mecanismos fenotÍpicos de resistencia a antibiÓticos …
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MECANISMOS FENOTÍPICOS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS DE BACTERIAS ENDOSIMBIÓTICAS DE AMEBAS DE VIDA LIBRE AISLADAS DE
AGUA DE CONSUMO DE LA CIUDAD DE CÚCUTA, 2019
JESSICA LICETH CÁRDENAS ORTEGA YENNY PAOLA SOLANO ESCALANTE
UNIVERSIDAD DE SANTANDER “UDES” - CAMPUS CÚCUTA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO SN JOSE DE CUCUTA
2020
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MECANISMOS FENOTÍPICOS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS DE BACTERIAS ENDOSIMBIÓTICAS DE AMEBAS DE VIDA LIBRE AISLADAS DE
AGUA DE CONSUMO DE LA CIUDAD DE CÚCUTA, 2019
JESSICA LICETH CÁRDENAS ORTEGA COD: 15172003
YENNY PAOLA SOLANO ESCALANTE COD: 15172007
Trabajo de grado para optar al título de Bacteriólogo y Laboratorista clínico
Director Científico MSc. YESMIT KARINA RÍOS RAMÍREZ
Asesor metodológico MSc. JAEL CONTRERAS RANGEL
UNIVERSIDAD DE SANTANDER “UDES” - CAMPUS CÚCUTA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO SN JOSE DE CUCUTA
2020
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ADVERTENCIA “Los autores, JESSICA LICETH CÁRDENAS ORTEGA y YENNY PAOLA SOLANO ESCALANTE, autorizo a la UNIVERSIDAD DE SANTANDER (UDES) la reproducción total o parcial de este documento, con la debida cita de reconocimiento de la autoría y cedemos a la misma universidad los derechos patrimoniales con fines de investigación, docencia e institucionales, consagrado en el artículo 72 de la Ley 23 de 1982 y las normas que lo instituyan o modifiquen”.
(Artículo 4º, Acuerdo 0066 de 2003)
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DEDICATORIA
Jessica Liceth Cárdenas Ortega:
Este trabajo está dedicado a Dios y
a mis padres, a mi familia por todo
su apoyo en este proceso.
Yenny Paola Solano Escalante:
Este logro lo dedico principalmente
a Dios, mi madre, abuela y familia
por siempre estar para mí en cada
paso y decisión que doy
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AGRADECIMIENTOS
De: Jessica Liceth Cárdenas Ortega
Agradezco a Dios por guiarme en este camino y por brindarme la sabiduría de poder concluir con este proceso, a mis padres quienes son mi motor y mi mayor inspiración de seguir adelante, ya que esto es posible por el esfuerzo y apoyo económico brindado, Por otra parte a la Universidad de Santander, por prestarnos sus instalaciones y brindarnos sus servicios. Y a la directora del proyecto Dr Karina Ríos, por cada una de sus orientaciones y por transmitirnos todos sus conocimientos, a nuestro asesor metodológico el Dr. Jael Contreras por sus consejos y conocimientos para la elaboración de este trabajo.
De: Yenny Paola Solano Escalante
Doy gracias a Dios por brindarme la sabiduría y entendimiento en este proceso, a mi madre GRACIELA ESCALANTE por ser mi polo a tierra, el farol que ilumina mi camino, por ser mi apoyo incondicional y principalmente por haber desempeñado muy bien el papel padre y madre formando en valores éticos y morales, abuelo desde el cielo sé que soy motivo de orgullo para ti, abuela gracias por su compañía oración y apoyo, mi hermano que quiero mucho, mi tío Onofre Escalante que fue siempre mi imagen paterna a mi familia por escucharme y entenderme, a todos los que no creyeron en mí, que me consideraron débil y que no culminaría mi sueño, solo diré aquí estoy de la mano de DIOS cumpliendo lo que un día me prometí, a la Dr. Karina ríos por colaborarnos y transmitirnos sus conocimientos, a mi asesor metodológico el Dr. Jael contreras por todo el apoyo para la realización de esta investigación, a la universidad de Santander por facilitarnos todos los recursos y herramientas que fueron necesarios para llevar a cabo este trabajo.
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Título: MECANISMOS FENOTÍPICOS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS DE BACTERIAS ENDOSIMBIÓTICAS DE AMEBAS DE VIDA LIBRE AISLADAS DE
AGUA DE CONSUMO DE LA CIUDAD DE CÚCUTA, 2019
Autores JESSICA LICETH CÁRDENAS ORTEGA YENNY PAOLA SOLANO ESCALANTE
Director Científico
MSc. YESMIT KARINA RÍOS RAMÍREZ
Asesor metodológico MSc. JAEL CONTRERAS RANGEL
Línea de investigación MICROBIOLOGIA CLINICA
Palabras clave: Endosimbiosis, Amebas de vida libre, resistencia bacteriana, antibióticos
Resumen
Las amebas de vida libre (AVL) son protozoos anfizoicas, heterótrofos, reservorio de virus, hongos y bacterias ya que sobreviven e incluso algunos se multiplican dentro de ellas. Y esto Proporciona un mecanismo de protección para evadir ambientes hostiles generando un aumento en su virulencia, en el caso de las bacterias desarrollan resistencia a los antibióticos; el propósito de este estudio se basa en probar de forma fenotípica los mecanismo de resistencia de bacterias endosimbiòticas aisladas de AVL de agua de consumo. Objetivo: Establecer mecanismos fenotípicos de resistencia a antibióticos de bacterias endosimbiòticas de amebas de vida libre aisladas de agua de consumo de la ciudad de Cúcuta, 2019. Métodos: fueron empleadas técnicas de filtración por membrana y siembra en agar no nutritivo para el aislamiento de AVL, lisis, utilización de batería bioquímica para identificación bacteriana, realización de técnica de difusión en disco para detección fenotípica de mecanismo de resistencia y MicroScan para determinar su sensibilidad. Resultados: se demuestra la presencia de AVL en agua de consumo donde fueron analizadas 30 muestras, distribuidas en tres muestras por comuna, obteniendo un total 12 muestras positivas, con un equivalente de 40% se aislaron bacterias como Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Salmonella Typhi, Rhizobium radiobacter,
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Ochorobactrum antropi y Staphylococcus auricularis coagulasa negativa. Tanto en la detención de mecanismo de resistencia y sensibilidad frente a los antibióticos BLEE, se identificó en un mayor porcentaje, Conclusiones: se logró identificar la presencia de AVL en diferentes comunas de la ciudad de Cúcuta observando variedad de géneros, entre estos: Acanthamoeba spp, Vermamoeba spp, Vahlkampfia spp; demostrando la alta resistencia de estos protozoos a diferentes procesos de desinfección y el desarrollo de resistencia frente a los antibióticos pueden generar a largo plazo un problema de salud pública.
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Title: PHENOTYPIC MECHANISMS OF RESISTANCE TO ANTIBIOTICS OF ENDOSYMBIOTIC BACTERIA FROM FREE-LIVING AMEBAS ISOLATED FROM
DRINKING WATER FROM CÚCUTA, 2019
Authors JESSICA LICETH CÁRDENAS ORTEGA YENNY PAOLA SOLANO ESCALANTE
Scientific Director
MSc. YESMIT KARINA RÍOS RAMÍREZ
Methodological advisor MSc. JAEL CONTRERAS RANGEL
Research Line CLINICAL MICROBIOLOGY
Key words: Endosymbiosis, Free-living amoebas, bacterial resistance, antibiotics
Abstract Free-living amoebas (AVL) are amphizoic, heterotrophic protozoa, a reservoir of viruses, fungi and bacteria since they survive and some even multiply within them. And this provides a protection mechanism to evade hostile environments generating an increase in its virulence, in the case of bacteria they develop resistance to antibiotics; The purpose of this study is based on phenotypically testing the resistance mechanisms of endosymbiotic bacteria isolated from AVL from drinking water. Objective: To establish phenotypic mechanisms of resistance to antibiotics of endosymbiotic bacteria of free-living amoebae isolated from drinking water in the city of Cúcuta, 2019. Methods: membrane filtration techniques and seeding on non-nutritive agar were used for the isolation of AVL , lysis, use of biochemical battery for bacterial identification, performance of disk diffusion technique for phenotypic detection of resistance mechanism and MicroScan to determine its sensitivity. Results: the presence of AVL in drinking water was demonstrated where 30 samples were analyzed, distributed in three samples per commune, obtaining a total of 12 positive samples, with an equivalent of 40% bacteria such as Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae were isolated , Salmonella Typhi, Rhizobium radiobacter, Ochorobactrum antropi and Staphylococcus auricularis coagulase negative. Both in the arrest of resistance
14
mechanism and sensitivity to ESBL antibiotics, a higher percentage was identified, Conclusions: the presence of AVL was identified in different communes of the city of Cúcuta by observing a variety of genera, among these: Acanthamoeba spp , Vermamoeba spp, Vahlkampfia spp; demonstrating the high resistance of these protozoa to different disinfection processes and the development of resistance to antibiotics can generate a long-term public health problem.
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GLOSARIO
AMEBAS DE VIDA LIBRE: “Son protozoarios de tipo oportunista, considerados como cosmopolitas, donde han sido aislados en ambientes acuáticos naturales y artificiales, suelos y aire”1. ANTIBIOGRAMA: Es un método el cual tiene como objetivo la determinación de la sensibilidad bacteriana frente a los antimicrobianos avalado por National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)2. BIOFILM: “Son denominados como a las comunidades conformadas por bacterias, protozoarios o partículas virales, donde estas se adhieren superficies vivas o inertes”3. BLEE: Es la manifestación de enzimas las cuales confieren resistencia a diferentes tipo de antibióticos tales como las penicilinas y cefalosporinas tanto de tercera y cuarta generación, los cuales también se conoce que pueden ser inhibidas por el ácido clavulánico, tazobactam y sulbactam4. ENDOSIMBIOSIS: “Es la relación que se produce entre dos especies, donde una de ellas vive a despensas de la otra o dentro de ella” 5. VIRULENCIA: “Grado de patogenicidad”6. RESISTENCIA BACTERIANA: Esto se ve reflejado cuando (virus, bacterias, parásitos y hongos) manifiestan cambios al estar expuestos antes su propios antimicrobianos7. MEDIO DE CULTIVO: “Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos”8. QUISTE: “Es la forma morfológicas de protección del organismo, en el que se recubre por una cubierta resistente tanto a factores físicos como químicos y permanece inmóvil e inactivo hasta que se reanuden las condiciones favorables para su supervivencia“9. TROFOZOÍTO: “Es la forma activa del protozoario en la cual se alimenta, se reproduce, se moviliza y ejerce su acción patógena“10.
16
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN 21
1. PROBLEMA 23
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 23
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 25
1.3 OBJETIVOS 26
1.3.1 Objetivo General 26
1.3.2 Objetivos Específicos 26
1.4 JUSTIFICACIÓN 26
2. MARCO REFERENCIAL 29
2.1 ANTECEDENTES 29
2.2 MARCO TEÓRICO 33
2.3 MARCO CONCEPTUAL 51
2.4 MARCO LEGAL 53
2.5 MARCO CONTEXTUAL 55
2.6 SISTEMA DE HIPOTESIS 56
2.7 MATRIZ OPERATIVA DE LAS VARIABLES 57
3. MARCO METODOLÓGICO 58
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 58
3.1.1 Nivel de Investigación 58
3.1.2 Diseño de Investigación 58
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS 58
3.2.1 Fase I: Preparatoria 59
3.2.2 Fase II: Descriptiva 59
17
3.2.3 Fase III: Interactiva 60
3.2.4 Fase IV: AnalÍtica 60
3.2.5 Fase V: Cierre 60
3.3. POBLACIÒN Y MUESTRA 61
3.3.1 Población 61
3.3.2 Muestra 61
3.4 TÉCNICA E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS 61
3.5 TÉCNICA DE PROCEDIMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS 61
4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 63
4.1 RESULTADOS E INTERPRETACIÓN 63
4.1.1 Identificación de las bacterias endosimbióticas patógenas aisladas de
amebas de vida libre mediante cultivos microbiológicos 63
4.1.2 Identificación de la sensibilidad a antibióticos en bacterias endosimbióticas
patógenas mediante MicroScan 67
4.1.3 Determinación mecanismo de resistencia a antibióticos de bacterias
endosimbióticas mediante pruebas fenotípicas por difusión en disco 68
4.2 Discusión 69
5. CONCLUSIÓNES Y RECOMENDACIONES 72
5.1 CONCLUSIONES 72
5.2 RECOMENDACIONES 72
BIBLIOGRAFÍA 74
ANEXOS 86
18
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN SALINA DE NEFF`S MODIFICADA
(PAS) ..................................................................................................................... 87
Anexo B. FILTRACIÓN POR MEMBRANA ............................................................ 90
Anexo C. PREPARACION DE AGAR NO NUTRITIVO ......................................... 93
Anexo D. PRUEBAS FENOTÍPICAS DIFUSIÓN EN DISCO ................................. 97
Anexo E. EVIDENCIAS FOTOGRÁFICAS ............................................................ 99
Anexo F. MICROSCAN ........................................................................................ 101
19
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Clasificación taxonómica de amebas de vida libre potencialmente
patógenas .............................................................................................................. 35
Figura 2. Ciclo de Acanthamoeba spp ................................................................... 37
Figura 3 . Ciclo de vida de Naegleria fowleri. ......................................................... 39
Figura 4. Trofozoíto y quiste de Vermamoeba vermiformis ................................... 41
Figura 5. Mecanismos de resistencia antimicrobiana. ........................................... 45
Figura 6. Muestras de aguas de consumo positivas para amebas de vida libre,
distribuidas por comuna que conforman la ciudad de Cúcuta. .............................. 63
Figura 7. Géneros y morfología de amebas de vida libre aislados en aguas de
consumo de la ciudad de Cúcuta 2019 .................................................................. 65
Figura 8. Mecanismo de resistencia a antibióticos de bacterias endosimbióticas.. 68
20
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Clasificación de las penicilinas ................................................................. 46
Tabla 2. Clasificación de las cefalosporinas .......................................................... 49
Tabla 3. Operacionalización de las variables ......................................................... 57
Tabla 4. Muestras de aguas de consumo positivas para amebas de vida libre,
distribuidas por comuna que conforman la ciudad de Cúcuta. .............................. 63
Tabla 5. Géneros y morfología de amebas de vida libre aislados en aguas de
consumo de la ciudad de Cúcuta 2019 .................................................................. 64
Tabla 6. Identificación de bacterias endosimbióticas aisladas de amebas de vida
libre. ....................................................................................................................... 66
Tabla 7. Identificación bacteriana y mecanismo de resistencia ............................. 67
Tabla 8. Mecanismo de resistencia a antibióticos de bacterias endosimbióticas ... 68
21
INTRODUCCIÓN
La ciudad de Cúcuta está constituida por dos grandes vertientes de agua, como es el rio Zulia donde su nacimiento se yace en la serranía de Santurbán, este declive baña otros municipios como Cucutilla, Salazar, Santiago y Tibú entre otros, el Rio Pamplonita se conoce como el principal afluente del rio Zulia el cual en su extensa trayectoria baña municipios como Chinácota, Los Patios, Cúcuta entre otros11.
Las vertientes de estos vértices son las fuentes hídricas de las cuales la
comunidad cucuteña se abastece para su consumo y necesidades en su diario
vivir, durante su largo recorrido puede presentar disminución en su calidad gracias
a que puede presentar diferentes alteraciones tanto físicas, químicas como
microbiológicas, permitiendo que el agua sea una fuente de diseminación fácil y
rápida12 esto proporciona un gran número de factores, cuya afección puede verse
manifestada en la propia comunidad de forma directa.
Todo este tipo de afectaciones en el agua han enfatizado la presencia de Amebas
de Vida Libre (AVL) siendo estos considerados como protozoarios anfizoicas, de
los cuales la distribución es considerablemente amplia a nivel mundial, su
aislamiento se ha mostrado en entornos hídricos de tipo dulce o salado. Sin
discriminar la localización de la fuente hídrica sea urbana, semiurbana y rural
puesto que su aislamiento no juzga el desarrollo territorial. Las AVL tienen la
ventaja de vivir como parasito o microorganismo de vida libre, esto se ha generado
gracias al aislamiento de estos protozoarios en agua potable, tierra, piscinas,
aguas estancadas, lentes de contacto, equipos de diálisis entre otros. Por lo que
está relacionado con afectaciones al ser humano ocasionando patologías como
meningitis, queratitis y encefalitis13, estos microorganismos también tienen la
capacidad de tener una interacción con virus, hongos y bacterias llamado
endosimbiosis, esta relación permite que las bacterias adquieran un mecanismo
de protección, lo que permite no ser digeridos por estas mismas, por lo que cuyo
factores externos permite el aumento en su virulencia y por ende se constituye
como problema de salud pública14.
Esta relación entre las AVL y las bacterias endosimbiòticas ha sido un factor
importante en cuanto a la expresión de resistencia a los antibióticos, siendo una
amenaza para la salud mundial, ya que su afectación puede manifestarse en
cualquier persona. Esta resistencia es un fenómeno natural, pero actualmente se
relaciona a factores externos como el uso irracional de estos fármacos, cuya
consecuencia es un manejo difícil en cuanto al tratamiento debido a la pérdida de
su eficacia, esta expresión de resistencia genera un problema de salud pública
puesto que las estancias hospitalarias son más prologadas y la incrementación de
los costos médicos se reflejan en aumento15.
22
El propósito de este análisis fue establecer mecanismos fenotípicos de resistencia
a antibióticos de bacterias endosimbiòticas de amebas de vida libre aisladas en
agua de consumo de la ciudad de Cúcuta. Este estudio aporta conocimientos
sobre la posible existencia de endosimbiosis entre las AVL Y bacterias
endosimbiòticas junto con la expresión fenotípica de resistencia antimicrobiana, y
que de forma futura se permita poder disminuir la incidencia y prevalencia de la
resistencia a los antibióticos.
Para lograr este propósito se establecieron las aguas de consumo de las diez
comunas de la ciudad de Cúcuta, la cual se realizó el aislamiento y lisis de AVL
donde se obtuvieron bacterias endosimbiòticas a las cuales se realiza una
identificación bacteriana mediante batería bioquímica, donde posteriormente se
analiza mediante técnica fenotípica tales como difusión en disco y MicroScan. La
resistencia y sensibilidad frente a los antibióticos.
Dentro de la estructura del trabajo, el primer capítulo expresa todo lo relacionado al problema, donde se expresa el planteamiento y formulación del problema, estableciendo el objetivo general, objetivos específicos, la justificación de la realización de la investigación.
En el segundo capítulo se percibe todo lo relacionado al marco teórico, basados en antecedentes de investigación que de forma previa se han realizado de los cuales se tuviera énfasis en marco teórico y conceptual donde se localizan conceptos de interés; el marco contextual donde informa todo con respecto al área de estudio; el marco legal donde sustenta todo lo relacionado con leyes, y resoluciones; el sistema de hipótesis y la matriz operativa de variables.
En capítulo tres, se expresa la metodología que fue empleada durante la investigación, donde hace hincapié en materiales, métodos, población y muestra.
En el cuarto capítulo se encuentra resultados con respectiva discusión basados en el desarrollo y cumplimiento de cada uno de los objetivos planteados.
Por último, el quinto capítulo expresa la conclusión del trabajo de investigación, junto con las recomendaciones para futuras investigaciones.
23
1. PROBLEMA
MECANISMOS FENOTÍPICOS DE RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS DE BACTERIAS ENDOSIMBIÓTICAS DE AMEBAS DE VIDA LIBRE AISLADAS DE AGUA DE CONSUMO DE LA CUIDAD DE CÚCUTA, 2019.
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las amebas están muy extendidas en el medio ambiente, principalmente en las
interfaces agua-aire y agua-suelo, lo que describe que las amebas llevan un estilo
de vida predominantemente heterótrofo, se alimentan de una variedad de
organismos incluyendo bacterias, hongos e incluso otros protista, sin embargo,
algunos microorganismos han evolucionado para volverse resistentes a estos
protistas, por ser verdaderos simbiontes, que viven en estrecha asociación durante
un período específico de su vida con las amebas, o por ser verdaderos patógenos
amebianos capaces de lisar las amebas antes o después de completar un ciclo de
replicación intraamebiana16. Por lo tanto, las amebas pueden considerarse como
un nicho replicativo tanto para los simbiontes amebianos como para los patógenos
amebianos. No obstante, las amebas no son un sitio replicativo neutro, sino una
potente cuna evolutiva que promueve la selección de rasgos de virulencia que
conducen a la supervivencia contra las células fagocíticas. Las amebas de vida
libre pueden desempeñar un papel en la selección de los rasgos de virulencia y en
la adaptación a la supervivencia en cuanto a la acción de los macrófagos.
De esta relación, se evidencia el crecimiento intra-amebiano aumenta la virulencia,
y mecanismos similares parecen estar implicados en la supervivencia de las
bacterias resistentes a las amebas en respuesta tanto a las amebas como a los
macrófagos. Además, las AVL representan una herramienta útil para el cultivo de
algunas bacterias intracelulares y de nuevas especies bacterianas que podrían ser
patógenos y emergentes potenciales17.
En los últimos años se han evidenciado gracias a varias publicaciones que
documentan que la ameba puede servir como un "crisol" en el que se producen
intercambios genéticos18, es por ello que la interacción entre las AVL y estas
impulsan la patogenicidad de las bacterias, siendo esta importante para la
adaptación de estos microorganismos a las células eucariotas a través del
crecimiento intracelular, debido a que estas promueven un mecanismo de
protección contra condiciones adversas y algunas especies bacterianas son
capaces de sobrevivir aun en su interior, incluso durante la etapa de quiste19.
Sin embargo, no todas las bacterias son ingeridas o digeridas por la ameba. Ya
que estás han desarrollado varias adaptaciones para escapar de estos procesos
24
de fagocitosis y así explotar los recursos de las células huéspedes. Las bacterias
intracelulares, llamadas también bacterias resistentes a las amebas, utilizan a
estas como "campo de entrenamiento" para la resistencia a la destrucción por
parte de los macrófagos. La mayor parte del agua (suministros de aguas de
hospitales, viviendas, ríos, lagos y otros) y el suelo han sido investigados como
posibles reservorios de bacterias resistentes a las amebas, es por esto que los
ecosistemas acuáticos alrededor de los asentamientos humanos son reconocidos
como reservorios de bacterias resistentes a las amebas20.
Con respecto a esto, gracias a estudios previos indicaron que cuatro especies
de amebas de vida libre están asociadas con la enfermedad humana:
Naegleria fowleri, Sappinia diploidea, Balamuthia mandrillaris y Acanthamoeba
spp, estos patógenos oportunistas causan infecciones humanas mortales que
afectan al sistema nervioso central (N. fowleri, B. mandrillaris y Acanthamoeba
spp.), meningoencefalitis aguda y fulminante (N. fowleri), encefalitis (S.
diploidea) y queratitis (Acanthamoeba spp).De acuerdo a lo anterior es
importante mencionar, que las amebas son capaces de interactuar con las
bacterias patógenas de varias maneras. Una de ellas es que las amebas de
vida libre actué y se llene de bacterias vivas, en un proceso llamado "caballos
de Troya". Otra forma es que las bacterias son capaces de resistir la digestión
de las amebas libres y viven en trofozoìtos o quistes21. Además, es posible que
se produzcan interacciones cuando las bacterias manipulan la expresión
génica del hospedero y se capacitan para proliferar en las células de la ameba.
“La interacción bacteriana con la ameba se ha asociado con el aumento de la
resistencia a los antimicrobianos de los patógenos bacterianos”22. Por lo tanto, la
interacción entre las amebas de vida libre y las bacterias endosimbiòticas
promueve la supervivencia de las bacterias bajo la presión del pastoreo, y
consiguientemente, desarrollan nuevas características adaptativas como la
comunicación de célula a célula, la formación de micro colonias, la velocidad de
natación y los metabolitos bio-activos23.
Debido a los rasgos morfológicos de las bacterias, como la motilidad, la alta
abundancia y el pequeño tamaño, interactúan fácilmente con varias especies de
AVL. Por su parte, la resistencia antimicrobiana es la capacidad natural o
adquirida de una bacteria de permanecer indiferente a los efectos bactericidas o
bacteriostáticos de los Antibióticos. Los países en vías de desarrollo en general,
muestran niveles de resistencia mayores que en países industrializados y a su vez
cuentan con menos recursos para el desarrollo de estrategias para su contención.
A pesar de que es un problema global, tiene mayores consecuencias en los países
con menos recursos24.
25
Flores et al. Determinó que las bacterias endosimbiontes de Acanthamoeba spp tienen una importancia clínica debido a que la mayoría son patógenas para el hombre, un ejemplo de esto es Legionella pneumophila, que es capaz de multiplicarse y aumentar su virulencia. Burkholderia cepacia y Vibrio cholerae sobreviven y se multiplican en amebas de vida libre. Mycobacterium avium aumenta su resistencia a antimicrobianos. Listeria monocytogenes que, además de sobrevivir como endosimbionte, provoca la destrucción de la ameba, es por ello que Acanthamoeba spp tiene la capacidad de vivir en el medio ambiente ser parásito facultativo de aves, animales y humanos por esto se le considera como microorganismo anfizoicas25.
En cuanto a las plantas de tratamiento de agua de los municipios Cúcuta y patios
de las cuales son abastecidas por el rio pamplonita siendo este unas de las
principales fuentes hídricas del departamento Norte de Santander26, la cual por
parte del grupo de investigación BIOGEN en la Universidad de Santander sede
Cúcuta evidencio no solo la presencia de AVL, sino la relación endosimbiòtica con
las bacterias, en el rio pamplonita.
Con respecto a Colombia se han realizado pocos estudios relacionados a los
mecanismos de resistencia de bacterias endosimbióticas en amebas de vida libre,
sin embargo las investigaciones encontradas se fundamentan, Con el fin de mitigar
el mal uso de los antibióticos en las diferentes áreas, dado que la resistencia a los
antibióticos ha aumentado siendo uno de los principales problemas de salud
pública, lo que ha obligado a mantener una lucha constante en cuanto al uso
adecuado de los mismos. De igual manera, para el sistema de salud en general la
detección de mecanismos de resistencia se forma en un reto y una necesidad para
la contención de este problema27. Por lo que en este trabajo se quiere determinar
los diferentes mecanismos de resistencia de las bacterias endosimbióticas de AVL
en aguas de consumo de la ciudad de Cúcuta.
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Cuáles son los mecanismos fenotípicos de resistencia a los antibióticos de
bacterias endosimbióticas de amebas de vida libre aisladas de agua de consumo
de la ciudad de Cúcuta, 2019?
26
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo General
Establecer mecanismos fenotípicos de resistencia a antibióticos de bacterias
endosimbióticas de amebas de vida libre aisladas de agua de consumo de la
ciudad de Cúcuta
1.3.2 Objetivos Específicos
Identificar bacterias endosimbióticas patógenas aisladas de amebas de vida libre mediante cultivos microbiológicos
Identificar sensibilidad a antibióticos en bacterias endosimbióticas patógenas mediante MicroScan.
Determinar mecanismo de resistencia a antibióticos de bacterias endosimbióticas mediante pruebas fenotípicas por difusión en disco.
1.4 JUSTIFICACIÓN
La resistencia a los antibióticos es la capacidad de las bacterias de impedir que los
antimicrobianos procedan en su contra, lo cual acarrea consecuencia en los
tratamientos usuales en donde se convierten en ineficaces y las infecciones
persisten. Los estudios relacionados entre los protozoos y sus endosimbiontes
bacterianos no sólo son importantes para la ecología del huésped y de la bacteria,
sino que proporcionan asimismo información sobre las cuestiones generales de
las interacciones endosimbióticas específicas.
El presente estudio pretende constituirse en una herramienta útil en la
determinación e identificación de los mecanismos de resistencia bacteriana en
amebas de vida libre de las fuentes hídricas de los alrededores de la ciudad de
Cúcuta. La pertinencia que posee esta investigación radica en que la información
puede ser utilizada en diferentes laboratorios clínicos, para contribuir en
investigaciones de la universidad. Cúcuta, es una ciudad que cuenta con gran
27
variedad de abastecimientos y fuentes hídricas que lo rodean. Siendo El agua una
sustancia elemental que permite la vida en nuestro planeta y todo lo que en ella
invade. Tales como fauna, flora y principalmente el ser humano, este recurso
biológico a pasar del tiempo y de la misma mano del hombre ha ido aumentando
su contaminación y por ende desarrollando ambientes hostiles que perjudican todo
aquel consumidor.
La endosimbiosis ha generado una atmosfera rica para el desarrollo,
supervivencia y transporte de agentes etiológicos o patógenos que generan una
gran relevancia clínica a nivel de salud pública siendo una de las variables más
importantes al momento del contagio y propagación de la patología. A nivel
nacional no se tienen investigaciones que fundamenten el estudio sobre los
mecanismos de resistencia de las bacterias endosimbióticas aisladas previamente
de las AVL, siendo esta una particularidad que le aporta un mayor grado de
virulencia al momento del desarrollo de la patogenicidad.
Diversos han sido los factores que han auxiliado al aumento de bacterias
multirresistentes a antibióticos, como su uso inadecuado, migración que facilita la
diseminación, aglomeraciones, desecho, entre otros que aumentan las bacterias
resistentes y sus mecanismos moleculares de resistencia antimicrobiana,
detectando blancos terapéuticos y pocos nuevos fármacos. “El conocimiento de
los mecanismos de resistencia permitirá una terapia antimicrobiana racional y
dirigida, además de ayudar al diseño de nuevos fármacos”28. Por lo que dichas
indagaciones ejercen una importancia vital en cuanto a las bacterias y su potencial
patogénico establecido en el agua de consumo, lo cual muestra la necesidad de
realizar de estudios sobre su distribución en fuentes hídricas de la ciudad de
Cúcuta y el impacto que estos microorganismos podría tener para la población que
accede al recurso hídrico.
A nivel nacional no se tienen investigaciones que fundamenten el trabajo, sobre
los mecanismos de resistencia de las bacterias endosimbióticas en amebas de
vida libre, siendo esta una singularidad que le asigna un mayor factor de
complejidad al momento del desarrollo de la patogenicidad, es importante
mencionar que la endosimbiosis confiere la capacidad de subsistir en ambientes
favorables para la supervivencia donde las amebas de vida libre aparte de ser un
mecanismo de protección, es un mecanismo que facilita transporte y mayor
afectación al hospedero por ende surgen el interrogante de cuáles son los
mecanismo de resistencia presentes en las bacterias endosimbióticas.
La investigación se hace necesario ya que lo sugerido por asociaciones científicas
es muy importante conocer los perfiles microbiológicos que se pueden presentar
en estas bacterias endosimbióticas y la resistencia que estas pueden manifestar
28
teniendo en cuenta el ámbito local, para así generar protocolos de manejos en
cuanto al tratamientos de plantas de agua.
Es conveniente para nuestro municipio esta investigación ya que genera de forma
adicional la ampliación del conocimiento en cuanto la manifestación de mecanismo
de resistencia que estas bacterias puedan ir adquiriendo gracias a la relación
endosimbiótica.
Este estudio pretende dejar conocimiento un aporte de la importancia que estos
microorganismos poseen, su evolución ya que les ha permitido que por medio del
agua sea mucho más sencillo su transporte y propagación, en la disminución de la
prevalencia, morbilidad y mortalidad en cuanto al desarrollo de la resistencia al
antibiótico.
29
2. MARCO REFERENCIAL 2.1 ANTECEDENTES En el 2020 Lee D, et al.29 llevo a cabo un análisis llamado “Identification of Free-Living Amoebas in Tap Water of Buildings with Storage Tanks in Korea” donde su objetivo fue analizar 163 muestras de agua de grifo de 37 departamentos, 102 oficinas de edificio y 24 servicio de carretera. Obteniendo 500 ml de agua del grifo a las cuales se realiza proceso de filtración con membranas de poros de 0,2 µm. Los filtros se incubaron en placas de agar con E. coli inactivada.se extrajo las cepas más puras seleccionadas para el análisis del ADN se realizó la clasificación utilizando secuenciación por PCR de 18S-rDNA. Donde determinaron que el 12,9% del agua del grifo de los edificios con tanques de almacenamiento en Corea contaminado con AVL. Las cuales en servicio de carreteras presentaron la mayor tasa de presencia de AVL con un 33,3%, excepto uno, eran genéticamente similares a Vermamoeba vermiformis (Hartmannella vermiformis). Las AVL restante (KFA21) presentaron similitud a Acanthamoeba lugdunensis (KA / E26).e informa que los casos de infecciones en humanos por V. vermiformis son muy extraños pero se deben prestar atención al hecho de que un tercio de los suministros de agua del grifo en las áreas de servicio de las carreteras han sido contaminados. Y así enfrentar problemas de salud. En el año 2020 Behniafar H, et al.30 se lleva a cabo una investigación “Molecular Characterization of Pathogenic Acanthamoeba Isolated from Drinking and Recreational water in East Azerbaijan, Northwest Iran” En el presente estudio, se recolectaron 67 muestras de agua de los recursos hídricos en el este de Azerbaiyán, una provincia en el noroeste de Irán. CLASIFICADOS EN manantiales
fríos (29), agua del grifo (24), ríos (5), manantiales termales (6) y pozos domésticos (3), se realizó filtración al vacío con membrana de nitrocelulosa con poro 1,6 um, esta membrana fue expuesta en ANN con E.coli inactivada se realizó seguimiento durante 1 semana de forma diaria hasta el cumplimiento de 2 meses, las muestras positivas con trofozoìtos se utilizaron estudio de secuencia para la gen tipificación. Y análisis de prueba de termo y osmo-tolerancia. Se pudo determinar Acanthamoeba spp la cual se detectaron en 17 (25,4%) de las 67 muestras recogidas. Se determinó que le agua de grifo presento mayor contaminación por AVL con un (37,5%) del genero Acanthamoeba spp con un 36%,( 9 de 25 muestras) y 19,05 % (8 de 42 muestras) en las regiones rurales y urbanas de forma respectiva en cuanto a el análisis de secuenciación reveló que los aislados pertenecían a los genotipos T3 (23,52%), mezcla T3 / T4 (5,88%), T4 (58,82%), T5 (5,88%) y T13 (5,88%). Mediante pruebas de termo y osmo-tolerancia, el 88,23% de los aislamientos fueron resistentes a 37 ° C, 40 ° C y 0,5 M y 1 M de osmolaridad; por lo tanto, estos aislamientos tenían el potencial de
30
patogenicidad. Estos hallazgos apuntan a un serio problema de salud pública en la región estudiada. Este estudio es el primero en informar sobre Acanthamoeba spp aislado de fuentes de agua potable y recreativa en el este de Azerbaiyán y Acanthamoeba spp T13 aislado del agua del grifo en Irán. En el año 2018 Onana M, et al.31Realizaron un estudio titulado “Identification of
free-living amoebae isolated form tap wáter in Estambul, Turkey” donde analizo 50
muestras de agua de grifo en hogares de personas de las cuales se tenía
conocimiento del uso de lentes de contacto donde se obtuvieron 3 réplicas con
una cantidad de 50 ml se filtraron mediante membrana de nitrato de celulosa
0,45 um, donde se siembra en ANN recubierta con E.coli, se examinaron de
forma diaria durante un tiempo establecido de 10 días y después de ello fueron
almacenados a - 86ºc donde después de esta exposición a esta temperatura tan
baja fueron nuevamente cultivadas, se realizó una extracción de ADN de los
trofozoítos este procedimiento fue realizado por QLA ampDNA MINI
KIT(QIAGEN,hilden,Alemania), este estudio manifestó que 15 (30%),fueron
positivas predominando la identificación de tipo morfológico del genero
Vermamoeba spp (4),Acanthamoeba spp (1) de otros genero de amebas (3) datos
que coincidieron mediante el análisis molecular, por lo que se puede conocer
como potenciales patógenos de tipo ocular, también como huéspedes y vehículos
de diversidad bacteriana.
En el año 2018 Una investigación realizada por Arango, Lozano, Segura32.
Titulada: Amebas de vida libre asociadas con bacterias intracelulares en
aislamientos de humedales y aguas dulces, el objetivo del trabajo se centró en
identificar amebas de vida libre en muestras de agua de humedales, con el fin de
verificar si estas tienen, de manera intracelular, bacterias potencialmente
patógenas, la metodología utilizada consistió en la recolección de muestras de
agua y se identificaron los valores de temperatura, pH y turbidez. Se
estandarizaron medios de cultivo con base en solución salina de Page,
Hartmannella 1 y Hartmannella 2, en los cuales se determinaron las condiciones
óptimas para el crecimiento de las amebas, posteriormente se generó la lisis
amebiana y se sembró en agar sangre, agar chocolate y agar MacConkey con el
fin de verificar los patógenos intracelulares; también se realizaron coloraciones de
Gram y Ziehl-Neelsen, en cuyos resultados mostro un gran porcentaje de amebas
de los géneros Acanthamoeba spp y Hartmannella spp; tras la implementación de
protocolos para el proceso de lisis de bacterias intracelulares, se aisló
Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus licheniformis y
Bacillus cereus y por último se concluyó que se aislaron amebas de vida libre de
ambientes de humedal y se comprobó la presencia de bacterias intracelulares que
31
pueden estar asociadas a procesos infecciosos en pacientes inmunocompetentes
e inmunocomprometidos.
Otra investigación realizada en el año 2016 realizada por Luisa Carbal et al.33
Titulada: Amebas de Vida Libre aisladas en aguas superficiales del municipio de
Turbaco, Bolívar-Colombia, tuvo como objetivo evaluar la presencia de las amebas
de vida libre en fuentes de agua natural en el municipio de Turbaco, con el fin de
que sean consideradas en la conducta diagnóstica y terapéutica por las entidades
de salud pertinentes, la metodología consistió en un estudio descriptivo,
transversal en los arroyos Matute, Mameyal y Cucumán del municipio de Turbaco -
Bolívar. La identificación se hizo mediante el estudio de los frescos de las fuentes
de agua observando características morfológicas de las amebas, en los resultados
se evidencio un total de 54 muestras se obtuvo una positividad del 55,5 % para
una o más AVL. Con mayor frecuencia Naegleria spp con un 44,4 % y
Acanthamoeba spp, en un 7,4 %. Además, se encontraron otros microorganismos
responsables, llegando a la conclusión que los arroyos estudiados son hábitat de
las AVL, demostrando que están presentes en el ambiente y que son frecuentes
en zonas donde el ser humano suele practicar ciertas actividades, sin embargo, la
proporción de Naegleria spp, permite alertar aún más a la población puesto que
esta ameba puede afectar a todo tipo de individuo independiente de su estado
inmunológico.
En el año 2018 Víctor Andrés Duque et al.34 llevo a cabo una investigación
basada, donde fueron aisladas AVL de Acanthamoeba spp y Naegleria spp del rio
pamplonita, y en el área metropolitana en la ciudad de Cúcuta, donde después de
su aislamiento se realizó examen directo, cultivo microbiológicos ANN con
variadas temperaturas como fueron 28,37 y 42ºC, determinación de PH y
temperatura in situ con la determinación de la carga de coliformes, se pudo
evidenciar la presencia de estas amebas en las 21 muestras analizadas, con
76.2% fue aislada Acanthamoeba spp y el 28,6% de los cultivos en una
incubación de 42ºC fue para Naegleria spp, indicando así que estas AVL son
consideradas patógenas para el hombre, teniendo en cuenta que la exposición a
estos protozoos es muy alta ya que el ser humano suelen practicar diversidad de
actividades.
En antecedentes locales se tiene la investigación realizada en el año 2018 por
Avellaneda & Ramírez35.Titulada: Determinación molecular de amebas de vida
libre y de bacterias endosimbióticas potencialmente patógenas del río Pamplonita,
norte de Santander, tuvo como objetivo determinar las amebas de vida libre como
agentes productores de enfermedad, el efecto protector que ejercen sobre
Bacterias Resistentes a Amebas y el potencial patogénico de estas últimas;
muestran la necesidad de realizar de estudios sobre su distribución en el cauce
principal del Río Pamplonita y el impacto que estos microorganismos podría tener
32
para la población que accede al recurso hídrico. La metodología se fundamentó en
un estudio descriptivo de corte transversal, los métodos aplicados para la
recolección de la información fueron: Análisis físico-químico in situ; Análisis
microbiológicos; Identificación y aislamiento de amebas de vida libre; Análisis
molecular y por ultimo determinación de bacterias endosimbióticas patógenas,
cuyos resultados muestran que debido a que se desconoce el impacto real de la
presencia de amebas de vida libre (AVL) con potencial patógeno en la región, a
partir de este estudio el grupo Biogen espera realizar la primera descripción
relacionada con la distribución de amebas de Vida libre de los géneros
Acanthamoeba spp, Naegleria spp, Vermamoeba spp y Sappinia spp en aguas
provenientes del curso principal del río Pamplonita y relacionar estos hallazgos
con factores físico-químicos y microbiológicos que podrían favorecer o dificultar su
existencia en el ambiente.
Otra investigación que se ha realizado en el año 2017 por mano Albarracín S &
Rodríguez D36. Titulada: determinación de amebas de vida libre y bacterias
endosimbióticas en agua de consumo de los municipios de Cúcuta y los Patios,
tuvo como objetivo Determinar amebas de vida libre y bacterias endosimbióticas
en agua de consumo de los municipios de Cúcuta y Los Patios, la metodología
utilizada para la obtención de los resultados fue descriptiva, de Campo, el
aislamiento de las amebas de vida libre se realizó mediante la recolección de 1
Litro de agua proveniente de cada una de las residencias, usando técnica de
filtración de membrana alternada con centrifugación, para concentrar los
sedimentos en donde se podrían encontrar potenciales amebas de vida libre.
Estos sedimentos serán cultivados en Agar No Nutritivo (ANN) suplementado con
Escherichia coli para valorar el crecimiento de los microorganismos en cuestión a
tres temperaturas diferentes (28,37 y 42 °C). De encontrarse estas amebas, serán
subcultivadas cinco veces antes de ser expuestas a lisis mediante agujas calibre
27 para obtener las bacterias en su interior, las cuales serán identificadas por
medio de cultivo diferencial y baterías bioquímicas, en cuyos resultados evidencia
la presencia de amebas de vida libre y bacterias endosimbióticas en aguas de
consumo de los municipios de Cúcuta y Los Patios, aspecto que será de impacto
para la salud pública y permitiría generar nuevas estrategias de manejo y control
de estos microorganismos .
33
2.2 MARCO TEÓRICO
2.2.1 Agua
El agua es un recurso cada vez más apreciado, por lo que su escasez o
contaminación se sitúa como prioridad vital para el desarrollo de las poblaciones,
donde el déficit local y regional de agua es debido, sobre todo, al aumento de las
necesidades surgidas del desarrollo económico y de la explosión demográfica. En
el ciclo hidrológico o secuencia de fenómenos por medio de los cuales el agua
pasa de la superficie terrestre, está en el proceso de abastecimiento logran surgir
problemas de contaminación microbiológica tanto en los recursos como en el
proceso de almacenamiento y distribución. “Los datos epidemiológicos tienen un
mayor peso que los datos de calidad del agua por lo que los brotes sin datos de
calidad del agua se pueden incluir, pero informes que carecen de datos
epidemiológicos no, pues contribuyen al sub-registro”37.
Por ende, los conocimientos existentes sobre la microbiología del agua, requieren
un diseño elaborado evidencien en la aparición de bacterias, virus, hongos y
parásitos potencialmente patógenos en el agua de consumo, en el caso de la
contaminación microbiológica los protozoos pueden aparecer de manera frecuente
y son responsables de epidemias los cuales están ampliamente distribuido en la
naturaleza y es portado por todo tipo de animales, incluyendo animales. Asimismo,
las bacterias forman el grupo más importante de presencia en las aguas potables
y las más importantes en cuanto a número de epidemias causadas. La mayor
parte de la contaminación bacteriana causante de infecciones, un ejemplo de ello
es el género Salmonella spp, responsables de un gran número de problemas de
salud pública tanto en aguas como alimentos.
2.2.2 Amebas de Vida Libre (AVL)
Las Amebas de Vida Libre son un grupo diverso de protozoos unicelulares que
son habitantes de entornos tanto naturales como artificiales. A lo largo de esta
revisión, "ameba" se utilizará como un término general para describir protozoos
que utilizan extensiones citoplásmaticas, conocidos como pseudópodos, como
medio principal de locomoción, y no necesariamente se refiere específicamente a
los miembros del género Amoeba. Muchos de los organismos ameboideas más
comúnmente aislados y estudiados pertenecen a los géneros Acanthamoeba spp,
Hartmannella spp y Naegleria spp, estas amebas se pueden encontrar tanto en
sistemas terrestres como acuáticos, aisladas del suelo, polvo, aguas residenciales,
redes de agua hospitalarias y cuerpos de agua salada
34
La ameba de vida libre se basa en vías endocíticas para obtener nutrientes,
principalmente por fagocitosis de microorganismos que incluyen bacterias,
hongos, algas, otros protozoos, así como virus grandes presentes en el medio
ambiente38.
Todas las amebas de vida libre tienen trofozoítos y quistes como estadios
morfológicos en su ciclo de vida, con excepción de Naegleria que además tiene
una forma de transición flagelada. El trofozoíto es la forma en que se alimenta y en
condiciones desfavorables como por ejemplo en desecación o inanición, se
transforma en quiste o forma de latencia, cualquiera de estas tres morfologías
puede ingresar al hospedero; pero generalmente se considera al trofozoíto como
el estadio infectante. Con respecto al ciclo de vida AVL tienen al menos dos
estadios de desarrollo: trofozoítos y quiste. El trofozoíto es el estado
metabólicamente activo, se alimenta de bacterias y se multiplica por fisión binaria,
otras como el género Naegleria, presentan tres estadios morfológicos en su ciclo
de vida: ameboide, quístico y flagelado. La forma flagelada se presenta cuando la
ameba se encuentra en un medio sin nutrientes; es transitoria, el organismo no se
alimenta ni se divide y después de un tiempo, cuando se encuentra nuevamente
en un ambiente adecuado, regresa a su forma ameboide39.
El quiste es la forma de resistencia, generalmente tiene dos capas: una externa y
otra interna o endoquiste; una tercera capa, el mesoquiste, está presente en
algunas especies. Estas estructuras quísticas pueden explicar por qué el quiste es
tan resistente a biosidas usados para la desinfección de broncoscopios y lentes de
contacto, también a la cloración y esterilización en sistemas de agua. Las
condiciones adversas de pH, presión osmótica y temperatura causan el paso de
trofozoíto a quiste y el enquistamiento también ocurre cuando los requerimientos
alimenticios no están cubiertos. El protozoo se desenquista nuevamente, cuando
las condiciones ambientales vuelven a ser favorables, por lo cual su abundancia y
diversidad dependen de la estación del año, la temperatura, la humedad,
precipitaciones y disponibilidad de nutrientes39.
Taxonomía y nomenclatura
Las amebas de vida libre son microorganismos que pertenecen al Dominio
Eukarya, Reino protista, subreino Protozoa, dividido en cuatro grupos
Sarcodina(amebas), Mastigophora (flagelados), Sporozoa (además de las formas
esporas protozoos parásitos), Infusoria (ciliados); cuyos géneros de importancia
clínica están incluidos en Rhizopoda y Percoloza15.
35
Figura 1. Clasificación taxonómica de amebas de vida libre potencialmente patógenas
Ejemplo tomado de: Fernández M. Caracterización molecular de Amebas de Vida
Libre e identificación de otros parásitos en aguas de red de la provincia de
Zaragoza: asociación con otros microorganismos y riesgos para la Salud Pública.
Tesis doctoral. Universidad de Zaragoza; 201539.
Genero Acanthamoeba spp
Las especies pertenecientes al género Acanthamoeba spp están asociadas a varias enfermedades en humanos. Las AVL están entre los protozoos más abundantes en la naturaleza ya que a su distribución cosmopolita y a que pueden sobrevivir en una amplia variedad de hábitats, incluyendo ambientes inhóspitos, gracias a su escaza demanda de alimento y a que puede formar estructuras como quistes que las hacen resistentes. Es considerado como el género más común de las amebas, siendo estos protozoos anfizoicas que pueden ser aislados o encontrados en aguas de diferente origen por ejemplo a partir de: materia fecal, secreciones pulmonares y en algunos animales como peces, reptiles y mamíferos; debido a que pueden sobrevivir a distintas temperaturas, agentes desinfectantes, salinidad, os molaridad, y condiciones de pH40.
36
Morfología de Acanthamoeba spp Los trofozoìtos de Acanthamoeba spp su forma es irregular y miden entre 13 a
22,5um de diámetro, según la especie, tienen un citoplasma granular con
vacuolas, presenta múltiples pseudópodos en su superficie y un núcleo sin
cromatina periférica con nucléolo prominente, esta morfología de la ameba
predomina el crecimiento en condiciones ideales como en un pH neutro, con
abundantes nutrientes y temperatura de 30°C.por otra parte los quiste miden de 9
y 12um de diámetro, presenta dos paredes, la pared externa está formada por un
ectoquiste el cual es irregular y está compuesto por polisacáridos, lípidos,
proteínas. Por el contrario, la pared interna o el endoquista compuesta por hidratos
de carbono41.
Ciclo de vida Acanthamoeba spp El ciclo de vida de estas especies involucran una forma activa (trofozoìtos)
distribuidas en ríos, piscinas entre otro, sus vía de entrada en el ser humano es
por medio de ojos, mucosa nasal o atreves de lesiones en la piel y una forma
latente conocida como quiste el cual puede variar de 9 y 12µm de acuerdo a la
especie, este amebas tiene la capacidad de viajar vía hematógena a otros tejidos,
donde tiene una asociación con personas con cierto grado de inmunosupresión, o
en personas sanas que pueden manifestar queratitis afectando directamente el
sistema nervioso central42.
37
Figura 2. Ciclo de Acanthamoeba spp
FUENTE: www.dpd.cdc.gov/dpdx
Manifestaciones clínicas Acanthamoeba spp La infección de Acanthamoeba spp se asocia a meningoencefalitis crónica que es denominada encefalitis granulomatosa amebiana. Que puede afectar a personas inmunosuprimidas como los pacientes con VIH, con receptores de trasplante de órgano sólido, pero se han descrito casos en personas sanas. Las manifestaciones clínicas son similares a las producidas por las lesiones ocupantes de espacio en el sistema nervioso central y dependen del área afectada, los pacientes presentan diplopía, afectación de pares craneales, crisis comiciales, ataxia, alteración del estado mental, anorexia y Se pueden abstraer lesiones cutáneas granulomatosas. Otra infección que produce es la queratitis amebiana se caracteriza por una ulceración de la córnea e incluso por una pérdida total del ojo, pero está relacionada principalmente en pacientes que usan lentes de contactos y paciente inmunocompetentes43.
38
Genero Naegleria spp
Esta especie es la única reportada como patógena para los humanos llamada
Naegleria fowleri productora de meningoencefalitis. Es un ameboflagelado
termófilo que se halla generosamente intercambiado en el agua y suelos; pero es
sensitiva a ciertas circunstancias ambientales como salinidad, pH excesivo y
deshidratación. Esta es la única ameba patógena de vida libre que tiene circuito
disciplinar, conjuntamente de excrecencia y trofozoìtos; los cuales son las formas
activas de la ameba que se nutren de microorganismos y materia orgánica que en
contextos de depravación de nutrientes, se logra transfigurar en carácter flagelado
y consiente su derramamiento en suelo y agua44. “Se han nombrado más de 30
especies de Naegleria spp. Aunque, se sabe que Naegleria fowleri es la única
especie conocida como patógena que perjudica individuos sanos, niño y jóvenes
produciendo cuadros de meningoencefalitis amebiana primaria considerada una
enfermedad rápida y fatal”45.
Morfología de Naegleria spp
Naegleria spp comprende de tres estadios dos formas vegetativas (trofozoíto
ameboide y flagelado) y la forma de resistencia (quiste). El trofozoíto mide de 10 a
20μm se desplaza por seudópodos y se reproduce por fisión binaria. Puede
transformarse en trofozoíto flagelado es una forma transicional ante cambios
ambientales; tiene forma de pera, un estadio que presenta dos flagelos en el
extremo más ancho. Esta forma no se reproduce, si no que se revierte al estado
de trofozoíto amebiode. En condiciones desfavorables, el trofozoíto se transforma
en quiste que mide 7 a 15μm de diámetro y contiene una doble pared lisa con
poros, esférica con granulaciones y núcleo46.
Ciclo de vida de Naegleria spp La Naegleria fowleri en todo su ciclo de vida presenta estadios tales como;
trofozoìtos (15 a 25 μm), donde su replicación se da mediante el proceso mitótico,
con un citoplasma granular, con un gran número de mitocondrias, lisosomas y
vacuolas. Siendo esta su forma infectante. En cuanto a su forma quística puede
medir de 8 a 12 μm, con una doble pared lisa con poros e inmóvil, su forma de
adquisición es mediante la realización de actividades acuáticas donde se permite
la entrada de agua mediante la nariz47.
39
Figura 3 . Ciclo de vida de Naegleria fowleri.
FUENTE: www.dpd.cdc.gov/dpdx
Manifestaciones clínicas
Naegleria fowleri ha sido la única especie como patógena que afecta a niños,
hombres y animales, particularmente a hombres y niños sanos después de estar
en contacto con los distintos tipos de agua. Es el causante de meningoencefalitis
amebiana primaria los pacientes presentan fiebre, cambio en el comportamiento,
somnolencia, letargia, irritabilidad y tendencia progresiva a coma siendo este una
enfermedad mortal del sistema nervioso central48.
“Este género infecta a los seres humanos por vía nasal, migra a los nervios
olfativos y la placa cribiforme, para alcanzar los bulbos olfativos dentro del sistema
nervioso central”49.
40
Genero Vahlkampfia spp
Esta AVL su distribución en muy amplia en cuanto al medio ambiente,
normalmente se ha aislado en barro, lagos, plantas acuáticas y ríos, su
reproducción es mediante la función binaria, con referente a su parte morfológica
presenta un núcleo, un solo nucléolo, citoplasma granuloso y vacuolado, en
cuanto su ciclo presentan presenta trofozoítos activos y pleomorfos50.
Genero Vermamoeba spp
Vermamoeba vermiformis es una ameba que se encuentra distribuida en distintos
ambientes, como el agua ha sido aislada de entornos artificiales y aguas
recreativas, fuentes de agua potable, en sistemas de agua del grifo. Sin embargo
este protista se ha considerado como un problema de salud debido a ser potencial
patógeno para el ser humano. Este microorganismo se ha aislado de la córnea de
pacientes con queratitis por el uso de lentes de contacto y ha sido aislada de fluido
cerebroespinal de pacientes con meningoencefalitis51.
Morfología Vermamoeba spp
Vermamoeba vermiformis es una ameba que posee dos estadios quiste y
trofozoíto, los quistes miden 6 a 8μm contiene una pared compuesta por un
endoquiste grueso de 50nm y un ectoquiste de 110 a 140nm, proteínas y
polímeros de glucosa. Esta forma de quiste le permite que sobreviva en
condiciones ambientales hostiles como escases de nutrientes, cambios de
temperatura y pH. Puede volverse eliminar su quiste en cuanto recupere las
condiciones ambientales favorables52. “Los trofozoìtos tienen una morfología
cilíndrica, los gránulos son visibles en el citoplasma, y así como una pequeña zona
hiliana anterior”53.
41
Figura 4. Trofozoíto y quiste de Vermamoeba vermiformis
Ejemplo tomado de: Scheid P. Vermamoeba vermiformis - A Free-Living Amoeba with Public Health and Environmental Health Significance. The Open Parasitology Journal [Internet]. 2019 [cited 17 August 2019];7(1):40-47. Available from: https://benthamopen.com/contents/pdf/TOPARAJ/TOPARAJ-7-40.pdf53.
Ciclo de vida Vermamoeba spp
Vermamoeba vermiformis presenta dos estadios, el quiste que mide
aproximadamente de 6 a 9μm tiene forma esférica donde muestra de uno a dos
núcleos y contiene dos capas un endoquiste y ectoquiste que sobrevive a
condiciones ambientales como el agotamiento de nutrientes, el estrés osmótico o
los cambios de temperatura50.un trofozoíto presenta morfología alargada, mide
aproximadamente 22 a 42μm de largo, sus gránulos son visibles en el citoplasma,
muestran una forma monopodial en locomoción53.
Manifestaciones clínicas Vermamoeba spp
El género V. vermiformis es un potencial patógeno para el ser humano,
considerado como un problema de salud pública debido a su distribución ya que
se ha aislado de fluido cerebroespinal de paciente con meningoencefalitis y
bronconeumonía, también de paciente con queratitis por el uso inadecuado de
lentes de contacto1.”Ha sido reportado en diversos países, debido al aislamiento
de esta ameba mientras se evidencia otra infección ha aportado una evidencia de
su participación en la patogénesis”53.
42
2.2.3 Bacterias endosimbiòticas
El fenómeno de la endosimbiosis, o un organismo que vive dentro de otro, ha
tenido un profundo impacto en la evolución de la vida y continúa dando forma a la
ecología de innumerables especies. Tradicionalmente, los biólogos han visto la
evolución como un patrón ampliamente derivado, que refleja mutaciones y otros
cambios en la información genética existente, la especiación y divergencia
ocasional de linajes. Si bien la bifurcación del linaje ha sido claramente importante
en la evolución, la fusión de dos linajes a través de la endosimbiosis también ha
hecho profundas contribuciones a la novedad evolutiva54.
Las mitocondrias y los cloroplastos son reliquias de antiguos endosimbiontes
bacterianos que finalmente ampliaron el rango de hábitats aceptables para la vida
al permitir que los hospederos prosperen en presencia de oxígeno y para convertir
la luz en energía. Hoy en día, la gran abundancia de relaciones endosimbióticas a
través de diversos linajes y hábitats de acogida atestigua su continua
importancia55.
La definición más completa de endosimbiosis incluye todo el espectro de tipos de
interacción, desde dañino (parasitario) hasta beneficioso (mutualista), y se aplica a
organismos que viven en cualquier lugar dentro del cuerpo del huésped, como
dentro de tejidos o células53.
Morganella morganii
Esta es una bacteria presente en la flora fecal promotor como otras
enterobacterias de infección urinaria y, en pequeña mesura, de otras infecciones
en el globo ginecológico o herida quirúrgica. A veces se relacionado con la artritis
séptica, especialmente en pacientes de avanzada edad y con enfermedades de
larga evolución. “Son sensibles a terapias antibióticas con la excepción de los
betalactámicos”56. Esta especie se considera un patógeno oportunista inusual que
origina principalmente infecciones del tracto urinario. Sin embargo, ciertos
aislamientos clínicos de esta presentan aguante a variados antibióticos al portar
varios genes resistentes, lo que simboliza un serio desafío para el control de
infecciones56.
Klebsiella pneumoniae Klebsiella spp es un género de bacterias Gram-negativas, afirma el experto José
Ramón Puño. Además de la pneumoniae, existen otros tipos como la Klebsiella
oxytoca o la ozaenae, apunta. Entre ellas se diferencian en los genes y en las
43
proteínas que codifican estos genes. Este grupo de bacterias son pertenecientes a
familia Enterobacteriaceae, que juegan un importante rol como causantes de las
enfermedades infecciosas oportunistas. Su asimilación y la fermentación de la
lactosa se puede observar en el “agar MacConkey donde las colonias son de color
rosado y en el medio Kliger o TSI donde son Ácido/Ácido, es decir fermentador de
la lactosa más producción de gas; y en la fermentación acetónica o prueba de
Voges Proskauer son positivos. Por último, sus condiciones óptimas de cultivo son
en agar nutritivo a 37 °C, pH de 7.0, presión osmótica de 1 atm”57.
Se conoce que estas bacterias causan alrededor del uno por ciento de las
neumonías bacterianas y puede producir concentración hemorrágica amplia del
pulmón. Conjuntamente, en ocasiones incita infección al aparato urinario y
bacteriemia a partir de lesiones focales personas debilitadas que puede terminar
con la vida. Algunas de las complicaciones más frecuentes son el absceso
pulmonar57.
Pseudomona aeruginosa. Esta bacteria pertenece a la familia Pseudomonaceae. Están en la tierra y se
contagia por contacto directo con cosas contaminadas, asimismo es una especie
de bacterias Gram-negativas, aeróbicas, con motilidad unipolar, distinguida por
secreta una variedad de pigmentos. Conocida como patógena oportunista en
humanos y también en plantas, ya que infecta los pulmones y las vías
respiratorias, las vías urinarias, heridas, y también causa infecciones
generalizadas en el organismo.
“Las infecciones más graves incluyen otitis externa maligna, endoftalmitis,
endocarditis, meningitis, neumonía y septicemia. La probabilidad de recuperación
de la infección por Pseudomonas spp está relacionada con la gravedad del
proceso patológico subyacente”58. Pseudomonas spp puede causar neumonías a
grupos, lo que en ocasiones precisa socorro mecánico para superar dichas
neumonías, están forman parte de los microorganismos más habituales aislados
en diversos estudios. Pseudomona aeruginosa es el causante de dermatitis,
originada por disminución del control de la calidad del agua potable. El más común
causante de altas fiebres en infecciones por su causa58.
44
2.2.5 Resistencia bacteriana La resistencia bacteriana es un fenómeno que se da en las bacterias cuando son
expuestas a antibióticos, generado principalmente por el uso inadecuado de los
antibióticos, dentro de este tipo se conoce la resistencia intrínseca esta se
desarrolla de forma natural en ausencia de mecanismo de presión (no hay
exposición previa a los antibióticos).la adquisición de material genético por las
bacterias sensibles a antimicrobianos ocurre a través de la conjugación,
transformación o transducción que facilitan la incorporación de genes con
resistencia al plásmido o genoma59. La resistencia adquirida puede estar presente
en una cepa bacteriana determinada, aparece por cambios precisos en el DNA
mutación espontanea provocando una alteración genética o por la adquisión extra-
comosomica que se origina por incorporación genética por fuera del cromosoma
ya sea por trasposoneso plásmidos60.
Mecanismo de resistencia. (Genotípica y fenotípica) La resistencia bacteriana es una anomalía progresiva diferenciada por una
refractariedad parcial o total de los microorganismos al resultado del antibiótico
formado especialmente por el uso indiscriminado de éstos y no sólo por el apremio
progresivo que se practica en el uso curativo. En las bacterias cada vez aparecen
nuevos mecanismos que son difíciles de controlar por estos medicamentos.
1. Cambio enzimático del antibiótico: se manifiesta en bacterias que tienen la
facultad de crear cambios a nivel estructural del antibiótico generando una pérdida
de su parte funcional. Las ß-lactamasas son las más pronunciadas, ya que estas
proteínas tienen la capacidad de hidrolizar el anillo ß-lactamico, igualmente
existente enzimas que modifican los aminoglucósidos también son capaces de
cambiar mediante la acetilación, fosforilaciòn y adenilación61.
2. Bombas de salida: en este mecanismo se labora apropiándose del espacio
periplásmico expulsándolo al parte externa, evitando que llegue a lugar donde
debe ser su accionar, en la bacterias Gram negativas es muy frecuente que se
presente esta alteración.
3. Cambios de la permeabilidad de la membrana externa: se puede expresar
cambios en la bicapa lipídica, pero en realidad la afectación de la permeabilidad
se da principalmente por la alteración o cambio de las porinas, reconociendo que
estas son proteínas las cuales forman canales con agua embebidos en la
membrana externa, donde regulan el acceso de elementos tales como los
antibióticos, incluso puede llegar a suceder que la membrana externa no permite
el paso de estos, al espacio periplásmico.
45
4. Alteraciones del sitio de acción: se puede percibir la alteración de este sitio
donde se realiza la unión entre el antibiótico y la bacteria y así interrumpir el
objetivo que tiene el antibiótico, esta alteración es muy común las bacterias Gram
positivas, donde se generan cambios en la estructura de los ß-lactamicos a nivel
de las proteínas unidoras de penicilinas61.
Figura 5. Mecanismos de resistencia antimicrobiana.
.
Ejemplo tomado de: Moreno C, González E, Beltrán C. Mecanismo de resistencia
antimicrobiana en patógenos. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
200962.
Betalactámicos
Betalactámicos son un grupo de antibióticos de linaje natural o semisintético que
contienen en su estructura un anillo betalactámicos, que interviene inhibiendo la
etapa final de síntesis de pared celular de la bacteria. Forman al grupo más
abundante de los antimicrobianos y los más usados en la clínica. Se emplea de
compuestos de acción bactericida lenta e independientemente de la concentración
plasmática, muestran poca toxicidad y poseen un amplio margen terapéutico. El
espectro de estos se ha ido aumentando en el tiempo por las nuevas moléculas
con mayor actividad frente a las bacterias Gramnegativos, Grampositivas y
espiroquetas. Los batalactamicos tienen similitud de la D-alanil-Dalanina, el
aminoácido terminal de las subunidades peptídicas de la barrera peptidoglicana.
46
La similitud que hay entre los betalactamicos y la D-alanil-D-alanina posibilita su
anclaje al centro activo de las PBPs. El núcleo betalactamico de la molécula se
une irreversible a las PBP, este enlace evita la etapa final de la formación de la
barrera peptidoglicano impidiendo la síntesis de la pared63.
Se pueden clasificar en grupos diferentes: penicilinas, cefalosporinas,
monobactámicos y carbapenemicos
Penicilinas Son un grupo de antibióticos de origen natural y semisintético contienen el núcleo
de ácido 6-aminopenicilanico, consiste en un anillo betalactámico enlazado a un
anillo tiazolidinico. Los compuestos de origen natural son derivados por distintas
especies de Penicillum spp. El espectro antimicrobiano de la penicilina G incluye
cocos Gram positivos, Gram negativos, bacilos Gram positivos y espiroquetas. La
producción proveniente del ácido 6-aminopenicilanico permite disponer
preparados activos por vía oral. Farmacología: la absorción por vía oral puede
diferir en las distintas penicilinas pero la penicilina G no se absorbe bien en
cambio que la penicilina V se absorbe mucho mejor y resiste la inactivación
gástrica. Las penicilinas antiestafilocóciacas, oxacilina y dicloxacilina, son
permanente ala acido gástrico y se absorben adecuadamente. Según su origen y
espectro de acción se pueden clasificarse en: penicilinas naturales, penicilinas
resistentes a las penicilinas estafilococias, amino-penicilinas, ureido penicilinas,
carboxipenicilinas64.
Tabla 1. Clasificación de las penicilinas
Tipo y Nombre Genérico Nombre Comercial
Penicilinas naturales
Penicilina G cristalina Penicilina G procaínica Penicilina G benzatinica Fenoximetil penicilina (penicilina V)
Penicilina G sódica o potásica Allerpen Bencetazil Pen-vee-K
Tipo y Nombre Genérico Nombre Comercial
Penicilinas penicilinasas resistentes
Meticilina Oxacilina Nafcilina Cloxacinina Dicloxacilina
No disponible Prostafilina Nafcil, unipen Prostafilina A Diclocil
Tipo y Nombre Genérico Nombre Comercial
Penicilinas de Amplio Espectro
47
Aminopenicilinas
Ampicilina Amoxacilina Bacampicilina
Amfipén, Binotal Amoxal, Amoxicilina, Rhamoxilina Bacampicilina, Bamaxin, Penglobe
Carboxipenicilinas
Carbenicilina Ticarcilina
No disponible Ticapen
Ureidopenicilinas
Mezlocilina Azlocilina Piperacilina
Mezlin Azlin Pipracil
Tipo y Nombre Genérico Nombre Comercial
Penicilina + inhibidor de betalactamasas
Amoxacilin - ácido clavulánico Ampicilina – sulbactam Ticarcilina - ácido clavulánico Piperacilina – tazobactam
Clavulin Unasyn, Sulam, Sultamicina No disponible No disponible
Fuente de: http://med.javeriana.edu.co/fisiologia/fw/c72.htm
Carbapenémicos
Los carbapenémicos son una clase de antibióticos betalactámicos de amplio
espectro, actividad y resistencia a las betalactamasas. Contiene un mayor
espectro de actividad y potentes contra bacterias Gram negativas y Gram
positivas. Los carbapenémicos se diferencian de las penicilinas por la substitución
de un átomo de carbono por uno de sulfuro y la adición de un doble enlace en el
núcleo del anillo de penicilina que contiene 5 carbonos. Su mecanismo de acción
de los carbapenémicos tiene una elevada afinidad por las diferentes enzimas
como las PBPs que participan en la unión del peptidoglicano, estructura en la
pared celular de las bacterias. De acuerdo a su función se clasifican en
transglicosilsasas, transpeptidasa y carboxipeptidasas. Se conoce que las
bacterias Gram negativas los carbapenémicos muestran una elevada afinidad por
las PBPs de aumento peso molecular que le permite la capacidad antimicrobiana
de cada antibiótico, para que el carbapenémico pueda ejercer la función debe
llegar al sitio blanco65.
El imipenem es más potente que el meropenem contra las bacterias Gram
positivos, mientras el meropenem es más potente contra las bacterias
gramnegativos. Las bacterias patógenas que suelen ser resistentes a los
carbapenémicos incluyen Stenotrophomonas maltophilia y Burkholderia
48
cepacia. El perfil de resistencia de estos microorganismos se ha mantenido
estable por un tiempo de experiencia clínica66.
Cefalosporinas
Las cefalosporinas pertenece al grupo de los betalactámicos ya que poseen un
anillo betalactámico fusionado con un anillo dihidrotiazinico. Son bactericidas que
inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana al igual que las penicilinas. Las
cefalosporinas de primera generación tienen una importante actividad contra los
cocos Gram positivos se usan para tratar infecciones no complicadas de la piel y
los tejidos blandos, las de segunda generación son activas contra los cocos Gram
positivos y algunos bacilos Gram negativos infecciones de pie diabético64.
Cefalosporinas de primera generación
Las cefalosporinas de primera generación son para vía oral y parental. Las orales
son mencionadas fenilglicinas o derivados hidroxifenilglicinas que incorporan la
cefalexina, cefadroxilo, cefradina y cefapirina; en las parenterales está la
cefalotina, cefradina, cefalozina y cefapirina. Este grupo de antibacterianos
incluyen sustitutos de la penicilina G resistentes a las penicilinas de
Staphylococcus spp por lo tanto tienen una buena actividad contra
microorganismos aerobias Gram positivas pero con excepción de Enterococos,
Staphylococcus epidermidis, neumococos resistentes a penicilina Staphylococcus
resistentes a la meticilina y asimismo a bacterias Gram negativos como Proteus
mirabilis, Escherichia coli, Moxarella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae67.
Cefalosporinas de segunda generación
Las cefalosporinas de segunda generación tienen un espectro algo más amplio
frente a bacilos gramnegativos que de la primera generación. Su cobertura es más
amplia ya que aumentan su actividad contra Gram negativos en los cuales
Haemophilus influenzae y Neisseria spp. Estas cefalosporinas al igual que las de
primera generación se administran por vía oral y parenteral. Las orales son
llamadas cefaclor, cefuroxime axetil y cefprozil. Las parentales son el cefamandol,
cefonicid, cefoxitina, ceforinida, cefuroxime cefmetazole y por ultimo cefotetan67.
Cefalosporinas de tercera generación
Las cefalosporinas de tercera generación su espectro de acción es más amplio
contienen una mayor potencia contra las microorganismos Gram negativos,
incluyendo las Enterobacteriaceae más importantes, desde el punto de vista
clínico. Su actividad contra los Gram positivos es menor que la de las
49
cefalosporinas de primera generación, pero son muy efectivas contra los
estreptococos 65. Estas cefalosporinas de tercera generación son el tratamiento de
elección en la infección de meningitis por bacilos Gram negativos. Este grupo de
cefalosporinas son efectivas contra la mayoría de las bacterias Gram negativas
pero excepto Enterobacter y citrobacter. Dentro de los antibióticos de tercera
generación se encuentran el Cefixime, cefdinir, cefpodoxima proxetil y ceftibuten
son las orales y cefoperazone, ceftazidime, moxalactam, cefotaxime, ceftizoxime,
cefmenoxime y ceftriaxone son parenterales68.
Cefalosporinas de cuarta generación
Las cefalosporinas de cuarta generación en este grupo se incluye el cefepime y el
cefpirone, poseen una estructura química que las hace tener buena penetración a
través de la membrana celular más externa de las bacterias, además de poca o
ninguna afinidad para inducir la producción de betalactamasas tipo 1, lo que
disminuye su degradación enzimática69.
Tabla 2. Clasificación de las cefalosporinas
Generación Parenterales Orales
Primera Cefalotina Cefazolina Cefradina Cefapirina
Cefalexina Cefadroxilo Cefradina
Segunda Cefamandol Cefonicid Cefoxitina Cefuroxime Cefotetan Cefmetazole Ceforanide Ceforinida
Loracarbef Cefaclor Cefuroxime axetil Cefprozil
Tercera
Ceftazidime Cefotaxime Ceftriaxone Ceftizoxime Cefoperazone Moxalactam Cefmenoxime
Cefixime Ceftibuten Cefdinir Cefpodoxima proxetil
Cuarta Cefepime
50
Cefpirone Cefpiramide Cefozopran
Ejemplo tomado de: Rivas K, Rivas M, Davila E, Rodríguez M. Cefalosporinas: De
la Primera a la Cuarta Generación. Revista de la Facultad de Medicina.2002;
25(2): 142-15367.
BLEE Las ß-lactamasas de amplio espectro extendido (BLEE), son una estirpe de enzimas derivadas por los microorganismos Gram negativos, esencialmente Enterobacterias sustancialmente habituales en Klebsiella Pneumoniae y Escherichia coli, aunque también por microorganismos no fermentadores como Pseudomonas aeruginosa y otros. Son capaces de inactivar, además de a las penicilinas y a las cefalosporinas de primera y segunda generación, a las oximino-cefalosporinas y al aztreonam70. Puede causar de forma disminuida la resistencia o sensibilidad a penicilinas,
oximino-cefalosporinas (cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefepima) y
monobactámicos (aztreonam), pero no la presenta a la cefoxitina, ni
carbapenémicos (imipenem, meropenem y ertapenem), estas bacterias son
inhibidas por el ácido clavulánico71. Las infecciones por microorganismos
productores de BLEE pueden ser comunitarias u hospitalarias y esporádicas o
epidémicas, su capacidad de propagación es extraordinaria, su transmisión logra
ser interhospitalaria, interurbana e incluso entre países. De lo que se deduce que
toda precaución para controlar este fenómeno es poca, existen varios métodos
fenotípicos y genotípicos para confirmar la existencia de BLEE, identificarlas y
llevar a cabo la investigación epidemiológica necesaria para poder saber si los
aislamientos proceden de un predecesor común o no72.
AMPCES Este tipo de B- lactamasas puede ser provocado por la exhibición a antibióticos B-
lactamicos. Son también conocidas betalactamasas de clase molecular tipo C de
Ambler, tienen la capacidad de hidroliza las cefalosporinas de primera y segunda
generación, donde puede encontrarse la cefamicinas. Este tipo de resistencia se
ve inhibida por antibióticos como la cloxacilina, aztreonam, ácido borónico y sus
derivados (ácido fenil-borónico), a diferencia del ácido clavulànico, sulbactam y
tazobactam no son buenos inhibidores. Esto se debe a la apariencia en estos
microorganismos de un gen ordenador denominado AMPR, el cual en contexto de
crecimiento estándar tiene la función de reprimir la expresión de AMPC. La sigla
51
AMPCES hace referencia a los siguientes microorganismos en el cual se observan
este tipo de resistencia. Acinetobacter, Morganella, Proteus/Providencia,
Citrobacter, Enterobacter y Serratia73.
MRSA El mecanismo que confiere (MRSA en inglés) para las infecciones por
Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Esta bacteria incita infecciones
que son resistentes a varios antibióticos comunes. En las cuales se podría
desarrollar la SARM hospitalaria, que es la que ocurre en las personas que se
encuentran en hospitales o centros de cuidado de la salud y la SARM adquirida en
la comunidad que es la que se presenta en personas que tienen contacto directo y
cercano con otra persona. “A través de diversos mecanismos, estos aislados
presentan resistencia al cloranfenicol, tetraciclinas, macrólidos, lincosaminas,
aminoglucósidos e, incluso, quinolonas, describiéndose cada vez con mayor
frecuencia brotes SARM sensibles sólo a los glucopéptidos”74.
2.3 MARCO CONCEPTUAL
Los siguientes conceptos fundamentan el tema de investigación, en este caso “la
determinación de mecanismos de resistencia de bacterias endosimbióticas de
amebas de vida libre (AVL) en la ciudad Cúcuta, Norte de Santander”.
Amebas de Vida Libre: Las amebas de vida libre (AVL) son un grupo de
protozoarios de importancia médica. Son organismos capaces de producir
infecciones en el sistema nervioso central y los ojos del ser humano, entre otras.
Las AVL son consideradas como organismos anfizóicos por su capacidad de vivir
libremente o como endoparásitos75.
Antibióticos: Son medicamentos que pelean con las infecciones bacterianas en
personas y animales, desempeñan su labor matando las bacterias o dificultando
su crecimiento y multiplicación. Estos tratan ciertas infecciones bacterianas y
únicamente deben tomar cuando es estrictamente necesario porque pueden
causar efectos secundarios y pueden contribuir a la resistencia a los antibióticos.
Esta ocurre cuando la bacteria cambia y puede resistir los efectos de un
antibiótico, es decir, las bacterias no mueren y continúan creciendo76.
Bacterias patógenas: Formas y agrupaciones características. Todas las
bacterias, procariotas unicelulares. El tamaño medio de las bacterias patógenas
humanas es de alrededor de 1 micra. Bacillus anthracis es la mayor (1-1,3 X 3-10
micras) y las más pequeñas pertenecen al género Mycoplasma (0,1 X 0,2 micras).
52
Las bacterias pueden adoptar diferentes formas. Se denominan cocos las de
forma esférica y bacilos las alargadas; cuando los bacilos se curvan como una
“coma” se llama vidrios, y si forman espirales espirilos. Los actinomicetos son
bacterias filamentosas formadas por largos filamentos e incluso ramificadas77.
Cultivos microbiológicos: Es un método para la multiplicación de organismos
para identificar bacterias y su agente etiológico de una infección y determinar la
susceptibilidad a determinados antimicrobianos. Para obtener los mejores
resultados clínicos, es necesario tener asociaciones sólidas entre el médico
tratante y el especialista técnico de laboratorio, fomentando una comunicación
abierta78.
Endosimbiosis: Las bacterias endosimbiontes son componentes integrales de la
biología de su hospedante y pueden ser agentes de un cambio evolutivo rápido,
permitiendo su adaptación a cambios en las condiciones ambientales. Po tanto,
los fenotipos del simbionte deben tener importantes implicaciones para las
estrategias de manejo de plagas basadas en criterios ecológicos79.
Fenotipo: expresión del genotipo en ocupación de un determinado ambiente. Los
rasgos fenotípicos cuentan con rasgos tanto físicos como conductuales. Los
cuales no puede definirse exclusivamente como alguna manifestación visible del
genotipo, ya que en ocasiones las características estudiadas no son visibles en el
individuo, como es el caso de la presencia de una enzima. Siendo entonces
cualquier característica o rasgo observable de un organismo, como su morfología,
desarrollo, propiedades bioquímicas, fisiología y comportamiento80.
MicroScan: Es un sistema total para el laboratorio de Microbiología que accede
efectuar pruebas de sustentabilidad antimicrobiana simultáneamente con
procedimientos manuales, semiautomatizados y automatizados, para
caracterización y escrúpulo de microorganismos de interés clínico de una manera
rápida, practica, confiada y estandarizada para completar a las labores rutinarias81.
Mecanismos de resistencia: Las bacterias son capaces de adquirir resistencia
en función de su variabilidad genética. Nuevos mecanismos de resistencia pueden
ser adquiridos mediante mutación o mediante transferencia de material genético
entre células bacterianas de especies relacionadas o diferentes. Estos genes de
resistencia pueden estar codificados en el material genético cromosómico o extra
cromosómico (plásmidos) 82.
Además, la resistencia bacteriana tanto natural como adquirida se puede abordar
desde el punto de vista molecular y bioquímico de tal forma que se pueden
clasificar en tres mecanismos básicos, por medio de los cuales las cepas
bacterianas pueden adquirir resistencia a los antibióticos de acuerdo al
mecanismo expresado y el mecanismo de acción del antibiótico. Los mecanismos
53
de resistencia son: inactivación del antibiótico, alteración del sitio blanco del
antibiótico y alteración de barreras de permeabilidad. Cabe resaltar que los 15 tres
mecanismos pueden ocurrir simultáneamente83.
Protozoos: Los protozoos son células eucariotas simples (organismos cuyas
células tienen membrana nuclear) con características del reino animal, ya que son
móviles y heterótrofos. El nombre, que proviene del griego proto: primero y zoo:
animal, avala la hipótesis de que son los seres vivos más antiguos, que fueron las
primeras células que existieron. Debido a su tamaño pequeño y a la producción de
quistes que les permiten resistir a las condiciones medioambientales adversas,
muchas especies son cosmopolitas, mientras que otras son de distribución
limitada84.
Simbiosis: Simbiosis (del griego simbios; vivir juntos): Anton de Bary en 1879
definió el término como: “La asociación permanente entre dos o más organismos
específicamente distintos, principalmente en una parte de su ciclo de vida”. Este
autor incluye al parasitismo como un tipo de simbiosis y considera esta simbiosis
cuando ambos organismos se benefician de la asociación. Un caso especial de la
simbiosis es la endosimbiosis en el cual uno de los dos organismos generalmente
un procarionte se encuentra localizado dentro de otro85.
2.4 MARCO LEGAL
En primera instancia se debe citar la maxima legislacion del Estado la cual es
Constitución Política de 1991, la cual establece en su artículo 49. “La atención de
la salud y el saneamiento ambiental son servicios públicos a cargo del Estado”.
Esta garantiza el acceso a los servicios de promoción, protección y recuperación
de la salud de los habitantes y de saneamiento ambiental procurando el cuidado
integral de su salud y la comunidad86.
También se contempla en la Ley 23 de 1973 “Por la cual se conceden facultades
extraordinarias al Presidente de la República para expedir el Código de Recursos
Naturales y protección al medio ambiente y se dictan otras disposiciones.” En su
Articulo 3. En el cual se consideran bienes contaminables el aire, el agua y el
suelo. La cual llevará su control estadístico, prestará colaboración científica y
técnica a las autoridades sanitarias de todo el país, a fin de coordinar la
planificación de acciones; y deberá aproximar específicamente a los problemas y
dispensación para asegurar a todos los habitantes y de control evolutivo del medio
ambiente, de acuerdo a la reglamentación que se dicte87.
54
Asimismo, el Decreto 1575 de 2007 manifiesta y establece las diferentes
entidades responsables del control y vigilancia cuyo objetivo es monitorear
prevenir y controlar el manejo de este recurso, por el territorio nacional88.
Articulo 2. Define que el agua para consumo humano debe cumplir las
características físicas, químicas y microbiológicas, en las condiciones
señaladas en el presente decreto y demás normas que la reglamenten,
es apta para consumo humano. Se maneja en líquidos directos en
alimentos o higiene personal. En este mismo ariculo refiere que los
laboratorios de análisis donde se realicen estos análisis sobre las
características físicas, químicas y microbiológicas del agua para
consumo humano, el cual debe cumplir con los requisitos previstos en el
presente decreto.
Artículo 3º; Establece que las características físicas, químicas y
microbiológicas del agua para consumo humano, que logren afectar
directa o indirectamente la salud humana, así como los criterios y
valores máximos aceptables que debe cumplir el agua para el consumo
humano, serán determinados por los Ministerios de la Protección Social
y de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial.
Por otra parte, el Decreto 1873 de 2012 Por medio de este decreto se informa
sobre la evaluacion y viabilizacion de todo proyecto cuya objetivo sea la
manipulacion del agua potable y su sanemiento basico, de forma departamental
y regional89.
Artículo 2. El cual establece que el “Mecanismo Departamental de
Viabilización de Proyectos” es el encargado de evaluar y viabilizar
aquellos proyectos del sector de agua potable y saneamiento básico.
Artículo 10. En este articulo se expresan los procesos de evaluación,
viabilización y aprobación de los proyectos de agua potable y
saneamiento básico priorizados en el marco de los Planes
Departamentales de Agua así como los demás Programas regionales
para el manejo de agua potable y saneamiento básicos.
Resolucion 2115 de 2007 Manfiesta las diferentes caractersticas fisicas, quimicas,
microbiologicas aceptables con relacion a el agua de consumo mediante un
55
sistema de control y vigilancia, buscando como objetivola oprima calidad del
agua90.
“Artículo 1. En este se encarga de las definiciones previas en las cuales
para este proyecto se destaca el análisis microbiológico del agua,
expresado como los ordenamientos de laboratorio que se verifican a una
muestra de agua para consumo humano para valorar la presencia o
ausencia, tipo y cantidad de microorganismos”.
“Artículo 11. Donde plantea las características microbiológicas del agua
para consumo humano han encuadrar en valores microbiológico
máximos aceptables teniendo en cuenta los límites de confianza del 95%
y para técnicas con habilidad de detección desde 1 Unidad Formadora
de Colonia (UFC) ó 1 microorganismo en 100 cm3 de muestra,
establecidos específicamente en dicha resolución”.
“Artículo 22. Puntializa el control para los análisis microbiológicos de
coliformes totales y E.coli a realizar al agua para consumo humano por
las personas prestadoras en la red de distribución, se sujetará como
mínimo, a las frecuencias y número de muestras de acuerdo con la
población atendida, definidos en el cuadro Nº.12 de la esa Resolución”.
2.5 MARCO CONTEXTUAL
La investigación se desarrolló en la ciudad de Cúcuta, la cual es una ciudad
colombiana en la frontera con Venezuela, conocida por su historia militar. El
Monumento a la Batalla de Cúcuta marca el punto donde se cree que el líder
militar Simón Bolívar reunió a sus tropas en 1813. El Malecón es un paseo costero
junto al río. El edificio de la Torre del Reloj tiene exhibiciones de arte. El cerro
Cristo Rey tiene una estatua de Cristo y vista a la ciudad. El museo del lugar de
nacimiento del General Santander está en Villa del Rosario, al sur91.
En esta ciudad las fuentes hídricas principales fuentes hidrográficas son el río
Pamplonita y el río Táchira. Cabe mencionar que el rio pamplonita pertenece los
municipios: Cúcuta, Pamplona, Los Patios, Chinácota, Bochalema y Pamplonita, y
los corregimientos El Diamante, La Don Juana, La Garita, San Faustino y Agua
Clara, situado entre 1 „2‟ de longitud oriental y 7‟8‟ de latitud norte, en la cordillera
oriental, extendiéndose por el suroeste de Norte de Santander, desde Pamplona
hasta Puerto Santander. El cual ha sufrido las consecuencias de pasar por la
ciudad y muchas de estas consecuencias de la contaminación92.
56
Debido a la escasa cultura de conservacion de los cucuteños, sumando a que el
rio pamplonita es un rio urbano, aumentan los impactos sociales que inciden en
forma negativa. Uno de los principales impactos ecologicos es debido a las aguas
reiduales que recibe del municipio de Pamplona las cuales logran un deterioro en
la calidad de agua. Ademas la red del alcantarllado inoperante de los municipios
de Chinacota, los Patios y Cúcuta.
Tambien aportan a este deterioro con receptor de aguas decompuestas residuales
industriales debido al más grave de contaminación cuando los barriles de petróleo
cayeron sobre el río Pamplonita, conllevando a la aparición de enfermedades en
varios niños debido a la contaminación del importante donde los impactos
ecológicos negativos los reciben al convertirse en receptor de aguas residuales de
Pamplona93.
Ademas del depositario de aguas descompuestas de Los Patios y de la misma
ciudad de Cúcuta. Otra fuente de contaminación son los vertidos de los mataderos
de Pamplona y de Bochalema, así como los plaguicidas y agroquímicos utilizados
para la agricultura y ganadería en municipios distantes, pero sobre los cuales se
ubica el mencionado río.Es por ello la importancia de determinar mecanismos de
resistencia de bacterias endosimbióticas de amebas de vida libre en fuentes
hídrica de la ciudad de Cúcuta.
2.6 SISTEMA DE HIPOTESIS
H1: Las betalactamasas de espectro extendido BLEE es el mecanismo de resistencia mas predominante en bacterias endosimbioticas en las Amebas de Vida Libre AVL en agua de consumo de la ciudad Cùcuta. H0: Las betalactamasas de espectro extendido BLEE no es el mecanismo de resistencia mas predominante en bacterias endosimbioticas en las Amebas de Vida Libre AVL en agua de consumo de la ciudad Cùcuta.
57
2.7 MATRIZ OPERATIVA DE LAS VARIABLES
Tabla 3 Operacionalización de las variables
PREGUNTA OBJETIVO ESPECIFICOS OPERACIÓN DE LAS VARIABLES
¿Existen bacterias
endosimbioticas
patogenas, aisladas
de AVL?
Identificar bacterias
endosimbiòticas patógenas
aisladas de amebas de
vida libre mediante cultivos
INDICADOR INSTRUMENT
O
ESCAL
A
FUENTE
Ausente o
presente
Observacion
microscopica y
macroscopica
Nominal
Amebas de vida libre
aisladas de
diferentes tipos de
agua
¿Cuáles mecanismos
de resistencia a
antibioticos presentan
las bacterias
endosimbioticas?
Determinar mecanismo de
resistencia a antibióticos
de bacterias
endosimbiòticas mediante
pruebas fenotípicas por
difusión en disco.
Sensible o
resistente
Observacion
macroscopica
Nominal
Bacterias
endosimbioticas
aislada de AVL
¿Presentan
sensibilidad a
antibioicos las
bacterias
endosimbioticos
patogenas?
Identificar sensibilidad a
antibióticos en bacterias
endosimbiòticas patógenas
mediante MicroScan
Sensibilidad o
resistente
Observacion
macroscopica
Nominal
Bacterias
endosimbioticas
aislada de AVL
Fuente: Cardenas J, Solano Y.
58
3. MARCO METODOLÓGICO
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
Según el autor.Sousa V et al.74 Señala que la investigacion cuantitativa es principalmente investigación exploratoria. Adopta una estrategia sistemática, objetiva y rigurosa para generar y refinar el conocimiento en el cual el investigador comienza con una teoría o estructura establecida, en donde conceptos ya fueron reducidos a variables, recolectando evidencia para evaluar o probar si la teoría se confirma.
3.1.1 Nivel de Investigación
Segun Morales F, expresa que “la investigación descriptiva busca especificar propiedades, características y rasgos importantes de cualquier fenómeno que se analice”95. Es por esta razón, que la presente investigación se orientó de esta manera ya que se pudo obtener las notas que caracterizan a la realidad estudiada. Por consiguiente, se definió asi debido a que se pretendia determinar los diferentes mecanimos fenotipicos de resistencia que se manifiesta gracias a la endisimbiosis entre las bacterias y amebas de vida libre en agua de consumo, en comunas de la ciudad de Cúcuta.
3.1.2 Diseño de Investigación
Según Sabino C.”plantea que una investigación de campo es aquella que se aplica extrayendo datos e informaciones directamente de la realidad a través del uso de técnicas de recolección, basado en un método cualitativo encaminado a comprender, observar e interactuar en su entorno nativo”96 .
Por lo que este estudio se planteó como estudio de campo, basado en la recoleción directa de agua de consumo en las 10 comunas de ciudad de Cúcuta, durante 3 muestreos lo que generó información indispensable para la investigación.
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se elaboró mediante cinco fases las cuales se subdividieron de la siguiente manera:
59
3.2.1 Fase I: Preparatoria
Se ejecutó un listado con los instrumentos que se solicitaron para su utilizaciòn durante todo el transcurso de la investigación: para el cultivo de amebas de vida libre; agar ANN, cepa 25922 de E.coli, cajas de petri, filtración, se requirió membranas de 45um, tubos falcon de 15 ml. Lisis se utilizó aguja de 5 ml para la siembra las bacterias endosimbioticas aisladas, tinción de gram, cultivo base sangre, McConckey y material bioquímico donde incluye (citrato, TSI, LIA, SIM, catalasa y oxidasa). Para el análisis de antibioticos se necesitó medio de cultivo Mueller Hilton, y antibiogramas, como excedentes se utilizó puntas amarillas, puntas azules, cambina de flujo, centrifuga, estufa y equipo de filtracion otorgado por la universidad de santander UDES.
3.2.2 Fase II: Descriptiva
Se planificaron para la investigacion diferentes aspectos para la ejecucion:
En la primera etapa se ejecutaron tres tomas de muestras por cada una de las 10 comunas que integran la ciudad de Cúcuta, pero en diferentes domicilios donde en cada punto se recolectó 1 litro de agua, en envases esteríl, con su respectiva enumeración para asi evitar posibles contaminaciones.
La segunda etapa se habla del aislamiento de AVL, el litro de agua recolectada fue procesada mediante un sistema de filtración al vacío, por con siguiente se realizó una siembra en medio de cultivo ANN, la identificación de dicha AVL fue mediante la observación microscópica, donde al observarse su crecimiento se realizó una serie de repiques con el proposito de disminuir o eliminar posibles contaminantes en la siembra y asi obteniendo cepas mucho mas puras.
La tercera etapa se efectuó la Lisis amebianas que se realiza a las AVL definidas como asilamiento primario.
En una cuarta etapa se hizo el cultivo de las lisis con el fin de aislar las bacterias endosimbiòticas con ayuda de medio primarios como lo son base sangre y MacConkey.
En la etapa cinco se identifica dichas bacterias mediante la ayuda de material bioquímico.
60
En la última etapa se llevó acabo todo con respecto a la sensibilidad y resistencia frente a los antibióticos utilizando técnicas fenotípicas como difusión en disco y MicroScan.
3.2.3 Fase III: Interactiva
Se realizó la visita en cada uno de los domicilios, para la toma de muestra en cada una de las comunas de la ciudad de Cúcuta y asi posteriormente se efectuó su análisis.
3.2.4 Fase IV: AnalÍtica
Se analizaron 10 comunas con diferentes puntos de recoleccion 3 muestras por cada comuna, esto se realizo con frascos esteriles disminuyendo la probabilidad de contaminacion de la muestra de agua. Se pasó a un proceso de filtración para eliminar el mayor porcentaje de impurezas y obtener una mayor concetración de amebas de vida libre, de las cuales a todas las muestras se cultivaron en medios con presencia previamente inactivada de la cepa Escherichia coli ATCC 25922, estas siembras se incuban a 37ºC por 1 semana aproximadamente. Donde cualquier tipo de crecimiento que se presentó en el agar fue observado para hacer un seguimiento donde se aislaron las muestras positivas teniendo en cuenta los criterios de exclusión e inclusión; donde se excluyen las cepas de las cuales se perciban crecimiento macroscópica y microscópicamente de hongos, positivas aquellas que contenían AVL. Posteriormente se llevó acabo la Lisis amebiana con la ayuda de jeringas y solución de PAS con el objetivo de romper AVL para asi evidenciar la endosimbiosis con bacterias mediante el crecimiento en agares base sangre y chocolate de los cuales se expusieron a una identificación mediante pruebas bioquímicas para obtener una identificación completa. En cuanto a la determinación de sus mecanismos de resistencia se formularon por técnicas fenotípica y mediante microScan; estos resultados fueron tabulados en el programa de microsoft office “Excel”.
3.2.5 Fase V: Cierre
Se elaboró el reporte de resultados por medio de técnicas virtuales, usando la plataforma Excel con el fin de realizar la tabulación de resultados obtenidos, así de esta manera se ejecutó la revisión del informe y corrección de las
61
observaciones en donde se pudo analizar no solo la endosimbiosis de Amebas de Vida Libre y las bacterias; sino también sus mecanismos de resistencias.
3.3. POBLACIÒN Y MUESTRA
3.3.1 Población
Según Francia97 población es “el conjunto de todos los elementos en el que se refiere la investigación se puede definir como el conjunto de todas las unidades de muestreo”
Esta representada por las diferentes muestras de aguas de consumo de las diversas comunas que conforman la ciudad de Cúcuta.
3.3.2 Muestra
Según Tamayo define a muestra como un “conjunto de individuos que es tomado de la población y asi estudiar el fenonemo estadístico”98 en este caso el tipo de agua determinada para la investigación fue de “agua de consumo humano”, distribuidas en las 10 comunas que conforman la ciudad de Cúcuta, adquieriendo 3 muestras por cada comuna, por lo que en su totalidad fueron 30 muestras, de las cuales se determinó la presencia de AVL, una vez obtenidas las muestras positivas se procedió a obtener los cultivos más puros para asi continuar con la realización de la Lisis amebiana y así garantizar el desarrollo de un proceso endosimbiotico, donde se realizó la identificación de dichas bacterias endosimbioticas mediante material bioquímico y por consiguiente la identificación de mecanismos de resistancia que pueden manifestarse, esto se realizó mediante pruebas de fundamento fenotípico o mediante técnicas como el MicroScan.
3.4 TÉCNICA E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS
En el trancurso y desarrollo de este estudio se emplearon como instrumentos de trabajo, una libreta de investigación, donde se fue plasmando el paso a paso realizado, partiendo desde los puntos de recoleción de muestras, fechas, procedimientos y resultados que se iban obteniendo durante la investigación.
3.5 TÉCNICA DE PROCEDIMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS
Al obtener los resultados fueron registrados en el programa Microsoft Office Excel, posteriormente se realizó el análisis estadístico análisis estadístico, basado en la
62
elaboración de distribuciones de frecuencia simple, tablas de contingencia para el cruce de variables y la respectiva representación gráfica de los resultados
63
4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
4.1 RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
4.1.1 Identificación de las bacterias endosimbióticas patógenas aisladas de
amebas de vida libre mediante cultivos microbiológicos
Tabla 4. Muestras de aguas de consumo positivas para amebas de vida libre, distribuidas por comuna que conforman la ciudad de Cúcuta.
N° COMUNA
NUMERO DE MUESTRAS TOMADAS
NUMERO DE MUESTRAS POSITIVAS
1 3 (10%) 2 (6.67%)
2 3 (10%) 0
3 3 (10%) 0
4 3 (10%) 0
5 3 (10%) 0
6 3 (10%) 0
7 3 (10%) 3 (10%)
8 3 (10%) 2 (6.67%)
9 3 (10%) 3 (10%)
10 3 (10%) 2 (6,67%)
TOTAL 30 (100 %) 12(40%)
Figura 6. Muestras de aguas de consumo positivas para amebas de vida libre, distribuidas por comuna que conforman la ciudad de Cúcuta.
64
El número total de muestras de aguas de consumo analizadas fue de 30,
distribuidas en tres muestras por comuna, de lo cual se obtuvieron en total 12
muestras positivas, con un equivalente de 40% de las muestras de aguas
analizadas, se reportan como negativas aquellos cultivos que tras el paso de 20
días no se observó crecimiento amebiano, por ende fueron descartadas como fue
el caso en las muestras pertenecientes a las comunas 2, 3, 4, 5 y 6. Asimismo,
para las otras muestras de agua, se identificaron que simultáneamente las
comunas 7 y 9 aportaron cada una un 10% de las muestras totales positivas, a
diferencia de las comunas restantes 1, 8 y 10 donde se manifestó su positividad
en solo dos de sus muestras (6.67%).
Tabla 5 Géneros y morfología de amebas de vida libre aislados en aguas de consumo de la ciudad de Cúcuta 2019
Nº COMUNA
MUESTRA Nº1
MUESTRA Nº2
MUESTRA Nº3
1
Negativo Quiste de Vermamoeba spp
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Vermamoeba spp
7
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Vermamoeba spp
Quiste de vahlkampfia spp
Quiste de vahlkampfia SPP
8
Negativo
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Vermamoeba spp
Quiste de Vermamoeba spp
9
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Vermamoeba spp
Quiste de Vermamoeba spp
Quiste de Vermamoeba spp
10
Quiste de Acanthamoeba spp
Quiste de Acanthamoeba spp
Negativo
Quiste de vahlkampfia spp
Quiste de Vermamoeba spp
65
Figura 7. Géneros y morfología de amebas de vida libre aislados en aguas de consumo de la ciudad de Cúcuta 2019
En la tabla 5 se evidenció, el crecimiento de AVL a partir de las 30 muestras
obtenidas, donde 23 de ellas fueron positivas para AVL, Gracias al examen
directo fue posible encontrar formas evolutivas de estos protozoarios. Amebas de
mayor predominancia fueron del género Acanthamoeba spp de las cuales se
obtuvieron a partir de sedimentos en un 47% (11/23), seguido Vermamoeba spp
con 39% (9/23) y Vahlkampfia spp con un 13% (3/23), también se puede observar
un crecimiento constante en el total de las muestras obtenidas en la comuna 9 en
cuanto a los quistes del género Acanthamoeba spp y Vermamoeba spp.
No se incluyeron datos de las comunas 2, 3, 4, 5 y 6 porque se notifican con
muestras negativas. Tras haber transcurrido los 20 días
11
9
3
0
2
4
6
8
10
12
Acanthamoeba spp Vermamoeba spp vahlkampfia spp
Fre
cue
nci
a
Genero de Amebas de vida Libre
66
Tabla 6 Identificación de bacterias endosimbióticas aisladas de amebas de vida libre.
N°
COMUNA
MUESTRA Nº1 MUESTRA Nº2 MUESTRA Nº3
1 ----- Rhizobium radiobacter Enterobacter
cloacae
7 Morganella
morganii
Klebsiella pneumoniae Salmonella
enterica
Serotipo Typhi
8 ---- Rhizobium radiobacter Escherichia coli
9 Escherichia coli Staphylococcus auricularis
(coagulasa negativa)
Pseudomona
aeruginosa
10 Ochorobactrum
anthropi
Negativo -----
Se percibe asociación endosimbióticas en un 91% (11/12),ya que se observa un
aislamiento total de 12 muestras positivas para bacterias endosimbióticas de las
cuales con respecto al aislamiento e identificación bacteriana la cual se realizó
mediante material bioquímico, en el que se puede percibir un crecimiento con
predominio de la familia Enterobacteriaceae con 54% (6/11);(Escherichia coli (2),
Enterobacter cloacae (1), Klebsiella pneumoniae (1), Salmonella Typhi (1),
Morganella morganii (1); seguida de la familia Rhizobiaceae con un 18% (2/11);
(Rhizobium radiobacter).(1), Brucellaceae (Ochrobactrum anthropi)(1) y
Staphylococcaceae (Staphylococcus auricularis coagulasa negativa). Mientras en
la comuna 10 en su segunda muestra aun siendo positiva para AVL, no se
observó crecimiento bacteriano por lo que se califica como una muestra negativa.
67
4.1.2 Identificación de la sensibilidad a antibióticos en bacterias
endosimbióticas patógenas mediante MicroScan
Tabla 7. Identificación bacteriana y mecanismo de resistencia
COMUNA- Nº DE
MUESTRA
IDENTIFICACION
BACTERIANA
MECANISMO DE
RESISTENCIA
C10-1 Ochrobactrum anthropi BLEE
C1-2 Rhizobium radiobacter BLEE
C8-2 Rhizobium radiobacter BLEE
C9-2 Staphylococcus auricularis
( coagulasa negativa)
MRSA
( TEST DE CEFOXITIN
POSITIVO)
C7-3 Salmonella entérica serotipo Typhi BLEE
Como se puede observar en la figura anterior, de las muestras analizadas cinco
fueron sometidas a un análisis automatizado mediante la técnica de MicroScan, lo
que permitió reconocer bacterias poco comunes de las cuales su identificación
son un poco más complejo tales como Rhizobium radiobacter la cual obtuvo un
porcentaje mayor con un 40% (2/5) Por otra parte, con un 20% Ochrobactrum
anthropi (1/5) siendo una bacteria Gram-negativo, aerobio obligatorio, la cual está
generosamente mercantilizada en la naturaleza, hallándose en suelo y agua. De
igual forma un 20% Staphylococcus auricularis (coagulasa negativa), teniendo en
cuenta que en varias ocasiones son difíciles de establecer, ya que logran ser
patógenos oportunistas y Salmonella enterica serotipo Typhi las cuales obtuvieron
un 20%. En cuanto a la resistencia bacteriana se permitió observar que BLEE
obtuvo un 90% (4/5) siendo este de mayor predominancia en cuanto al 10%
restante que obtuvo un mecanismo poco común como lo es MRSA.
.
68
4.1.3 Determinación mecanismo de resistencia a antibióticos de bacterias
endosimbióticas mediante pruebas fenotípicas por difusión en disco
Tabla 8. Mecanismo de resistencia a antibióticos de bacterias endosimbióticas
N°
COMUNA
MUESTRA Nº1 MUESTRA Nº2 MUESTRA Nº3
1 ---- BLEE AMPCES
7 AMPCES BLEE BLEE
8 ---- BLEE BLEE
9
BLEE
MRSA
No presenta
mecanismo de
resistencia
10 BLEE ---- -----
Figura 8. Mecanismo de resistencia a antibióticos de bacterias endosimbióticas
En la figura anterior, se revela que el mecanismo fenotípico de mayor predominio
es el mecanismo de resistencia BLEE (ß-lactamasas de espectro extendido) con
63% (7/11) seguido de AMPCES con un valor de 18% (2/11) a diferencia de
7
2
1 1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
BLEE AMPCES MRSA NO PRESENTAMECANISMO DE
RESISTENCIA
Fre
cue
nci
a
Mecanismo de resistencia de bacterias endosimbioticas aisladas de AVL
69
MRSA y no presentar mecanismo de resistencia que obtuvieron un 9%
respectivamente, esta condición de resistencia fue informada en total de una
muestras de 11 aisladas señalando que más de la mitad de las bacterias son de la
familia Enterobacteriaceae la cual presentan de forma muy común la
manifestación de este mecanismo de resistencia BLEE.
4.2 Discusión
Las infecciones en los seres humanos causadas por amebas de vida libre, se han
manifestado con mayor frecuencia en la actualidad, donde existen 4 géneros
asociadas a producir meningoencefalitis primaria (MAP) la cual ocurre de forma
típica en personas jóvenes, que manifiestan tener antecedentes de realizar
actividades en aguas cálidas, su afectación directa en el SNC permite reconocer
como una enfermedad rápida y letal, donde con lleva al fallecimiento de las
personas una semana después de manifestar los primeros síntomas; tales como
fiebre, cefalea, náuseas, vómitos, confusión y convulsiones99.
En este trabajo, en donde se encuentra que, en un total 12 muestras positivas,
siendo este el 40% de las muestras totales de aguas de consumo analizadas, es
un porcentaje alto, que dobla incluso, los valores de los resultados obtenidos por
Lee et al (12.9% del total de muestras) y Javanmard et al100. (20.6% del total de
muestras) en aguas de consumo, lo cual evidencia una deficiente calidad del agua
de consumo de la ciudad respecto a la presencia de AVL, siendo estos resultados
muy preocupantes. Sin embargo, estos resultados pueden ser probables, dado
que la normatividad vigente (Decreto 1725 de 2007 y Resolución 2115 de 2007)
no contemplan la detección ni acciones directas a mitigar la presencia de AVL en
aguas de consumo humano.
Además, el género predominante en el aislamiento de las AVL fue el género
Acanthamoeba spp. Con una frecuencia del 47%, la cual está relacionada
directamente a infecciones oculares (queratitis) por contacto con aguas
contaminadas, corroborado con lo que informa Mónica Pérez y Aurea Pereira101,
donde afirman también que las aguas de consumo no poseen el tratamiento de
desinfección, lo suficientemente fuerte contra estos protozoos, ya que poseen una
estructura de resistencia como son las “vacuolas” y éstas le permiten sobrevivir.
Según Miray Üstüntürk-Onan y Julia Walochnik102, afirman que el agua de
consumo es considerada como medio de transporte de bacterias o
microorganismos patogénicos, que pueden generar afectación al ser humano.
Esto se puede evidenciar en el aislamiento bacteriano obtenido en este estudio ,
basado en lo encontrado por Camacho J, Escobar M, et al.103 Donde se demostró
70
también que en la red de distribución de agua de consumo humano en el
municipio de Colcapirhua se obtuvieron bacterias patógenas con un porcentaje
coliformes totales (55%) donde incluye a E.coli con un (31%,), Klebsiella
pneumoniae (6.4%), Enterobacter cloacae (3,7%), entre otros y no coliformes
(6,4%) tales como Pseudomona aeruginosa, demostrando que presenta
semejanza con el análisis realizado en este estudio, como se muestra en la tabla
4, donde se perciben porcentajes similares 54%, en cuanto el aislamiento e
identificación de estas bacterias, se muestra mayor predominancia de la familia
Enterobacteriaceae como es Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella
pneumoniae, Morganella morganii y Salmonella Typhi. Cabe aclarar que, en estos
otros estudios, se enfocaban directamente en buscar la presencia de estas
bacterias, y no en la identificación de bacterias endosimbiòticas encontradas
dentro de las AVL, por lo que no se puede llegar a una conclusión clara acerca del
porqué de estos resultados.
En la actualidad, los microorganismos patógenos han desarrollado la capacidad de
evolucionar y así soportar la acción de los tratamientos de antibióticos, lo que ha
promovido una crisis de salud pública y de tipo urgente 104.también se ha podido
percibir el hallazgo de antibióticos farmacéuticos en cantidades
considerablemente grandes todo esto creado por uso irracional de ellos por
ejemplo el mal uso en plantas de tratamientos de agua 105 y esto ha permitido que
se encuentren cada vez más en ambientes terrestres y en fuentes hídricas 106
Por lo que a las bacterias endosimbiòticas anteriormente aisladas se les fue
realizado un análisis de los mecanismo de resistencia que pudiesen presentar
pero se reconoce de antemano que las pruebas confirmatorias de tipo fenotípica
pueden promover casos de falsos negativos o positivos, ya que dichas bacterias
pueden producir un gran número variado de betalactamasas o la presencia de
AmpC unido con BLEE, por lo que este tipo de pruebas tienden a tener cierta
deficiencia en cuanto la sensibilidad y especificidad y así quizás generando
resultados inconclusos107.
Por lo que Las pruebas fenotípicas para la detección de los tipos de resistencia
bacteriana varían en complejidad y costo. En este trabajo, se utilizó la técnica de
difusión en disco, lo cual nos permitió una identificación económica y sencilla de la
mayoría de las colonias aisladas de bacterias endosimbiòticas. De ahí entonces,
se acepta la hipótesis alterna planteada, dado que los resultados mostraron la
predominancia del método de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) con
un total de presencia en el 63% de las muestras de las bacterias endosimbiòticas
presentes dentro de las AVL.
71
Actualmente, no se han encontrado estudios relacionados a este trabajo utilizando
la tecnología MicroScan. Esta tecnología de MicroScan, presente en las
instalaciones de la UDES permite una identificación rápida y certera de las
muestras recolectadas lo que permite a este trabajo, confirmar los resultados
obtenidos en el segundo objetivo, donde se logra identificar bacterias poco
comunes como el Rhizobium radiobacter, que es poco común que afecte a
humanos, dado que es una bacteria fijadora de nitrógeno presente en el suelo 108 y
Ochrobactrum anthropi, ésta última, habiendo aumentado su interés, debido a su
fácil adherencia a materiales sintéticos y su resistencia natural a los
betalactámicos109
Las bacterias resistentes a antibióticos ya se encuentran en aguas potables y a
nivel ambiental esparcidas en diferentes partes del mundo, como lo muestran los
resultados obtenidos por Xi et al en sistemas de agua potable en Estados Unidos y
Lateef et al110 en diferentes ambientes en Nigeria del Sur. Estos estudios
encontraron que hay bacterias resistentes a diferentes clases de antibióticos, sin
importar la cantidad y calidad de los sistemas de recepción, tratamiento y
utilización del agua para consumo humano, como lo muestra también este estudio,
presentando un total de 3 tipos distintos de mecanismos de resistencia bacteriana
(BLEE, AMPCES y MRSA) ésta última siendo un mecanismo poco común en las
familias de bacterias halladas dentro de las AVL.
El origen de la resistencia bacteriana puede estar relacionado al uso de agentes
desinfectantes como el cloro, el cual es posible que incremente la expresión de la
resistencia tipo bomba de flujo. También, las bacterias pueden adquirir resistencia
a algunos antibióticos vía mutación espontánea o por la adquisición de genes
resistentes 111 La forma más común para la adquisición de estos genes, es la
transferencia genética horizontal, la cual se ha propuesto recientemente ser otro
contaminante más en ecosistemas acuáticos 112 Por ello, este trabajo, logra sentar
un precedente en ser el primero que pretende, no sólo encontrar que existe una
relación entre las AVL y las bacterias endosimbiòticas presentes en ellas, sino
también a qué mecanismos de resistencia bacteriana se encuentra en las
bacterias presentes dentro de las AVL en aguas de consumo humano en la
Ciudad de Cúcuta.
72
5. CONCLUSIÓNES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Mediante la investigación realizada y los resultados obtenidos se pudo determinar
la presencia de AVL y su proceso endosimbiòtica en agua de consumo humano en
las diferentes comunas de la ciudad de Cúcuta, observando diversos géneros
como; Acanthamoeba spp, Vermamoeba spp y Vahlkampfia spp en cuanto la
normatividad colombiana no contempla la presencia de AVL sino solo
determinación de coliformes totales y fecales. De esta relación se permitió
observar el crecimiento de bacterias patógenas que generan afectación directa al
ser humano provocando patologías como cuadros de diarrea generados por
E.coli, Salmonella Typhi, afectaciones respiratorias Klebsiella pneumoneae entre
otras manifestaciones
En cuanto al análisis fenotípico de los mecanismos de resistencia, se pudo
evidenciar que el mecanismo más común es el BLEE siendo de mayor
prevalencia, generando así una gran complejidad y problema de salud pública; a
causa del desarrollo de este tipo de resistencia por lo que genera una disminución
en cuanto a la opción de tratamiento de antibióticos de primera línea.
Finalmente, gracias a la tecnología semiatumatizada del MicroScan, la cual nos
permitió obtener la identificación bacteriana de aquellas bacterias de las cuales su
identificación fue más tediosa en cuanto pruebas bioquímicas como fue el caso
de Rhizobium radiobacter, Ochrobactrum antropi y también facilitando el análisis
de la sensibilidad a los antibióticos como fue el caso Staphylococcus coagulasa
negativa y Salmonella Typhi las cuales son reconocidas como patógenos para
humanos, logrando demostrar el rol activo de las AVL como fuentes de riesgo que
implica su presencia en el agua para el consumo de la población de Cúcuta.
.
5.2 RECOMENDACIONES
Se recomienda hacer énfasis en la necesidad de agregar parámetros de
detección, control y disminución de los niveles de AVL presentes en la
normatividad vigente respecto al agua de consumo que llega a las diferentes
comunas de la ciudad de Cúcuta (y del país), tratando así de minimizar la
exposición de pacientes inmunosuprimidos que puedan obtener enfermedades
73
potencialmente graves, no solo por acción de las AVL como tal, sino de también
las bacterias endosimbióticas presentes en ellas, que comúnmente, resultan más
peligrosas para la salud humana que las AVL.
Se recomienda, además, profundizar en el estudio de la presencia de AVL en
aguas de consumo humano en otras partes de la región y el país, para obtener
datos comparativos y llegar a tomar decisiones en establecer protocolos y
acciones enfocadas a la mitigación de la presencia de estos patógenos
potenciales y sus riesgos subsecuentes.
También, recomendar el uso de herramientas de análisis de resistencia bacteriana
más avanzadas y fiables, que permitan tener referencias locales, nacionales y
mundiales sobre los tipos de resistencia bacteriana presentes, y así efectuar
estudios más amplios en otros métodos de contrarrestar las crecientes y
alarmantes niveles de resistencia a amplia gama de antibióticos presentes en
bacterias, lo cual está creciendo como problema de salud pública a nivel mundial.
74
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86
ANEXOS
87
PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR
(POE)
PREPARACION DE SOLUCION SALINA DE NEFF`S MODIFICADA (PAS)
CODIGO: POEPAS -01 VERSION: 01 PAGINAS: 1
Anexo A. PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN SALINA DE NEFF`S MODIFICADA
(PAS)
1. OBJETIVO.
Establecer los lineamientos para la preparación de solución salina de NEFF`S modificada (PAS) la cual será utilizado para la preparación de agares no nutritivos y para uso de la transferencia de amebas crecidas en agar.
2. FUNDAMENTO.
La solución salina se utiliza de manera sistemática como diluyente para ajustar la turbidez de las suspensiones de células bacterianas y así mantener la integridad y viabilidad de las células. En este caso se utiliza para la preparación de agar no nutritivo y para la realización de repiques de las amebas de vida libre.
3. SEGURIDAD.
Se utilizara de forma constante las medidas de bioseguridad necesarias: bata desechable, guantes, tapabocas, gorro, lentes de protección; también se tendrá en cuenta la utilización de mechero, desinfección de mesón. 4. DEFINICIONES.
Amebas de vida libre: Las amebas de vida libre son numerosas y se
encuentran en la naturaleza, en medios como: agua, suelos y vegetación.
5. MATERIALES Y EQUIPOS.
Probeta de 1000 ml
Erlenmeyer 1000 ml
Autoclave
Estufa
Balanza
88
Papel kraft
Papel aluminio
Agitador de vidrio
Toalla de tela
Espátulas
Mechero de bunsen
Normas de bioseguridad
Cinta de enmascarar 6. REACTIVOS.
Agua Destilada
Na2HPO4 1.50g
KH2PO4 1.40g
NaCl 1.30g
MgSO4.7H2O 0.06g
CaCl2.2 H2O 0.06g 7. RESPONSABLES
Jessica liceth cárdenas ortega
Yenny Paola solano Escalante
8. DURACIÓN.
4 horas.
9. PROCEDIMIENTO.
9.1 Preparación de la solución de PAS
Utilización de normas de bioseguridad
Limpieza, desinfección de mesón y material a utilizar
Agregar en un erlenmeyer 1000ml de agua destilada.
Pesar NaCl 1.20g, MgSO4.7H2O 0.04g, CaCl2.2 H2O 0.04g, Na2HPO4 1.42g, KH2PO4 1.36g y adicionarlos al erlenmeyer.
Agitar para homogenizar.
Calentar en la estufa hasta hervir.
Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Tapar con un trozo de papel aluminio.
Marcar con nombre y fecha de la preparación.
Llevar a esterilización en autoclave por dos horas.
Guardar en la nevera a 6°C.
10. CONTROL DE CALIDAD
89
Adicionar una gota entre lámina y laminilla y observar al microscopio para confirmar la esterilidad de la solución.
Adicionar solución de PAS en un vial estéril, incubar a 37 °C por 72 horas. La presencia o ausencia de turbidez determinara la esterilidad de la solución.
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90
PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR
(POE)
PROCESO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
CODIGO: POEFM -02 VERSION: 01 PAGINAS: 1
Anexo B. FILTRACIÓN POR MEMBRANA
1. OBJETIVO.
Establecer los lineamientos para el procedimiento de filtración por membrana utilizado para la filtración de muestras de agua obtenidas de las 10 comunas que conforman la ciudad de Cúcuta.
2. FUNDAMENTO.
La técnica de filtración por membrana se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos problemas. En esta técnica se utilizan membranas con un tamaño de poro de 0.45 micras ya que la mayoría de los microorganismos tienen un tamaño superior (diámetro).este es un método altamente reproducible, para el análisis de volúmenes de muestras relativamente grandes. 3. SEGURIDAD. De forma constante se debe usar las medidas de bioseguridad necesarias: bata desechable, guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro. Junto con los procesos de limpieza y desinfección
4. DEFINICIONES.
Filtración: Se denomina filtración al proceso unitario donde se posibilita la separación de sustancia solidas de dicha suspensión atreves de un material mecánico poroso, también llamados tamiz, criba, cedazo o filtro.
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Amebas de vida libre: Las amebas de vida libre se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, siendo multitud las especies aisladas de la tierra, aire, aguas tratadas para consumo, agua de mar o lagos de aguas termales.
5. MATERIALES Y EQUIPOS.
Equipo de filtración
Pinzas
Micropipeta de 100-1000ul
Mechero de bunsen
Membrana de 0.45ul
Papel absorbente
Baja lenguas
Puntas
Tubos colectores tapa azul de 14ml
Cajas de Petri
6. REACTIVOS
Muestras de agua de las 10 comunas de la ciudad de Cúcuta
Solución de PAS
7. RESPONSABLES
Jessica liceth cárdenas ortega
Yenny Paola solano Escalante
8. DURACIÓN.
4 horas.
9. PROCEDIMIENTO.
Utilización de normas de bioseguridad
Limpieza, desinfección de mesón y material a utilizar
Limpiar con alcohol la superficie de la porta filtros.
Colocar un filtro de membrana (0,45um) sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas de acero previamente flameadas con mechero.
Situar un embudo sobre el soporte de forma que se encuentre fijo y seguro
Verter la muestra de agua problema en el embudo (100ml) y aplicar el vacío hasta que el líquido se haya filtrado.
Debido a la gran cantidad de sedimento, agitar la muestra con una baja lengua para que sea más rápida la filtración.
Con las pinzas previamente flameadas con las que se extrae el filtro del soporte.
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Se coloca el filtro dentro de un tubo colector de 45ml con 1 ml de muestra de solución de PAS
Agitar hasta de desprender el sedimento de la membrana.
Extraer el filtro y llevar a centrifugación las muestras (3500 rpm por 15 min).
Eliminar el sobrenadante y sembrar 300ul de sedimento en el agar bacto agar.
10. BIBLIOGRAFIA
Fernández M. Caracterización molecular de Amebas de Vida Libre e identificación de otros parásitos en aguas de red de la provincia de Zaragoza: asociación con otros microorganismos y riesgos para la Salud Pública. Tesis doctoral. Universidad De Zaragoza;2015
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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR
(POE)
PREPARACION DE AGAR NO NUTRITIVO
CODIGO: POEANN -03 VERSION: 01 PAGINAS: 1
Anexo C. PREPARACION DE AGAR NO NUTRITIVO
1. OBJETIVO.
Establecer los lineamientos para la preparación de agar no nutritivo utilizado para el aislamiento de amebas de vida libre a partir de muestras de agua obtenidas de las 10 comunas que conforman la ciudad de Cúcuta.
2. FUNDAMENTO.
Por sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco
exigentes en cuanto su bajo requerimiento nutricional. No contiene inhibidores del
desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el
desarrollo de microorganismos. Como requerimiento adicional de las amebas de
vida libre, se agrega una base de Escherichia coli ATCC 25922 inactivada al
medio de cultivo.
3. SEGURIDAD.
De forma constante se debe usar las medidas de bioseguridad necesarias: bata desechable, guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro. Junto con los procesos de limpieza y desinfección 4. DEFINICIONES. Amebas de vida libre: Las amebas de vida libre se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, siendo multitud las especies aisladas de la tierra, aire, aguas tratadas para consumo, agua de mar o lagos de aguas termales. Pluripeptona: La pluripeptona (es una mezcla en partes iguales de peptona de carne y peptona de caseína) es la fuente de nutrientes para el desarrollo de microorganismos, el almidón soluble absorbe sustancias tóxicas indeseables para
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el desarrollo de ciertos microorganismos, las sales de fosfato forman un sistema buffer y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. 5. MATERIALES Y EQUIPOS.
Probeta de 1000 ml
Erlenmeyer 1000 ml
Estufa
Balanza
Papel aluminio
Espátulas
Guantes de látex
Mechero
Cabina de seguridad
Cajas de Petri 20 ml
Papel kraft
Cinta de enmascara
Asa de hockey
Fósforos
Papel absorbente
Toalla de tela
autoclave.
Cepa de Escherichia coli ATCC 25922
Agar bacto agar BD
Agitador de vidrio
6. REACTIVOS.
Agua Destilada
Solución de PAS
Alcohol 70% en recipiente spray
7. RESPONSABLES
Jessica Liceth cárdenas ortega
Yenny paola solano Escalante
8. DURACIÓN.
3 horas.
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9. PROCEDIMIENTO.
9.1 Preparación del agar no nutritivo
Utilización de normas de bioseguridad
Limpieza, desinfección de mesón y material a utilizar
Medir 900ml de agua destilada y 100ml de solución de PAS, pesar 15g de agar no nutritivo y adicionar todo en un Erlenmeyer de 1000ml.
Agitar para homogenizar la mezcla.
En la estufa calentar hasta hervir.
Separar los 1000ml de agar en dos erlenmeyer
Llevar al autoclave por 2 horas
9.2 Distribución del agar no nutritivo
Pasada las dos horas esperar que se enfrié el agar hasta 55°C aproximadamente.
Agregar 25 ml de agar en cada caja de Petri.
Esperar a que se solidifiquen los medios.
9.3 Suplemento del agar no nutritivo
Mientras el medio de cultivo está en esterilización, preparar la Escherichia coli inactivada.
Calcular la cantidad de cajas a servir para saber el volumen de Escherichia coli a inactivar (tener en cuenta que son 300ul por cada caja).
Después de medir el volumen de solución salina a necesitar, inocular cepa de Escherichia coli ATCC 25922 hasta lograr una concentración de 0,5 escala McFarland.
Adicionar agua en un vaso de precipitado y poner en la estufa a calentar hasta lograr una temperatura de 60 °C (supervisar constantemente con la ayuda de un termómetro la temperatura del agua hasta lograr la temperatura deseada).
Al estar la temperatura del agua a 60 °C sumergir el tubo con la suspensión de Escherichia coli.
Ya inactivada adicionar 300ul de la suspensión en cada medio de cultivo y distribuir uniformemente con un asa de hockey la Escherichia coli en el medio.
Embalar con cinta tirro, marcar con nombre y fecha de preparación y guardar a 6°C.
10. CONTROL DE CALIDAD
Incubar una de las cajas a 37°C por 24 h y observar crecimiento de
microorganismos en el medio.
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NOTA: en el caso de necesitar menos de un litro, calcular mediante regla de tres
la cantidad de medio a requerir dependiendo de la necesidad de cajas de Petri a
preparar.
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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR
(POE)
PRUEBAS FENOTÍPICAS DIFUSIÓN EN DISCO
CODIGO: POEPAS -01 VERSION: 01 PAGINAS: 1
Anexo D. PRUEBAS FENOTÍPICAS DIFUSIÓN EN DISCO
1. OBJETIVO
Determinar la producción de mecanismos fenotípicos de resistencia en cultivos bacterianos
2. FUNDAMENTO
Las pruebas fenotípicas de difusión usan discos de papel impregnados con una
solución estandarizada de antibiótico que se disponen sobre la superficie de un
medio sólido previamente inoculado en el área con una suspensión bacteriana.
Tras un tiempo de incubación, el diámetro del halo formado está en relación con el
grado de sensibilidad del microorganismo. La interpretación de la prueba está
basada en la correlación entre el diámetro de la zona de inhibición (mm) con la
CIM (µg/mL) para cada antimicrobiano y microorganismo.
3. SEGURIDAD
Se utilizarán todas las normas de bioseguridad estipuladas en el laboratorio para
la realización del procedimiento
4. DEFINICIONES
BLEE: Betalactamasas de espectro extendido, que tienen capacidad de hidrolizar
y causar resistencia a penicilinas, cefalosporinas (cefotaxima, ceftriaxona,
ceftazidima, cefepima) y monobactámicos (aztreonam), siendo inhibidas por el
ácido clavulánico.
KPC: Klebsiella pneumoniae carbapenemasa, hidrolizan de forma eficiente
penicilinas, carbapenicos, cefalosporinas, no se inhiben por el ácido clavulànico,
pero si por el ácido Borico.
MBL: Metalobelactamasas
AMPCES: Hidroliza a cefalosporinas de 3ra generación e Inhibidores de
Betalactamasas
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Kirby Bauer: Empleado para determinar la sensibilidad de un agente microbiano
frente a un antibiótico o quimioterápico.
5. MATERIALES Y EQUIPOS
Guantes
Bata
Gorros
Tapabocas
Mechero
Asa
Hisopos estériles
Incubadora
Agar Mueller-Hilton
Sensidiscos
6. RESPONSABLES
Jessica Liceth cárdenas ortega
Yenny paola solano Escalante
7. DURACIÓN
1 hora
8. PROCEDIMIENTO
Se debe tomar una asada del cultivo bacteriano previamente sembrado en
Agar Mac Conkey
Junto al mechero, se debe preparar una solución McFarland al 0.5
Impregne un escobillón y siembre de forma masiva en agar Mueller-Hilton
Test confirmatorio Ácido clavulánico
Flamear las pinzas y colocar los 4 sensidiscos de (Cefotaxime, Ceftazidime,
Cefotaxime con Ác. Clavulánico y Ceftazidime con Ác. Clavulánico).
Prueba de disco con ácido boronico
Flamear las pinzas y colocar los 3 sensidiscos de (ertapenen , ácido
boronico,meropenen).
Test de sinergia con EDTA
Flamear las pinzas y colocar los 3 sensidiscos de (imipenen, EDTA,
meropenen).
Sinergia de doble disco
Flamear las pinzas y colocar los sensidiscos de (ácido fenil-borónico y
cefotaxima, ceftazidima)
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Incubar en posición horizontal por 24h a 37°C
Observar
Anexo E. EVIDENCIAS FOTOGRÁFICAS
Quistes de Acanthamoeba spp
Quiste de vahlkampfia spp
Quiste de Vermamoeba spp
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Filtracion
Prueba Fenotipica
Técnica de MicroScan
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Anexo F. MICROSCAN
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