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M. C. de Productos Naturales y Alimentos
Análisis Químico Cuantitativo
Conceptos de Cromatografía
Dr. Raúl Salas Coronado
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Diciembre de 2012; Huajuapan de León, Oaxaca
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El proceso cromatográfico básico se describe como sigue:
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1. Un tubo de vidrio hueco vertical (la columna) se llena con un sólido en polvo adecuado, la fase estacionaria.
2. En la parte superior de la columna se coloca un volumen pequeño de la muestra a ser separada en sus componentes individuales.
a) Los ingredientes necesarios (C columna, SP, fase estacionaria; MP, fase móvil; y S, muestra); b) Introducción de la muestra; c) inicio de la elución; d) recuperación de los productos.
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3. La muestra se desplaza a través de la columna por la adición continua de la fase móvil, la cual viaja a través de la columna por gravedad, transportando los diversos constituyentes de la mezcla. Este proceso se llama elución. Si los componentes migran a diferentes velocidades, éstos se separarán y se podrán recuperar de la fase móvil.
Generalidades
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(a) Tiempo de retención (b) Curva gaussiana con = 20 y = 1
(c) Características de una curva gaussiana normal
Comparación entre un cromatograma verdadero y picos con forma gaussiana
normal
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a = Factor de sesgo TF = Factor de cola
La asimetría observada de un pico se mide con dos parámetros, el factor de sesgo (a) medido a un 10 % de su altura y el factor de cola (TF) medido al 5 % .
Resolución
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Una medida de la eficiencia de una columna es la resolución, Rs. Al igual que
en otras técnicas analíticas, el término resolución se usa para expresar el grado
con el que los picos adyacentes están separados. Para cromatografía, la
definición es:
• Donde d es la distancia entre los picos para dos solutos, A y B. En la Figura se muestra la manera en la que la resolución se calcula. Las tangentes se trazan en los puntos de inflexión para calcular las amplitudes de los picos en sus bases. Normalmente, los picos adyacentes de igual área tendrán la misma amplitud de picos. Consecuentemente la ecuación anterior se reduce a:
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En un análisis cromatográfico de aceite de limón un pico asignado al limoneno tiene un tiempo de retención de 8.36 min con una amplitud de línea base de 0.96 min. El -terpineno eluye a 9.54 min, con una amplitud de línea base de 0.64 min. ¿Cuál es la resolución entre los dos picos? Solución
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Existen dos métodos para mejorar la resolución cromatográfica de a) separación original mostrando un par de solutos pobremente resueltos: b) Mejora la resolución por un incremento en la eficacia de la columna. c) Mejora la resolución por un cambio en la selectividad de la columna.
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Factor de capacidad
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La distribución de un soluto, S, entre la fase móvil y la fase estacionaria se puede
representar por una reacción en equilibrio
y su coeficiente de reparto, KD, y su relación de distribución, D,
La conservación de masa requiere que los moles totales de un soluto se
conserven constante durante la separación, así:
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Donde Vm y Vs son los volúmenes de las fases móvil y estacionaria. Rearreglando y
resolviendo para la fracción de soluto en la fase móvil, fm, se obtiene:
Donde:
Es el factor de capacidad del soluto.
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El factor de capacidad de un soluto se puede determinar a partir de un cromatograma
midiendo el tiempo muerto de la columna, tm, y el tiempo de retención del soluto, tr.
La velocidad lineal media de la fase móvil, u, es igual a la longitud de la columna, L,
dividida entre el tiempo necesario para que eluya el soluto no retenido, tm
Utilizando el mismo razonamiento, la velocidad lineal media del soluto, v, es:
El soluto puede moverse solamente a través de la columna cuando este está en la fase
móvil. Su velocidad lineal promedio, consecuentemente, es simplemente el producto
de la velocidad promedio de la fase móvil y la fracción de soluto presente en la fase
móvil.
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Sustituyendo en:
Se obtiene:
Finalmente, resolviendo esta ecuación para k’ produce:
Donde tr’ se conoce como el tiempo de retención ajustado.
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En un análisis cromatográfico de ácidos de bajo peso molecular, el ácido
butírico eluye con un tiempo de retención de 7.63 min. El tiempo muerto de la
columna es de 0.31 min. Calcule el factor de capacidad del ácido butírico.
Solución
Selectividad de la columna
La selectividad relativa de una columna cromatográfica para un par de solutos
viene dada por el factor de selectividad, , que se define como:
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Las identidades de los solutos se definen de forma que el soluto A es siempre
el que tiene un tiempo de retención más corto. Por tanto el factor de
selectividad es igual a 1 cuando los tiempos de retención de los solutos son
idénticos.
En el mismo análisis cromatográfico de ácidos de bajo peso molecular considerado en el ejemplo anterior, el tiempo de retención del ácido isobutírico es 5.98 min. ¿Cuál es el factor de selectividad para los ácidos isobutírico y butírico?
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El factor de capacidad, también se conoce factor de retención y es una
medida de la fortaleza con que la fase estacionaria retiene un soluto dado.
El factor de selectividad también se conoce como
Eficiencia de la columna
Al iniciar una separación cromatográfica, el soluto ocupa una banda estrecha de anchura finita. A medida que el soluto atraviesa la columna, la anchura de la banda se incrementa de manera continua, en un proceso de ensanchamiento de banda. La eficiencia de la columna proporciona una medida de ese ensanchamiento.
Martin y Synge propusieron un modelo teórico que considera a la columna constituida por secciones, a las que llamaron platos teóricos.
𝑁 =𝐿
𝐻
N = número de platos teóricos
H = altura de los platos
L = Longitud de la columna
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Dispersión de un soluto en una columna y su
traslado a un cromatograma
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Admitiendo un perfil gaussiano, la magnitud del ensanchamiento de banda se
mide por la varianza o la desviación estándar de un pico cromatográfico. La
altura de un plato teórico se define como:
Donde la varianza, 2, tiene unidades de distancia al cuadrado.
Debido a que el tiempo de retención y la amplitud del pico se miden en
segundos o minutos, es más conveniente expresar la desviación estándar en
unidades de tiempo, , dividiendo entre la velocidad lineal de la fase móvil.
Cuando un pico tiene forma gaussiana, su amplitud en la línea base, w, es
cuatro veces la desviación estándar, .
w = 4
Combinando las ecuaciones anteriores se obtiene:
Consecuentemente el número de platos teóricos de una columna cromatográfica:
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𝑁 = 16𝑡𝑟
𝑤
2 = 5.545
𝑡𝑟
𝑤1/2
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Un análisis cromatográfico del pesticida clorado Dieldrin proporciona un pico con un
tiempo de retención de 8.68 min y una ancho de pico en la base de 0.29 min. ¿Cuántos
platos teóricos intervienen en la separación? Dado que la longitud de la columna
utilizada para este análisis es de 2.0 m, ¿Qué altura tiene un plato teórico?
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Número de platos efectivos (Eficiencia real)
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h = altura ajustada del plato dm = diámetro promedio de partícula
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Capacidad de picos
La capacidad de pico, nc, es el número máximo de solutos que pueden
separarse en una columna determinada.
Donde Vmin y Vmax son los volúmenes menor y mayor de la fase móvil en que
un soluto puede eluir y ser detectado. Por ejemplo una columna con 10,000
platos teóricos no puede separar más de :
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Optimización de las separaciones
cromatográficas
• Una vez definido el factor de capacidad, la selectividad y la eficacia de la
columna, se puede considerar su relación con la resolución.
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𝑁 = 16𝑡𝑟
𝑤
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Uso del factor de capacidad para optimizar la
resolución
Una de las formas más sencillas de
mejorar la resolución consiste en
ajustar el factor de capacidad para
el soluto B.
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Cualquier mejora de la resolución obtenida aumentando k’B suele hacerse a expensas de una prolongación del tiempo del análisis.
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En GC se puede llevar a cabo con una programación de temperatura. En HPLC se logra por una elución en gradiente.
Uso de la selectividad de la columna para
optimizar la resolución
Una segunda forma de mejorar la resolución consiste en ajustar .
Cuando = 1, la resolución no se puede mejorar ajustando k’B o N.
Los cambios de son posibles si las condiciones cromatográficas se alteran de
una forma más selectiva para uno de los solutos.
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Uso de la eficacia de la columna para
optimizar la resolución
Cuando se conocen el factor de capacidad y , el cálculo del número de platos
teóricos necesarios para alcanzar la resolución deseada puede hacerse
empleando la ecuación:
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Por ejemplo, con = 1.05 y k’B = 2.0, una resolución de 1.25 requiere N = ¿?
Revisar tabla de la diapositiva anterior. Si la columna solo tiene la mitad del
número de platos calculados (N), ¿Cómo puede duplicarse ese valor?
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Para determinar la forma de reducir la altura del plato teórico es necesario
conocer los factores experimentales que contribuyen al ensanchamiento de la
banda cromatográfica de un soluto.
De manera general se aceptan cuatro contribuciones:
1. La difusión en remolino
2. La difusión longitudinal
3. La transferencia de masa en la fase estacionaria
4. La transferencia de masa en la fase móvil
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Uso de la eficacia de la columna para optimizar la
resolución mediante la modificación de H
Difusión en remolino
Las moléculas en disolución que atraviesan una columna cromatográfica
siguen remolinos distintos de longitud variada.
La contribución de la difusión de remolina a la altura del plato teórico, Hp, es:
Donde dp = es el diámetro medio de las partículas del material de relleno.
= constante que representa la homogeneidad del empaquetado.
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Difusión longitudinal
Una contribución al ensanchamiento de la banda debida a la difusión del soluto desde las áreas de mayor concentración a las de menor concentración.
Contribución de la difusión longitudinal, Hd, a la altura de un plato teórico.
Dm = coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil
u = velocidad de la fase móvil
= Constante relacionada con el empaquetamiento de la columna
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Transferencia de masa
Las dos últimas contribuciones al ensanchamiento de la banda dependen del tiempo finito necesario para que una molécula de soluto difunda por la fase estacionaria y la fase móvil.
Donde:
df = grosor de la fase estacionaria
dc = diámetro de la columna
Ds = coeficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria
Dm = coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil
q = constante relacionada con el material empaquetado en la columna
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Reunión de todos los parámetros anteriores
La altura neta de un plato teórico es el resultado de la suma de las
contribuciones de cada uno de los términos anteriormente descritos.
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Ecuación de van Deemter
Ecuación basada en una distribución Gaussiana que relaciona a la altura de los
platos teóricos, H, con la velocidad lineal promedio de la fase móvil, 𝑢 . Esta
ecuación identifica tres efectos que contribuyen al ensanchamiento de la banda
en columnas empacadas; la difusión de remolino (término A), la difusión
molecular longitudinal (el término B) y la transferencia de masa en la fase
estacionaria (el término C).
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Curva de van Deemter en cromatografía de gases con los dominios de los
parámetros A, B y C indicados. Existe una ecuación similar a la de van
Deemter que considera la temperatura: H = A + B/T + CT.
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Cálculo de los coeficientes A, B y C
En la práctica, los valores para los coeficientes A, B y C de la ecuación de van
Deemter se pueden obtener a partir de varias mediciones de la eficiencia para
el mismo compuesto a diferentes velocidades de flujo, debido a que l flujo y la
velocidad lineal están relacionadas. Después la función hiperbólica que mejor
satisface los valores experimentales se calcula usando, preferentemente, el
método de regresión lineal.
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In general, a low diffusion coefficient (B) can be achieved by using carrier gases with
larger molecular weights like nitrogen or argon. This term is divided by the linear
velocity, so a large velocity or flow rate will also minimize the contribution of the B term
to the overall peak broadening. That is, a high velocity will decrease the time a solute
spends in the column and thus decrease the time available for molecular diffusion.
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