medición de pequeños volúmenes en laboratorios errores

•1

Medición de pequeños volúmenes en laboratoriosErrores frecuentes en el uso de recipientes volumétricos y micropipetas

1.Errores típicos en el uso de instrumentos volumétricos.

2.Interpretación de certificados.

Medición de pequeños volúmenes en laboratorios

Disertante:Tec. Mauricio J. AlberiniÁrea Metrología Dimensional y Volumen

•2

Conocer las fuentes de error nos permite controlarlos!

Errores típicos en el uso de material de vidrio ó plástico.

• Limpieza.

• Ajuste del menisco.

• Enrase del menisco.

• Tiempos de vertido (escurrimiento) y tiempo de espera.

(Solo para instrumentos con ajuste EX.)

• Falta de trazabilidad (calibración).


Limpieza

Si el material de vidrio presenta alguna contaminación en su interior, esto puede distorsionar el menisco

y provocar un error sensible en la lectura.


Fuente: Información sobre la medición de volumen; F I R S T C L A S S • B R A N D ; 0402

Fuente: Google imagenes.

•3

Ajuste del menisco

El término menisco se utiliza para describir la curvatura de la superficie del líquido.

El menisco adopta forma convexa o cóncava. La formación de la depende de la relación entre la fuerza de

cohesión y adherencia del liquido.




Ajuste del menisco

Para el caso de un menisco cóncavo, la lectura se realiza a la altura del punto más bajo de la superficie del

líquido. Donde el punto más bajo del menisco debe tocar el borde superior de la división de la escala.


Correcto Incorrecto Incorrecto


•4

Ajuste del menisco

Para el caso de un menisco convexo, la lectura se realiza a la altura del punto más alto de la superficie del

líquido. Donde el punto más alto del menisco debe tocar el borde inferior de la división de la escala.


Franja de Schellbach

Es una estrecha franja azul en el centro de una franja blanca. Se aplican en la parte posterior de buretas para mejor legibilidad. Debido a la refracción de la luz, la franja azul aparece en forma de dos puntas de flecha a la altura del menisco. La lectura se realiza a la altura del punto de contacto de las dos puntas.


Enrase del menisco

Para evitar el error de paralaje a la hora de enrasar el menisco, el aparato volumétrico debe estar en posición

vertical y los ojos del operador deben encontrarse a la altura del menisco. En esta posición, el aforo se

visualiza como una línea.



•5

Tiempos de vertido (escurrimiento) y tiempo de espera.

(Solo para instrumentos con ajuste EX.)

El volumen de líquido vertido es siempre un poco menor que el volumen contenido en el aparato.

Esto se debe a que, en la superficie interior del aparato de medición queda una película de líquido retenida. El

volumen de esta película de líquido depende del tiempo de vertido, el cual fue tenido en cuenta durante el

ajuste del aparato de medición.


El tiempo de vertido (escurrimiento)

Es el período de tiempo para el descenso libre del menisco, desde el aforo superior hasta el aforo inferior de volumen, o hasta la punta del aparato.

El tiempo de espera

El tiempo de espera comienza cuando el menisco permanece quieto a la altura de la marca de volumen

inferior o bien a la punta de vertido. En el tiempo de espera se escurren los restos del líquido que puedan quedar adherido a la pared del instrumento.


Conocer las fuentes de error nos permite controlarlos!

Errores típicos en el uso de micropipetas.

• El uso de las punteras.

• Mantenimiento y la limpieza del instrumento.

• Proceso de pipeteado y el ritmo de pipeteo.

• Ángulo de inclinación de la pipeta.

• Profundidad de inmersión.

• Periodo de espera.

• Falta de trazabilidad (calibración).

Mejoras respecto al uso de material de vidrio.

• Limpieza., las punteras son descartables pero

la micropipeta hay que hacerle mantenimiento

• Ajuste del menisco.

• Enrase del menisco.

• Tiempos de vertido (escurrimiento) y tiempo de espera, este ultimo se reduce.

Tolerancias:

• Pipeta aforada de 1 mL ±6 µL .

• Micropipeta de 1 mL ±8 µL .

• Pipeta aforada de 10 mL ±20 µL .

• Micropipeta de 10 mL ±60 µL .

•6

Punteras descartables (Tip).

• Las micropipetas están equipadas con algún tipo de

punta reemplazable para minimizar el riesgo de

contaminación cruzada. A pesar de que son genéricas,

es buena la práctica de utilizar sólo puntas que

recomienda el fabricante, ya que pueden adaptarse

mejor a la pipeta y tener el volumen interno correcto.

• Se recomienda siempre prehumedecerlas puntas de

las pipetas.

• Elegir correctamente la puntera en función del

volumen nominal de la micropipeta.

• Estan destinados para un solo uso. Se

desaconseja cualquier intento de limpiar y volver a

usarlos.


Presione hacia abajocon un movimiento derotación

Evite clavar lapuntera en lamicropipeta

Fuente: Selecting the right tip for your pipette; GILSON



----- límites de tolerancia del error sistemático

-----límites de tolerancia del error aleatorio

----- promedio de las determinaciones

Micropipeta de 100 µL

Valores hallados.

Error sistemático.

Hallado: -0,2 µL ; U = 0,8 µL

Permitido: 0,8 µL

Error aleatorio.

Hallado: 0,6 µL

Permitido: 0,3 µL

•7



----- límites de tolerancia del error sistemático

-----límites de tolerancia del error aleatorio

----- promedio de las determinaciones

Micropipeta de 100 µL

Valores hallados.

Error sistemático.

Hallado: 0,1 µL ; U = 0,3 µL

Permitido: 0,8 µL

(ErrorS : -0,2 µL ; U = 0,8 µL)

Error aleatorio.

Hallado: 0,1 µL

Permitido: 0,3 µL

(ErrorA : 0,6 µL)

Mantenimiento y la limpieza del instrumento.

Es fundamental que se realicen actividades de manteamiento y limpieza del equipo, no solo para prolongar su

vida útil , sino porque esta actividad asegura la correcta dosificación del volumen elegido.

En muchos casos, dependiendo mas que nada de cada marca de micropipetas, cuando se realizan las

actividades de limpieza y mantenimiento como indica el fabricante, estas acciones no alteran la calibración.


PARA PODER REALIZAR ESTOS PASOS ES FUNDAMENTAL LA LECTURA DEL MANUAL

DEL EQUIPO.

•8



4940

4960

4980

5000

5020

5040

5060

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Vol

umen

hal

lado

(µL)

mi

Micropipeta de 5 000 µL

Valores hallados.

Error sistemático.

Hallado: 19 µL ; U = 25 µL

Permitido: 40 µL

Error aleatorio.

Hallado: 34 µL

Permitido: 15 µL



Micropipeta de 5 000 µL

4950

4960

4970

4980

4990

5000

5010

5020

5030

5040

5050

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Vol

umen

hal

lado

(µL)

mi

Valores hallados.

Error sistemático.

Hallado: 15 µL ; U = 4 µL

Permitido: 40 µL

(ES : 19 µL ; U = 25 µL)

Error aleatorio.

Hallado: 6 µL

Permitido: 15 µL

(EA : 34 µL)

•9

Proceso de pipeteado y el ritmo de pipeteo.

Se debe realizar de una manera suave y regular.

Los movimientos del pistón demasiado rápido en la aspiración pueden hacer ingresar líquido dentro de la

cámara de aire de la micropipeta y movimientos rápidos cuando se entrega líquido pueden dar lugar a la

introducción de burbujas de aire.

Para mejorar la exactitud, lo que se recomienda es pipetear varias veces con el líquido que se dosifica. Esto

permite que la humedad entre el volumen de aire muerto y líquido se estabilice.


Se recomienda siempre el uso el método de pipeteo directo o estándar

Proceso de pipeteado y el ritmo de pipeteo.


Se recomienda como paso previo al proceso de pipeteado prehumedecer la punta de la pipeta.

Fuente: Eppendorf AG,UserguideLiquidhandlingNo, 20: Impact of pipetting techniques on precision and accuracy.

Periodo de espera

Para asegurar que la aspiración se ha completado, se recomienda un periodo de 1 segundo para hasta 1 000 µL de volumen nominal.

Pipetas con volumen nominal mayor de 1 000 µL necesitan 3 segundos.

Fuente: Eppendorf AG,User guide Liquid handling N 20: Impact of pipetting techniques on precision and accuracy.

•10

Ángulo de inclinación de la pipeta.

Si una pipeta no se mantiene vertical durante la aspiración, corre el riesgo de pipetear un volumen mayor. (dependiendo del ángulo de inclinación)


60 º de inclinación

45º de inclinación

• Pipeta 100 µL :60 º de inclinación = incremento 0.53 % en Volumen• Pipeta 1 000 µL :45 º de inclinación = incremento 0.29% en Volumen

Tolerancia en 100 µL y 1 000 µL: Error Sistemático = 0,8 % del Volumen nominal

Fuente: Eppendorf AG,UserguideLiquidhandlingNo, 20:

Impact of pipetting techniques on precision and accuracy.

Profundidad de inmersión

Muchas veces que dos personas no pipeteen exactamente el mismo volumen usando la misma pipeta se explica por factores tales como diferentes ángulos de inclinación cuando se aspira el líquido, o la profundidad de inmersión de la punta de la pipeta.


Error sistemático de 0,2 % a 0,4 %

10 mm 30 mm (30 – 40) mm


Volumen nominal

[ µL ]

Profundidad de

inmersión optima

[ mm ]

0,1 a 1 1

1 a 100 2 a 3

101 a 1 000 2 a 4

1 001 a 10 000 3 a 6




•11


¿Que hacer con estos errores de uso?

El efecto puede ser pequeño en cada caso, pero los errores se van sumando y el error total puede llegar a ser considerable.

Estos errores hacen que la incertidumbre de medición aumente significativamente.

Recordar: La incertidumbre representa la calidad de las mediciones.


Interpretación de certificados de calibraciónCuando se compra material volumétrico algunos fabricantes ofrecen, con un costo extra, enviar los instrumentos ya calibrados.

Estos pueden tener dos clases de certificados:

• Certificado de lote: indica que el instrumento adquirido cuenta con una verificación en el lote de instrumentos fabricados.

• Certificado individual: indica que el instrumento adquirido fue calibrado.

Datos que deben constar en el certificado de calibración:

• Identificación única del instrumento, ej.: Nº Serie

• Fecha de calibración y fecha de emisión del certificado

• Metodología aplicada para la calibración, ej.: Procedimiento Nº 64.

• Normativa utilizada o procedimiento, ej.: ASTM E287

• Resultado hallado, se puede informar un resultado promedio o el error hallado o ambos,

ej.: • Valor hallado: 200,01 mL • Error hallado 0,01 mL

• Incertidumbre de calibración, ej.: U = ± 0,03 mL, con k = 2 .

• Ente acreditador, si corresponde.

•12

Medición de pequeños volúmenes en laboratoriosInterpretación de certificados de calibración

Medición de pequeños volúmenes en laboratoriosInterpretación de certificados de calibración

Estas tolerancias e incertidumbres son de calibración, cada usuario tiene que definir sus tolerancias para cada técnica de medición, como

así su incertidumbre de medición.Tanto la tolerancia de la técnica y la incertidumbre de medición

serán mayores que las de calibración.

E. Sist. 1000 µL |1| µL + 2 µL ≤ 3 µL

10 mL |0,08| mL + 0,03 mL ≤ 0,11 mL

•13


¿Que hacer con estos errores de calibración informados?

Si corrijo

Error Informado para micropipeta de 1 mL:

Error sistemático hallado en 1 000 µL = + 5 µL ; U = 2 µL

Error Aleatorio hallado en 1 000 µL = 2 µL

Si queremos dosificar 1 000 µL, entonces

Volumen = Volumen deseado – Error hallado

Volumen = 1 000 µL – 5 µL = 995 µL

Incertidumbre de medición:

Resultado de medición

Volumen = 995 µL ; U = 11 µL

Tol./2 > U

Suponiendo:

Tolerancia de la técnica = 25 µL.

Esta fuente no se usa en material de vidrio


¿Que hacer con estos errores de calibración informados?

Si no corrijo

Error Informado para micropipeta de 1 mL:

Error sistemático hallado en 1 000 µL = + 5 µL ; U = 2 µL

Error Aleatorio hallado en 1 000 µL = 2 µL

Si queremos dosificar 1 000 µL, entonces

Volumen = Volumen deseado – Error hallado

Volumen = 1 000 µL – 5 µL = 995 µL

Incertidumbre de medición:

Resultado de medición

Volumen = 995 µL ; U = 16 µL

Tol./2 < U

Suponiendo:

Tolerancia de la técnica = 25 µL.

Esta fuente no se usa en material de vidrio

•14

Ruta Nacional 34 – km 227,6

C.P. S2300 WAC, Rafaela

Santa Fe – Argentina

Tel.: (03492) 440471 / 441401

E-mail: [email protected]

Web: www.inti.gob.ar/rafaela

medición de pequeños volúmenes en laboratorios errores

Documents