memoria del trabajo de investigación (programa de doctorado de estudios avanzados en ......

Memoria del trabajo de investigación (Programa de Doctorado de Estudios Avanzados en Química) presentado

por Jorge Rencoret Pazo.

Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS-CSIC)

ABREVIATURAS

a Etapa ácida suave (en secuencia de blanqueo)

Ah Alcoholes

Alc Alcanos

ABTS Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)

AOX Compuestos organoclorados

AQ Antraquinona

BSTFA N,O-bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida

δC Desplazamiento químico del carbono

δH Desplazamiento químico del protón

DCM Diclorometano

DFRC Derivatización seguida de rotura reductora (derivatization followed by

reductive cleavage)

DHP Polímero deshidrogenativo

DTPA Ácido dietilentriaminopentaacético

2D-NMR Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de dos dimensiones

ECF Secuencia de blanqueo libre de cloro elemental (elemental chlorine free)

EPA Agencia de protección medioambiental de EE.UU.

FID Detector de ionización de llama (flame ionization detector)

G Unidad guayacilpropano (o guayacilo)

GC Cromatografía de gases (gas chromatography)

GC/MS Cromatografía de gases/espectrometría de masas (gas

chromatography/mass spectrometry)

H Unidad 4-hidroxifenilpropano (o 4-hidroxifenilo)

HBT 1-Hidroxibenzotriazol

HMBC Espectroscopía 2D de correlaccción de múltiples enlaces

(heteronuclear multiple bond correlation)

HSQC Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear de cuanto simple

(heteronuclear single-quantum correlation)

ICP-OES Espectrometría de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente

ITD Detector de trampa de iones (ion trap detector)

MW Masa molecular (molecular weight)

L Etapa lacasa-mediador (en secuencia de blanqueo)

L/Q Etapa de quelato incluyendo lacasa-mediador (en secuencia de

blanqueo)

LM Lámina media

MTBE terc-butil metil eter

MWL Lignina de madera molida (milled wood lignin)

NMR Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (nuclear

magnetic resonance)

O Etapa de deslignificación con oxígeno (en secuencia de blanqueo)

PoP Doble etapa de blanqueo con peróxido de hidrógeno, la primera

bajo oxígeno presurizado

Py-GC/MS Pirólisis acoplada a cromatografía de gases/espectrometría de masas

(pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry)

Q Etapa de quelato (en secuencia de blanqueo)

rpm Revoluciones por minuto

S Unidad siringilpropano (o siringilo)

SLM Sistema lacasa-mediador

SPE Extracción en fase sólida (solid phase extraction)

Secuencia de blanqueo totalmente libre de cloro (totally chlorine free)

TMP Tipo de pasta de papel obtenida mediante procesos termo-mecánicos

(thermomechanical pulp)

TMSD Trimetilsilildiazometano

TMSi Trimetilsililo

U Unidad de actividad enzimática

ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………1

1.1 Estructura y composición de los materiales lignocelulósicos…………….3

1.1.1 Estructura de la lignocelulosa………………………………………3

1.1.2 Composición de la lignocelulosa………………………...................3

1.1.2.1 Celulosa……………………………………………………….5

1.1.2.2 Hemicelulosa.…………………………………………………5

1.1.2.3 Lignina………………………………………………………..6

1.1.2.4 Extractos……………………………………………………...8

1.1.2.5 Compuestos minerales……………………………………….11

1.2 Fabricación de pasta de papel……………………………………………11

1.2.1 Procesos de producción de pasta de papel…………………………11

1.2.1.1 Procesos físicos………………………………………………12

1.2.1.2 Procesos químicos……………………………………………12

1.2.2 Blanqueo de la pasta de papel……………………………………...12

1.2.3 Calidad de las pastas de papel……………………………...............13

2. RESUMEN DE LA LABOR EXPERIMENTAL REALIZADA………….15

2.1 Caracterización química detallada de la madera de cinco especies

de eucalipto: Eucalyptus globulus, E. nitens, E. maidenii,

E. grandis y E. dunnii……………………………………………………...17

2.1.1 Extraíbles lipofílicos.………………………………………………..17

2.1.2 Composición y estructura de la lignina…………………..................17

2.2 Aplicaciones biotecnológicas como posibles alternativas a la proble-

mática del pitch……………………………………………………………18

2.2.1 Utilización del sistema lacasa-mediador para la eliminación de

los lípidos residuales presentes en pastas de distinta naturaleza……18

2.2.2 Inclusión de una etapa enzimática en una secuencia de blanqueo

TCF de pasta de eucalipto…………………………………………..18

3. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………….21

3.1 Materiales…………………………………………………………………..23

3.1.1 Maderas de las diferentes especies de eucalipto…………………….23

3.1.2 Pastas de eucalipto, picea y lino tratadas con el SLM………………23

3.1.3 Lacasa y HBT………………………………………………………23

3.2 Métodos……………………………………………………………………23

3.2.1 Tratamientos de la pasta con el SLM…………………...………….23

3.2.2 Tratamiento de la pasta de E. globulus con el SLM en una

secuencia de blanqueo TCF………………………………………..24

3.2.3 Extracción de los compuestos extraíbles lipofílicos………………..24

3.2.4 Fraccionamiento de los compuestos extraíbles lipofílicos

mediante extracción en fase sólida (SPE)…………………………...24

3.2.5 Saponificación de ésteres de esteroles……………………………...25

3.2.6 Análisis mediante GC y GC/MS de los extractos lipofílicos

totales y sus fracciones……………………………………………...25

3.2.6.1 GC……………………………………………………………...26

3.2.6.2 GC/MS........................................................................................26

3.2.7 Métodos de derivatización………………………………………….26

3.2.7.1 Silanización…………………………………………………….27

3.2.7.2 Metilación……………………………………………………...27

3.2.8 Determinación de la fracción hidrosoluble………………................27

3.2.9 Determinación de la lignina Klason………………………………..27

3.2.10 Determinación de la composición de polisacáridos……………….27

3.2.11 Análisis de los metales y otros elementos…………………………28

3.2.12 Determinación del contenido en cenizas…………………………..28

3.2.13 Aislamiento de la lignina de la madera. Método Björkman……….28

3.2.14 Determinación de la composición química de la lignina…………..29

3.2.14.1 Pirólisis-cromatografía de gases/espectrometría

de masas ……………………………………………………29

3.2.14.2 Tioacidolisis de la lignina…………………………………….30

3.2.14.3 DFRC…………………………………………………………31

3.2.15 Análisis de la estructura de la lignina mediante resonancia

magnética nuclear bidimensional (2D NMR)………………………32

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………..33

4.1 Composición general de las maderas de las especies de eucalipto

estudiadas…………………………………………………………………..35

4.1.1 Contenido en lignina klason………………………………………...35

4.1.2 Contenido en cenizas y composición de metales…………….……..36

4.1.3 Composición química de los polisacáridos de la madera………….36

4.1.4 Composición lipídica………………………………………………37

4.1.5 Estudio de la composición y estructura de la lignina de las

maderas de las diferentes especies de eucalipto……………………46

4.1.5.1 Análisis de composición de la lignina mediante Py-GC/MS….46

4.1.5.2 Análisis de composición de la lignina mediante DFRC……….50

4.1.5.3 Análisis de composición de la lignina mediante tioacidolisis…51

4.1.5.4 Estudio de la estructura de la lignina de las diferentes

especies de eucalipto…………..………………………………51

4.1.6 Conclusiones………………………………………………………...56

4.2 Utilización del SLM para la eliminación de los lípidos residuales

presentes en pastas de distinta naturaleza…………………………………57

4.2.1 Tratamiento de la pasta kraft de eucalipto con el SLM……………57

4.2.2 Tratamiento de la pasta TMP de picea con el SLM………………..60

4.2.3 Tratamiento de la pasta soda-AQ de lino con el SLM……………..62

4.3 Inclusión de una etapa enzimática en una secuencia TCF………………...65

5. REFERENCIAS……………………………………………………………...71

1. INTRODUCCIÓN

1

1. Introducción

3

1.1 ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DE LOS MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS

La madera y otros materiales lignocelulósicos representan la mayor fuente de energía y materia orgánica renovables de la biosfera. La madera es el más abundante de los materiales lignocelulósicos y representa la principal materia prima en la industria de pasta de papel. En Europa, en el año 2000, el 99% de la producción de fibra virgen se llevó a cabo a partir de madera (47 millones de toneladas); el resto, se produjo a partir de residuos agrícolas como el bagazo de caña, paja de trigo, o de plantas anuales como bambú, lino, abacá, sisal, etc; si bien estas últimas materias primas se emplean, sobre todo, en países en vías de desarrollo o con escasos recursos forestales. La estructura y composición de la madera (Fengel y Wegener, 1984; Hon y Shiraiski, 1991) condiciona su utilización industrial y la posible aplicación de métodos biotecnológicos. Los materiales lignocelulósicos se pueden clasificar en dos categorías: gimnospermas, árboles de especies coníferas y, angiospermas, que incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas o árboles de especies frondosas (Praham et al.,1984). 1.1.1 Estructura de la lignocelulosa

La pared celular de las plantas vasculares es una estructura compleja y semirrígida constituida por un entramado de microfibrillas cristalinas de celulosa, recubiertas por una matriz de hemicelulosa y lignina (Figura 1). La pared celular vegetal está constituida por una pared primaria y una pared secundaria. Las paredes primarias de dos células adyacentes están unidas entre sí por lignina, denominándose a esta capa lámina media (LM). La pared secundaria está constituida por tres capas que difieren en la orientación de las fibrillas de celulosa. En las capas exterior e interior (S1 y S3) las fibrillas están dispuestas formando un amplio ángulo con el eje de la célula, mientras que la disposición de las fibrillas en la capa intermedia gruesa (S2) es prácticamente paralela al eje (Figura 2). La formación de la pared celular tiene lugar a través de los siguientes procesos: a) Depósito de microfibrillas de celulosa, constituyéndose el marco de la pared celular. b) Adición de las cadenas principales de hemicelulosa alrededor de las microfibrillas y reforzamiento de la pared. c) Adición de las ramificaciones de las hemicelulosas. d) Acumulación de la lignina incrustándose en todos los espacios del entramado.

1.1.2 Composición de la lignocelulosa

La celulosa, junto con la hemicelulosa y la lignina, son los tres polímeros mayoritarios de la lignocelulosa, variando el porcentaje de cada uno de ellos con el tipo de planta, la edad o la parte del tejido vegetal de donde provengan (Fengel y Wegener, 1984). Además de estos tres, están presentes otros compuestos como proteínas, lípidos y minerales. Los constituyentes químicos de la lignocelulosa, por lo tanto, se pueden clasificar en: - Componentes mayoritarios: que incluyen celulosa y hemicelulosas, polisacáridos que representan entre el 60 y el 82% de la madera, según especies, y la lignina, que supone entre el 17 y el 30%. - Componentes minoritarios: que incluyen una amplia variedad de compuestos, que por su naturaleza se clasifican en extractos (representan entre un 1 y un 10% de la madera) y en compuestos minerales (representan hasta un 1%).

1. Introducción

4

Puentes de hidrógeno Celulosa Hemicelulosa Lignina Enlances entre hemicelulosas

Figura 1. Representación esquemática de las relaciones entre los principales constituyentes de la pared secundaria (celulosa, lignina y hemicelulosa) de una angiosperma herbácea. Se muestran las microfibrillas de celulosa inmersas en una matriz de lignina en la que también se incluye la hemicelulosa. Las uniones entre estos polímeros se completan mediante puentes intermoleculares formados por los ácidos p-hidroxicinámicos (Bidlack et al., 1992).

Tangencial

S 3

S 2

S 1

P

L M

Dire

cció

n de

las f

ibra

s

Sección tangencial

F ib ra s d ec e lu lo sa

H e m ic e lu lo saM a triz d e lig n in a -h e m ic e lu lo sa

S ecc ió n R ad ia l

Figura 2. Esquema de la localización de la lignina, celulosa y hemicelulosa en la pared de las células vegetales (P: pared primaria, S1-S3: capas de la pared secundaria y LM: lámina media) adaptado de Kirk y Cullen (1998).

1. Introducción

5

1.1.2.1 Celulosa

La celulosa es el constituyente principal de las células vegetales ya que representa entre un 43 y un 47% en maderas de coníferas y ente un 42 y un 44% en maderas de frondosas (Aitken et al., 1988). La celulosa es un polímero lineal formado por unidades de β-D-glucopiranosa unidas entre sí por enlaces glucosídicos β(1 4) (Figura 3). Dos unidades de glucosa adyacentes se unen eliminando una molécula de agua entre los grupos hidroxilo del C1 y el C4 de la otra unidad para formar la molécula de celobiosa, un disacárido que representa la unidad constitutiva de la celulosa. El grado de polimerización de la celulosa en la madera está comprendido entre 7000 y 10000.

1.1.2.2 Hemicelulosa

Las hemicelulosas, también llamadas poliosas, son polisacáridos ramificados formados por una cadena lineal de monosacáridos unidos principalmente por enlaces β (1→ 4) (en algunos casos β (1→ 3)), a la cual se unen cadenas laterales cortas a menudo de azúcares distintos a los de la cadena principal. Los residuos de monosacáridos (Figura 4) incluyen pentosas (D-xilosa y L-arabinosa), hexosas (D-glucosa, D-galactosa, L-galactosa, D-manosa, L-ramnosa y L-fucosa) y ácidos urónicos (ácido D-glucurónico y ácido D-galacturónico), que pueden encontrarse acetilados o en forma de ésteres metílicos. La fracción hemicelulósica representa entre un 25 y un 30% en especies coníferas y entre un 20 y un 43% en frondosas (Aitken et al., 1988). Las cadenas de hemicelulosas presentan grados de polimerización medios de 150 y actúan junto con la lignina como matriz soporte para las microfibrillas de celulosa en la pared celular. Las hemicelulosas son de menor peso molecular, más fácilmente degradables y más fáciles de disolver que la celulosa. La estructura de la celulosa es la misma en los diferentes tipos de madera y otros materiales lignocelulósicos, sin embargo, en las hemicelulosas existe una considerable variación entre las diferentes maderas. Mientras que en las frondosas (maderas duras) se encuentran principalmente hemicelulosas con unidades de cinco carbonos (pentosanos) como el xilano, en las coníferas (maderas blandas) abundan más las hemicelulosas con unidades de seis carbonos (hexosanos) como los glucomananos que se forman por polimerización de unidades de glucosa y manosa, con una relación de 3 unidades de manosa por una unidad de glucosa. Las plantas herbáceas presentan al igual que las maderas de frondosas un mayor porcentaje de pentosanos.

Figura 3. Estructura de la celulosa.

O

HOOH

O

OH

O

HOOH

O

OH

O

HOOH

O

OH

O

HOOH

O

OH

O

1. Introducción

6

1.1.2.3 Lignina

La lignina es el segundo compuesto orgánico más abundante en la superficie de la tierra sobrepasada sólo por la celulosa. Representa entre un 25 y un 33% en especies coníferas y entre un 18 y un 34% en frondosas (Aitken et al., 1988), siendo una de las moléculas orgánicas más recalcitrantes. La lignina da soporte estructural a los tejidos de las plantas e impermeabilidad a los elementos vasculares, y proporciona resistencia frente al ataque de microorganismos y el estrés mecánico. Se trata de un polímero aromático tridimensional sintetizado a partir de la fenilalanina a través de la ruta de los ácidos cinámicos (Higuchi, 1997; Boerjan et al., 2003). De esta forma se sintetizan los alcoholes p-cumarílico (4-hidroxicinamílico), coniferílico (4-hidroxi-3-metoxicinamílico) y sinapílico (4-hidroxi-3,5-dimetoxicinamílico), que actúan como precursores de la lignina (Figura 5). Su polimerización deshidrogenativa da lugar respectivamente a las unidades 4-hidroxifenilpropano (H), guayacilpropano (G) y siringilpropano (S). Recientemente se ha descrito, utilizando pirólisis analítica, la existencia en plantas herbáceas de unidades acetiladas derivadas de los correspondientes alcoholes p-hidroxicinamílicos acetilados (del Río et al., 2004). En la polimerización de los alcoholes p-hidroxicinamílicos participan peroxidasas y/o fenoloxidasas vegetales que forman radicales libres de tipo fenoxilo, estabilizados por resonancia. Estos radicales polimerizan dando lugar a una variedad de dímeros y posteriormente al polímero de lignina. El tipo de unidades presentes en la lignina, así como los tipos de unión entre las mismas puede variar entre los distintos grupos de plantas (coníferas, frondosas y herbáceas). Incluso en una misma planta la composición de la lignina puede variar en los distintos tejidos y capas de la pared celular. La lignina de coníferas se forma mayoritariamente a partir del alcohol coniferílico (unidad G), mientras que la lignina de frondosas se sintetiza a partir de los alcoholes coniferílico y sinapílico (unidades G y S, respectivamente). La lignina de las plantas herbáceas está compuesta de unidades H procedentes del alcohol p-cumarílico, además de las unidades G y S en distintas proporciones. En la composición de la pared celular de las plantas herbáceas participan los ácidos p-hidroxicinámicos (principalmente p-cumárico y ferúlico). Estos ácidos contribuyen a la unión de la lignina con la hemicelulosa mediante enlaces tanto éster como éter por reacción de sus grupos carboxilo e hidroxilo fenólico (Sun et al., 2002). En estas plantas el ácido ferúlico es el principal responsable de los puentes entre

O

H

HO

H

HO

H

H

OHHOH

OH

O

H

HO

H

HO

OH

H

HHOH

OH

O

H

HO

H

HO

H

H

OHH

H

OH

O

OH

H

H

HO

H

H

OHH

H

OH

A

B

C

D

O

H

HO

H

HO

H

H

OHHOH

OH

O

H

HO

H

HO

OH

H

HHOH

OH

O

H

HO

H

HO

H

H

OHH

H

OH

O

OH

H

H

HO

H

H

OHH

H

OH

A

B

C

D Figura 4. Estructura de algunos de los monosacáridos componentes de las hemicelulosas: D-glucosa (A), D-manosa (B), D-xilosa (C) y L-arabinosa (D).

1. Introducción

7

la lignina y los polisacáridos. De un 40 a un 70% del ácido ferúlico está eterificado con la lignina formando un puente de unión con los polisacáridos a los que se une por enlaces éster. Sin embargo, un 70% del ácido p-cumárico está solamente esterificado con la posición γ de la cadena lateral de las unidades de la lignina. Las uniones entre monómeros dan lugar a una estructura tridimensional (Figura 6).

Los primeros modelos estructurales de lignina de coníferas y frondosas se propusieron en los años 70 (Nimz, 1974; Adler, 1977). En 1951 Freudemberg describió por primera vez un polímero deshidrogenativo (DHP) formado a partir del alcohol coniferílico, cuyas propiedades eran similares a la lignina de las coníferas (Freudenberg and Neish,

165 4 3

2

OH

OCH3

OH

H3CO

αβ

γ

165 4 3

2

OH

OCH3

OH

αβ

γ

165 4 3

2

OH

OH

αβ

γ

Figura 5. Estructura de los alcoholes p-hidroxicinamílicos precursores de la lignina.

Figura 6. Primer modelo estructural de la lignina de angiospermas propuesto por Nimz en 1974.

SS

SS

S

S

S

S

SS

S

H

G

G G

GG

GG

GGG

G

GG

G

Enlaces entre unidades β/α-O-4: 65% β-1: 15% β−β: 8% β-5: 6% α−β: 3% 4-O-5: 2% 5-5’: 2%

1. Introducción

8

1968). No existen modelos detallados de la lignina de las plantas herbáceas excepto algunas aproximaciones (Sun et al., 1997). Aunque la variedad de uniones es amplia, se pueden diferenciar dos tipos: uniones de tipo éter y uniones carbono-carbono. - Uniones éter: se diferencian principalmente dos tipos, uno de ellos basado en la unión de la cadena de propano de un monómero de la lignina a un átomo de carbono del anillo bencénico de otra unidad fenilpropano (Figura 7) la unión más corriente de este tipo es la β-O-4’. La unión α-O-4’ es menos frecuente pero más fácil de romper. El otro tipo lo constituyen las uniones entre dos átomos de carbono de dos anillos bencénicos diferentes, como por ejemplo la unión 4-O-5’.

- Uniones de tipo carbono carbono (Figura 8): más difíciles de romper que las uniones éter, incluyen las uniones de dos cadenas alifáticas (del tipo β-β’), las debidas a la unión de un carbono de un anillo bencénico con el de una cadena alifática de otra unidad (uniones β-5’ o β-1’) y las uniones entre carbonos de anillos bencénicos (unión 5-5’). La lignina también se encuentra unida covalentemente a las hemicelulosas y a la celulosa, formando el llamado complejo lignina-carbohidrato. Existen al menos 3 tipos de estas uniones: uniones éter, éster y fenil glucosídico. 1.1.2.4 Extractos

El término extractos cubre una amplia variedad de compuestos de bajo peso molecular que pueden ser separados de la madera mediante extracciones con agua (extraíbles hidrofílicos) o con disolventes orgánicos (extraíbles lipofílicos) (Hillis, 1962; Fengel y Weneger, 1984; Rowe, 1989; Sjöström, 1993). Los extractos se encuentran en la madera en pequeña cantidad, pero su presencia puede interferir en la deslignificación, pricipalmente los de naturaleza lipofílica. La cantidad y la composición de los extractos varían según la especie considerada. Entre ellos se encuentran los taninos, ácidos grasos y resínicos, alcoholes grasos, esteroles (libres y esterificados), glicéridos y ceras entre otros. Una de las principales funciones de los compuestos extraíbles es la protección de la planta contra patógenos. La baja degradabilidad de muchos de estos compuestos

O

OCH3H3CO

O

HO

HO

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

165

4 32

3'

1'6'5' 4'

2'

α

βγ OCH3

OHO

O OCH3

H3CO

A B

O

OCH3

O

OCH3

OCH3

61 2

45

36'1' 2'

4'5'

3'

CO

OCH3H3CO

O

HO

HO

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

165

4 32

3'

1'6'5' 4'

2'

α

βγ OCH3

OHO

O OCH3

H3CO

A B

O

OCH3

O

OCH3

OCH3

61 2

45

36'1' 2'

4'5'

3'

C

Figura 7. Uniones eter presentes en la molécula de lignina: enlace β-O-4’ (A), enlace α-O-4’ (B) y el enlace 4-O-5’ (C).

1. Introducción

9

contribuye a este fin, pero también origina problemas en ciertos aprovechamientos industriales de la biomasa vegetal que se describen a continuación (Hillis y Sumimoto, 1989).

Los extraíbles polares engloban diferentes compuestos fenólicos libres de bajo peso molecular, lignanos (dilignoles y compuestos relacionados), taninos y flavonoides, entre otros. Los compuestos fenólicos libres incluyen precursores de la lignina (ácidos p-hidroxicinámicos y aldehídos p-hidroxicinamílicos), ácidos bencenocarboxílicos relacionados (como ácido p-hidroxibenzoico, vainíllico y siríngico), aldehídos y cetonas aromáticos (p-hidroxibezaldehído, vanillina, siringaldehído y propioguaiacona). Los taninos son un grupo de compuestos caracterizados más por su acción curtiente sobre las proteínas de las pieles que por su estructura química común. Los taninos hidrolizables son esteres del ácido gálico y sus dímeros (incluyendo el ácido elágico típico del eucalipto) con monosacáridos. Los flavonoides presentan diferentes estructuras derivadas del anillo de flavona (2-fenilbenzopirona). Los taninos no hidrolizables están constituidos por varias unidades de flavonoides condensadas. A pesar de que muchas especies vegetales contienen cantidades muy significativas de extraíbles polares, la fracción lipídica es predominante en algunas de ellas. Además, cuando estas especies vegetales son utilizadas para la fabricación de pasta de papel, estos compuestos lipofílicos deben ser tenidos muy en cuenta ya que pueden deteriorar significativamente la calidad de la pasta, debido a la formación de depósitos de brea, conocidos como depósitos de pitch (Figura 9).

5'

3'2'1' 6'

4'O

OCH3

OCH3O

O654

321

O

OCH3

H3CO

α'

β'

γ'α

β

γ

165

4 32

3'

1'6'5' 4'

2'

α

βγ OCH3

OHO

O OCH3

H3CO

O

OCH3H3CO

HO

HO

165 4 3

2

αβ

γ

4'

2'1'6' 5'

3'

O

OCH3

OCH3

O

OCH3

Oα

β

γ OAr

OHHO

O

H3CO

1'6'5' 4' 3'

2'

α' β'γ'

OCH3

H3CO

1654 3

2

OCH3

HO

OCH3

OH

16543

2 1' 2'3'4'

5'6'

βα

γ

β'α'

γ'OHHO

A B C

D E

5'

3'2'1' 6'

4'O

OCH3

OCH3O

O654

321

O

OCH3

H3CO

α'

β'

γ'α

β

γ

165

4 32

3'

1'6'5' 4'

2'

α

βγ OCH3

OHO

O OCH3

H3CO

O

OCH3H3CO

HO

HO

165 4 3

2

αβ

γ

4'

2'1'6' 5'

3'

O

OCH3

OCH3

O

OCH3

Oα

β

γ OAr

OHHO

O

H3CO

1'6'5' 4' 3'

2'

α' β'γ'

OCH3

H3CO

1654 3

2

OCH3

HO

OCH3

OH

16543

2 1' 2'3'4'

5'6'

βα

γ

β'α'

γ'OHHO

A B C

D E

Figura 8. Uniones tipo C-C presentes en la molécula de lignina: enlace β-β’ (A), enlace β-1’ (B), enlace β-5’/α-O-4’ (C), enlace β-1’/α-O-α’ (D) y enlace 5-5’(E).

1. Introducción

10

Entre estos compuestos se encuentran los ácidos grasos libres, alcoholes grasos libres, hidrocarburos, ceras, grasas, terpenos y esteroides (Figura 10). Las ceras se definen como ésteres de ácidos grasos con alcoholes de cadena larga, mientras que las grasas son ésteres de ácidos grasos con glicerol (mono-, di- y triglicéridos). Los triglicéridos se encuentran entre los principales constituyentes de la fracción lipofílica de los extraíbles de muchas maderas (hasta un 50%). Los principales ácidos grasos esterificados en grasas y ceras son el ácido oleico, linoleico y linolénico, juntos con porcentajes muy inferiores de los ácidos palmítico y esteárico, entre otros. Se han identificado y aislado de la madera, principalmente de coníferas, más de 4000 terpenos diferentes. Estos compuestos se subdividen en varias clases dependiendo del número de unidades de isopreno que los constituyen: monoterpenos (2 unidades), sesquiterpenos (3 unidades), diterpenos (4 unidades), sesterpenos (5 unidades) y triterpenos (6 unidades). Entre los compuestos de tipo diterpenos se encuentran los ácidos resínicos que son muy abundantes en la madera de coníferas (y están ausentes en las frondosas). Los ácidos resínicos se caracterizan por su elevada toxicidad, comparado con los otros constituyentes de la fracción lipofílica de los extraíbles de la madera (Peng y Roberts, 2000). Los principales compuestos tipo triterpenoides son los esteroides que difieren de los triterpenos en su biosíntesis (Sjöström, 1993). Los esteroles son los esteroides más abundantes en la madera pero también existen cetonas e hidrocarburos esteroidales. Los esteroles pueden encontrarse libres o esterificados con ácidos grasos, siendo en ambos casos el sitosterol el principal esterol, tanto en coníferas como en frondosas. También se han descrito formando glicósidos y acilglicósidos en diferentes maderas (Gutiérrez y del Río, 2001). El sitosterol y los esteres de sitosterol se caracterizan por ser compuestos con alto grado de adherencia por lo que a menudo se encuentran en el origen de los depósitos de pitch, que se forman por acumulación de extraíbles lipofílicos durante la fabricación de pasta de papel (Back y Allen, 2000). Una caracterización química adecuada de las materias primas utilizadas para la fabricación de pasta de papel constituirá un requisito fundamental para llegar a diseñar estrategias adecuadas para el control del pitch.

Figura 9. Fotografía de un depósito de pitch en una pasta.

1. Introducción

11

1.1.2.5 Compuestos minerales

La cantidad de materia inorgánica es pequeña (generalmente menos de un 1% del total de la madera), pero indispensable para el crecimiento del árbol. 1.2 FABRICACIÓN DE PASTA DE PAPEL 1.2.1 Procesos de producción de pasta de papel

La fabricación de pasta de papel consiste en la separación de las fibras de celulosa, que se encuentran cementadas por la lámina media compuesta fundamentalmente de lignina utilizando métodos físicos o químicos (Fengel y Wegener, 1984; Sjöström, 1993). El proceso de fabricación de pasta de papel es conocido como pasteado.

Figura 10. Estructuras de algunos extraíbles lipofílicos presentes en materiales lignocelulósicos: hexacosanol (A), ácido palmítico (B), ácido dehidroabiético (C), escualeno (D), β-sitosterol (E), estigmasta-3,5-dien-7-ona (F), α-tocoferol (G), trilinoleina (H) y sitosteril linoleato (I).

OH A

OH

O

B

COOH

C

D

HO

E

O

F

O

HO

G

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

H

O

O I

OH AOH A

OH

O

BOH

O

OH

O

OH

O

OH

O

B

COOH

CCOOHCOOH

C

DD

HO

E

O

FOOO

F

O

HO

GO

HO

O

HO

G

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

HCO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

CO-O-CH2

CO-O-CHCO-O-CH

CO-O-CH2CO-O-CH2

H

O

O IO

O

O

O

O

O I

1. Introducción

12

1.2.1.1 Procesos físicos

El pasteado físico separa las fibras por fragmentación mecánica utilizando molinos y refinos de discos, lo que supone un considerable gasto energético. Es un proceso que ofrece un gran rendimiento (hasta un 99% del material inicial), obteniéndose pastas que resultan ventajosas para algunos tipos de papel, ya que confieren rigidez, volumen y opacidad. No obstante, el alto contenido de lignina en la pasta va en detrimento de la calidad del papel ya que las fibras son poco flexibles, no están bien unidas entre sí y el papel es poco resistente y tiende a amarillear con el sol (por oxidación de la lignina residual y otros componentes de la pasta). 1.2.1.2 Procesos químicos

El pasteado químico disuelve y extrae una buena parte de la lignina utilizando reactivos químicos a altas temperaturas. Puede realizarse en condiciones alcalinas, utilizando por ejemplo sulfuro sódico e hidróxido sódico (pasteado kraft), o únicamente hidróxido sódico (pasteado a la sosa de fibras no madereras) y en condiciones ácidas, utilizando por ejemplo bisulfito sódico que disuelve la lignina en forma de lignosulfonatos (pasteado al sulfito). En la deslignificación en condiciones alcalinas a menudo se utiliza antraquinona como catalizador. También se emplean solventes orgánicos para el pasteado organosolv de diferentes maderas incluyendo el eucalipto (Gilarranz et al., 1999). El pasteado kraft es el más extendido a nivel mundial (más del 50% del total de pasta) al permitir obtener pastas con una gran resistencia, aunque con menor rendimiento (alrededor del 50% del material inicial), a partir de diferentes tipos de maderas incluyendo el eucalipto (García Hortal y Colom, 1992; Santos et al., 1997). Este proceso libera una lignina degradada, denominada lignina kraft, en la que se ha producido la ruptura de los enlaces éter, entre otras reacciones. La lignina kraft se utiliza como fuente de energía en la fábrica al mismo tiempo que se recupera los reactivos químicos. La lignina residual que queda en la pasta kraft ha sufrido reacciones de oxidación y es responsable del color oscuro de estas pastas. Por ello, para la obtención de papeles de escritura y otros es necesario eliminar la lignina residual mediante un proceso de blanqueo.

1.2.2 Blanqueo de la pasta de papel

Una vez obtenida la pasta, ésta debe ser sometida a un proceso de blanqueo. Durante las cocciones químicas se elimina la mayor parte de la lignina presente en la materia prima utilizada para la fabricación de la pasta de papel, pero la lignina residual que queda en la pasta presenta un color oscuro como consecuencia de las reacciones de oxidación durante la cocción. El blanqueo tiene como objetivo eliminar estos restos de lignina que son responsables del color de las pastas. Mediante esta operación se modifica el color de las pastas y se obtiene un incremento de su blancura consiguiéndose así una materia fibrosa casi completamente blanca, o por lo menos mucho más blanca que el producto inicial, susceptible de ser empleada en la producción de papeles blancos o poco coloreados. Los reactivos comerciales más utilizados para el blanqueo son o han sido el cloro gaseoso, el hipoclorito, el peróxido de hidrógeno y el dióxido de cloro. El proceso de blanqueo ha sido una de las secciones de la industria de la pasta y papel que ha sufrido más cambios durante los últimos años. La decisión de eliminar el cloro y, en algunos casos, el dióxido de cloro, en las secuencias de blanqueo se debe a la necesidad de reducir las emisiones de compuestos organoclorados (AOX) en los efluentes. El

1. Introducción

13

desarrollo de leyes más restrictivas con respecto a los procesos contaminantes (Brooks et al., 1994) y en especial contra los compuestos clorados, catalogados como contaminantes prioritarios por la Agencia de Protección Ambiental de EE.UU. (EPA), por su persistencia en el suelo y el agua, ha llevado a una parte de la industria europea de pasta y papel (especialmente a la de los países nórdicos) a introducir secuencias de blanqueo de la pasta de papel totalmente libre de cloro (secuencias TCF, “Totally Chlorine Free”) basadas principalmente en el blanqueo con peróxido de hidrógeno, oxígeno y ozono (Figura 11). Otra parte de la industria papelera mundial, incluyendo buena parte de la industria norteamericana de este sector, ha eliminado el cloro gaseoso pero continua utilizando dióxido de cloro como agente de blanqueo (secuencia ECF, “Elementary Chlorine Free”). La novedad de la secuencia de blanqueo TCF obliga a solucionar nuevos problemas ya que la eficacia en el blanqueo de estas secuencias es inferior a la de las secuencias que incluían cloro.

1.2.3 Calidad de las pastas

La fabricación de pastas de papel mediante tecnologías más respetuosas con el medio ambiente ha traído nuevos problemas en el blanqueo de la pasta, que no existían cuando se utilizaban reactivos más agresivos (aunque también más contaminantes) y/o en sistemas con un menor grado de cierre de los circuitos. La acción deslignificante del oxígeno se conoce desde hace tiempo pero el desarrollo del blanqueo con oxígeno ha sido bastante lento debido a la degradación de la celulosa y demás polisacáridos de la madera. Como consecuencia, el blanqueo con oxígeno viene acompañado a menudo por perdidas de rendimiento y viscosidad de la pasta. Las ventajas del peróxido de hidrógeno se apoyan en su facilidad de manipulación y aplicación, su versatilidad y la naturaleza relativamente inocua de los productos de reacción. Una parte de los problemas que han surgido con la introducción de estos reactivos está relacionada con la blancura de las pastas, porque de momento ni el oxígeno ni la combinación de oxígeno y peróxido pueden igualar la eficacia de la cloración para la eliminación de los productos derivados de la lignina, responsables del color de las pastas. La modificación de los procesos de cocción, con objeto de obtener pastas con menor contenido en lignina, representa otra alternativa para facilitar la blanqueabilidad de las pastas.

A la máquina de secado

Blowtank

Digestor O Ofiltro filtro filtro filtro filtroStock StockQ Po P

O2 O2H2O2NaOH O2

DTPAH2SO4

98ºCpH 11

98ºCpH 11

105ºCpH 11

98ºCpH 11

Na2SNaOH

Stock

Astillas demadera

Pasta sin blanquear

Pasta blanqueada

A la máquina de secado

Blowtank


O2 O2H2O2NaOH O2

DTPAH2SO4

98ºCpH 11

98ºCpH 11

105ºCpH 11

98ºCpH 11

Na2SNaOH

StockBlowtank


O2O2 O2O2H2O2NaOHH2O2NaOH O2O2

DTPAH2SO4

98ºCpH 11

98ºCpH 11

105ºCpH 11

98ºCpH 11

Na2SNaOH

Stock

Astillas demadera

Pasta sin blanquear

Pasta blanqueada

Figura 11. Diagrama del proceso Kraft seguido de una secuencia de blanqueo TCF.

1. Introducción

14

Otra parte de los problemas está relacionada con los extraíbles de los compuestos lignocelulósicos descritos anteriormente. Entre los problemas causados por este tipo de compuestos ocupa un lugar importante la formación de depósitos de pitch en las máquinas de papel (que obligan a realizar paradas técnicas) y en la misma pasta (Allen, 1980; Hillis y Sumimoto, 1989). Estos últimos reducen drásticamente la calidad del producto final. Generalmente el término pitch se aplica tanto a extraíbles lipofílicos de la madera como a los depósitos que estos lípidos causan durante el proceso de fabricación de la pasta y el papel. Muchos de estos compuestos estaban presentes en concentraciones más bajas cuando se utilizaban volúmenes de agua mayores en el lavado de la pasta y menor grado de cierre de los circuitos. Por otro lado, aunque no se conoce adecuadamente la posible incidencia medioambiental de estos compuestos en los vertidos (Swan, 1989), ya se ha indicado anteriormente que algunos de ellos pueden ser fuertemente tóxicos. La problemática del pitch es muy compleja porque varía con la materia prima así como con el proceso empleado para la fabricación de pasta y papel. La formación de depósitos de pitch durante la fabricación de pastas de papel a partir de madera de coníferas ha sido estudiado durante años, dado el uso mayoritario de este tipo de madera en los principales países productores de pasta (USA, Canadá y países nórdicos de la UE), sin embargo la formación de estos depósitos en procesos que utilizan maderas de frondosas se encuentra menos estudiada.

2. RESUMEN DE LA LABOR EXPERIMENTAL REALIZADA

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2. Resumen de la labor experimental realizada

2.1 CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DETALLADA DE LA MADERA DE CINCO ESPECIES DE EUCALIPTO: Eucalyptus globulus, E. nitens, E. maidenii, E. grandis y E. dunnii.

La madera de eucalipto es utilizada como materia prima para la fabricación de pasta de papel en el suroeste de Europa, Brasil, Sudáfrica, Japón y otros países. La caracterización química de estas especies se ha centrado fundamentalmente en los compuestos que presentan mayor influencia en el proceso de fabricación de la pasta de papel: la lignina y los extraíbles lipofílicos. Entre las diferentes especies de eucalipto, objetos de nuestro estudio, la madera de E. globulus es considerada la mejor materia prima para la fabricación de pasta kraft, obteniendose de ella el mayor rendimiento de pasta (del Río et al., 2005). La composición lipídica de la madera de E. globulus (Gutiérrez et al., 1998a, 1999, 2001a, b; Gutiérrez y del Río 2001; Freire et al., 2002, 2006), así como la composición de su lignina (Ona et al., 1997; Rodrigues et al., 1999; Evtuguin et al., 2001; del Río et al., 2001a,b, 2002, 2005) es ampliamente conocida, sin embargo, además del E. globulus, las maderas de E. nitens, E. maidenii, E. grandis y E. dunnii también son utilizadas para la fabricación de pasta de papel, aunque su composición química es poco conocida, existiendo una información muy limitada sobre ellas (Freire et al., 2006; Ona et al., 1997; González-Vila et al., 1999; Yokoi et al., 1999, 2001; Capanema et al., 2005). El objetivo final de este estudio, además de realizar una caracterización química detallada de cada una de las especies de eucalipto, es intentar encontrar una explicación de por qué la madera de E. globulus presenta un rendimiento de obtención de pasta de papel superior al resto de las otras especies de eucalipto. 2.1.1 Extraíbles lipofílicos

Los extraíbles lipofílicos son liberados de las fibras durante el pasteo dando lugar a la formación de depósitos pitch, tanto en los distintos puntos del proceso (maquinaria y circuitos) como en el producto final provocando una reducción de la calidad del producto y grandes pérdidas económicas (Hillis y Sumimoto 1989 ; Back y Allen 2000; Gutiérrez et al., 2001c). En la producción de las pastas alcalinas, una gran parte de los lípidos de las fibras utilizadas se eliminan durante la cocción, no obstante algunas especies químicas sobreviven a este proceso (Swan, 1967; Affleck y Ryan, 1969; Leone y Breuil, 1998) y son detectadas como extraíbles de la pasta. Los depósitos pitch representan uno de los mayores problemas en la obtención de pasta de papel a partir de la madera de E. globulus, siendo los esteroles libres y conjugados (esterificados y formando glicósidos) los principales compuestos presentes en los depósitos de pitch (del Río et al., 1998, 2000; Gutiérrez et al., 1998a, 1999; Silvestre et al., 1999; Gutiérrez y del Río 2001). Los extraíbles lipofílicos se aislaron de las maderas y de las pastas, para ser analizados mediante técnicas analíticas que se detallan en el siguiente apartado. 2.1.2 Composición y estructura de la lignina

La composición de la lignina esta directamente relacionada con el rendimiento de la deslignificación (Chang y Sarkanen, 1973; Tsutsumi et al., 1995; González-Vila et al., 1999; del Río et al., 2005). En general, la eficiencia de la cocción está directamente relacionada con la cantidad de unidades siringilo (S) y guayacilo (G) presentes en la molécula de lignina, que se suele expresar mediante la relación S/G. Las unidades guayacilo, a diferencia de las unidades siringilo, presentan en el C5 un posible punto de unión que posibilita la formación de enlaces carbono-carbono, que hace que la

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estructura de la lignina con mayor número de unidades G sea más condensada (presenta mayor número de enlaces C-C), siendo más difícil de degradar. La composición de la lignina de las maderas de las diferentes especies de eucalipto se determinará mediante técnicas y métodos analíticos que se detallan más adelante. Por otro lado, con respecto al estudio de la estructura de la lignina, se ha producido un gran avance debido a la utilización de la resonancia magnética nuclear bidimensional (Nimz et al., 1981; Ralph et al., 1999; Capanema et al., 2001, 2004, 2005; Ralph et al,. 1999, 2004; Liitiä et al., 2003; Balakshin et al,. 2003), ya que hasta el momento solo se habían utilizado técnicas de resonancia magnética nuclear monodimensionles (1H y 13C, las cuales daban lugar a señales solapadas), además de técnicas degradativas (tioacidolis, pirólisis…) que sólo aportan información sobre la composición (contenido de unidades H, G y S). El conocimiento de la estructura de la lignina es fundamental tanto para entender como este polímero se degrada durante las etapas de cocción y blanqueo, así como para el establecimiento de nuevas aplicaciones biotecnológicas dirigidas a eliminar la lignina mediante el uso de hongos y enzimas.

2.2 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS COMO POSIBLES ALTERNA- TIVAS A LA PROBLAMÁTICA DEL PITCH

2.2.1 Utilización del sistema lacasa-mediador para la eliminación de los lípidos residuales presentes en pastas de distinta naturaleza (Gutiérrez et al., 2006a) Una alternativa para disminuir los depósitos de pitch es el uso de enzimas (Fischer y Messner, 1992; Fischer et al., 1993; Fujita et al., 1992) y microorganismos (Behrendt y Blanchette, 1997; Farrell et al., 1993; Gao et al., 1994; Gutiérrez et al., 1999b, 2001b). Sin embargo, las preparaciones comerciales disponibles no son del todo efectivas, ya que están basadas en enzimas (lipasas) y microorganismos que hidrolizan preferentemente triglicéridos. Además de las lipasas se han propuesto otras enzimas como las estearasas (Calero-Rueda et al., 2002; Kontkanen et al., 2004), no solucionándose el problema del pitch, puesto que los esteroles libres son tan recalcitrantes como los esteres de esteroles. Las lacasas, a diferencia de las lipasas y las estearasas, son enzimas oxidativas que actúan principalmente sobre compuestos fenólicos. Una característica muy importante de estas enzimas es que pueden actuar junto a medidores (sistema lacasa-mediador, SLM) aumentando considerablemente su capacidad en la degradación de lignina y otros compuestos (Bourbonnais y Paice, 1990). Se han realizado muchos estudios sobre la utilización del SLM en la deslignificación y blanqueo de las pasta de papel (Bajpai, 1999; Call y Mücke, 1997), sin embargo, nunca antes se había utilizado el SLM en el tratamiento de los extraíbles lipofílicos. Con la finalidad de evaluar la capacidad de degradación del SLM sobre los extraíbles lipofílicos, se trataron tres pastas de papel (no blanqueadas) representativas de diferentes materias primas lignocelulósicas y de diferentes procesos de pasteo (ver Tabla 1) con el sistema lacasa-HBT (1-Hidroxibenzotriazol). 2.2.2 Inclusión de una etapa enzimática en una secuencia de blanqueo TCF de pasta de eucalipto (Gutiérrez et al., 2006b) El uso de secuencias de blanqueo de la pasta totalmente libres de cloro (procesos TCF) en lugar de procesos libres de cloro elemental (procesos ECF), junto con el cierre de los

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circuitos para disminuir los consumos de agua, está incrementando la severidad de los problemas de pitch debido a la baja reactividad con los lípidos de la pasta. Se propuso llevar a cabo experimentos basados en una secuencia de blanqueo TCF incluyendo una etapa enzimática. La pasta kraft de eucalipto se trató con la lacasa termoestable de elevado potencial redox procedente del hongo P. Cinnabarinus y HBT. Este tratamiento lacasa-mediador se incluyó en una secuencia TCF a escala de laboratorio, realizada en reactores presurizados (secuencia O-O-L-Q-PoP). Esta secuencia reproduce la secuencia industrial TCF usada para el blanqueo de la pasta kraft de E. globulus, con el adicional tratamiento enzimático (etapa L). La secuencia empezó con deslignificaciones con oxígeno (dos etapas) y se completó con dos fases de blanqueo con peróxido (etapa PoP, con un primer paso bajo oxígeno a presión) después de un tratamiento de quelación (etapa Q) para eliminar los metales que destruyen el peróxido. Las pastas y los líquidos (licores) de los tratamientos se tomaron en diferentes etapas de la secuencia que contenía la enzima así como para la secuencia control (industrial). Los extraíbles lipofílicos se aislaron de las pastas y de los líquidos, y se analizaron. Tabla 1. Diferentes tipos de materias primas lignocelulósicas y sus respectivos procesos de pasteo.

Especie Tipo de materia prima Proceso de pasteo

Eucalipto (Eucalyptus globulus) Frondosa Kraft

Picea (Picea abies) Conífera Termomecánico (TMP)

Lino (Linum usitatissimun) No maderera Soda antraquinona (soda-AQ)

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2. Resumen de la labor experimental realizada 2. Resumen de la labor experimental realizada

20 20

3. MATERIALES Y MÉTODOS

21

3. Materiales y métodos

3.1 MATERIALES

3.1.1 Maderas de las diferentes especies de eucalipto

Las maderas de eucalipto utilizadas para el estudio de su composición química fueron suministradas por la empresa papelera ENCE (Pontevedra, España). En concreto, las especies analizadas: E. globulus, E. nitens, E. maidenii, E. grandis y E. dunnii, corresponden a árboles adultos (10-12 años). Las especies E. globulus y E. nitens crecieron en el noroeste de España, mientras que las restantes lo hicieron en Uruguay. Las astillas de las maderas fueron molidas tras su recepción y se almacenaron a –20 ºC para preservar al máximo sus fracciones mas alterables. Los resultados del pulpeo de estas cinco especies se encuentran en la Tabla 2. Tabla 2. Evaluación de las diferentes especies de eucalipto realizada en ENCE.

3.1.2 Pastas de eucalipto, picea y lino tratadas con el SLM

- La pasta kraft de eucalipto (Eucalyptus globulus) fue sumistrada por la fábrica de ENCE en Pontevedra (España).

- La pasta termomecánica de picea (Picea abies) fue suministrada por la fábrica de UPM en Valkeakoski (Finlandia).

- La pasta de lino (Linum usitatissimun) sin blanquear y obtenida mediante cocción soda-AQ fue suministrada por la fábrica de CELESA en Tortosa (España).

3.1.3 Lacasa y HBT

La lacasa usada para tratar las pastas fue suministrada por Beldem (Andenne, Bélgica) y se obtuvo de una cepa hiperproductiva del hongo Pycnoporus cinnabarinus proporcionada por el INRA (Marsella, Francia). Una unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima que transforma 1 µmol del ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) por min al correspondiente radical catiónico (ε436 29300 M-1 cm-1) en tampón acetato sódico 0,1 M (pH 5). El mediador HBT fue suministrado por Sigma-Aldrich.

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Tratamientos de la pasta con el SLM

Los tratamientos de la pasta se llevaron a cabo en reactores de acero inoxidable, de una capacidad de 4 litros, usando 200 g de pasta (peso seco) al 10 % de consistencia bajo una presión de oxígeno de 6 Kg/cm2, excepto para la pasta TMP de picea, la cual se trató bajo condiciones atmosféricas y con burbujeo de oxígeno. Los tratamientos se realizaron utilizando lacasa (20 U/g pasta) y HBT (1,5%, referido al peso de pasta seco)

Especie Densidad Alcalis

activo,% Indice Rto Rechazos Viscosidad

mL/g Alcalis

residual,g/LKappa Bruto,% %

E. globulus 600 13.0 16.1 59.5 8.4 1413 3.6 E. nitens 450 17.5 16.3 50.4 1.7 1177 6.2 E. maidenii 600 18.0 16.5 50.8 1.4 1093 11.3 E. grandis 435 17.0 15.7 49.7 0.2 1148 9.2 E. dunnii 595 20.0 16.1 48.7 1.6 931 15.5

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a pH 4 (para el ajuste del pH se utlizó tampón tartrato), durante 2 h a 50 ºC. Los controles para la evaluación de la acción de la enzima se trataron bajo las mismas condiciones pero sin lacasa ni mediador. Otros controles adicionales como tratamientos solo con enzima (sin mediador) y otros solo con mediador (sin enzima) también se realizaron.

3.2.2 Tratamiento de la pasta de E. globulus con el SLM en una secuencia de blanqueo TCF Las condiciones del tratamiento con el SLM son idénticas a las del apartado anterior pero en este caso el tratamiento se ha introducido como una etapa dentro de una secuencia de blanqueo TCF (O-O-L-Q-PoP), la cual incluye: - Dos etapas alcalinas de oxígeno (O) utilizando una presión de oxígeno de 6 Kg/cm2,

1,5% de NaOH y 0.5% de MgSO4 durante 60 min a 98 ºC. - Una etapa (L) de tratamiento con el SLM descrito en el apartado anterior. - Una etapa de quelato (Q) utilizando ácido dietilentriamino-N,N,N’,N’’,N’’-

pentaacético (DTPA) a una concentración del 0,3% durante 60 min a 85 ºC (pH 5-6). - Una etapa alcalina de peróxido (PoP) utilizando 3% de H2O2, 2% de NaOH, 0.1%

MgSO4 y 0.5% de Na2Si2O3 durante 140 min a 105 ºC bajo 6 Kg/cm2 de O2, seguido de 180 min a 98 ºC sin presión de oxígeno (Ibarra et al., 2006). Todos los porcentajes anteriores referidos al peso de pasta seco.

Las pastas se separaron de los líquidos del tratamiento por filtración y mediante exhaustivos lavados con agua destilada después de cada etapa. Para identificar mejor los efectos producidos por el tratamiento con el SLM, se realizó una secuencia que incluía una etapa control bajo las mismas condiciones que las utilizadas con el SLM pero sin añadir ni lacasa ni mediador (etapa a, debido a que el medio es ligeramente ácido). 3.2.3 Extracción de los compuestos extraíbles lipofílicos

Para el análisis de los compuestos extraíbles lipofílicos es necesario su previo aislamiento. Por ello, los compuestos extraíbles lipofílicos de las maderas de eucalipto (molida), así como los de las pastas utilizadas en los tratamientos con el SLM, se extrajeron con acetona en un extractor de tipo Soxhlet durante ocho horas. Este extractor está constituido por un condensador, un tubo de extracción y un matraz, donde la extracción se lleva a cabo por contacto continuo de un solvente con la muestra sólida (que se encuentra en el interior de un cartucho de celulosa propio para la extracción). El disolvente se evaporó a sequedad en un rotavapor. La cantidad de extracto se determinó por gravimetría. Los análisis de los líquidos, obtenidos de las diferentes etapas de la secuencia de blanqueo TCF aplicada a la pasta de E. globulus, se realizaron mediante una extracción líquido-líquido utilizando terc-butil metil éter (MTBE) como disolvente orgánico. Las extracciones se realizaron en un embudo de decantación a pH=14. Una vez extraídos los extraíbles lipofílicos, los cuales pasan de la fase acuosa (líquidos) a la fase orgánica (MTBE), se secaron bajo una corriente nitrógeno. Los extractos lipofílicos obtenidos de las pastas y los líquidos se redisolvieron en cloroformo para su posterior análisis por cromatografía de gases (GC) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS). 3.2.4 Fraccionamiento de los compuestos extraíbles lipofílicos mediante extracción en fase sólida (SPE) Para llevar a cabo una caracterización más detallada de algunos compuestos presentes en los extractos, los extraíbles lipofílicos obtenidos de las maderas de eucalipto se

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separaron en distintas fracciones por elución en una columna en orden creciente de polaridad (Gutiérrez et al., 1998b). La columna consiste en un cartucho con fase de aminopropilo (500 mg) Millipore, Milford, MA, USA. Se utilizó una cantidad de extracto lipofilico total entre 5-20 mg que se redisolvió en una cantidad mínima (< 0,5 mL) de hexano-cloroformo (4:1). La columna se acondicionó previamente con hexano (4 mL). La primera fracción se eluyó con 8 mL de hexano (fracción A, contiene los compuestos más apolares como esteres de esteroles, ceras e hidrocarburos), la segunda con 6 mL de una solución de hexano-cloroformo (5:1) (fracción B, rica en triglicéridos y cetonas esteroidales), la tercera con 10 mL de cloroformo (fracción C, contiene principalmente esteroles libres y alcoholes) y la cuarta fracción con 10 mL de una solución de éter etílico-ácido acético (98:2) (fracción D, contiene ácidos grasos). Cada fracción aislada se secó con nitrógeno, se pesó y se procedió a su análisis por GC y GC/MS. 3.2.5 Saponificación de ésteres de esteroles

La identificación completa de la estructura de los ésteres de esteroles requiere una rotura previa del enlace éster, ya que los espectros de masas de estos compuestos se caracterizan por ser similares a los del esteroles libres que lo componen, no apareciendo generalmente ningún fragmento correspondiente al ión molecular (Lusby et al., 1984; Evershed et al., 1989). Para el análisis de los esteres de esteroles, la fracción A, separada por SPE, se hidrolizó a reflujo con una disolución de KOH 0,5 M al 90% en etanol durante 8 h (Gutiérrez et al., 1999a). Una vez finalizada la saponificación, se realizó una extracción líquido-líquido con hexano (3 x 20 ml) extrayéndose la fracción neutra (contiene los esteroles libres), la cual se secó en el rotavapor. Por otro lado, la fase acuosa se acidificó con HCl 6 M y la fracción ácida (contiene los ácidos grasos libres) se extrajo igualmente con hexano (3 x 20ml) y se secó en el rotavapor. Ambas fracciones se analizaron por GC y GC/MS. 3.2.6 Análisis mediante GC y GC/MS de los extractos lipofílicos totales y sus fracciones La cromatografía de gases se utiliza para separar compuestos que se encuentran en mezclas complejas y como método de identificación y determinación cuantitativa de cada uno de esos componentes. En este tipo de cromatografía la fase móvil es un gas inerte y la fase estacionaria es líquida depositada en un soporte sólido apropiado, donde su principio de operación envuelve la volatilización de la muestra, la separación de cada componente en la columna y la detección de los diferentes componentes por el detector. En el análisis de lípidos por GC y GC/MS, es muy importante las características de las columnas cromatográficas, que permitan separar e identificar compuestos de alto peso molecular como ceras, ésteres de esteroles, triglicéridos, etc. Se han realizado estudios sobre procedimientos para el análisis de los extractos lipofílicos de las maderas (Gutiérrez et al., 1998b, 2004) por GC y GC/MS, en donde se usaron diversas columnas de diferente longitud y diferentes programas de temperatura. En estos estudios, las columnas capilares seleccionadas para el análisis de lípidos por GC fueron cortas (de 5 m) ya que proporcionan una conveniente elución y separación de lípidos de alto peso molecular (Wakeham y Frew, 1982; Lusby et al., 1984; Evershed et al., 1989; Sitholé et al., 1992; Örså y Holmbom, 1994), además de que el análisis ocurre en un corto período de tiempo (20 min). Columnas menores de 5 m no son convenientes ya que no proporcionan la resolución necesaria para análisis cuantitativos. En el caso de los análisis por GC/MS, los cromatogramas obtenidos tienen que ser reproducibles con los obtenidos por GC usando columnas capilares de 5 m para identificar los diferentes

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compuestos. No obstante, en el sistema GC/MS no se pueden usar columnas tan cortas, usándose normalmente columnas de 10-15 m. Esta longitud de columna es apropiada para el análisis de lípidos de alto peso molecular por GC/MS proporcionando resultados en un corto período de tiempo (30 min), incrementando para esto la temperatura final a 380 ºC.

3.2.6.1 GC

Los análisis cromatográficos de los extractos se realizaron en un cromatógrafo de gases HP 6890 (Hewlett-Packard, Hoofddorp, Netherlands) equipado con un detector de ionización de llama (FID, flame ionization detector) y una columna capilar corta de alta temperatura de sílice fundida (DB-5HT J&W; 5 m × 0,25 mm I.D., con 0,1 µm de espesor de película) para análisis por GC. Las temperaturas del inyector y del detector se fijaron a 300 ºC y 350 ºC, respectivamente. Se utilizó Helio como gas portador y la inyección se realizó en modo splitless. El programa de temperaturas del horno fue de 100 ºC (1 min) a 350 ºC (3 min) a 15 ºC/min, manteniendo la temperatura final por 5 minutos. Los picos cromatográficos correspondientes a los extraíbles lipofílicos se cuantificaron a partir de sus áreas en los cromatogramas. Se utilizó una mezcla de compuestos patrones suministrados por Sigma-Aldrich (octadecano, hexadecanol, ácido palmítico, sitosterol, 7-oxocolesterol, sitosteril 3β-D-glucopiranósido, colesterol oleato y triheptadecanoina) en la obtención de la recta de calibrado utilizada para la cuantificación de los extraíbles lipofílicos, con un rango de concentración comprendido entre 0.1 y 1 mg/ml. En todos los casos se obtuvo un coeficiente de correlación mayor de 0.99. 3.2.6.2 GC/MS

La combinación de la cromatografía de gases con la espectrometría de masas resulta en una técnica analítica muy útil para el análisis de mezclas de compuestos orgánicos volátiles o semi-volátiles, siendo por lo tanto útil en la identificación de cada uno de los componentes existentes en los extractos lipofílicos obtenidos de los métodos de extracción anteriormente citados. Para la separación e identificación de los compuestos individuales se usó un cromatógrafo de gases Varian Star 3400 acoplado a un detector de trampa de iones (ITD, Varian Saturn 2000) usando una columna capilar de 15 m × 0,25 mm DB-5HT (0,1 µm, J&W Scientific). Se utilizó Helio como gas portador y la inyección se realizó en modo splitless. Las muestras se inyectaron con un inyector automático (Varian 8200). La temperatura del inyector durante la inyección fue de 120 ºC y 0,1 min después de la inyección se programó a 380 ºC (10 min) a una velocidad de 200 ºC/min. El horno se programó a 120 ºC durante 1 min y a 380 ºC durante 5 min a 10 ºC/min. Las temperaturas del ITD y de la línea de transferencia fueron de 200 ºC y 300 ºC respectivamente. La identidad de cada componente se determinó por comparación de sus espectros de masas con los espectros existentes en las librerías (Willey y NIST) y con espectros publicados anteriormente, por sus fragmentaciones y cuando fue posible por sus patrones.

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3.2.7 Métodos de derivatización

Para el análisis por GC/MS es esencial que los compuestos existentes en la muestra sean suficientemente volátiles a presión atmosférica para pasar a través del cromatógrafo de gases, por lo que es necesario recurrir a métodos de derivatización cuando los compuestos a analizar no son volátiles, esto es, métodos de conversión de ciertos compuestos en otros que sean compatibles con el método analítico de GC/MS.

3.2.7.1 Silanización

Compuestos como alcoholes, esteroles y otros con grupos funcionales polares pueden ser derivatizados para conferirles estabilidad térmica y química, además de la volatilidad necesaria. Para esto, se le pueden introducir grupos trimetilsililo (TMS) formando así éteres de trimetilsililo que presentan características de fragmentación más favorables para la identificación de los compuestos por sus espectros de masas. Varios reactivos pueden ser usados para la preparación de los derivados TMS, pero en este caso se ha utilizado el N,O-bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (BSTFA) en presencia de piridina. Una vez secada la muestra, se añadió 0,1 ml de BSTFA y 0,05 de piridina. A continuación se calentó a 70 ºC durante 2 h y se evaporó la mezcla con nitrógeno hasta sequedad. Posteriormente, se redisolvió en cloroformo para ser analizada por GC/MS. 3.2.7.2 Metilación

Los grupos carboxilos de los ácidos grasos libres e hidroxiácidos, además de los grupos fenólicos se metilaron con trimetilsilildiazometano (TMSD) en metanol. Para ello, a la muestra seca se le añadió 0,1 ml de metanol y 0,025 ml de una solución 2 M de trimetilsilildiazometano en hexano y se mantuvo durante 20 minutos en el baño de ultrasonido. 3.2.8 Determinación de la fracción hidrosoluble

El porcentaje de los compuestos solubles en agua para las maderas de las diferentes especies de eucalipto se determinó según la norma Tappi T 207 om-88. Para ello, las maderas libres de compuestos extraíbles lipofílicos, se extrajeron con agua a 100 ºC durante 3 horas. El extracto se evaporó y se secó a 100 ºC para su determinación gravimétrica.

3.2.9 Determinación de la lignina Klason

La lignina Klason se determinó según la norma Tappi T222 om-88 con algunas modificaciones. En este método, las maderas molidas de las distintas especies de eucalipto, libres de compuestos extraíbles e hidrosolubles se sometieron a una hidrólisis con H2SO4. Para ello, aproximadamente 300 mg de cada muestra se colocaron en frascos pirex con 3 mL de H2SO4 al 72% y se mantuvieron en un baño de agua a 30 ºC durante 1 hora. Posteriormente se diluyó con 84 mL de agua para obtener la concentración de ácido de 4% y se colocó en una autoclave durante 1 hora a 120 ºC. La lignina Klason se retuvo por filtración en filtros de vidrio poroso (previamente tarados tras 4 horas a 100 ºC). El residuo insoluble (lignina Klason) se lavó con agua destilada hasta pH neutro y seco para cuantificación gravimétrica.

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3.2.10 Determinación de la composición de los polisacáridos

La composición en monosacáridos de las maderas de eucalipto se determinó según la norma Tappi T 249 om-85. Del hidrolizado proveniente de la obtención de la lignina Klason, se retiraron 3 mL, se colocaron en un tubo de centrífuga y se adicionó a cada uno 1 mL de inositol (1 mg/mL), como patrón interno. Las mezclas se neutralizaron con carbonato de bario, se diluyeron y se centrifugaron durante 5 min a 9000 rpm. El sobrenadante de cada tubo se recogió y se secó. A continuación, se añadió borohidruro sódico, para promover la reducción de los monosacáridos. Después de 12 horas las muestras se acidificaron con HCL y se secaron en un rotavapor a 50 ºC. Al residuo de cada tubo se le adicionaron 2 mL de metanol y se secó, repitiendo esta operación 3 veces, para eliminar el borohidruro sódico. Una vez reducidas las muestras, se acetilaron con 0,250 mL de piridina y 0,250 mL de anhídrido acético durante 1 hora a 100 ºC y evaporando de nuevo hasta obtención de un extracto seco. Después de preparadas las muestras, los acetatos de alditol, se analizaron en un cromatógrafo de gases Perkin Elmer Sigma 3, utilizando una columna (2m × 2mm) con 3% SP-2340 sobre 100/120 Supelcoport como fase estacionaria, nitrógeno como gas portador (30 mL/min), una rampa de temperatura de 10 ºC/ min desde 200 ºC (3 min) hasta 230 ºC (8 min) y un detector FID.

3.2.11 Análisis de los metales y otros elementos

Las muestras de maderas de eucalipto, una vez lavadas y secas, se molieron y se realizó la digestión ácida. Para ello, se añadieron 4 mL de ácido nítrico concentrado a 0,5 mg de muestra, dejándolas 15 min en un horno microondas (Jones &Case, 1990). Posteriormente se filtraron con filtro Whatman del número 2 y se recogieron en un matraz que se enrasó hasta 50 mL. La concentración de metales en la disolución obtenida se determinó por espectrometría de emisión por plasma (ICP-OES) en un espectrómetro Termo Jarrel Ash, modelo IRIS Advantages.

3.2.12 Determinación del contenido en cenizas

Se determinó mediante la norma Tappi 211 om-85. Se depositaron 200 mg de cada una de las especies de eucalipto en crisoles de porcelana previamente tarados y se introdujeron en la mufla a 575 ºC durante 6 h. Para tararlos se limpiaron con HCl y se introdujeron en la mufla a 575 ºC durante 1 h.

3.2.13 Aislamiento de la lignina de la madera. Método Björkman

El método Björkman (Björkman, 1956) consiste en la extracción de la lignina directamente de la madera, libre de extraíbles y de hidrosolubles, con ayuda de un molino de bolas durante 170-200h y utilizando tolueno como refrigerante. Después de este tratamiento, la madera molida se trata con una mezcla de dioxano-agua (9:1, utilizando 250 ml por cada 10 g de muestra), agitándose durante 12 h. Este proceso se repite de forma consecutiva 2 veces, centrifugándose la mezcla (25 min, 4 ºC y 11000 rpm) y recogiéndose el sobrenadante (contiene la lignina) en un matraz para ser posteriormente secado en el rotavapor a 40 ºC. A continuación, el residuo seco se disuelve en una mezcla ácido acético: agua (9:1, añadiéndose 20 ml por cada gramo de residuo seco). Esta disolución es añadida lentamente a un vaso con agua destilada (225 ml por cada gramo de lignina) en constante agitación. La lignina precipita y se recoge

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tras centrifugación. El residuo seco se muele en un mortero de ágata para facilitar su disolución en una mezcla 1,2-dicloroetano-etanol (2:1) y de nuevo se vuelve a centrifugar a baja velocidad (5000 rpm durante 5 min) y nos quedamos con el sobrenadante, que contiene la lignina. Éste se dispersa gota a gota, sin agitar en éter dietílico (225 ml es suficiente para 0.5-1 g de lignina), precipitando la lignina, volviéndose a centrifugar (5000 rpm durante 5 min) y resuspendiendo el residuo en éter de petróleo de bajo punto de ebullición (40-60 ºC) en el que se deja durante 12 horas. Finalmente se centrifuga y se seca mediante corriente de nitrógeno y se coserva a 4 ºC, preservándola de la luz y el aire para evitar su oxidación hasta el momento de su análisis. Con este método se obtiene una lignina poco degradada y con una estructura muy similar a la de la lignina nativa de la madera.

3.2.14 Determinación de la composición química de la lignina

La composición química de la lignina se determinó mediante el uso de técnicas degradativas como la pirólisis acoplada a GC/MS, la tioacidolis y la derivatización seguida de rotura reductora (DFRC). 3.2.14.1 Pirólisis-cromatografía de gases/ espectrometría de masas

La pirólisis es un método degradativo que transforma compuestos complejos no volátiles en una mezcla de fragmentos volátiles por descomposición térmica en ausencia de oxígeno, que se lleva a cabo habitualmente a temperaturas de entre 400ºC y 800ºC y en condiciones de atmósfera inerte. En la pirólisis, se producen roturas de los enlaces por acción del calor, pues cuando la energía aplicada a la molécula es mayor que la energía de enlaces específicos ocurre la disociación de éstos de una forma predecible y reproducible, pudiendo obtener cierta información en relación a la molécula original a través del análisis de los productos de degradación formados. Los fragmentos resultantes de la pirólisis pueden ser separados por cromatografía de gases e identificados por espectrometría de masas, utilizándose para esto el método de la pirólisis acoplado a GC/MS, ahora Py-GC/MS. La Py-GC/MS es un poderoso método para el análisis de materiales lignocelulósicos, especialmente de la lignina pues aunque las cadenas laterales de los monómeros de la lignina sean parcialmente destruidas, los substituyentes de las diferentes unidades H, G, S de la lignina no lo son. La lignina es pirolizada para producir una mezcla de compuestos fenólicos (Figura 12) que resultan de la rotura no sólo de enlaces éter, sino también de ciertos enlaces C-C, reteniendo estos fenoles las características de substitución del polímero de lignina y siendo posible por lo tanto identificar los diferentes componentes de ligninas provenientes de unidades H, G y S.

Levoglusano y otros Levoglusano y otros Levoglusano y otros
Celu los a
Hemicelu losas

Lignina

Glicoaldehídos

Ácido acético y fórmico

Furfura l y productos resinosos de su reacción confenoles en el me dio ácido d e la pirólis is

Carbón

Fenoles

Celu los a

Hemicelu losas

Lignina

Glicoaldehídos



Carbón

Fenoles

Celu los a

Hemicelu losas

Lignina

Glicoaldehídos



Carbón

Fenoles

Figura 12. Productos de pirólisis de los materiales lignocelulósicos.

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La Py-GC/MS presenta diversas ventajas frente a otros métodos degradativos, pues es una técnica analítica rápida que proporciona resultados en apenas un paso, siendo necesaria poca cantidad de muestra y una simple preparación de la misma (secar y pesar). También presenta ventajas frente a los métodos clásicos de análisis de la lignina, pues no es necesario aislar la lignina de la muestra, permitiendo el análisis de la lignina in situ. Además, es una técnica reproducible permitiendo resultados válidos tanto cualitativamente como cuantitativamente

Para la realización de las pirólisis de las maderas y de las ligninas de eucalipto se utilizó un pirolizador de micro-horno (Frontier Lab), acoplado a un equipo Agilent GC/MS, con una columna de 30 m × 0,25 mm DB-5 (0,25 µm de espesor de película). En una cápsula metálica, se depositaron 0,5-1 mg de muestra finamente dividida y se introdujo en la cámara del microhorno donde se pirolizó a 600 ºC. El cromatógrafo se programó desde 40 ºC (1 min) hasta 300 ºC, con una rampa de 6 ºC/min, manteniéndose 20 min la temperatura final. El inyector y el detector se mantuvieron a 300 ºC. Los compuestos se identificaron por comparación con la literatura (Faix et al., 1990; Ralph y Hatfield, 1991) y con los incluidos en las bibliotecas electrónicas Wiley y NIST. 3.2.14.2 Tioacidolisis de la lignina El principio general de la tioacidolisis consiste en una solvolisis en una mezcla de dioxano y etanotiol en presencia de eterato de trifloruro de boro en medio anhidro (Lapierre et al., 1985; Rolando et al., 1992; Grabber et al., 1996). Las condiciones de la solvolisis son suaves y combinan el efecto de un ácido de Lewis fuerte, el eterato de trifloruro de boro (Et2O-BF3) y el efecto de un nucleófilo suave, el etanotiol (EtSH). La tioacidolisis provoca el corte específico de las uniones alquil-aril-éter (β-O-4 y α-O-4) de las ligninas. Permite por lo tanto, mediante el análisis de los productos de degradación, estimar el porcentaje de monómeros de la lignina unidos por este tipo de enlace. Este análisis se lleva a cabo mediante la separación de los monómeros en una columna de cromatografía de gases. Procedimiento: la preparación del reactivo de tioacidolisis se lleva a cabo mezclando 20 ml de dioxano puro con 2,5 ml de eterato de trifloruro de boro y 10 ml de etanotiol. Esta mezcla se completa hasta 100 ml con dioxano. En cada tubo de tioacidolisis se introducen aproximadamente 5 mg de lignina y se añaden 15 ml del reactivo de tioacidolisis, preparado anteriormente y 200 µl de patrón interno (C22H46). Los tubos se tapan y se mantienen durante 4 horas con agitación a 100ºC en un baño de aceite. Para llevar a cabo la extracción de los productos de tioacidolisis, en cada uno de los vasos donde ésta tendrá lugar se introducen 20 ml de diclorometano y 7,5 ml de bicarbonato de sodio 0,4 M. Pasadas 4 horas de reacción, se trasvasa el contenido de los tubos y se mide el pH del producto, ajustando éste a 2-3 con gotas de HCl 6N. El contenido de los vasos se transfiere a unos embudos de decantación donde la fase orgánica (zona inferior) es recogida en erlenmeyers en los que, previamente, se ha añadido una pequeña cantidad de sulfato de sodio para que adsorba el agua del medio. La fase acuosa superior se extrae dos veces mas con diclorometano, recogiendo de nuevo y combinando todas las fases orgánicas. El contenido de los erlenmeyers se concentra por evaporación en rotavapor a 60ºC.

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Previo al análisis de los productos de tioacidolisis por GC, éstos son silanizados. Los análisis en GC se realizaron en una columna capilar de sílice, siendo la fase estacionaria de polidimetilxilano. Se utilizó Helio como gas portador (presión 1,5 bar) y la temperatura del horno se programó para pasar de 160 a 260ºC en 50 minutos (+ 2ºC/min). El aparato de GC se encontraba equipado con un detector FID. El porcentaje de unidades guayacilo y siringilo se obtuvo utilizando el método de calibrado del patrón externo usando como patrón el hidrocarburo tetracosano. 3.2.14.3 DFRC

La composición (H:G:S) de las ligninas obtenidas de las diferentes maderas de eucalipto también se obtuvo mediante DFRC (Lu y Ralph, 1997a,1997b,1998) que permite el análisis cromatográfico separado de los monómeros unidos con enlaces éteres β-O-4 (los más abundantes en la estructura de la lignina) o α-O-4. El protocolo de la DFRC se divide en cuatro pasos que se detallan a continuación: a) Etapa de formación de βbromo-éteres

Se pesan 10 mg de lignina Björkman y se añaden a un matraz de fondo redondo, junto con una mosca para agitar. Se añaden 2,5 ml de una disolución de bromuro de acetilo: ácido acético (8:92) y se deja la mezcla en agitación durante 2 h a 50 ºC. A continuación, se retira la mosca y se elimina el disolvente en el rotavapor (sin sobrepasar los 50 ºC).

b) Etapa de ruptura reductora

Se añaden, al matraz que contiene el residuo seco, 50 mg de Zn metálico en polvo, 2,5 ml de una disolución dioxano:ácido acético:agua (5:4:1) y una mosca. Se deja en agitación durante 30-40 min a Tª ambiente. Se saca la mosca y se ajusta el pH con una disolución de HCl al 3% hasta que tenga pH < 3. Se añade tetracosano como patrón interno y a continuación se realiza una extracción líquido-líquido en un embudo de extracción, para ello se añaden 10 ml de una disolución saturada de cloruro de amonio y 10 ml de diclorometano (DCM). Sea agita vigorosamente y dejar reposar hasta tener dos fases bien diferenciadas. Se recoge la fase inferior (fase orgánica: DCM) y se procede a dos extracciones sucesivas con 5 ml de DCM en cada una de ellas. La fase orgánica extraída se seca añadiéndole sulfato de sodio anhidro y se filtra, recogiéndose el filtrado en un matraz para la posterior eliminación del disolvente en el rotavapor.

c) Etapa de acetilación

Al residuo que queda tras la evaporación, se le añaden: 1.1 ml de DCM; 0.2 ml de anhídrido acético y 0.2 ml de piridina. La piridina y el anhídrido siempre tienen que estar en la misma proporción (1:1). Se añade una mosca y se deja en agitación 1h. Se elimina la mosca y se añade etanol (se añade de 10 en 10 ml hasta 30 ml en total, para ayudar a eliminar el disolvente).

d) Análisis

El extracto resultante de la etapa de acetilación se resuspende en DCM para poder analizado por GC/MS. Los análisis se realizaron en un equipo Varian Star 3400 acoplado a un detector de trampa de iones (ITD, Varian Saturn 2000) usando una

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columna capilar de 12 m × 0,25 mm DB-5HT (0,1 µm, J&W Scientific). Se utilizó Helio como gas portador y la inyección se realizó en modo splitless. El horno se programó desde 50 ºC (0,2 min) hasta 100 º C con una rampa de 30 ºC/min y desde 100 ºC hasta 300 ºC con una rampa de 5 ºC/min, temperatura a la que permaneció durante 5 min. Las temperaturas del ITD y de la línea de transferencia se establecieron en 200 ºC y 300 ºC respectivamente.

3.2.15 Análisis de la estructura de la lignina mediante 2D NMR.

Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker AVANCE 500 MHz, equipado con una sonda triple con gradientes en el eje z, a una temperatura de 298ºK. Se disolvieron aproximadamente 40 mg de lignina en 0,75 ml de dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6).

Los experimentos que se llevaron a cabo se trataron de 2D HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) y 2D HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation). El análisis HSQC proporciona correlaciones a través de acoplamiento escalar a un enlace entre un protón y el heteronúcleo al que está directamente unido. En cuanto al HMBC. Este experimento 2D sirve para asignar señales del esqueleto de una molécula orgánica. Los picos que se observan en este experimento son correlaciones entre un protón y un heteronúcleo (por ej. 13C, o 15N) situado a una distancia de 2 ó 3 enlaces. En ocasiones se puede llegar a observar correlaciones hasta 4 enlaces. El experimento HMBC permite establecer correlaciones con carbonos cuaternarios que tengan un protón a dos o tres enlaces con mucha mejor sensibilidad que en el espectro monodimensional de 13C. En este experimento se suprimen las correlaciones del isotopómero de 1H directamente unido al heteronúcleo (a un enlace), por lo que este experimento es complementario del HSQC. Las señales de cruce observadas en los espectros bidimensionales se asignaron principalmente por la comparación de éstos con los existen en la literatura (Capanema et al., 2001, 2004, 2005; Ralph et al., 1999, 2004; Liitiä et al., 2003; Balakshin et al., 2003) y mediante la combinación del HSQC y el HMBC.

Los experimentos HSQC se realizaron con 96 acumulaciones, empleando una matriz de datos de 256, 320 o 384 incrementos en la dirección indirecta, y adquiriendo 1024 puntos en la dimensión de adquisición. La anchura espectral fue de 150 o 176 ppm en la dimensión indirecta y de 11,90 ppm en la de adquisición. Los experimentos HMBC se realizaron con 96 o 128 acumulaciones empleando una matriz de datos de 256 o 384 incrementos en la dimensión indirecta y adquiriendo 2048 puntos en la dimensión de adquisición. La anchura espectral fue de 209 o 250 ppm en la dimensión indirecta y de 11,90 ppm en la de adquisición.

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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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4. Resultados y discusión

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4.1 COMPOSICIÓN GENERAL DE LAS MADERAS DE LAS ESPECIES DE EUCALIPTO ESTUDIADAS

La caracterización general de las maderas de las cinco especies de eucalipto: E, globulus, E, nitens, E, maidenii, E, grandis, E, dunnii incluye la cuantificación de las principales fracciones, polisacáridos, lignina, extraíbles totales, material hidrosoluble y cenizas (Figura 13).

Los resultados se muestran en la Tabla 3 y en ella se puede observar que las maderas están constituidas principalmente por los polisacáridos celulosa y hemicelulosa (74,1-78,0%) además de cantidades considerables de lignina (18,7-22,6%), mientras que las fracciones restantes representan bajos porcentajes.

4.1.1 Contenido en lignina klason

La cuantificación de la lignina se realizó mediante el método klason. Este método es el más conocido y utilizado para cuantificar el contenido de este polímero en diferentes sustratos lignocelulósicos (Effland, 1977). Sin embargo, este método no se considera útil para el estudio de la estructura de la lignina debido a que el tratamiento ácido es muy agresivo y da lugar a una lignina muy condensada y alterada. La especie de eucalipto que presenta un menor contenido de lignina klason resultó ser la de E. globulus (18,7%), lo que a priori es una ventaja desde el punto de vista papelero, ya que la cantidad de lignina que hay que eliminar (cocción y blanqueo) es menor. El porcentaje mayor de lignina klason se obtuvo para la especie E. maidenii.

Muestra Extraíbles* Hidrosolubles Lignina Klason Polisacáridos Cenizas

E. globulus 0,3 (1,5) 1,2 18,7 78,0 0,5

E. nitens 0,6 (1,4) 1,2 22,5 74,2 0,4

E. maidenii 0,5 (1,3) 1,3 22,6 74,1 0,3

E. grandis 0,5 (1,3) 1,6 21,1 75,3 0,3

E. dunnii 0,6 (1,2) 1,4 21,6 75,2 0,2

* Los porcentajes entre paréntesis se refieren al extracto de acetona

Tabla 3. Composición general (%) de las madera de las especies de eucalipto.

Figura 13. Diagrama de los principales compuestos constituyentes de los materiales lignocelulósicos.

Material lignocelulósico

Compuestos de bajo peso molecular

Compuestos macromoleculares

Material orgánico Material inorgánico Polisacáridos Lignina

Celulosa HemicelulosaExtraíbles Cenizas

Material lignocelulósico

Compuestos de bajo peso molecular

Compuestos macromoleculares

Material orgánico Material inorgánico Polisacáridos Lignina

Celulosa HemicelulosaExtraíbles Cenizas


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4.1.2 Contenido en cenizas y composición de metales

Los componentes inorgánicos o sustancias minerales dependen de las condiciones del suelo de cultivo y de factores intrínsecos de las plantas (Anglés et al., 1997; Angelova et al., 2004). En la planta varían dependiendo de la especie, de la edad y de la parte estudiada (Anglés et al,. 1997). Los contenidos en cenizas son bajos desde 0,2 a 0,5%, lo que está de acuerdo con la bibliografía. El conocimiento de las cantidades de cationes metálicos presentes en las maderas es de especial interés ya que la presencia de estos en la pasta producen unos efectos negativos en el blanqueo de las pastas que se resumen en la descomposición de los agentes de blanqueo, el incremento de consumo de reactivos, reversión de la blancura, deposiciones en los circuitos y en propiedades fisicomecánicas y ópticas de los papeles menos favorables. En la Tabla 4 se muestran las cantidades de los distintos cationes presentes en la madera de eucalipto. Los elementos más abundantes en las diferentes maderas de las especies de eucalipto resultaron ser K, Ca, Mg, S, P y Mn, siendo la madera de E. globulus la que presenta un contenido global menor.

4.1.3 Composición química de los polisacáridos de la madera

Los azúcares neutros se analizaron, para las diferentes especies, libres de compuestos extraíbles lipofílicos y compuestos hidrosolubles, por cromatografía de gases tras su conversión en acetatos de alditol. Mediante dicha conversión, los isómeros de cada monosacárido se transforman en una sola especie a cuantificar, presentando el cromatograma un único pico para cada tipo de azúcar. Otra ventaja es que mediante este método sólo se analizan aquellas especies moleculares susceptibles de ser convertidas en acetatos de alditol (azúcares), evitando la interferencia con otro tipo de compuestos que pueden estar presentes en la muestra. La Tabla 5 recoge los resultados

Tabla 4. Contenido en metales y otros elementos (mg/Kg) de las especies de eucalipto.

Metal E. globulus E. nitens E. maidenii E. grandis E. dunnii

Al 7,6 3,9 7,5 22,6 83,1

B 2,7 5,5 2,1 3,6 3,4

Ca 260,0 551,0 900,0 930,0 1.900,0

Cd <0,1 0 <0,1 0 <0,1

Cr 1,1 0,2 0,3 0,8 1,1

Cu 0,8 0,7 0,5 1,3 0,7

Fe 14,7 3,9 4,3 24,9 36,7

K 440,0 1.070,0 940,0 370,0 470,0

Mg 120,0 130,0 150,0 90,0 390,0

Mn 77,2 6,1 3,5 50,3 42,5

Na 55,0 290,0 10,0 120,0 20,0

Ni 0,4 0,3 0,4 0,5 0,5

P 50,0 120,0 70,0 60,0 140,0

Pb 1,4 1,5 1,2 0,5 1,0

S 64,0 130,0 83,5 74,0 100,0

Sr 7,2 2,6 5,4 3,4 13,8

Ti 0,0 0,0 0,1 0,3 0,7

Zn 0,6 0,7 0,0 0,4 0,0


37

del análisis cuantitativo de los azucares neutros presentes en las distintas maderas de eucalipto estudiadas.

Además de la glucosa, que proviene fundamentalmente de la celulosa, la xilosa es el monosacárido predominante, confirmando la importancia de los xilanos en la estructura de la pared celular (Fengel y Weneger, 1984; Sjöström, 1993; Shimizu, 2001). Manosa, arabinosa y galactosa se encuentran en menores cantidades, especialmente la galactosa no siendo detectada en la madera de E. maidenii.

4.1.4 Composición lipídica

Los extractos lipofílicos, resuspendidos en cloroformo, se analizaron por GC y GC/MS de acuerdo con el método propuesto por Gutiérrez et al., 1998b, los cromatogramas de los extractos lipofílicos totales de cada una de las especies de eucalipto estudiadas se muestran en la Figura 14. Se observa que para una misma cantidad de madera de partida el E. nitens presenta una mayor cantidad de extraíbles lipofílicos. Con la finalidad de obtener una mejor caracterización de las diferentes series homologas y de los compuestos minoritarios, los extractos lipídicos se fraccionaron por SPE (Figura 15) y las fracciones aisladas se analizaron por GC y GC/MS. La composición lipídica detallada de las diferentes especies de eucalipto seleccionadas para este estudio se muestran en la Tabla 6, los compuestos lipofílicos más predominantes en las maderas de eucaliptos estudiadas son los esteroides, incluyendo esteroles, ésteres de esteroles y esterilglucósidos, con cantidades menores de cetonas e hidrocarburos esteroidales (Figura 16) (Rencoret et al., 2007). La madera de E, globulus y E, dunnii son las que presentan un menor contenido de esteroles libres y conjugados (ésteres y glicósidos), los cuales son los principales responsables de la formación de los depósitos de pitch durante la fabricación de la pasta kraft (del Río et al., 1998,2000; Silvestre et al., 1999; Gutiérrez y del Río 2001), mientras que la madera de la especie E, nitens presenta el mayor contenido de estos compuestos causantes de los depósitos de pitch. Otros compuestos lipofílicos presentes en los extractos de las diferentes maderas son series de ácidos grasos, alcoholes grasos, ω-hidroxiácidos, mono- di- y triglicéridos, tocoferoles (libres y esterificados), alquilferulatos y pequeñas cantidades de escualeno (Figura 17).

Especie Arabinosa Xilosa Manosa Galactosa Glucosa E. globulus 2.7 12.1 5.1 1.1 79.0 E. nitens 3.5 16.3 5.1 0.7 74.2 E. maidenii 2.7 11.3 5.5 0.0 80.6 E. grandis 3.6 13.4 5.3 0.7 77.0 E. dunnii 2.4 14.0 4.8 2.1 76.5

Tabla 5. Composición de los monosacáridos de las maderas de eucalipto seleccionadas.


38

2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20tiempo de retención (min)

E. globulus

E. nitens

E. maidenii

E. grandis

E. dunnii

C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos

Hidrocarburos esteroidales

Sitosterol

Estigmasterol+

fucosterol

Cetonas esteroidales

Ésteres de esteroles

C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos


Sitosterol

Estigmasterol+

fucosterol



C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos


SitosterolEstigmasterol

+fucosterol



Triglicéridos

Triglicéridos

Triglicéridos

Triglicéridos

Triglicéridos

C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos


Sitosterol

Estigmasterol+

fucosterol



C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos



+fucosterol

Cetonas esteroidales Ésteres de esteroles

2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20tiempo de retención (min)

E. globulus

E. nitens

E. maidenii

E. grandis

E. dunnii

C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos


Sitosterol

Estigmasterol+

fucosterol



C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos


Sitosterol

Estigmasterol+

fucosterol



C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos



+fucosterol



Triglicéridos

Triglicéridos

Triglicéridos

Triglicéridos

Triglicéridos

C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos


Sitosterol

Estigmasterol+

fucosterol



C16

C18:1+

C18:2

Ácidos grasos



+fucosterol

Cetonas esteroidales Ésteres de esteroles

Figura 14. Cromatogramas de los extractos de las maderas de eucalipto sin derivatizar.


39

Hexano8 mL

A

Hexano/CHCl3(5:1) 6mL

B

CHCl310 mL

Éter/AcOH(98:2) 10 mL

D

Acondicionamiento

Hexano 4 mL

Fase aminopropilo

Extracto lipídico total enHexano /CHCl3 (4:1) 0.5 mL

Extracto total


Esteroles

C

Ácidos grasos

D

C

Hidrocarburosesteroidales

AÉsteres de esteroles


Cetonas esteroidales BTriglicéridos

Sitosterol


Ácidos grasos

2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 t(min)

2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 t(min)

Hexano8 mL

A

Hexano/CHCl3(5:1) 6mL

B

CHCl310 mL

Éter/AcOH(98:2) 10 mL

D

Acondicionamiento

Hexano 4 mL

Fase aminopropilo

Extracto lipídico total enHexano /CHCl3 (4:1) 0.5 mL

Extracto total


Esteroles

C

Ácidos grasos

D

C


AÉsteres de esteroles


Cetonas esteroidales BTriglicéridos

Sitosterol


Ácidos grasos

2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 t(min)2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 t(min)

2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 t(min)2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 t(min)

Figura 15. Fraccionamiento SPE aplicado a los extractos totales.


40

Tabla 6. Composición lipídica detallada de los extractos lipofílicos de las especies de eucalipto. Compuestos E. globulus E. nitens E. maidenii E. grandis E. dunnii Ácidos n-grasos 306.7 432.2 200.9 307.4 428.9 ácido n-tetradecanoico 1.6 1.2 0.6 1.5 3.2 ácido n-pentadecanoico 1.7 4.7 0.8 2.6 2.7 ácido n-hexadecanoico 88.3 112.7 39.3 75.4 112.3 ácido n-heptadecanoico 2.6 6.8 2.0 3.9 4.9 ácido 9,12-octadecadienoico 48.6 95.9 35.9 45.0 60.4 ácido 9-octadecenoico 39.6 63.9 51.6 41.5 112.2 ácido n-octadecanoico 8.5 14.0 9.3 12.0 23.7 ácido n-nonadecanoico 0.8 2.1 0.7 1.5 1.5 ácido n-eicosanoico 5.6 11.0 4.1 8.3 9.3 ácido n-heneicosanoico 2.8 8.6 2.5 6.2 5.7 ácido n-docosanoico 20.7 27.7 10.9 16.9 14.9 ácido n-tricosanoico 4.1 9.8 3.8 11.0 7.9 ácido n-tetracosanoico 34.2 46.1 17.9 39.9 28.8 ácido n-pentacosanoico 4.7 7.1 3.5 10.6 6.5 ácido n-hexacosanoico 31.9 16.5 14.2 25.1 26.7 ácido n-heptacosanoico 0.7 1.1 0.5 0.9 1.2 ácido n-octacosanoico 7.3 2.2 2.1 4.5 5.5 ácido n-triacontanoico 3.0 0.8 1.2 0.6 1.5 ω-Hidroxiácidos 23.9 17.4 13.9 9.1 10.5 ácido 22-hidroxidocosanoico 15.1 11.1 8.1 5.7 5.9 ácido 24-hidroxitetracosanoico 8.8 6.3 5.8 3.4 4.5 Esteroles 268.3 543.5 336.2 361.5 272.3 campesterol 2,8 6.9 2.7 2.9 2.4 sitosterol 190,3 396.2 263.2 287.0 212.1 estigmastanol 45,7 84.9 53.9 55.6 43.0 fucosterol 4,4 24.2 3.9 7.4 1.8 cicloartenol 8,1 22.8 2.4 0.1 2.7 24-metilencicloartanol 5,7 - - - 1.4 citrostadienol 2,6 1.1 6.0 2.0 5.0 7-oxositosterol 8,7 7.5 4.3 6.5 4.0 Cetonas esteroidales 37.2 72.0 113.0 59.7 95.4 estigmastan-3-ona 4.0 5.8 13.7 4.2 12.4 estigmasta-3,5-dien-7-ona 14.7 1.5 6.2 4.9 5.1 estigmast-4-en-3-ona 13.0 51.2 74.8 39.0 60.4 estigmasta-3,6-diona 5.5 13.5 18.3 11.6 17.5 Hidrocarburos esteroidales 31.3 30.5 22.2 19.4 26.6 estigmastano 3.3 4.3 2.1 2.2 3.2 estigmasta-4,22-dieno 2.6 2.8 1.8 1.6 2.0 estigmasta-3,5-dieno 15.7 17.6 12.6 10.0 13.1 estigmasta-3,5,22-trieno 8.1 4.6 4.1 5.4 6.3 Otros hidrocarburos 1.6 1.2 1.6 0.2 2.0 escualeno 1.6 1.2 1.6 0.2 2.0 Alcoholes grasos 2.4 7.2 3.9 4.1 2.0 n-hexadecanol 0.1 0.4 0.1 tr tr n-octadecanol 0.1 0.5 0.1 0.1 tr n-eicosanol tr 0.1 tr 0.1 tr n-docosanol 0.6 1.9 0.6 1.2 0.7 n-tetracosanol 0.5 2.3 0.6 0.8 0.3 n-hexacosanol 0.3 1.1 0.9 0.3 0.3


41

n-octacosanol 0.8 0.9 1.8 1.6 0.7 Tocoferoles 8.5 6.5 11.5 8.3 10.5 α-tocoferol 6.4 4.6 7.4 6.2 7.2 β-tocoferol 2.1 1.9 4.1 2.1 3.3 Monoglicéridos 117.4 121.4 80.3 58.7 61.7 tetradecanoato de 2,3-dihidroxipropilo 0.2 tr 0.1 0.2 0.2 hexadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo 3.3 7,0 1.0 2.5 3.0 heptadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo 0.2 0,4 tr 0.1 0.1 octadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo 2.6 5,6 1.0 2.3 6.0 nonadecanoato de 2,3-dihidroxipropilo tr 0,1 tr tr tr eicosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 0.2 0,7 tr 0.1 0.2 heneicosanoato de 2,3-dihidroxipropilo tr 0,7 tr tr tr docosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 1.8 8,9 2.9 3.3 3.0 tricosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 0.2 1,5 0.3 0.1 0.4 tetracosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 24.8 50,0 24.5 17.3 14.5 pentacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 2.9 4,5 4.6 2.5 1.0 hexacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 55.5 35,3 35.6 31.2 26.9 heptacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 1.0 0,8 1.5 1.3 1.4 octacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 20.0 5,8 7.9 4.6 4.2 nonacosanoato de 2,3-dihidroxipropilo 1.7 0,1 0.5 1.1 0.5 triacontanoato de 2,3-dihidroxipropilo 3.0 tr 0.3 1.6 0.3 Monoglicéridos de ω-hidroxiácidos 2.4 5.1 1.3 2.3 1.7 24-hidroxitetracosanoato de 2,3- dihidroxipropilo

0.9 4.1 0.7 1.1 0.7

26-hidroxihexacosanoato de 2,3- dihidroxipropilo

1.2 1.0 0.5 0.9 0.8

28-hidroxioctacosanoato de 2,3- dihidroxipropilo

0.3 tr 0.1 0.3 0.2

Diglicéridos 0.4 0.3 tr 0.2 0.6 dipalmitina tr tr tr tr 0.1 palmitinestearina 0.2 0.2 tr 0.1 0.3 diestearina 0.2 0.1 tr 0.1 0.2 Ferulatos de n-alquilo 5.8 3.4 1.2 1.6 7.9 trans-ferulato de eicosilo tr 0.1 tr tr tr trans-ferulato de docosilo 2.5 1.9 0.5 0.7 1.8 trans-ferulato de tetracosilo 2.0 1.2 0.4 0.5 3.8 trans-ferulato de hexacosilo 1.3 0.2 0.3 0.4 2.3 ω-Carboxialquilferulatos 22.4 1.2 tr 1.1 3.8 ácido trans-feruloiloxihexadecanoico 1.7 tr tr tr 0.3 ácido trans-feruloiloxioctadecanoico 1.5 tr tr tr 0.1 ácido trans-feruloiloxidocosanoico 9.0 0.6 tr 0.2 0.5 ácido trans-feruloiloxitetracosanoico 9.5 0.6 tr 0.9 2.3 ácido trans-feruloiloxihexacosanoico 0.7 tr tr tr 0.6 Glicósidos esteroidales 65.1 206.0 68.1 159.5 89.5 Sitosteril 3β-D-glucopiranósido 65.1 206.0 68.1 159.5 89.5 Ésteres de tocoferoles 5.8 15.9 6.1 6.4 9.7 dodecanoato de α-tocoferilo tr tr tr tr tr tetradecanoato de α-tocoferilo 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 hexadecanoato de α-tocoferilo 0.6 1.3 0.6 0.3 0.4 oleato/linoleato de α-tocoferilo 2.4 8.2 3.3 3.4 4.1 octadecanoato de α-tocoferilo 0.4 0.6 0.5 0.3 0.5 eicosanoato de α-tocoferilo tr tr 0.1 tr tr


42

dodecanoato de β-tocoferilo tr tr tr tr tr tetradecanoato de β-tocoferilo 0.2 1.0 0.2 0.1 0.3 hexadecanoato de β-tocoferilo 0.4 1.4 0.3 0.2 0.8 oleato/linoleato de β-tocoferilo 1.4 2.4 0.8 1.8 3.3 octadecanoato de β-tocoferilo 0.2 0.8 0.1 0.2 0.2 eicosanoato de β-tocoferilo tr tr tr tr tr Ésteres de esteroles 250.2 828.5 434.4 214.3 289.6 ésteres de sitosterol 153.1 515.3 297.1 149.2 197.2 ésteres de estigmastanol 52.3 163.3 87.3 41.8 57.6 otros ésteres de esteroles 44.8 149.9 50.0 23.3 34.8 Triglicéridos 11.2 21.0 38.1 15.7 28.0 Lípidos totales identificados 1160.6 2313.3 1332.7 1229.5 1340.7

Los esteroles libres son una de las más abundantes clases de compuestos presentes en los extractos de todas las maderas estudiadas (268-543 mg KgP

-1P), siendo el sitosterol (I)

y el estigamstanol (II) los principales esteroles en todas las maderas analizadas. Otros esteroles, menos abundantes, como campesterol (III), fucosterol (IV), cicloartenol (V), 24-metilencicloartenol (VI), citrostadienol (VII) y 7-oxositosterol (VIII) también se detectaron en todas las especies de eucalipto estudiadas. Los esteroles libres pueden ser analizados tanto en los extractos sin derivatizar como silanizados. Las maderas de las especies de E. globulus y E. dunnii son las que presentan menores cantidades de esteroles libres mientras que la de la especie E. nitens, por el contrario, es la que más esteroles libres contiene. Cantidades significativas (65-206 mg Kg P

-1P) de

esterilglicósidos, principalmente sitosteril 3β-D-glucopiranósido, se encontraron en todos los extractos de las maderas de eucalipto. Estos compuestos se identificaron por primera vez, en la madera de E. globulus por Gutiérrez y del Río (2001), mediante la correspondiente derivatización (solo son detectables cuando se encuentran silanizados) y por comparación con sus patrones. El sitosteril 3β-D-glucopiranósido es especialmente abundante en las maderas de E. nitens y E. grandis, mientras se presentan en menor proporción en las de E. globulus y E. maidenii.


43

Los ésteres de esteroles también se encuentran entre los extraíbles lipofílicos más abundantes (214-828 mg Kg P

-1P), siendo la madera del E. nitens la que presenta un mayor

contenido en ésteres de esteroles y las maderas de E. grandis y E. globulus las que menos. Los ésteres de esteroles están compuestos principalmente por series de ésteres de sitosterol y estigmastanol, con menores cantidades de las series de campesterol, fucosterol, y 24-metilencicloartenol. La saponificación de la fracción de ésteres de esteroles, aislada mediante SPE, muestra que el principal éster de esterol presente en los extractos de las maderas de eucalipto es el sitosteril linoleato (X). Otros compuestos esteroidales como las cetonas son detectados en cantidades considerables en los extractos lipofílicos de las maderas de eucalipto seleccionadas para este estudio. Las cetonas esteroidales (37-113 mg Kg P

-1P de madera) están constituidas

principalmente por estigmastan-3-one (XI), estigmasta-3,5-dien-7-ona (XII), estigmast-4-en-3-one (XIII) y estigmasta-3,6-diona (XIV).

HO

IHO

IIHO

IIIHO

IV

HO

V

HO

VI

HO

VII

HO O

VIII

O

XII

O

XIII

OO

XIV XV

O

XI

O

OH

O

OHHO

CH2OH

IX

O

O

X

HO

IHO

IIHO

IIIHO

IVHO

IHOHO

IHO

IIHOHO

IIHO

IIIHOHO

IIIHO

IVHOHO

IV

HO

V

HO

VI

HO

VII

HO O

VIII

HO

V

HOHO

V

HO

VI

HOHO

VI

HO

VII

HOHO

VII

HO O

VIII

HO OHO OO

VIII

O

XII

O

XIII

OO

XIV XV

O

XII

OO

XII

O

XIII

OO

XIII

OO

XIV

OO

OO

XIV XVXV

O

XI

OO

XI

O

OH

O

OHHO

CH2OH

IX

O

OH

O

OHHO

CH2OH

O

OH

O

OHHO

CH2OH

IX

O

O

X

O

O

O

O

O

O

X

Figura 16. Estructura de los principales compuestos esteroidales identificados en las maderas de eucalipto a los que se hace referencia en el texto.(I) sitosterol, (II) estigmastanol, (III) campesterol, (IV) fucosterol, (V) cicloartenol, (VI) 24-metilencicloartanol, (VII) citrostadienol, (VIII) 7-oxositosterol, (IX) sitosteril 3β-D-glucopiranósido, (X) sitosteril linoleato, (XI) estigmastan-3-ona, (XII) estigmast-4-en-3-ona, (XIII) estigmasta-3,5-dien-7-ona, (XIV) estigmasta-3,6-diona, (XV) estigmasta-3,5-dieno.


44

Con respecto a los hidrocarburos esteroidales, se detectaron con una, dos y hasta con tres instauraciones, aunque en pequeñas cantidades, siendo el estigamasta-3,5-dieno (XV) el más predominante. Los ácidos grasos libres representan una fracción importante de los extraíbles lipofílicos de las maderas estudiadas. Las series de ácidos grasos libres se encontraron en cantidades de 201-432 mg Kg P

-1P de madera, y con un predominio de aquellos que

presentan un número par de átomos de carbono, en el rango de CB14 B a CB30 B. Esta serie puede ser analizada tanto en los extractos sin derivatizar, así como en los metilados y en los silanizados. Los ácidos grasos predominantes resultaron ser el ácido palmítico (XVI), el oleico (XVII) y el linoleico (XVIII). Los ácidos grasos de mayor peso molecular como el ácido docosanoico (CB22B), tetracosanoico (CB24 B) y hexacosanoico (CB26B) se encontraron en elevadas cantidades en todos los extractos de las maderas analizadas. Con respecto a los ácidos grasos hidroxilados, es de destacar que se encontraron ω-hidroxiácidos como el 22-hidroxidocosanoico (XIX) y el 24-hidroxitetracosanoico en todos los extractos. Otros compuestos encontrados, aunque en bajas cantidades, son los tocoferoles, incluyendo α-tocoferoles (XX) y β-tocoferoles (XXI), con un predominio de los primeros. Los tocoferoles, además de encontrarse en su forma libre, también se detectaron esterificados con ácidos grasos de cadena larga en todos los extractos. Las series correspondientes a los α-tocoferol ésteres (XXII) y β-tocoferol ésteres (XXIII) se caracterizaron intactas por GC/MS, mediante sus espectros de masas. Los tocoferoles se encuentran esterificados a ácidos grasos con un número par de átomos de carbono, comprendido en el rango desde CB12B a CB20 B, incluyendo los ácidos grasos insaturados oleico (CB18:1B) y linoleico (CB18:2B) (Rencoret et al., 2006). Se encontraron unas series de compuestos en las cuales el ácido ferúlico está unido mediante un enlace ester con n-alcoholes grasos de cadena larga (XXIV) o con ω-hidroxiácidos (XXV). La caracterización de estos compuestos intactos se realizó mediante sus espectros de masas, tanto de las muestras sin derivatizar, así como con los espectros de las muestras derivatizadas (metiladas y/o silanizadas) publicados por del Río et al., 2004. La serie de n-alquil trans ferulatos se detectó con alcoholes que presentaban entre 20 y 26 átomos de carbono, con predominio de los pares, siendo los más predominantes los CB22 B y CB24B en todas los extractos de las maderas a excepción de la del E. dunnii, donde los predominantes resultaron ser los CB24B y CB26 B. Los feruloil ésteres de ω-hidroxiácidos, los cuales habían sido raramente detectados en algunas plantas (Pereira et al., 2002), se identificaron en el rango desde CB16 B a CB26 B, siendo los más predominantes los CB22B y CB24 B en todos los extractos excepto en el del E. dunnii donde los predominantes fueron los de CB24 B y CB26 B. Pequeñas cantidades de alquilferulatos y ω-carboxialquilferulatos también se encontraron en el extracto de E. globulus (Freire et al., 2002). Los glicéridos, incluyendo mono-, di- y triglicéridos, se detectaron en todos los extractos, con un predominio de monoglicéridos. Los monoglicéridos (XXVI) se encuentran en los extractos en cantidades relativamente grandes (59-121mg KgP

-1P de

madera). El número de carbonos de la molécula de ácido graso se encuentra en el rango de CB14 B a CB30B y de nuevo se observa un predominio de aquellos monoglicéridos constituidos por ácidos grasos con número par de átomos de átomos de carbono, siendo los más predominantes los CB24B, CB26 B y CB28 B. Además, se detectó una serie de monoglicéridos constituidos por ω-hidroxiácidos (Freire et al., 2006) de CB24B, CB26 B y CB28 B en todos los extractos de las diferentes maderas estudiadas, aunque en cantidades muy


45

bajas. Las cantidades de triglicéridos encontradas oscilaron entre 11-38 mg KgP

-1P de

madera, constituidos principalmente por tripalmitina (XXVII), mientras los diglicéridos se encuentran en muy baja proporción en todos los extractos de las maderas estudiadas. Finalmente, se encontraron, en todos los extractos, pequeñas cantidades de otros compuestos, como escualeno (XXVII) y una serie de alcoholes de cadena larga (XXIX) desde CB14B a CB28 B, solo detectable en las muestras silanizadas.

OH

O

XVIOH

O

XVII

OH

O

XVIII

HOOH

O

XIX

XXVIII

O

HO

XXO

HO

XXI

O

O

OXXII

O

O

O

XXIII

O

OCH3

OH

O

XXIV

OOH

OO

OCH3

OH

XXV

CO-O-CH2

HO-O-CH

HO-O-CH2

XXVI XXVII

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

OH

XXIX

OH

O

XVIOH

O

OH

O

OH

O

XVIOH

O

XVIIOH

O

OH

O

OHOH

O

XVII

OH

O

XVIIIOH

O

OH

O

OHOH

O

XVIII

HOOH

O

XIX

HOOH

OHO

OH

O

OHOH

O

XIX

XXVIIIXXVIII

O

HO

XXO

HO

O

HO

XXO

HO

XXIO

HO

O

HO

XXI

O

O

OXXII O

O

OO

O

O

O

OXXII

O

O

O

XXIII

O

O

OO

O

OO

O

OO

O

O

O

OO

XXIII

O

OCH3

OH

O

XXIV

O

OCH3

OH

OO

OCH3

OH

O

XXIV

OOH

OO

OCH3

OH

XXV

OOH

OO

OCH3

OH

OOH

OO

OCH3

OH

OOH

OO

OCH3

OH

OCH3

OH

XXV

CO-O-CH2

HO-O-CH

HO-O-CH2

XXVI

CO-O-CH2

HO-O-CH

HO-O-CH2

CO-O-CH2

HO-O-CH

HO-O-CH2

CO-O-CH2

HO-O-CH

HO-O-CH2

XXVI XXVII

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

XXVII

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

OH

XXIXOHOH

XXIX

Figura 17. Estructuras de los compuestos no esteroidales identificados en las maderas de eucalipto a las que se hace referencia en el texto: (XVI) ácido palmítico, (XVII) ácido oleico, (XVIII) ácido linoleico, (XIX) ácido 22-hidroxidocosanoico, (XX) α-tocoferol, (XXI) β-tocoferol, (XXII) α-tocoferil linoleato, (XXIII) β-tocoferol linoleato, (XXIV) trans-docosanil ferulato, (XXV) trans- ácido feruloiloxidocosanoico, (XXVI) docosanoato de 2,3-dihidroxipropilo, (XXVII) tripalmitina, (XXVIII) escualeno, (XXIX) n-docosanol.


46

4.1.5 Estudio de la composición y estructura de la lignina de las maderas de las diferentes especies de eucalipto

El análisis de la composición química de la lignina se llevó a cabo mediante el uso de las siguientes técnicas: Py-GC/MS, DFRC y tioacidolisis. Por otro lado, el estudio de la estructura se realizó mediante 2D-NMR.

4.1.5.1 Análisis de la composición de la lignina mediante Py-GC/MS

Las técnicas pirolíticas presentan diversas ventajas sobre otros métodos degradativos en el estudio de las macromoléculas. Junto con su rapidez, el análisis por Py-GC/MS se caracteriza por la pequeña cantidad de muestra requerida y por permitir el análisis de la lignina “in situ”, frente a los métodos clásicos que requieren su extracción de la madera. Se han publicado numerosos estudios sobre pirólisis de materiales lignocelulósicos (Pouwels et al., 1987; Saiz-Jiménez et al., 1987; Elder, 1991; Yokoi et al., 1999; del Río et al., 2001b, 2002, 2005). Las pirólisis se realizaron tanto a las maderas de las especies de eucalipto seleccionadas para este estudio como a las ligninas Björkman (MWL) obtenidas de éstas. Los pirogramas obtenidos de las diferentes maderas estudiadas se muestran en la Figura 18 y las asignaciones y las abundancias molares relativas de los compuestos obtenidos por pirólisis de las maderas se encuentran en la Tabla 7. Entre los compuestos derivados de los carbohidratos los principales son hidroxiacetaldehído (1), furfural (7), 5(H)-furan-2-ona (10), 2,3-dihidro-5-metilfuran-2-ona (11), 4-hidroxi-5,6-dihidro-2(H)-piran-2-ona (13), y levoglucosano (32). Entre los compuestos derivados de la lignina, los más típicos son los que provienen de las unidades fenólicas del tipo S y G, los más relevantes son: guaiacol (16), 4-metilguaiacol (17), 4-vinilguaicol (20), siringol (21), 4-metilsiringol (26), trans-isoeugenol (27), 4-vinilsiringol (35), siringaldehído (40), homosiringaldehído (43), acetosiringona (44) y trans-sinapaldéhido (52). En todos los pirogramas de las diferentes especies, los derivados fenólicos de tipo S fueron más abundantes que los derivados de tipo G. Las áreas molares relativas de los picos se calcularon para los productos de pirólisis de carbohidratos así como para los derivados de tipo S y G de la lignina. Las relaciones S/G y lignina/carbohidrato (L/CH) se determinaron para cada una de las maderas como el valor medio de dos replicados (Tabla 8). Se debe tener en cuenta que la relación L/CH observada no refleja el contenido real de cada molécula, ya que es sabido que la pirólisis subestima en demasía el contenido en celulosa debido a la gran cantidad de productos no cromatografiables que se producen a partir de ella. Sin embargo, la relación L/CH obtenida por pirólisis de las maderas pueden ser utilizadas para comparar las cantidades relativas de lignina y carbohidratos de las diferentes especies ya que se realizaron en las mismas condiciones. Los resultados obtenidos mostraron que la madera de E. globulus presenta la relación L/CH más baja, además de mostrar que las ligninas procedentes de las diferentes especies de eucalipto estudiadas presentan elevadas relaciones S/G, aunque hay que tener en cuenta que la pirólisis, como otros métodos degradativos, sobreestima las cantidades de unidades S obtenidas (Sarkanen and Hergert, 1971).


47

Figura 18. Pirogramas de las maderas de eucalipto.

5 10 252015Tiempo de retención (min)

E. globulus

E. grandis

E. maidenii

E. nitens

0

1

7

10 11

13

1217

20

21

16

26

27

32

35

37 39

40

41

43

44 4748

51 53

52

5

1

710

11

13

1720

21

1626

27

32

37 39

4041

43

44 47 4851 53

525

35

1

7

1011

13

17

20

21

16

26

2732

35

37 39

40

41

43

44 4748

5153

52

5

1

71011

13

17 20

21

16

26

27

32

35

37 39

40

41

43

4447 48

5153

52

5

35

E. dunnii1

7

10 11

13

12

17 20

21

16

26

27

32

3739

40

41

43

44 4748

51 53

52

5

5 10 252015Tiempo de retención (min)

E. globulus

E. grandis

E. maidenii

E. nitens

0

1

7

10 11

13

1217

20

21

16

26

27

32

35

37 39

40

41

43

44 4748

51 53

52

5

1

710

11

13

1720

21

1626

27

32

37 39

4041

43

44 47 4851 53

525

35

1

7

1011

13

17

20

21

16

26

2732

35

37 39

40

41

43

44 4748

5153

52

5

1

71011

13

17 20

21

16

26

27

32

35

37 39

40

41

43

4447 48

5153

52

5

35

E. dunnii1

7

10 11

13

12

17 20

21

16

26

27

32

3739

40

41

43

44 4748

51 53

52

5


48

Tabla 7. Abundancias molares relativas de los compuestos obtenidos por pirólisis de las diferentes maderas de eucalipto.

Nº Compuestos Origen E. globulus E. nitens E. maidenii E. grandis E. dunnii 1 hidroxiacetaldehido CH 24,6 34,9 26,8 26,4 24,0 2 (3H) Furan-2-ona CH 0,6 0,6 0,9 0,7 0,3 3 desconocido CH 1,0 1,2 0,9 0,8 1,0 4 (2H) Furan-3-ona CH 0,8 1,1 0,6 0,9 0,7 5 1,3-hidroxidihidro-2(3H)-furanona CH 1,4 1,7 1,6 1,2 0,9 6 desconocido CH 1,1 0,7 0,9 0,7 0,8 7 furfural CH 3,7 3,5 3,4 3,1 3,2 8 2,3 dihidro-5-metilfuran-2-ona CH 0,3 0,3 0,2 0,3 0,3 9 ciclopent-1-en-3,4-diona CH 0,5 0,6 0,5 0,5 0,0 10 (5H)-furan-2-ona CH 2,5 0,3 2,5 2,4 2,0 11 2,3-dihidro-5-metilfuran-2-ona CH 2,4 1,2 1,5 0,9 1,4 12 aldehido 5-metil-2-furfural CH 0,4 0,2 0,3 0,2 0,4 13 4-hidroxi-5,6-dihidro-(2H)-piran-2-ona CH 3,8 2,6 3,1 2,8 4,9 14 3-hidroxi-2-metil-2-ciclopenten-1-ona CH 0,6 0,3 0,5 0,7 0,9 15 2-hidroxi-3-metil-2-ciclopenten-1-ona CH 0,5 0,4 0,5 0,3 0,4 16 Guaiacol LG 1,2 1,5 1,2 1,4 1,2 17 4-metilguaiacol LG 1,3 1,3 1,3 1,9 1,4 18 3-metoxicatecol LG 0,5 0,2 0,7 0,1 0,8 19 4-etilguaiacol LG 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2 20 4-vinilguaicol LG 1,3 1,7 1,6 2,3 1,5 21 siringol LS 3,5 4,0 3,9 3,1 2,7 22 eugenol LG 0,2 0,3 0,2 0,4 0,2 23 propilguaiacol LG 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 24 vainillina LG 0,7 0,5 0,6 0,7 0,6 25 c-isoeugenol LG 0,2 0,3 0,2 0,3 0,2 26 4-metilsiringol LS 2,6 2,1 2,5 2,1 2,5 27 t-isoeugenol LG 0,7 0,7 0,8 0,9 0,9 28 homovainillina LG 0,3 0,4 0,3 0,5 0,5 29 propine-guaiacol LG 0,4 1,2 0,5 0,9 0,3 30 propine-guaiacol LG 0,6 0,9 0,4 0,9 0,6 31 acetoguiacona LG 0,1 0,4 0,4 0,3 0,2 32 levoglucosano CH 18,8 11,3 17,0 18,2 21,5 33 4-etilsiringol LS 0,5 0,4 0,5 1,0 0,4 34 guaiacilacetona LG 0,2 0,2 0,5 0,5 0,4 35 4-vinilsiringol LS 5,5 5,1 4,7 4,4 5,1 36 guaiacilvinilcetona LG 0,2 0,2 0,3 0,4 0,2 37 4-alilsiringol LS 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 38 propilsiringol LS 0,2 0,0 0,1 0,0 0,3 39 c-propenilsiringol LS 0,7 0,6 0,7 0,6 0,5 40 siringaldehido LS 2,0 2,4 2,8 2,4 2,0 41 propine-siringol LS 1,0 2,0 0,8 1,3 1,0 42 propine-siringol LS 0,7 1,3 0,5 0,9 0,7 43 t-propenilsiringol+ homosiringaldehido LS 4,7 3,7 4,1 3,5 4,5 44 acetosiringona LS 0,8 1,0 1,0 1,0 0,8 45 t-coniferilaldehido LG 0,2 0,4 0,8 0,8 0,6 46 alcohol c-coniferílico LG 0,8 0,7 0,9 1,1 1,0 47 siringilacetona LS 0,7 0,7 0,8 0,6 0,7 48 propiosiringona LS 0,3 0,2 0,3 0,2 0,3 49 siringilvinilcetona LS 0,1 0,3 0,2 0,2 0,1 50 alcohol dihidrosinapílico LS 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 51 alcohol c-sinapílico LS 0,3 0,3 0,5 0,4 0,4 52 t-sinapaldehido LS 2,4 2,4 2,9 2,7 2,4 53 alcohol t-sinapílico LS 0,7 0,8 0,9 1,1 1,3

Abreviaturas: c: cis t: trans

La madera de E. globulus presenta la mayor relación S/G (3,0), lo cual hace que sea más fácil de su deslignificación bajo las condiciones de pasteo Kraft debido a la mayor reactividad de las unidades S de la lignina en sistemas alcalinos (Chang y Sarkanen 1973; Tsutsumi et al., 1995).


49

Tabla 8. Porcentajes y relaciones obtenidas de las pirólisis de las maderas.

La pirólisis también se realizó a las MWL obtenidas de las diferentes maderas de eucalipto. A diferencia de las pirólisis de las maderas, en estos pirogramas, los picos procedentes de CH no suelen aparecer, en la Figura 19 se muestra el pirograma de la lignina de E. dunni. Las asignaciones y las abundancias molares relativas de los compuestos obtenidos por pirólisis de las MWL se encuentran en la Tabla 9. Las relaciones S/G obtenidas de las MWL presentan unos valores ligeramente más pequeños que aquellos obtenidos de sus maderas, sin embargo, la tendencia en las relaciones S/G se mantienen, siendo la relación S/G mayor para la especie E. globulus (2,6) y la menor para la especie E. grandis (1,9).

Tabla 9. Identificación y abundancia molar relativa de los compuestos obtenidos por Py-GC/MS de las MWL de las maderas de las diferentes especies de eucalipto. Nº Compuestos E. globulus E. nitens E. maidenii E. grandis E. dunnii 1 guaiacol 5,5 5,5 6,3 5,7 5,1 2 4-metilguaiacol 3,8 3,5 4,1 4,6 2,6 3 3-metoxicatecol 1,3 2,4 1,7 0,2 1,3 4 4-etilguaiacol 1,2 1,2 1,4 1,3 0,9 5 4-vinilguaicol 4,8 4,6 5,1 5,9 4,0 6 siringol 13,8 13,5 14,2 11,8 14,5 7 eugenol 0,7 0,9 0,7 1,2 0,9 8 4-propilguaiacol 0,3 0,4 0,3 0,3 0,2 9 vainillina 1,5 2,6 2,8 2,1 2,4 10 c-isoeugenol 0,3 0,1 0,3 0,8 0,4 11 4-methylsyringol 7,9 7,1 7,3 7,4 5,9 12 t-isoeugenol 2,6 3,9 3,4 3,7 3,1

Especie de eucalipto %G %S S/G %L %C L/C E. globulus 24.8 75.2 3.0 37.1 62.9 0.6 E. nitens 27.8 72.2 2.6 39.4 60.6 0.7 E. maidenii 27.2 72.8 2.7 39.0 61.0 0.6 E. grandis 33.3 66.7 2.0 40.1 59.9 0.7 E. dunnii 28.4 71.5 2.5 37.5 62.5 0.6

Figura 19. Pirograma de la MWL obtenida de la madera de E. dunnii.

Tiempo de retención (min)

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

2000000

4000000

6000000

8000000

1e+07

1.2e+07

1.4e+07

1.6e+07

1.8e+07

2e+07

2.2e+07

2.4e+07

2.6e+07

Time-->

AbundanceTIC: DUNII.D

1

2

5

6

11

12

17

19

21 23

24

27+28

2930

31

37

38

- - - - - - - - -

6 8 10 12 14 16 18 20 226.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00

0

2000000

4000000

6000000

8000000

1e+07

1.2e+07

1.4e+07

1.6e+07

1.8e+07

2e+07

2.2e+07

2.4e+07

2.6e+07

Time-->

AbundanceTIC: DUNII.D

1

2

5

6

11

12

17

19

21 23

24

27+28

2930

31

37

38

- - - - - - - - -

6 8 10 12 14 16 18 20 22


50

13 homovainillina 1,2 1,0 1,1 0,9 0,8 14 propine-guaiacol 0,6 0,5 0,6 1,0 0,7 15 propine-guaiacol 0,5 0,4 0,5 0,7 0,5 16 acetoguaiacona 0,6 0,9 1,2 1,4 1,0 17 4-etilsiringol 4,2 2,0 1,9 1,5 1,5 18 guaiacilacetona 0,6 0,5 0,5 0,4 0,4 19 4-vinilsiringol 9,9 8,2 7,5 8,1 7,9 20 guaiacilvinilcetona 0,6 0,6 0,7 0,8 0,8 21 4-alilsiringol 1,7 1,9 1,5 1,6 2,0 22 propilsiringol 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 23 c-propenilsiringol 1,4 1,4 1,6 1,8 1,8 24 siringaldehído 6,4 7,0 7,2 7,5 8,4 25 propine-siringol 1,7 1,4 1,2 1,3 1,5 26 propine-siringol 1,1 0,7 0,5 0,8 0,7 27 t-propenilsiringol 5,7 6,8 5,1 5,8 6,0 28 homosiringaldehído 4,9 4,0 3,3 2,6 3,1 29 acetosiringona 2,6 2,7 3,0 3,4 3,4 30 t-coniferaldehído 1,5 1,7 2,2 2,5 2,3 31 alcohol t-coniferílico 0,8 2,1 1,7 1,5 2,5 32 siringilacetona 1,5 1,2 1,1 0,9 1,0 33 propiosiringona 0,9 0,9 1,0 1,0 0,9 34 siringil vinil cetona 0,8 0,6 0,9 1,3 1,2 35 alcohol dihidrosinapílico 0,2 0,4 0,3 0,3 0,4 36 alcohol c-sinapílico 0,3 0,6 0,5 0,3 0,8 37 t-sinapaldehído 5,6 4,6 5,0 6,2 6,2 38 alcohol t-sinapílico 1,0 2,2 2,0 1,2 2,7 S/G ratio 2,6 2,1 2,0 1,9 2,4

4.1.5.2 Análisis de la composición química de la lignina mediante DFRC

La técnica DFRC se aplicó a las MWL aisladas de las maderas de las diferentes especies de eucaliptos. Los cromatogramas obtenidos mediante esta técnica se caracterizan por presentar cuatro picos intensos, correspondientes a los isómeros cis y trans de las unidades S y G. Mediante el cálculo de las áreas molares relativas es posible obtener las relaciones S/G para cada una de las diferentes MWL (Tabla 10).

4.1.5.3 Análisis de la composición química de la lignina mediante tioacidolisis

Al igual que la DFRC, la tioacidolisis se aplicó a las MWL. En este caso los cromatogramas se caracterizan por presentar dos dobletes, cada uno de ellos correspondientes a las formas eritro y treo de cada unidad. Las relaciones S/G al igual que en la DFRC se calculan a partir de las áreas molares relativas. Los valores de relación S/G obtenidos para las diferentes MWL se muestran en la Tabla 10, donde se aprecia que la composición de la MWL, en términos de relación S/G, es bastante similar a la obtenida por Py-GC/MS y muestra la misma tendencia que la obtenida mediante DFRC, siendo la mayor relación S/G para el E. globulus, seguida de E. dunnii, E. nitens, E. maidenii y por último E. grandis.


51

4.1.5.4 Estudio de la estructura de la lignina de las diferentes especies de eucalipto

El estudio de la estructura de la lignina se realizó a partir de las MWL, aisladas de las maderas de las diferentes especies de eucalipto, mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional. Los experimentos que se realizaron se trataron de 2D HSQC y 2D HMBC. Las señales de cruce observadas en los espectros bidimensionales se asignaron principalmente por la comparación de éstos con los existen en la literatura (Capanema et al., 2001, 2004, 2005; Ralph et al., 1999, 2004; Liitiä et al., 2003; Balakshin et al., 2003) y mediante la combinación del HSQC y el HMBC. El espectro 2D HSQC de la lignina se caracteriza porque presenta tres regiones claramente diferenciadas: la región alifática, la región alifática oxigenada y la región aromática (Figura 20). La región alifática (no oxigenada) presenta señales correspondientes a lípidos, a productos de degradación de la lignina y a otros compuestos no identificados, por lo que es la menos interesante desde el punto de vista del estudio de la estructura de la lignina.

Tabla 10. Relaciones S/G de las MWL de las maderas de eucalipto obtenidas por diferentes técnicas analíticas degradativas.

Técnica E. globulus E. nitens E. maidenii E. grandis E. dunnii

Py-GC/MS 2,6 2,1 2,0 1,9 2,4 DFRC 2,1 1,8 1,6 1,4 2,1 Tioacidolisis 2.5 2.1 1.8 1.6 2.3


52

En la Figura 20 se observa que los HSQC de las ligninas aisladas de las maderas de las diferentes especies de eucalipto son muy similares. Para llevar a cabo un análisis de los enlaces entre las unidades es necesario estudiar a fondo la región alifática oxigenada y la región aromática de los espectros HSQC, las cuales se muestran ampliadas para el espectro 2D HSQC de la lignina de E. dunnii en la Figura 21. Las asignaciones de las señales y sus desplazamientos químicos observados en los espectros HSQC de las diferentes ligninas se muestran en la Tabla 11. Las subestructuras elucidadas a partir de los espectros HSQC se pueden observar en la Figura 22.

Figura 20. Espectros HSQC totales de las ligninas de las diferentes especies de eucalipto.

ppm

Región aromática

Región alifática oxigenada

Región alifática

DMSO

E. globulus

1.02.03.04.05.06.07.08.0δH δH

0

δC

1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppmppm

100

50

E. nitens

Región aromática


Región alifática

ppm1.02.03.04.05.06.07.08.0δH

E. maidenii

Región aromática


Región alifática

δC

1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppmppm

100

50

δH

E. grandis

Región aromática


Región alifática

ppm1.02.03.04.05.06.07.08.0δH

E. dunnii

Región aromática


Región alifática

δC

100

50

ppm

Región aromática


Región alifática

DMSO

E. globulus

1.02.03.04.05.06.07.08.0δH δH

0

δC

1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppmppm

100

50

E. nitens

Región aromática


Región alifática

δH

0

δC

1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppmppm

100

50

E. nitens

Región aromática


Región alifática

ppm1.02.03.04.05.06.07.08.0δH

E. maidenii

Región aromática


Región alifática

ppm1.02.03.04.05.06.07.08.0δH

E. maidenii

Región aromática


Región alifática

δC

1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppmppm

100

50

δH

E. grandis

Región aromática


Región alifática

ppm1.02.03.04.05.06.07.08.0δH

E. dunnii

Región aromática


Región alifática

δC

100

50

ppm1.02.03.04.05.06.07.08.0δH

E. dunnii

Región aromática


Región alifática

ppm1.02.03.04.05.06.07.08.0δH

E. dunnii

Región aromática


Región alifática

δC

100

50


53

Tabla 11 Asignaciones de las señales de correlación P

13PC- P

1PPPH que aparecen los espectros HSQC de

las MWL de las diferentes especies de eucaliptos.

δBCB/δ BH B (ppm) Asignaciones

9-37/0.8-2.6 diferentes C-H en cadenas alifáticas saturadas

32.0/2.53 CBαBH BαB en alcohol dihidrosinapílico (E)

35.0/1.68 CBβBH BβB en alcohol dihidrosinapílico (E)

53.7/3.46 CBβ B-HBβ B en subestructuras de fenilcumarano (C)

54.1/3.06 CBβ B-HBβ B en subestructuras de resinol (B)

55.4/2.76 CBβ B-HBβ Ben subestructuras β-1’ (H)

56.2/3.73 C-H en metoxilos (MeO)

60.1/3.40 y 3.72 CBγ BHBγ B en subestructuras β-O-4’ (A)

60.3/2.75 CBβ B-HBβ B en subestructuras de espirodienonas (D)

61.9/4.09 CBγ B-HBγ B en alcohol p-hidroxicinamílico (sinapílicol/coniferílico) (I)

71.7/4.74 CBα B-HBα B en subestructuras β-O-4’ unida a unidades tipo G (A)

71.7/3.83 y 4.19 CBγ B-HBγ B en subestructuras de resinol (B)

72.4/4.86 CBα B-HBα B en subestructuras β-O-4’ unida a unidades tipo S (A)

74.8/5.02 CBαBH Bα B en subestructuras β-1’ (H)

79.8/4.11 CBβ’ B-HBβ’ B en subestructuras de espirodienonas (D)

81.7/5.09 CBαBH Bα B en subestructuras de espirodienonas (D)

83.8/5.23 CBβ B-HBβ B en subestructuras β-O-4’ con CBαB=O (F)

84.2/4.29 CBβ B-HBβ B en subestructuras β-O-4’ unida a unidades tipo G (A)

85.5/4.67 CBα B-HBα B en subestructuras de resinol (B)

86.6/4.39 CBα’ BH Bα’ B en subestructuras de espirodienonas (D)

86.4-87.3/4.01-4.11 CBβ B-HBβ B en subestructuras β-O-4’ unida a unidades tipo S (A)

87.4/5.47 CBα B-HBα B en subestructuras de fenilcumarano (C)

104.7/6.69 CB2,6B-HB2,6 B en unidades siringilo (S)

106.8/7.32 CB2,6B-HB2,6 B en unidades siringilo oxidadas (CBα B=O) (S’)

107.0 /7.19 CB2,6B-HB2,6 B en unidades siringilo oxidadas (CBα BOOH) (S’’)

107.4/6.33 CB2BH B2 B en subestructuras de espirodienonas (D)

111.6/6.99 CB2B-HB2B en unidades guaiacilo (G)

112.1/7.53 CB2B-HB2B en unidades guaiacilo oxidadas (G’)

114.1/6.26 CB6BH B6 B en subestructuras de espirodienonas (D)

115.4/6.72 y 6.94 CB5B-HB5B en unidades guaiacilo (G)

119.5/6.77 CB6B-HB6B en unidades guaiacilo (G)

123.8/7.58 CB6B-HB6B en unidades guaiacilo oxidadas (G’)


54

Figura 21. Regiones alifática oxigenada y aromática expandida del espectro 2D HSQC de la lignina de E. dunnii.

δH

3.03.54.04.55.05.5 ppm

MeO Cβ Bβ

Aα (S)

Bγ

Aγ

Aβ (G)Aβ (S)

Bα

Cα

Aα (G)

Dβ

A

δC

65

60

70

80

90

55

75

85

ppm

Fβ Dα Dβ’

Dα’

Iγ

S2,6S’2,6

G6

ppm6.06.57.07.58.0δH

B

G2

G5

110

105

115

125

100

120

130

ppm

95

δC

D2

D6

S’’2,6

G’2

δH

3.03.54.04.55.05.5 ppm

MeO Cβ Bβ

Aα (S)

Bγ

Aγ

Aβ (G)Aβ (S)

Bα

Cα

Aα (G)

Dβ

A

δC

65

60

70

80

90

55

75

85

ppm

Fβ Dα Dβ’

Dα’

Iγ

δH

3.03.54.04.55.05.5 ppm

MeO Cβ Bβ

Aα (S)

Bγ

Aγ

Aβ (G)Aβ (S)

Bα

Cα

Aα (G)

Dβ

A

δC

65

60

70

80

90

55

75

85

ppm

Fβ Dα Dβ’

Dα’

Iγ

S2,6S’2,6

G6

ppm6.06.57.07.58.0δH

B

G2

G5

110

105

115

125

100

120

130

ppm

95

δC

D2

D6

S’’2,6

G’2

S2,6S’2,6

G6

ppm6.06.57.07.58.0δH

B

G2

G5

110

105

115

125

100

120

130

ppm

95

δC

D2

D6

S’’2,6

G’2


55

El espectro HMBC de la muestra de lignina de E. globulus se muestra en la Figura 23. En los espectros HMBC se pueden observar diferentes señales de correlaciones (figura 23A) entre protones alquílicos (1.8-2.2 ppm) y los carbonos carboxílicos (170-175 ppm) asignadas a ácidos grasos libres o esterificados. Sin embargo, la información más interesante se encuentra en la región expandida δBHB 6-8 ppm (Figura 23B). Esta región muestra las correlaciones entre los protones HB2,6B de las unidades S (6.69 ppm) y los CB1 B, CB2,6 B, CB3,5 B, y CB4 B situados a uno o dos enlaces de distancia.

O

OCH3H3CO

O

HO

HO

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

A

5'

3'2'1' 6'

4'O

OCH3

OCH3O

O654

321

O

OCH3

H3CO

α'

β'

γ'α

β

γ

B

165

4 32

3'

1'6'5' 4'

2'

α

βγ OCH3

OHO

O OCH3

H3CO

C

O

OCH3H3CO

O

HO

O

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

F

165 4 3

2

OH

OCH3

O

H3CO

αβ

γ

EO

OCH3

Oα

β

γ OAr

OHHO

O

H3CO

1'6'5' 4' 3'

2'

α' β'γ'

OCH3

H3CO

1654 3

2

D

HO

OCH3H3CO

HO

HO

165 4 3

2

αβ

γ

4'

2'1'6' 5'

3'

O

OCH3

OCH3

165 4 3

2

OH

OCH3

O

H3CO

αβ

γ

I

O

OCH3

OH

165 4 3

2

α

G

O

OCH3

O

165 4 3

2

α

G’

O

OCH3H3CO

OH

165 4 3

2

α

S

O

OCH3H3CO

O

165 4 3

2

α

S’

O

OCH3H3CO

O

165 4 3

2

αHO

S’’

O

OCH3H3CO

O

HO

HO

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

A

O

OCH3H3CO

O

HO

HO

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

A

5'

3'2'1' 6'

4'O

OCH3

OCH3O

O654

321

O

OCH3

H3CO

α'

β'

γ'α

β

γ

B

5'

3'2'1' 6'

4'O

OCH3

OCH3O

O654

321

O

OCH3

H3CO

α'

β'

γ'α

β

γ

B

165

4 32

3'

1'6'5' 4'

2'

α

βγ OCH3

OHO

O OCH3

H3CO

C

165

4 32

3'

1'6'5' 4'

2'

α

βγ OCH3

OHO

O OCH3

H3CO

C

O

OCH3H3CO

O

HO

O

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

FO

OCH3H3CO

O

HO

O

H3CO

OCH316

5 4 32

2'

6'5'4' 3'

1'

αβ

γ

F

165 4 3

2

OH

OCH3

O

H3CO

αβ

γ

E

165 4 3

2

OH

OCH3

O

H3CO

αβ

γ

EO

OCH3

Oα

β

γ OAr

OHHO

O

H3CO

1'6'5' 4' 3'

2'

α' β'γ'

OCH3

H3CO

1654 3

2

DO

OCH3

Oα

β

γ OAr

OHHO

O

H3CO

1'6'5' 4' 3'

2'

α' β'γ'

OCH3

H3CO

1654 3

2

D

HO

OCH3H3CO

HO

HO

165 4 3

2

αβ

γ

4'

2'1'6' 5'

3'

O

OCH3

OCH3

HO

OCH3H3CO

HO

HO

165 4 3

2

αβ

γ

4'

2'1'6' 5'

3'

O

OCH3

OCH3

165 4 3

2

OH

OCH3

O

H3CO

αβ

γ

I

165 4 3

2

OH

OCH3

O

H3CO

αβ

γ

I

O

OCH3

OH

165 4 3

2

α

G

O

OCH3

OH

165 4 3

2

α

G

O

OCH3

O

165 4 3

2

α

G’

O

OCH3

O

165 4 3

2

α

G’

O

OCH3H3CO

OH

165 4 3

2

α

S

O

OCH3H3CO

OH

165 4 3

2

α

S

O

OCH3H3CO

O

165 4 3

2

α

S’

O

OCH3H3CO

O

165 4 3

2

α

S’

O

OCH3H3CO

O

165 4 3

2

αHO

S’’

O

OCH3H3CO

O

165 4 3

2

αHO

S’’

Figura 22. Subestructuras encontradas en los espectros HSQC a las que se hace referencia en la tabla 11.


56

4.1.6 Conclusiones

La caracterización química detallada de las maderas de las diferentes especies de eucalipto ha puesto de manifiesto que:

• Existe una gran similitud entre las composiciones químicas de las diferentes especies, lo cual es lógico ya que todas son maderas de eucalipto.

• En cuanto al contenido de extraíbles lipofílicos, se observa que la especie E. globulus presenta el contenido más bajo, tanto globalmente, como de aquellos compuestos responsables de la formación de los depósitos de pitch. Ésta es una de las ventajas de utilizar la madera de E. globulus en la fabricación de pasta de papel frente a la de las otras especies.

• La madera de las especies de eucalipto estudiadas presentan lignina del tipo G y S, mientras que no se han detectado unidades del tipo H.

• En todas las especies de eucalipto estudiadas existe un mayor porcentaje de lignina S frente a lignina G, lo cual desde el punto de vista papelero es muy positivo, ya que la lignina de tipo S es más fácilmente degradable que la lignina de tipo G (Chang y Sarkanen 1973; Tsutsumi et al., 1995; González-Vila et al., 1999; del Río et al., 2005) lo que, a priori, las convierte en materias primas interesantes para la industría de la pasta y el papel. La especie E. globulus resultó ser la especie con una mayor relación S/G, lo que unido a su menor contenido en lignina, hace que sea la especie que presente un mayor rendimiento en la obtención de pasta de papel.

1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppmppm

100

50

δH

δC

150

200

100

δH

δC

150

200

105

7.5 7.0 6.5 ppmppm

C

MeO

PEO-PPO

S2,6S’2,6

C2,6C1C4

C3,5

Cα (β-O-4’)BA

C3,5/HMeO

1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppmppm

100

50

δH

δC

150

200

100

δH

δC

150

200

105

7.5 7.0 6.5 ppmppm

C

MeO

PEO-PPO

S2,6S’2,6

C2,6C1C4

C3,5

Cα (β-O-4’)BA

C3,5/HMeO

Figura 23. Espectro HMBC total de la lignina de E. globulus (A), región expandida δH 6-8 ppm del HMBC de la lignina de E. globulus (B), región expandida del HSQC de la lignina de E. globulus (C).


57

4.2 UTILIZACIÓN DEL SLM PARA LA ELIMINACIÓN DE LOS LÍPIDOS RESIDUALES PRESENTES EN PASTAS DE DISTINTA NATURALEZA

El tratamiento con el sistema lacasa mediador afectó a todas las principales clases de lípidos encontrados en las diferentes tipos de pastas (Figura 24), como se puede observar por comparación con los correspondientes controles sin enzima. Sin embargo, no se observaron modificaciones durante tratamientos de la pasta con lacasa sola (sin el mediador).

4.2.1 Tratamientos de la pasta kraft de eucalipto con el SLM

Las abundancias de los principales compuestos lipofílicos presentes en la pasta control y la tratada enzimáticamente se muestran en la Tabla 12. Los esteroles en sus formas libres y conjugadas (como glicósidos y ésteres) resultaron ser los compuestos mayoritarios. Algunos hidrocarburos esteroidales y cetonas esteroidales, como la estigmasta-3,5-dien-7-ona y el 7-oxositosterol, se identificaron también junto con una serie de ácidos grasos libres. Los cromatogramas de la pasta control y la pasta tratada con el sistema lacasa-mediador se muestran en la Figura 25. La Tabla 12 muestra que el tratamiento con lacasa-HBT elimina casi en su totalidad los esteroles libres, ésteres de esteroles y el sitosteril-3-β-D-glucopiranósido. El sitosterol que representa más del 80 % de los esteroles libres en la pasta de eucalipto se eliminó en su totalidad, y solo una pequeña cantidad de estigmastanol permaneció en la pasta tratada. Por otro lado, se produjo un aumento en las cantidades de estigmasta-3,5-dien-7-ona, estigamastan-3-ona, y especialmente de 7-oxo-sitosterol, después del tratamiento de las pasta con el sistema lacasa-HBT. El sistema lacasa-mediador resultó ser muy eficiente en la eliminación de esteroles (95-100 % son eliminados), incluyendo sitosterol libre, sus glicósidos y sus ésteres con ácidos grasos, los cuales son los lípidos más característicos de la pasta de eucalipto. Estos compuestos proceden de los extraíbles lipofílicos presentes en la madera de eucalipto, los cuales sobreviven a la cocción y al blanqueo con oxigeno, dando lugar a los problemas de pitch en la pasta. Entre ellos, el estigmastanol (esterol saturado) resultó ser el más resistente a la acción del sistema lacasa-mediador que el sitosterol (esterol con una insaturación). La abundancia de las cetonas esteroidales en la pasta de eucalipto aumentó durante el tratamiento, lo que sugiere que éstas son productos oxidados de los esteroles. Las pequeñas cantidades de 7-oxositosterol que estaban presentes en la pasta de eucalipto inicial se formó problamente durante el pasteo y la deslignificación con oxígeno. El incremento de estos oxo-derivados en la pasta tratada es congruente con la naturaleza oxidativa del tratamiento con el SLM.


58

Figura 24. Estructura química de los compuestos representativos de las principales clases de lípidos presentes en las pastas de papel analizadas: ácido palmítico (A), ácido dehidroabiético (B), n-octacosanol (C), campesterol (D), sitosterol (E), estigmastanol (F), 7-oxositosterol (G), estigmasta-3,5-dien-7-ona (H), sitosteril 3-β-D-glucopiranósido (I), 7-oxositosteril 3-β-D-glucopiranósido (J), sitosteril linoleato (K) y trilinoleina (L).

OH

O

A

COOH

B

OH

C

HO

D

HO

E

HO

F

HO OG

OH

O

OH

OOH

HO

CH2OH

I

OO

OH

OOH

HO

CH2OH

J

O

O K

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

L

OH

O

OH

O

OH

O

OH

O

A

COOH

BCOOHCOOH

B

OHOH

C

HOHOHO

D

HOHOHO

E

HOHO

F

HO OHO OG

OOOH

O

OH

OOH

HO

CH2OH

O

OH

OOH

HO

CH2OH

O

OH

OOH

HO

CH2OH

I

OO

OH

OOH

HO

CH2OH

OOO

OH

OOH

HO

CH2OH

O

OH

OOH

HO

CH2OH

J

O

O

O

O

O

O K

CO-O-CH2

CO-O-CH

CO-O-CH2

CO-O-CH2

CO-O-CHCO-O-CH

CO-O-CH2CO-O-CH2

L


59


Tiempo de retención (min)2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

Sitosterol

Sitosteril 3-β-D-glucopiranósido

Ésteres deesteroles

7-Oxositosterol

Ácidos grasos Estigmasta-3,5-dien-7-ona

100Re

spue

sta

rela

tiva

C-16C-14

C-18C-22

C-24 C-26C-28

C-20

C-18:1+

C-18:2


2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

7-Oxositosterol

Estigmastanol+

Estigmasta-3,5-dien-7-onaEstigmastan-3-ona

7-Oxositosteril 3-β-D-glucopiranósido

100

Ácidos grasos

C-16

C-14 C-18 C-22 C-24C-26

C-20

B

A

Estigmastanol+

Fucosterol

Resp

uest

a re

lativ

a



Sitosterol



7-Oxositosterol


100Re

spue

sta

rela

tiva

C-16C-14

C-18C-22

C-24 C-26C-28

C-20

C-18:1+

C-18:2


2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

7-Oxositosterol

Estigmastanol+



100

Ácidos grasos

C-16

C-14 C-18 C-22 C-24C-26

C-20

B

A

Estigmastanol+

Fucosterol

Resp

uest

a re

lativ

a


Sitosterol



7-Oxositosterol


100100Re

spue

sta

rela

tiva

C-16C-14

C-18C-22

C-24 C-26C-28

C-20

C-18:1+

C-18:2


2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

7-Oxositosterol

Estigmastanol+



100100

Ácidos grasos

C-16

C-14 C-18 C-22 C-24C-26

C-20

B

A

Estigmastanol+

Fucosterol

Resp

uest

a re

lativ

a

Figura 25. Cromatogramas de los extraíbles lipofílicos de la pasta de eucalipto sin lacasa-mediador (A) y de la pasta tratada enzimáticamente (B).


60

4.2.2 Tratamiento de la pasta TMP de picea con el SLM

Las abundancias de los principales compuestos lipofílicos presentes en la pasta de picea control y la pasta tratada enzimáticamente se muestran en Tabla 13. En la pasta TMP de picea, la composición de los extraíbles lipofílicos resultó ser diferente a la encontrada en la pasta de eucalipto, con presencia de grandes cantidades de triglicéridos, ésteres de esteroles y ácidos resínicos. Además, presenta pequeñas cantidades de ácidos (ácidos grasos y ácidos resínicos) y esteroles libres. Los cromatogramas de la pasta de picea control y la pasta tratada con el sistema lacasa-mediador se muestran en la Figura 26. Los valores que se observan en la Tabla 13 muestran que el tratamiento enzimático elimina la mayoría de los triglicéridos, ésteres de esteroles y esteril glicósidos. Se produce además una significativa eliminación de ácidos resínicos y de los esteroles libres. La incompleta eliminación de los compuestos anteriores podría ser debida a que el pasteado termomecánico tiene lugar bajo condiciones de oxígeno atmosférico. Finalmente los ácidos grasos y los alcoholes grasos se eliminaron en una menor extensión que los otros compuestos lipofílicos. Los compuestos oxidados 7-oxocampesterol y 7-oxositosterol, además de las respectivas cetonas doblemente insaturadas, la ergosta-3,5-dien-7-ona y la estigmasta-3,5-dien-7-ona aumentaron

Compuestos Pasta de eucalipto control Pasta de eucalipto tratada

enzimáticamente

Ácidos grasos totales 48.5 27.9 ácido mirístico (C 14:0) 2.1 1.7 ácido palmítico (C 16:0) 4.8 4.8 ácido linoleico (C 18:2) 2.9 0.7 acido oleico (C 18:1) 1.4 1.1 ácido esteárico (C 18:0) 2.7 2.1 ácido araquidónico (C 20:0) 2.1 0.7 ácido behénico (C 22:0) 6.9 3.4 ácido lignocérico (C 24:0) 9.4 4.2 ácido cerótico (C 26:0) 9.2 5.3 ácido montánico (C 28:0) 7.0 3.9 Hidrocarburos esteroidales totales 14.2 4.9 Esteroles libres totales 140.3 5.5 sitosterol 111.0 - estigmastanol 25.8 5.5 fucosterol 3.5 - Cetonas esteroidales totales 9.0 97.2 estigmastan-3-ona 0.6 3.6 estigamast-3,5-dien-7-ona 2.9 24.1 7-oxositosterol 5.5 69.5 Esteril glicósidos totales 17.1 6.9 sitosterol-3-β -D-glucopiranósido 17.1 - 7-oxositosteril-3-β-D-glucopiranósido - 6.9

Ésteres de esteroles totales

95.4

-

Tabla 12. Composición de los extraíbles lipofílicos de las pastas kraft de eucalipto, tanto de la utilizada como control como la tratada con el sistema lacasa-HBT (mg/Kg pasta).


61

después del tratamiento enzimático, como también ocurre en la pasta de eucalipto tratada enzimáticamente.

Figura 26. Cromatogramas de los extraíbles lipofílicos de la pasta de picea sin lacasa-mediador (A) y de la pasta tratada enzimáticamente (B). Abreviaturas: Ah, alcohol; Alc, alcano.

Sitosterol

Campesterol

Ergosta-3,5-dien-7-ona

Estigmasta-3,5-dien-7-ona

Ah-24

Ácidos grasos y resínicos

TriglicéridosÉsteres deesteroles

B

7-Oxositosterol7-Oxocampesterol

100

Res

pues

ta re

lativ

a

2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20Tiempo de retención (min)

Triglicéridos


Sitosterol

Campesterol

Alc-24


A100

Res

pues

ta re

lativ

a

Sitosteril3-β-D-glucopiranósido

Sitosterol

Campesterol

Ergosta-3,5-dien-7-ona


Ah-24


TriglicéridosÉsteres deesteroles

B

7-Oxositosterol7-Oxocampesterol

100100

Res

pues

ta re

lativ

a



Triglicéridos


Sitosterol

Campesterol

Alc-24


A100100

Res

pues

ta re

lativ

a

Sitosteril3-β-D-glucopiranósido


62

4.2.3 Tratamiento de la pasta soda-AQ de lino con el SLM

La abundancia de los principales compuestos presentes en la pasta de lino control (pasta soda-AQ) y en la pasta de lino tratada se muestran en la Tabla 14. La composición de la fracción lipídica del lino resultó ser diferente a la de los otros tipos de pasta. Los principales compuestos, que se encontraron, resultaron ser los alcoholes grasos desde el docosanol hasta el dotriacontanol. Además, se encontraron grandes cantidades de esteroles libres y esteril glicósidos, mientras las cetonas esteroidales y las ceras se encontraron en una baja proporción. Los cromatogramas de la pasta de lino control y la pasta tratada con el sistema lacasa-mediador se muestran en la Figura 27. Los valores de la Tabla 14 ponen de manifiesto que el tratamiento con el sistema lacasa-mediador elimina completamente los esteroles libres (sitosterol, campesterol, y estigmasterol) inicialmente presentes en la pasta de lino, mientras algunas cantidades de

Compuestos Pasta de picea control Pasta de picea tratada enzimáticamente

Ácidos grasos totales 116.1 68.3 ácido palmítico (C 16:0) 26.6 1.5 ácido margárico ( 17:0) 21.0 14.1 ácido linoleico (C 18:2) 33.7 6.0 ácido oleico (C 18:1) 23.1 21.4 ácido esteárico (C 18:0) 11.7 5.3 Ácidos resínicos totales 1278.4 400.9 Alcoholes grasos totales 18.6 14.9 n-tetracosanol 17.2 13.7 n-hexacosanol 0.4 0.3 n-octocosanol 1.0 0.9 Esteroles libres totales 120.5 41.4 campesterol 30.4 8.0 sitosterol 90.1 33.4 Cetonas esteroidales totales 7.0 67.0 ergosta-3,5-dien-7-ona 2.0 8.0 estigamasta-3,5-dien-7-ona 3.3 27.0 estigmast-4-en-3-ona 1.7 1.7 7-oxocampesterol - 8.3 7-oxositosterol - 22.0 Esteril glicósidos totales 4.5 tr campesteril-3-β-D-glucopiranósido 0.7 - sitosteril-3-β-D-glucopiranósido 3.8 - 7-oxocampesteril-3-β-D-glucopiranósido - tr 7-oxositosteril-3-β-D-glucopiranósido - tr Ésteres de esteroles totales 1274.6 218.3 Triglicéridos totales 1982.5 151.2

Tabla 13. Composición de los extraíbles lipofílicos de la pasta de picea control y de la pasta tratada con el sistema lacasa mediador (mg/Kg pasta).


63

los correspondientes compuestos oxidados (7-oxositosterol, 7-oxocampesterol, y 7-oxoestigamasterol, además de las respectivas cetonas di-insaturadas, ergosta-3,5-dien-7-ona y la estigamasta-3,5-dien-7-ona) aparecen en el tratamiento de la pasta. Asimismo, los tres esteril glicósidos (sitosteril, campesteril y estigmasteril β-D-glucopiranósidos), presentes en la pasta control, también se eliminaron completamente, y aparecieron pequeñas cantidades de los respectivos 7-oxoesteril glicósidos. Alcoholes grasos y n-alcanos se eliminaron en una significativa extensión, aunque éstos resultaron ser, comparativamente, más resistentes a la acción del sistema lacasa-mediador que el resto de los compuestos lipofílicos presentes en esta pasta. Además, una mezcla de picos, que no aparecían bien definidos en los cromatogramas, correspondientes a los antiespumantes usados en los procesos industriales, también se eliminaron durante el tratamiento con el sistema lacasa-mediador.

Tabla 14. Composición de los extraíbles lipofílicos de la pasta de lino control y de la pasta de lino tratada con el sistema lacasa-mediador (mg/Kg pasta).

Compuestos Pasta de lino control Pasta de lino tratada enzimáticamente

Antiespumante 849.5 125.2 Alcoholes grasos totales 121.3 49.7

n-docosanol 3.8 1.8 n-tetracosanol 4.0 1.5 n-hexacosanol 25.6 9.6 n-octocosanol 70.8 29.0 n-triacontanol 15.0 7.8 n-dotriacontanol 2.1 - Alcanos totales 12.8 8.0

n-heptacosano 2.7 1.5 n-nonacosano 8.1 5.5 n-hentriacontano 2.0 1.0 Esteroles libres totales 81.5 - campesterol 11.96 - estigmasterol 3.7 - sitosterol 6.2 - Cetonas esteroidales totales 2.4 19.1 ergosta-3,5-dien-7-ona 0.4 1.4 estigmasta-3,5-dien-7-ona 2.0 6.0 7-oxocampesterol - 2.9 7-oxoestigmasterol - tr 7-oxositosterol - 8.8 Esteril glicósidos totales 14.0 5.4

campesteril 3-β-D-glucopiranósido 2.4 - estigmasteril 3-β-D-glucopiranósido 0.8 - sitosteril 3-β-D-glucopiranósido 10.8 - 7-oxocampesteril 3-β-D-glucopiranósido - 0.9 7-oxoestigmasteril 3-β-D-glucopiranósido - tr 7-oxositosteril 3-β-D-glucopiranósido - 4.5 Ceras totales 2.6 0.6


64


Antiespumante

Ah-28Sitosterol

Ah-22Ah-24

Ah-26

Ah-30

Campesterol+

Estigmasterol

Ah-32Ceras

Esteril glicósidos


Res

pues

ta re

lativ

a

100


Ceras

7-Oxoesterilglicósidos

7-Oxositosterol

Ah-24Ah-26

Ah-30Ah-22

Ah-28

7-Oxocampesterol+

7-Oxoestigmasterol

Res

pues

ta re

lativ

a

100

Alc-29

B

A


Antiespumante

Ah-28Sitosterol

Ah-22Ah-24

Ah-26

Ah-30

Campesterol+

Estigmasterol

Ah-32Ceras

Esteril glicósidos


Res

pues

ta re

lativ

a

100100


Ceras

7-Oxoesterilglicósidos

7-Oxositosterol

Ah-24Ah-26

Ah-30Ah-22

Ah-28

7-Oxocampesterol+

7-Oxoestigmasterol

Res

pues

ta re

lativ

a

100100

Alc-29

B

A

Figura 27. Cromatogramas de los extraíbles lipofílicos de la pasta de lino sin lacasa-mediador (A) y de la pasta tratada enzimáticamente (B). Abreviaturas: Ah, alcohol; Alc, alcano.


65

4.2 INCLUSIÓN DE UNA ETAPA ENZIMÁTICA EN UNA SECUENCIA DE BLANQUEO TCF

La composición de los extraíbles lipofílicos se analizó primeramente en las pastas de la secuencia industrial TCF (O-O-a-Q-PoP), la cual incluía una etapa de control bajo las mismas condiciones de la etapa L pero sin enzima (etapa a) (Figuras 28 A-B). Los filtrados correspondientes también se analizaron, y las abundancias de los principales compuestos lipofílicos identificados en las pastas y en los líquidos se muestran en las Tablas 15 y 16 respectivamente. Se puede observar que la mayor parte de los lípidos identificados se encontraban en la pastas, mientras sólo una mínima fracción fue liberada a los líquidos.

Los esteroles libres, esteril glicósidos, y ésteres de esteroles (Figuras 29 A-C) resultaron ser los principales compuestos identificados en la pasta deslignificada con oxígeno y en los correspondientes líquidos, donde representan el 80 % de los lípidos totales (muestras O-O-a en las tablas 15 y 16) junto con cantidades menores de hidrocarburos esteroidales (Figura 29 D). El sitosterol resultó ser el esterol predominante tanto en su forma libre como conjugado. Por otro lado, algunos esteroles oxidados se encontraron en la pasta y en los líquidos. El análisis de las pastas y de los líquidos de filtrado al final del blanqueo industrial TCF (O-O-a-Q-PoP) reveló que el contenido de los extraíbles lipofílicos disminuía con respecto a la pasta de la secuencia O-O-a (con excepción del estigmastanol que permanecía prácticamente invariable), aunque la composición relativa no varió considerablemente tras las 2 etapas adicionales. El descenso en el contenido de extraíbles lipofílicos es debido más a la disolución/dispersión y

Figura 28. Análisis cromatográfico de los extraíbles lipofílicos (silanizados) de la pasta de eucalipto en diferentes etapas de la secuencia TCF con lacasa (derecha) y TCF control (izquierda): (A) pasta después del doble oxígeno y etapa de control (O-O-a), (B) pasta final después de la secuencia control completa (O-O-a-Q-PoP), (C) pasta después del doble oxígeno y la etapa de la lacasa-mediador (O-O-L), (D) pasta final obtenida tras la aplicación de la secuencia completa con lacasa-mediador (O-O-L-Q-PoP). Todos los cromatogramas corresponden a la misma cantidad de pasta.

D

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

100 Sitosterol

Sitosteril-3-β-D-glucopiranósido


7-OxositosterolHidrocarburos

esteroidales

Ácidos grasos

C-14C-16

C-18C-22

C-26

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

100

Sitosterol


Ésteres de esteroles7-OxositosterolHidrocarburos

esteroidales

C-16 C-22C-24

C-24

A100

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

100

7-Oxositosterol

Estigmastan-3-onaEstigmasta-3,5-dien-7-ona

C

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

7-Oxositosterol

Estigmasta-3,5-dien-7-onaEstigmastan-3-ona 7-Oxositosteril-3-β-D-

glucopiranósido


C-16C-22 C-26

B D

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

100 Sitosterol



7-OxositosterolHidrocarburos

esteroidales

Ácidos grasos

C-14C-16

C-18C-22

C-26

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

100

Sitosterol


Ésteres de esteroles7-OxositosterolHidrocarburos

esteroidales

C-16 C-22C-24

C-24

A100

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

100

7-Oxositosterol

Estigmastan-3-onaEstigmasta-3,5-dien-7-ona

C

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

7-Oxositosterol


glucopiranósido


C-16C-22 C-26

C

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20

7-Oxositosterol


glucopiranósido


C-16C-22 C-26

B


66

eliminación de estos compuestos bajo condiciones alcalinas de la etapa PoP que a la propia acción del peróxido de hidrógeno. Este hecho se puso en evidencia tras la realización de un detallado balance de masa de los extraíbles lipofílicos presentes en las pastas, filtrados de blanqueo, y el total de los líquidos de lavado. Este balance reveló que la mayoría de esteroles libres y conjugados no se vieron afectados y sólo una pequeña cantidad de esteroles libres (un máximo del 8 %) se degradó en la etapa PoP.

HO

A

O

OH

O

OHHO

CH2OH B

O

OC

D

HOHO

A

O

OH

O

OHHO

CH2OH

O

OH

O

OHHO

CH2OH

O

OH

O

OHHO

CH2OH B

O

O

O

O

O

OC

D

Figura 29. Estructura de los principales compuestos presentes en las pastas O-O-a: sitosterol (A), Sitosteril 3-β-D-glucopiranósido (B), sitosteril linoleato (C) y estigmasta-3,5-dieno (D).


67

Los análisis anteriores revelaron que los principales compuestos lipofílicos presentes en la pasta de eucalipto deslignificada con oxígeno y en los correspondientes líquidos de filtrado, principalmente sitosterol, sitosteril β-D-glucopiranósido y ésteres de sitosterol (Figuras 29 A-C), se eliminaron completamente (98%) por el tratamiento con el sistema lacasa-mediador. Los ácidos grasos presentes en la pasta también se eliminaron en una gran extensión. Solo algunos esteroides oxidados procedentes de la oxidación del sitosterol, principalmente estigmastan-3-ona, estigmasta-3,5-dien-7-ona y 7-oxositosterol (Figuras 30 A-C), fueron identificados en las pastas tratadas enzimáticamente (O-O-L y O-O-L-Q-PoP) junto con pequeñas cantidades de estigmastanol. Los esteroles oxidados en la pasta O-O-a, como 7 α- y 7β- y sitostanotriol (Figuras 30 D-E), fueron también eliminados tras el tratamiento con el sistema lacasa-mediador, y aparecieron pequeñas cantidades de 7-oxositosterol β-D-glucopiranósido (Figura 30 F). Es interesante apuntar que el estigmastanol (esterol saturado), el cual permanecía inalterado tras las etapas de oxígeno y de peróxido, fue degradado (hasta un 75%) por el tratamiento con la lacasa-mediador.

Los resultados obtenidos demuestran como un tratamiento enzimático podría ser integrado en secuencias de blanqueo más respetuosas con el medio ambiente (secuencias TCF), las cuales representan la tendencia actual en las industrias de este sector.

HO OH

HOOH

OH

HO O

B E

OO

OH

O

OHHO

CH2OHF

C

A D

O

O HO OH

HOOH

OH

HO OHHO OH

HOOH

OHHO

OHOH

HO OHO O

B E

OO

OH

O

OHHO

CH2OH

OOO

OH

O

OHHO

CH2OH

O

OH

O

OHHO

CH2OHF

C

A D

OOO

OO

Figura 30. Estructura de los principales compuestos presentes en las pastas tratadas enzimáticamente: estigmastan-3-ona (A),estigmasta-3,5-dien-7-ona (B), 7-oxositosterol (C), 7 α-hidroxisitosterol (D), sitostanotriol (E), y 7-oxositosteril 3-β-D-glucopiranósido (F).


68

Compuestos O-O-a O-O-L O-O-a-Q-PoP O-O-L-Q-PoP Esteroles libres totales 140.3 5.5 98.2 3.9 sitosterol 103.1 - 69.3 - estigmastanol 34.4 5.5 28.1 3.9 fucosterol 2.8 - 0.8 Esteroles oxidados totales 11.9 98.5 11.7 49.3 estigmastan-3-ona 0.6 3.6 0.2 3.7 estigmasta-3,5-dien-7-ona 2.9 24.1 1.1 6.6 7α-hidroxisitosterol 0.8 0.2 2.2 0.2 7β-hidroxisitosterol 1.1 0.1 2.2 sitostanetriol 1.0 1.0 0.5 0.5 7-oxositosterol 5.5 69.5 5.5 38.3 Esteril glicósidos totales 17.1 6.9 5.1 0.9 sitosteril-3-β-D-glucopiranósido 17.1 - 5.1 - 7-oxositosteril-3-β-D- - 6.9 - 0.9 Ésteres de esteroles 95.4 - 41.0 - Hidrocarburos esteroidales 14.2 2.6 6.1 1.8 Esteroides totales 278.9 113.5 162.1 55.9 Ácidos grasos totales 44.5 18.1 3.9 0.7 ácido tetradecanoico (C 14:0) 2.1 1.7 - - ácido palmítico (C 16:0) 4.8 4.6 0.4 ácido linoleico (C 18:2) 2.9 0.7 - - ácido oleico (C 18:1) 1.4 1.1 - - ácido esteárico (C 18:0) 2.7 0.5 0.4 ácido eicosanoico (C 20:0) 2.1 0.5 0.2 ácido docosanoico (C 22:0) 6.9 2.5 1.2 0.5 ácido tetracosanoico (C 24:0) 9.4 3.0 1.5 0.2 ácido hexacosanoico (C 26:0) 9.2 2.8 0.2 ácido octacosanoico (C 28:0) 3.0 0.7 Lípidos totales 323.4 131.6 166.0 56.6

Tabla 15. Composición de los extraíbles lipofílicos de la pasta kraft de eucalipto en diferentes etapas de secuencias TCF, con lacasa (O-O-L-Q-PoP) y sin lacasa (control, O-O-a-Q-PoP) expresada en mg/Kg de pasta seca.

Abreviaturas: O, etapa de oxígeno; L, etapa lacasa-mediador; a, etapa control (etapa L sin lacasa ni mediador); Q, etapa de quelato; PoP, doble etapa de peroxido con un primer paso de oxigeno a presión; tr, trazas; y -, no detectado.


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Compuestos O-O-a O-O-L O-O-a-Q-PoP O-O-L-Q-PoP Esteroles libres totales 14.3 tr 11.8 2.8 sitosterol 9.5 - 7.3 tr estigmastanol 3.5 tr 3.3 2.8 fucosterol 1.3 - 1.2 tr Esteroles oxidados totales 3.6 14.9 1.8 27.1 estigmastan-3-ona 0.2 0.5 0.1 0.3 estigmasta-3,5-dien-7-ona 0.2 0.9 0.1 2.2 7α-hidroxisitosterol 0.6 - 0.1 0.4 7β-hidroxisitosterol 1.0 - 0.6 0.2 sitostanotriol 0.8 tr 0.3 0.4 7-oxositosterol 0.8 13.5 0.6 23.6 Esteril glicósidos totales 1.3 1.8 0.8 0.5 sitosteril-3-β-D-glucopiranósido 1.3 - 0.8 - 7-oxositosteril-3-β-D-glucopiranósido - 1.8 - 0.5 Ésteres de esteroles 1.1 - 5.3 - Hidrocarburos esteroidales 0.7 0.5 0.8 1.6 Esteroides totales 21.0 17.2 20.5 32.0 Ácidos grasos totales 3.5 4.1 4.0 4.4 ácido tetradecanoico (C 14:0) 0.3 tr 0.2 0.1 ácido palmítico (C 16:0) 1.4 1.4 1.7 2.1 ácido linoleico (C 18:2) tr tr 0.2 0.2 ácido oleico (C 18:1) tr tr 0.3 0.9 ácido esteárico (C 18:0) 0.8 0.8 0.8 0.4 ácido eicosanoico (C 20:0) 0.1 0.2 0.1 0.1 ácido docosanoico (C 22:0) 0.2 0.5 0.3 0.3 ácido tetracosanoico (C 24:0) 0.5 0.7 0.4 0.3 ácido hexacosanoico (C 26:0) 0.2 0.5 tr tr ácido octacosanoico (C 28:0) tr tr tr tr Lípidos totales 24.5 21.3 24.5 36.4

Abreviaturas, ver tabla 15

Tabla 16. Composición de los extraíbles lipofílicos en los líquidos de blanqueo procedentes de las diferentes etapas del proceso TCF con lacasa (O-O-L-Q-PoP) y sin lacasa (Control, O-O-a-Q-PoP) aplicados sobre pasta kraft de eucalipto (mg/Kg de pasta seca).


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memoria del trabajo de investigación (programa de doctorado de estudios avanzados en ......

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