfato, los que luego fueron
enjuagados exhaustivamente con agua destilada y finalmente con agua milli Q.
a) Solución B: HEPES 50 mM (pH 7,2)
Se prepararon 100 mL de solución, para esto se pesaron 2,174 g de HEPES, los que
se disolvieron en una cantidad mínima de H2O milli-Q con el fin de lograr sumergir
el electrodo del medidor de pH previamente calibrado.
En agitación permanente, se ajustó el pH agregando lentamente HCl 37% p.a. hasta
lograr un pH aproximado de 7,8, el que luego se ajustó a pH 7,2 mediante el uso de
HCl 37% diluido.
17
La solución obtenida se llevó a un matraz aforado de 100 mL y se completó el
volumen.
b) Solución BS: (Buffer + sales) pH 7,2
Para preparar 25 mL, se pesaron 8,314 mg de HEPES en un vaso de precipitado de
100 mL, los cuales se diluyeron en una cantidad mínima de H2O milli-Q para
sumergir el electrodo del medidor de pH previamente calibrado.
En agitación permanente, se ajustó el pH agregando lentamente HCl 37% p.a. hasta
lograr un pH aproximado de 7,8.
Durante la misma agitación se agregaron 466,1 mg de KCl, 59,4 mg de EGTA y
14,9 mg de MgCl2.
El pH fue nuevamente ajustado a pH 7,2 mediante el uso de HCl 37% diluido.
La solución obtenida se llevó a un matraz aforado de 25 mL y se completó el
volumen.
c) Solución de detención SD
Se prepararon 250 mL de la solución de detención (SD), para esto se pesaron 2,5 g
de molibdato de amonio y 95 mg de verde de malaquita, los cuales fueron llevados a
un matraz aforado de 250 mL, y se disolvieron en una cantidad mínima de H2O
milli-Q.
Al matraz se le agregó un volumen de 25 mL de HCl al 37%, y luego se aforó con
H2O milli-Q a un volumen de 250 mL.
La solución contenida en el matraz fue disuelta con ayuda de sonicador durante 30
min, y luego fue filtrada a un recipiente de 400 mL, obteniéndose la solución SD
final.
d) Solución Gli: glicógeno a 4 mg/mL
Con el fin de preparar 25 mL de solución, se pesaron 100 mg de glicógeno y se
llevaron a un matraz aforado de 25 mL, para luego aforar a 25 mL con solución B.
Los 25 mL fueron repartidos en 25 tubos eppendorf de 1000 L cada uno y
etiquetados debidamente.
18
e) Solución G1P: glucosa-1-fosfato 2 mM
Se prepararon 25 mL de solución G1P (2 mM), para esto se pesaron 15 mg de
glucosa-1-fosfato y se llevaron a un matraz aforado de 25 mL para luego aforar a 25
mL con solución B.
Los 25 mL fueron alicuotados en 25 tubos eppendorf de 1000 L cada uno y
etiquetados debidamente.
f) Solución de enzima glicógeno fosforilasa a (40 g/m).
En un tubo eppendorf de 1 mL, se pesó en una balanza analítica de precisión una
cantidad equivalente a 1 mg de enzima.
Por lo tanto, 2,421 mg de sólido se deben pesar para obtener un equivalente a 1 mg de
enzima.
La cantidad pesada se traspasó a un matraz de aforo de 5 mL con 4 porciones de
1000 L de solución B (pH 7,2) y luego se aforó a 5 mL con la misma solución.
Con la ayuda de un mini-cooler, 50 L de la solución obtenida fueron pasadas a un
tubo eppendorf de 50 L, al cual se le agregó 50 L de solución B, obteniéndose
una solución de GPa (100 g/mL). Esta operación se repitió 12 veces.
Finalmente, se recolectaron 56 L de la última solución, se traspasaron a un tubo
eppendorf y se le agregaron 84 L de solución B, obteniéndose una solución de GPa
40 g/mL.
IV.4.ii. Protocolo del ensayo
El ensayo se realizó mediante espectrofotometría con un lector de microplacas
Absorbance microplate reader Biotek EL800tm
, el cual nos permite medir a una longitud de onda
de 660 nm, la aparición de iones fosfato en el medio de reacción.
19
Para dicha medición se utilizaron microplacas adecuadas para el detector, las cuales
presentan 12 columnas con 8 pocillos cada una, en base a esto, y tomando en cuenta que la
medición se realiza de manera horizontal, las muestras se distribuyeron de la siguiente manera:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CN B CNE M1 M1 M1 M1 M1 M1
B CN B CNE M2 M2 M2 M2 M2 M2
C CN B CNE M3 M3 M3 M3 M3 M3
D CN B CNE M4 M4 M4 M4 M4 M4
E
FIGURA 7: Representación de la microplaca y distribución de las muestras en ella en el
ensayo frente a GPa
El ensayo fue diseñado con los siguientes grupos:
a) Control no enzimático (CNE): agregar en el pocillo 40 L de solución BS, 60
L de solución B y 10 L de la muestra a analizar.
b) Control Negativo (CN): agregar en el pocillo 40 L de solución BS, 10 L de
DMSO, 25 L de glicógeno, 25 L de G1P y 10 L de GPa.
c) Blanco (B): agregar en el pocillo 40 L de solución BS, 60 L de solución B y
10 L de DMSO.
d) Muestra (M): agregar en el pocillo 40 L de solución BS, 10 L de muestra, 25
L de glicógeno, 25 L de G1P y 10 L de GPa.
A todos los grupos arriba señalados y con el fin de detener la reacción después de 25
min, fueron agregados 150 L de la SD y luego de 5 min se realizó la lectura. Todas las
muestras fueron evaluadas en sextuplicado.
Es importante señalar que el DMSO es el solvente que debe ser usado en este ensayo
(Martin et al., 1998), por lo tanto en la preparación de la muestra, lo primero es tener en cuenta
su solubilidad en dicho solvente, para este caso, se hicieron dos pruebas de solubilidad tanto para
CS como para CHS.
20
TABLA 3: Prueba de solubilidad en DMSO de CS y de CSH
Muestra Cantidad de Muestra Disolvente Solubilidad
CS 5 mg DMSO 1 mL Soluble
CS 10 mg DMSO 1 mL Soluble
CSH 60 g DMSO 1 mL Soluble
CSH 3 mg DMSO 1 mL Soluble
En resumen, el proceso general se puede resumir mediante la Tabla 4.
TABLA 4: Tabla resumen del ensayo de inhibición sobre GPa
Blanco CNE CN Muestra
BS (L) 40 40 40 40
B (L) 60 60
DMSO (L) 10 10
Muestra
(L) 10 10
Glicógeno
(L) 25 25
Preparar
cronómetro
Preparar
cronómetro
G1P (L) 25 25
GPa (L) 10 10
Cronometrar 25
min
Cronometrar 25
min
SD (L) 150 150 150 150
Cronometrar 5
min
Cronometrar 5
min
Cronometrar 5
min
Cronometrar 5
min
Medir
absorbancia
Medir
absorbancia
Medir
absorbancia
Medir
absorbancia
21
Una vez obtenidos los resultados de absorbancia, se procedió a calcular el porcentaje de
inhibición logrado por cada grupo mediante la siguiente ecuación:
( ) ( )
( )
Dónde:
ACN = Absorbancia del control negativo
AB = Absorbancia del blanco de la muestra
AM= Absorbancia de la muestra
ACNE= Absorbancia del control no enzimático
IV.5. Análisis Estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo mediante el uso del Software. Los análisis
estadísticos fueron realizados mediante ANOVA y comparando los resultados mediante la
prueba de comparaciones múltiples de Tukey, utilizando el Software GraphPad Prism versión
5,03.
22
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
V.1. Estudio Químico
V.1.i. Obtención de los extractos
Los 4500 g de hojas secas de murtilla, fueron extraídas con solventes de polaridad
creciente, obteniéndose los resultados mostrados en la tabla 5.
TABLA 5: Rendimiento de los extractos obtenidos de las hojas de murtilla.
Solvente utilizado Extracto Rendimiento
Hexano EHEX 1,4%
Diclorometano EDCM 5,9%
Acetato de etilo EAE 3,7%
Etanol EET 22,2%
De los resultados, el mayor rendimiento obtenido en el extracto etanólico, nos entrega la
idea de que las hojas de murtilla, se componen principalmente de compuestos polares, como lo
son los heterósidos flavónicos, saponinas (de interés para la investigación), proantocianinas y
taninos, documentados en estudios anteriores de esta especie (Aguirre, 2007).
V.1.ii. Extracción líquido-líquido
V.1.ii.a. Primer procedimiento de extracción de saponinas mediante sucesivas extracciones
líquido-líquido con AcOEt y BuOH
Las extracciones realizadas sucesivamente con AcOEt y BuOH, fueron secadas y
pesadas en un frasco pequeño, debidamente rotuladas y se calculó su rendimiento.
En base a esto, el rendimiento de F-AcEt fue de:
El rendimiento de la F-But fue calculado de la misma manera, así:
23
Las fracciones obtenidas fueron monitorizadas mediante CCF en cromatofolios de gel de
sílice Merck F-254, utilizando PAS como reactivo revelador y una mezcla de BuOH: AcOEt:
NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como fase móvil. La CCF se observa en la Figura 9.
FIGURA 8: CCF del segundo procedimiento de obtención de saponinas utilizando una
mezcla de BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 y PAS como reactivo revelador. EET
extracto etanólico, F-AcEt fracción obtenida mediante extracción líquido-líquido con
AcOEt, F-But fracción obtenida mediante extracción líquido-líquido con n-BuOH, PCa
patrón de Centella asiatica
Como se observa en el cromatofolio, en la F-AcEt no se observan las manchas de color
morado que aparecen en Rfs superiores a 0,7 correspondientes a sapogeninas y si podemos
observar las manchas correspondientes a saponinas (Rf de 0,2).
Por otra parte, la F-But contiene en forma importante saponinas, las cuales se pueden
observar en la mancha verde con un Rf de 0,2, sin embargo, al UV (366 nm) se observaron
compuestos fenólicos de color celeste en esta fracción. Lo anterior y sumado al poco
rendimiento obtenido de la F-But, además que la fracción F-AcEt también contiene saponinas,
nos hizo buscar nuevos métodos para la obtención del crudo de saponinas.
24
V.1.ii.b. Segundo procedimiento de obtención de saponinas mediante sucesivas
extracciones líquido-líquido con AcOEt y BuOH en medio alcalino
Al igual que en el primer procedimiento de extracción, las fracciones recolectadas
fueron secadas y sus rendimientos fueron calculados.
De esta manera, se calculó primero el rendimiento de la F-AcEtb:
Para luego calcular el rendimiento de la F-Butb:
Ambas fracciones fueron monitoreadas mediante CCF en gel de sílice G60, utilizando
PAS como reactivo revelador y una mezcla de CHCl3: CH3COOH: MeOH: H2O = 64: 32: 12: 8
como fase móvil. En él cromatofolio se pudo determinar que al agregar una base fuerte al medio,
se permitió mantener la solubilidad de los polifenoles y saponinas en el medio acuoso, retirando
tan solo algunas sapogeninas presentes en el EET.
FIGURA 9: CCF del segundo procedimiento de obtención de saponinas utilizando PAS
como reactivo revelador y una mezcla de BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como
fase móvil. EET extracto etanólico, F-AcEtb fracción obtenida mediante extracción líquido-
líquido con AcOEt en medio básico, F-Butb fracción obtenida mediante extracción líquido-
líquido con n-BuOH en medio alcalino, PCa patrón de Centella asiatica
25
El cromatofolio de la Figura 9, nos permite observar la presencia de saponinas que
corresponde a la mancha de color verde con un Rf de 0,05. En este mismo cromatofolio, en el
EET y la F-Butb, las saponinas se presentan mezcladas con una mancha de color café que
corresponde a los taninos presentes en la especie en estudio.
Este procedimiento permitió una extracción más limpia de las saponinas que él
procedimiento descrito anteriormente. Sin embargo los bajos rendimientos obtenidos y la
presencia de taninos junto al CS, nos llevaron a la búsqueda de otro método.
V.1.ii.c. Tercer procedimiento de obtención de saponinas mediante sucesivas extracciones
líquido-líquido con EP: BuOH y BuOH
Con el fin de mejorar aún más el proceso de extracción realizado, y de esta manera ir
estableciendo un método más efectivo en la obtención de CS, se realizó un cambio en las
extracciones.
Al igual que él primer y segundo procedimiento, luego de agregado el NaOH, se
procedió a calcular los rendimientos para ambas fracciones obtenidas, de manera que el
rendimiento de la fracción extraída con EP: n-But = 6:1, fue el siguiente:
Además, se calculó el rendimiento de la F-But en la segunda extracción:
Mediante CCF, se monitorizaron los componentes de ambas fracciones, utilizando PAS
como reactivo revelador y una mezcla de CHCl3: CH3COOH: MeOH: H2O = 64: 32: 12: 8 como
fase móvil, como se muestra en la figura 10.
26
FIGURA 10: CCF del tercer procedimiento de obtención de saponinas utilizando PAS
como reactivo revelador y una mezcla de BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60: 40: 5: 10 como
fase móvil. FO1 fracción obtenida mediante extracción líquido-líquido con EP: n-BuOH,
FO2 fracción obtenida mediante extracción líquido-líquido con n-BuOH, U7 patrón de
ácido madecásico, Asi asiaticósido
En el cromatofolio de la Figura 10, la fracción FO1 contiene una gran cantidad de
geninas triterpénicas, las cuales se pueden observar por las distintas manchas de color morado.
Al parecer el hecho de utilizar una mezcla de un solvente apolar con uno de polaridad media
para la extracción (EP - BuOH = 6:1), otorga un medio adecuado para la extracción de
sapogeninas. Este resultado es bueno considerando que las geninas quedan en FO1 y así se
podría obtener la siguiente fracción FO2 libre de dichas sapogeninas.
En la fracción FO2, se observa una mancha café oscuro con un Rf que va desde la línea
de siembra hasta un valor de 0,26, la cual corresponde a una mezcla de taninos y saponinas. Sin
embargo se ven nuevamente manchas de geninas. Por lo tanto este método fue descartado ya que
no se logró obtener el CS libre de geninas y taninos.
V.1.iii. Cuarto procedimiento para la obtención del crudo de saponinas mediante
extracción por Soxhlet
Con el fin de mejorar el rendimiento de la extracción de saponinas, mediante un total
agotamiento del EET, se procedió a utilizar un equipo de extracción Soxhlet con agua como
solvente, la cual nos permite solubilizar y extraer los compuesto de interés como lo son las
saponinas.
27
Una vez llevado a cabo el proceso, se obtuvo una fase acuosa a la que llamamos AET, y
un residuo remanente en el cartucho de celulosa al que llamamos R-AET.
Los rendimientos a partir de 5,0 g de EET fueron:
Ya obtenido el AET y agregado el NaOH, se procedió a realizar las extracciones
sucesivas con AcOEt y con n-BuOH, obteniéndose las fracciones F-AcEts y F-Buts con los
siguientes rendimientos:
Las fracciones fueron analizadas mediante CCF, utilizando PAS como reactivo revelador y una
mezcla de CHCl3: CH3COOH: MeOH: H2O = 64: 32: 12: 8 como fase móvil. La placa
cromatográfica obtenida se muestra en la Figura 11.
FIGURA 11: Análisis por CCF de las fracciones obtenidas mediante extracción Soxhlet
utilizando PAS como reactivo revelador y una mezcla de BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60:
40: 5: 10 como fase móvil. EET extracto etanólico, AET fracción acuosa obtenida mediante
extracción por Soxhlet, F-Buts fracción obtenida mediante extracción líquido-líquido de
AET con n-BuOH, PCa patrón de Centella asiatica
28
Como se logra observar en el cromatofolio de la Figura 11, la FButs es la fracción que
contiene en mayor cantidad las saponinas triterpénicas con un Rf de 0,06, pero al mismo tiempo,
contiene sapogeninas y compuestos fenólicos que fueron evidenciados al revelar con el reactivo
NP-PEG, lo que demuestra que la extracción previa con acetato de etilo no fue capaz de retirar la
totalidad de las sapogeninas presentes en las hojas de murtilla.
Cabe resaltar, que la fracción F-Buts muestra (al igual que el EET) en la línea de siembra
de las muestras, una mancha café que corresponde principalmente a taninos, no logrando separar
las saponinas de estos compuestos. Como esto ocurrió en todas los procedimientos evaluados, se
hizo necesario retirar estos compuestos fenólicos desde el EET con el fin de poder obtener el CS.
V.1.iv. Procesos de eliminación de taninos desde el EET
V.1.iv.a. Precipitación con acetato de plomo
La precipitación con acetato de plomo (o defecación) no logró entregar resultados fiables
ni de utilidad para esta memoria. El acetato de plomo precipitó casi toda la muestra sometida al
proceso, por lo que no dejó una cantidad de muestra suficiente para continuar con los análisis
fitoquímicos mediante CCF.
Con la poca cantidad de muestra que dejó el proceso, se realizó la reacción con FeCl3,
observándose que el proceso no logró retirar los polifenoles, como se puede ver en la figura 12.
FIGURA 12: Reacción con FeCl3 de la muestra remanente obtenida mediante
defecación
29
V.1.iv.b. Precipitación con Cafeína
En cada tubo se observó la formación de un precipitado café oscuro, lo que nos dice que
la precipitación con cafeína es un método efectivo para eliminarlos.
Pero, al mismo tiempo que precipita taninos, la cafeína tiene una muy buena solubilidad
en agua, por lo que para realizar una extracción perfecta que no deje interferentes en la muestra,
se debiese agregar la cantidad exacta de cafeína que sea equivalente a la cantidad de taninos
presentes en el extracto solubilizado.
Esto es de alta complejidad, ya que la cantidad de taninos presentes en el extracto no se
conoce, y al agregar un exceso de cafeína, este alcaloide nos podría interferir en posteriores
análisis por CCF, por CLAE y en los estudios in vitro que se realizaron con la GPa.
V.1.iv.c. Precipitación con Albúmina
Al agregar la albúmina al EET disuelto en agua se observó rápidamente la formación de
un precipitado color crema, el cual se comienza a depositar en el fondo del tubo de ensayo, tal
como se observa en la figura 13.
FIGURA 13: Formación del precipitado tanino-albúmina
Luego, los tubos son centrifugados, obteniéndose una solución cuyo color variaba
dependiendo de la cantidad de albúmina utilizada, como se observa en la Figura 14.
30
FIGURA 14: Soluciones obtenidas de forma posterior a la centrifugación tras la
precipitación con albúmina
Como se puede observar en la Figura 14, en el frasco N°8 se observa este de manera
turbia, lo que se puede deber a un exceso de albúmina agregada para precipitar.
Cada fracción fue analizada mediante la reacción con FeCl3 en papel, observándose los
resultados en la Figura 15.
FIGURA 15: Reacción de cada fracción con FeCl3 en papel para analizar la
presencia de taninos remanentes tras la precipitación con albúmina
El método no logró retirar con efectividad los taninos, observándose la misma mancha
azul (que indica la presencia de taninos gálicos) en todas las fracciones analizadas.
Bajo este último análisis, se descartó el uso de albúmina para eliminar los taninos.
V.1.iv.e. Adsorción de los taninos por columna de poliamida
El EET fue eluído con MeOH por la CC, y cada fracción de 100 mL obtenida fue
analizada mediante CCF hasta observar que las saponinas dejaran de aparecer en él
cromatofolio, con lo cual se obtuvo un total de 46 fracciones que contenían las saponinas. La
CCF de algunas de estas fracciones con saponinas se muestra en la Figura 16.
31
FIGURA 16: Muestra de 5 fracciones obtenidas por elución en CC de poliamida con
MeOH analizada por CCF utilizado PAS como reactivo revelador y BAW como fase móvil
Luego, se reunieron las 46 fracciones en una y se determinó el rendimiento
correspondiente, otorgando un valor de un 61,3% de muestra libre de taninos (EETlt).
Por último, una pequeña muestra de EETlt fue disuelta en MeOH y se le agregaron 5
gotas de FeCl3, observándose una solución de color verde (Figura 17) que nos indicó la
presencia de taninos catéquicos y que habían sido eliminados los taninos gálicos.
FIGURA 17: Fracción EETft con FeCl3 para determinar la presencia de taninos
32
En base a todo esto, se determinó que el método a utilizar en esta memoria era la elución
del EET por una columna de poliamida para eliminar principalmente los taninos gálicos. El buen
rendimiento obtenido, la eficacia en la obtención de saponinas (aunque combinadas con otros
compuestos obtenidos como polifenoles y geninas triterpénicas) y el hecho de que el método es
reproducible comparado con los otros, hizo concluir que es este el proceso más adecuado para la
obtención de CS.
V.1.vi. Metodología final para la obtención del crudo de saponinas (CS)
En este procedimiento final se seleccionaron algunas de las técnicas anteriormente
descritas con el objetivo de obtener el CS libre de taninos y geninas triterpénicas. El resumen de
esta metodología es detallada a continuación:
1. Elución del EET por columna de poliamida
2. Unión de las fracciones que contienen saponinas (denominada EETlt)
3. Extracción mediante equipo Soxhlet con H2O y obtención de AETlt
4. Extracción líquido-líquido con n-BuOH del AETlt para obtener el CS
El rendimiento obtenido para la CC de poliamida, fue descrito en el punto anterior junto
con el análisis de la fracción por CCF del EETlt. De los 3,2 g obtenidos de EETlt (en el punto
anterior), se tomaron 2,0 g para ser extraídos con agua en el equipo Soxhlet, obteniéndose un
rendimiento para R-AETlt de un 33,4%, lo que permite determinar el rendimiento de AETlt que
se encuentra solubilizado en agua, mediante la diferencia con el 100% total.
De esta manera, el rendimiento obtenido de AETlt fue de un 66,6%. Los cuales se
extrajeron con n-BuOH para obtener el CS, con un rendimiento total de un 4,2%.
33
FIGURA 18: Crudo de saponinas obtenido a partir del EET de las hojas de Ugni molinae
disuelto en MeOH
El CS final (Figura 18) fue analizado mediante CCF donde se determinó la presencia de
saponinas con escasa cantidad de otros compuestos que no pudieron retirarse durante el proceso
como algunos polifenoles.
FIGURA 19: CCF del CS utilizando una mezcla de BuOH: AcOEt: NH3: H2O = 60:
40: 5: 10 y PAS como reactivo revelador. EET extracto etanólico, CS crudo de saponinas,
PCa Patrón de Centella asiática
El cromatofolio nos muestra el CS obtenido de forma clara mediante la mancha verde
correspondiente a saponinas con un Rf de 0.09 y sin manchas correspondientes a sapogeninas ni
taninos, lo cual debe ser confirmado mediante CLAE con arreglo de diodos a 201 nm.
34
V.1.vii. Análisis de CS mediante CLAE
El CS obtenido fue llevado a análisis mediante CLAE para determinar su composición
final en un equipo cromatográfico de mayor sensibilidad que la CCF.
Como ya se ha mencionado en la metodología, soluciones de 3 mg/mL fueron colocadas
en los viales del autosampler y se obtuvieron cromatogramas a 201 nm.
FIGURA 20: Cromatograma obtenido del CS mediante CLAE a 201 nm. Columna Hiber
250-4 Purospher STAR RP-18 (5 m), flujo de 0,6 mL/min, una mezcla de acetonitrilo:
ácido fórmico 0,1% = 60:40 como fase móvil y un volumen de inyección de 20 L
El cromatograma CLAE nos muestra 2 picos de importancia a 5,9 min y a 8,2 min, las
cuales corresponden al ácido madecásico y ácido asiático respectivamente, lo que es confirmado
mediante el barrido UV.
Los picos ubicados en tiempos de retención menores a 5 min corresponden al solvente
utilizado y al CS (Tr = 4.3 min).
35
V.1.viii. Hidrólisis de CS y obtención de CSH
Luego de hidrolizado el crudo CS, y su posterior filtración, se obtuvo un sólido de color
café oscuro.
FIGURA 21: Hidrolizado (CSH) obtenido de CS
El polvo fue trasladado a un frasco y se determinó el rendimiento de la hidrólisis.
El CSH fue analizado por CLAE
V.1.ix. Análisis de CSH mediante CLAE
De la misma manera que se analizó CS, el CSH fue analizado por CLAE obteniéndose el
cromatograma de la Figura 23.
36
FIGURA 22: Cromatograma obtenido de CSH mediante CLAE a 201 nm. Columna Hiber
250-4 Purospher STAR RP-18 (5 m), flujo de 0,6 mL/min, una mezcla de acetonitrilo:
ácido fórmico 0,1% = 60:40 como fase móvil y un volumen de inyección de 20 L
El cromatograma de la Figura 23 nos permite observar diversas señales, de las cuales
destacan la aparición del ácido alfitólico a 31, 3 min no apreciado en el cromatograma CLAE del
CS. Se observó además un pico muy pequeño a 29,1 min que corresponde a ácido maslínico.
El resultado más importante obtenido de este análisis es el pico observado en el
cromatograma de la figura 23 a 8,1 min que corresponde al ácido asiático, y cuya área aumentó
en aproximadamente 6-7 veces en este cromatograma respecto del área del cromatograma CLAE
del CS (Figura 20), lo que nos permite demostrar que el ácido asiático es la sapogenina
mayoritaria proveniente de las saponinas de murtilla.
37
Las áreas obtenidas en ambos cromatogramas se muestran a continuación en la tabla 6.
TABLA 6: Áreas de cada pico obtenido en los cromatogramas de CS y de CSH
Tr del pico
(min)
Área obtenida en CS
(uV*sec)
Área obtenida en CSH
(uV*sec)
Compuesto
4,3 28860983 25625420 Saponinas
5,9 1894378 432493 Ácido
madecásico
8,2 1437205 10411166 Ácido asiático
29,1 - 440009 Ácido maslínico
31,3 - 2726638 Ácido alfitólico
V.2. Ensayo de inhibición de la GPa
El CS se evaluó sólo a altas concentraciones, debido a que publicaciones anteriores
(Wen et al., 2006) muestran que la saponinas en general presentan un efecto inhibitorio sobre la
GPa muy bajo.
Los resultados obtenidos en el ensayo, se pueden observar en la Tabla 7.
TABLA 7: Resultados de las absorbancias obtenidas en el ensayo frente a la GPa
CS 5
mg/mL
CSH
60
g/mL
CN Blanco
A1 0,381 0,763 0,631 0,084
A2 0,303 0,765 0,664 0,087
A3 0,316 0,771 0,65 0,086
A4 0,307 0,766 0,635 0,087
A5 0,315 0,729 0,615 0,086
A6 0,325 0,765 0,621 0,087
CNE 0,128 0,149
38
Con estos datos, se calculó el porcentaje de inhibición sobre la GPa para cada muestra,
obteniéndose los resultados que se muestran en la Tabla 8.
Debemos tomar en cuenta que la medición del efecto inhibitorio de CSH a 60 g/mL se
realizó un día distinto a las otras mediciones, por lo que se obtuvieron valores distintos de CNE,
CN y B, como se muestran a continuación:
a) CN: 0,772
b) B: 0,097
c) CNE: 0,149
TABLA 8: Porcentajes de inhibición obtenidos tras en el ensayo con las muestras
Muestra % de inhibición
CS 5 mg/mL 64,27
CSH 60 g/mL 9,51
Cafeína 350 M 61,6
Cafeína 1000 M 89,8
En base a esto se puede determinar que las saponinas evaluadas a altas dosis si presentan
un efecto inhibitorio sobre la GPa, equivalente al de una solución 350 µM del compuesto de
referencia que es la cafeína.
El CSH por otro lado, presentó una baja capacidad inhibitoria sobre la GPa, esto se debe
a que la muestra por si sola ya presenta una alta absorbancia. Además, al ser un hidrolizado, es
posible que residuos de ácido hayan quedado remanentes en la fase, o posibles artefactos que se
hayan formado en el proceso de hidrólisis, produciendo la liberación de fosfato al medio.
Los resultados son coherentes con lo expresado en la literatura (Wen et al., 2005), donde
las saponinas avaluadas a bajas concentraciones (60 µg/mL) no poseen efecto inhibitorio sobre
GPa.
39
La GPa se describe como una enzima con muchos sitios de inhibición alostérica, lo que
explica la gran variedad de compuestos que han demostrado ser capaces de inhibir su actividad.
Son diversos los estudios que han relacionado a un compuesto sintético con el efecto inhibitorio
sobre GPa, lamentablemente no se ha encontrado mucha documentación cuando se trata de la
evaluación con un extracto vegetal o una fracción rica en algún metabolito secundario obtenido
desde un extracto.
Además de los compuestos de naturaleza triterpénica mostrados en el desarrollo de esta
memoria, se ha documentado que algunos taninos presentes en el té verde (Kamiyama et al.,
2010) poseen un efecto inhibitorio sobre la GPb, con valores de IC 50 que rondan los 35 M.
Por otro lado, se ha demostrado que otros compuestos como el ácido cafeico, logran inhibir la
enzima indirectamente mediante la inhibición de las enzimas kinasas responsables de fosforilar y
de esta manera activar a la GPa (Nardini et al., 2000).
Los flavonoides son otro tipo de metabolitos secundarios con un efecto inhibitorio sobre
GPa (Kamiyama et al., 2010), e incluso en un estudio se ha logrado determinar la relación
estructura-actividad de los flavonoides como inhibidores de la GPa. Otros estudios mencionan la
presencia de nuevos compuestos aislados desde el extracto etanólico de las raíces de Cyclocarya
paliurus como inhibidores de la GPa in vivo (Li et al., 2011), entre los que se destaca una
hidroxipterolactona, que no tiene ninguna relación con alguno de los compuestos mencionados
anteriormente, lo que deja de manifiesto la inmensa variedad de compuestos que pueden inhibir
a la GPa.
40
V.3. Análisis Estadístico
Los efectos inhibitorios de las muestras evaluadas y del compuesto de referencia
(Cafeína) a distintas concentraciones fueron graficados, tal como se observa en la Tabla 9.
TABLA 9: Gráfico de comparación de los efectos inhibitorios de las muestras evaluadas y
el compuesto de referencia
Efecto inhibitorio sobre GPa
CS 5
mg/m
L
CSH
60
ug/mL
Caf
eína
350
uM
Caf
eína
1000
uM
0
20
40
60
80
100
Muestras evaluadas
% d
e in
hib
ició
n
El análisis estadístico fue realizado mediante ANOVA y comparando los resultados
mediante la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. De esta manera se obtuvieron los
siguientes resultados, mostrados en la Tabla 10.
TABLA 10: Test de comparaciones múltiples de Tukey
Test de comparaciones múltiples de Tukey ¿Significativo? ¿P < 0,05?
CS 5 mg/mL vs CSH 60 ug/mL Yes
CS 5 mg/mL vs Cafeína 350 uM No
CS 5 mg/mL vs Cafeína 1000 uM Yes
CSH 60 ug/mL vs Cafeína 350 uM Yes
CSH 60 ug/mL vs Cafeína 1000 uM Yes
Cafeína 350 uM vs Cafeína 1000 uM Yes
La Tabla 10 muestra que todos los datos presentan diferencias significativas entre sí,
salvo la comparación realizada entre el CS a 5 mg/mL y la cafeína a 350 µM.
41
VI. CONCLUSIONES
Por primera vez, se obtuvo un crudo de saponinas desde las hojas de murtilla. El método de
obtención fue logrado luego de realizar diversos ensayos químicos, hasta llegar a la metodología
más adecuada y reproducible posible.
Se determinó que el uso de una columna de poliamida es el mejor procedimiento de los
evaluados para la obtención del crudo de saponinas libre de compuestos fenólicos en general.
Asimismo, el proceso fue optimizado, lográndose un método reproducible.
El análisis por CLAE con arreglo de diodos del hidrolizado obtenido a partir del crudo de
saponinas de murtilla, permitió demostrar que el ácido asiático es la sapogenina mayoritaria
obtenida del proceso de hidrólisis.
Las saponinas poseen efecto inhibitorio sobre la enzima glicógeno fosforilasa a, pero sólo a altas
concentraciones. El crudo de saponinas mencionado a 5 mg/mL, obtiene un efecto inhibitorio
similar al del compuesto de referencia (cafeína) a una concentración de 350 M.
Esta memoria, sumada a los estudios paralelos que se realizan con esta especie en el laboratorio
de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad
de Chile, permiten tener una buena proyección sobre el uso de esta planta en el tratamiento de la
diabetes y las complicaciones que produce la hiperglicemia.
42
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Zographos, S.E., Leonidas, D.D., Alexacou, K., Gimisis, T., Hayes, J.M., Oikonomakos, N.G.
Naturally occuring pentacyclic triterpenes as inhibitors of glycogen phosphorylase: Synthesis,
structure-activity relationships, and X-ray crystalographic studies. Journal of Medicinal
Chemistry, 2008, 3540-3554.
45
ANEXOS
XXXIII Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile (SOFARCHI).
Olmué, Chile, 16 al 19 de noviembre de 2011
Metabolitos secundarios responsables de la actividad antiinflamatoria de las hojas de Ugni molinae(murtilla)
Secondary metabolites responsible of the anti-inflammatory activity of the Ugni molinae leaves(murtilla)
Delporte C.*, Queupil M.J.*, García L.*, Barriga A. *, Peña M.*, Aguirre M.C.*, Jara D.*, Goïty L.E.*†
*Facultad de Cs. Químicas y Farmacéuticas - Universidad de Chile; †Becario [email protected]
Estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que las hojas de estaespecie autóctona son antiinflamatorias por vía tópica in vivo. El modelo utilizado fue la inducciónde edema en oreja de ratón por la aplicación de 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). Tantoel TPA como los distintos extractos y metabolitos secundarios obtenidos desde las hojas fueronaplicados por vía tópica.
Desde los extractos antiinflamatorios frente a TPA y por un estudio químico bioguiadofueron aislados e identificados por completos estudios espectroscópicos y/o por HPLC-UV-ESI-MSn
los ácidos corosólico, asiático, ursólico, oleanólico, madecásico, alfitólico y maslínico, cuyos DE50como antiinflamatorios frente a TPA fueron 0,19; 0,13; 0,21; 0,65; 0,11; 0,20; 0,27 µmol/ratón,respectivamente. El fármaco de referencia fue la indometacina y su DE50 fue de 0,38 µmol/ratón.
Los ácidos triterpenoides pentacíclicos derivados de los esqueletos ursano, oleanano ylupano son conocidos por su potente actividad antiinflamatoria, ésta es comparable con la de losantiinflamatorios no-esteroidales.
Nuestros resultados demuestran que los ácidos triterpénicos pentacíclicos 2α-hidroxilados(como los ácidos alfitólico, asiático, corosólico, madecásico y maslínico) fueron más potentes quela indometacina.
En el marco del estudio químico es importante destacar que los ácidos madecásico ymaslínico no habían sido descritos para Ugni molinae
AgradecimientosProyecto FONDECYT 1100750Beca Conicyt AT-24100051
OBTENCIÓN DE UN CRUDO DE SAPONINAS DE MURTILLA, DETERMINACIÓN DE LASAPOGENINA MAYORITARIA Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA SOBRE
GLICÓGENO FOSFORILASA
Marcelo Peñaa, Pamela Zapataa, Isabel Petita, Jessica Bravoa, Carla Delportea
aFacultad de Cs. Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile
XII Congreso Nacional de Estudiantes de Química y Farmacia – Santiago, 2011
Introducción: La murtilla (Ugni molinae, Turcz) es una planta nativa que crece de manera
importante en la zona centro-sur del país, y que ha cobrado gran importancia debido
principalmente a la exportación de sus frutos, y al uso terapéutico tradicional que se le ha dado
a la infusión de sus hojas. Estudios previos y en paralelo realizados describen actividad
antiinflamatoria y antioxidante, además de hipoglicemiante, mediante la inhibición de la
glicógeno fosforilasa a.
Objetivos: 1.- Obtener un crudo de saponinas limpio (FS) desde las hojas de Murtilla, 2.-
Determinar medante HPLC la sapogenina mayoritaria obtenida de la hidrólisis de FS, 3.-
Evaluar la actividad inhibitoria sobre glicógeno fosforilasa a tanto de FS como de su hidrolizado.
Metodología: Desde las hojas de Murtilla, se obtuvo un extracto etanólico (EET), el cual fue
eluido con MeOH por una columna de poliamida, y luego por una columna de Gel de Sílice 60,
con mezclas de solventes de polaridad creciente, obteniéndose un crudo de saponinas FS.
Este crudo fue hidrolizado con HCl 2N, el residuo fue filtrado y secado, analizándose las fases
mediante CCF y determinándose la sapogenina mayoritaria mediante HPLC. Tanto a FS como
a su hidrolizado se les evaluó la actividad inhibitoria sobre glicógeno fosforilasa a.
Resultados: 1.- Se obtuvo un crudo libre de taninos, 2.- La sapogenina mayoritaria obtenida de
la hidrólisis del crudo fue el ácido asiático, 3.- La fase FS obtuvo una actividad inhibitoria de un
62 % sobre GPa.
Conclusiones: 1.- La poliamida es efectiva en remover los taninos (presentes en gran cantidad
en una Myrtacea) de un extracto. 2.- Las saponinas son activas frente a GPa, pero sólo a altas
concentraciones. 3.- El ácido asiático se determinó como la sapogenina mayoritaria obtendel
proceso de hidrólisis.
52nd
Annual Meeting of the American Society of Pharmacognosy San Diego, California (30 Julio – 3 Agosto 2011)
MADECASSIC ACID IN THE CHILEAN UGNI MOLINAE
Leon E. Goity1, María-José Queupil
1, Daniela Jara
1, Sergio Alegría,
Marcelo Peña1, Carla Delporte
1
1.
Facultad de Cs. Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile,
Santiago, Chile.
Ugni molinae Turcz. is found as a wild
shrub along the Chilean southern lands.
Its edible berries have been appreciated by
locals due to their alimentary value (Fig.
1). Folk medicine has considered its
leaves for their use to treat different types
of pain. This was substantiated by our
previous pharmacological studies, which
also demonstrated that its leaves represent an important source of
pentacyclic triterpenoids. Given the relevance of these findings and
an observed pharmacological activity of a leaves ethanol extract
(EET), we decided to supplement these studies looking for in vivo
anti-inflammatory triterpenoids thus complementing the knowledge
about the composition of the leaves of U. molinae. Madecassic acid
(MA, Fig. 2) is here reported for the first time for this species and
also among Myrtaceae. It was isolated from EET and identified by
using spectroscopic techniques, HPLC-ESI-MS/MS and
comparative literature studies. The anti-inflammatory activity of
EET and MA was evaluated by means of the TPA-induced mouse
ear edema model. Observing 60.5 ± 3.3% of effect for the EET and
a dose dependent effect for MA with a
maximum effect of 69.8 ± 6.5% at 0.7 nmol/ear,
comparable to 71.7 ± 11.3%, produced by the
same dose of indomethacin. These results allow
us to demonstrate the contribution of MA over
the anti-inflammatory activity of EET obtained
from U. molinae.
HO
HO
OHOH
O
OH
Fig. 1
Ugni molinae Turcz., Myrtaceae
Figure 2
Madecassic acid
OBTENCIÓN DE UN CRUDO DE SAPONINAS TRITERPÉNICAS DESDE HOJAS DE MURTILLA
Marcelo Peña, León Goity, María José Queupil, Pablo Correa, Hugo Díaz, Isabel Petit, Gonzalo Cebrero, Magdalena Ríos, Jessica Bravo y Carla Delporte
Laboratorio de Productos Naturales. Departamento de Química Farmacológica y
Toxicológica ([email protected])
Palabras claves: Ugni molinae; antiinflamatorio; glicógeno fosforilasa a
A partir de las hojas de Ugni molinae, Myrtaceae, (n.v. murtilla) fueron obtenidos los
extractos seriados de hexano, diclorometano, acetato de etilo y etanol. El extracto etanólico
(EET) se caracterizó por presentar en un alto porcentaje taninos junto a flavonoides,
saponinas y sapogeninas identificadas como los ácidos asiático y corosólico entre otros.
Objetivo: obtener un crudo de saponinas (CS) desde el EET Metodología: se realizó una extracción por Soxhlet en forma sucesiva de diferentes lotes de 5 g de EET con H2O, CH2Cl2, EtOAc y etanol,
Resultados: fueron obtenidos los sub extractos AET (70%), SDM (3%), SAE (10%) y SET (12%) respectivamente (ver Figura). AET fue extraído por partición de solventes con éter de
petróleo: n-butanol: NaOH 0,05 M (5:1:6) para obtener una fase orgánica (F-Org 1 0,8%) y
una fase acuosa (F-Acu 1) enriquecida en saponinas y compuestos fenólicos. La F-Acu 1, fue
particionada con n-butanol y se obtuvo una fase acuosa 2 (F-Acu 2) la cual retiene taninos,
polifenoles y pequeñas cantidades de saponinas y la fase orgánica 2 (F-Org 2). La F-Org 2
fue purificada mediante columnas cromatográficas de Sephadex LH-20 desde la que se
obtuvo el CS. Mediante una hidrólisis ácida en medio acuoso el CS será hidrolizado con el
fin de aislar e identificar las sapogeninas mayoritarias. Tanto el CS, producto de hidrólisis y
sapogeninas aisladas e identificadas, serán evaluados frente a la glicógeno fosforilasa a e
inflamación inducida por ácido araquidónico y un éster del forbol (TPA).
Figura. Esquema de fraccionamiento del EET obtenido desde hojas de murtilla