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ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-DAD, EN EXTRACTOS ACETONICOS DE LAS ESPECIES Gnaphalium Elegans, Achyrocline
Satureioides Y Achyrocline Bogotensis
FABIÁN RICARDO LADINO TORRES LIZETH JHOANNA LÓPEZ CARRILLO
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y APLICADAS U.D.C.A
FACULTAD DE QUÍMICA BOGOTÁ D.C
2016
ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-DAD, EN EXTRACTOS ACETONICOS DE LAS ESPECIES Gnaphalium Elegans, Achyrocline
Satureioides Y Achyrocline Bogotensis
FABIÁN RICARDO LADINO TORRES
LIZETH JHOANNA LÓPEZ CARRILLO
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Químico
SERGIO ANDREI CUERVO ESCOBAR.
Químico UN, Ph.D.
Director
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y APLICADAS U.D.C.A FACULTAD DE QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2016
Nota de Aceptación
4. 2
Jorge Emilio Parra Emín
Jurado
Ruben Dario Torrenegra
Jurado
Bogotá D.C, 2016
DEDICATORIA
A Dios por danos la sabiduría
para desarrollar este proyecto y a nuestras familias por apoyarnos durante estos meses.
AGRADECIMIENTOS Agradecemos al profesor Sergio Andrei Cuervo, por brindar su confianza y apoyo
en la elaboración del proyecto.
A los docentes Rubén Torrenegra y Jeanet Rodíguez por permitirnos trabajar en su grupo de investigación y por su acompañamiento en el laboratorio de fitoquímica.
A la UDCA y la universidad de la Sabana por prestar sus laboratorios,
instrumentos y herramientas en la fase experimental. A nuestros familiares y amigos, en especial a nuestros padres, hermanos, quienes
nos acompañaron en todo el proceso, brindándonos apoyo, paciencia durante el tiempo trabajado.
Tabla de contenido
1 INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 2
2.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 2
2.2 OBJETIVO ESPECIFICOS. ....................................................................................... 2
3 MARCO REFERENCIAL............................................................................................ 3
3.1 GENERALIDADES SOBRE LA FAMILIA Asteraceae ........................................... 3 3.2 GENERALIDADES SOBRE LOS GÉNEROS Gnaphalium y Achyrocline ......... 3 3.3 GENERALIDADES SOBRE ESPECIES Gnaphalium elegans, Achyrocline
bogotensis y Achyrocline satureioides ............................................................................. 3 3.3.1 Especie Gnaphalium elegans ............................................................................ 3
3.3.2 Especie Achyrocline bogotensis ........................................................................ 4 3.4 ANTECEDENTES ........................................................................................................ 5
3.4.1 Flavonoides ........................................................................................................... 6
3.4.2 Perfiles cromatográficos en fitoquímica (huellas dactilares)......................... 9
4 METODOLOGIA ........................................................................................................10
4.1 REACTIVOS ...............................................................................................................10 4.2 RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL MATERIAl. .........................................10 4.3 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS DE HOJA Y FLOR POR SOXHLET CON
ACETONA. ..........................................................................................................................11 4.4 ANÁLISIS POR HPLC-DAD. ....................................................................................12 4.5 PREPARACIÓN DE PATRONES Y MUESTRAS ................................................13
5 RESULTADOS Y DISCUSION................................................................................13
5.1 DESARROLLO DE LA METODOLOGÍA POR HPLC-DAD ................................13
5.2 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES POR HPLC .....23 5.2.1 Curva de Calibración a bajas concentraciones.............................................23 5.2.2 Cuantificación de las señales obtenidas. .......................................................24
5.2.3 Análisis estadístico. ...........................................................................................25 5.3 PERFILES CROMATOGRÁFICOS DE LOS EXTRACTOS DE A.
SATUREIOIDES, A. BOGOTENSIS Y G. ELEGANS ..................................................27 5.4 COMPARACIÓN DE PERFILES DENTRO DE LA ESPECIE (REPLICAS) Y ENTRE ESPECIES............................................................................................................31
5.4.1 Comparación de replicas ..................................................................................31 5.5 DIFERENCIAS Y SEMEJANZAS ENTRE ESPECIES ........................................32
5.5.1 Extractos de flor. ................................................................................................32 5.5.2 Extractos de hoja. ..............................................................................................33
6 CONCLUSIONES ......................................................................................................34
7 RECOMENDACIONES .............................................................................................35
8 BIBLIOGRAFIA .........................................................................................................36
9 ANEXOS .....................................................................................................................40
LISTA DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1. Especie Gnaphalium Elegans. ____________________________________ 3
Ilustración 2. Especie Achyrocline bogotensis. __________________________________ 4
Ilustración 3. Especie Achyrocline Satureioides. _________________________________ 4
Ilustración 4. Estructura general de un flavonoide. Fuente [39] _____________________ 6
Ilustración 5. Clasificación de Flavonoides. Fuente [18 ] __________________________ 7
Ilustración 6.Figuras de recolección y separación para las especies A. Satureioides, A Bogotensis, G.Elegans. (Fuente Autores) _____________________________________ 11
Ilustración 7. Extracto concentrado especies G. Elegans. ________________________ 11
Ilustración 8.Perfil cromatográfico primer gradiente, obtenido a partir del primer ensayo de gradiente. (Fuente autores) ________________________________________________ 14
Ilustración 9. Perfil Cromatográfico, obtenido a partir del segundo ensayo de gradiente. 15
Ilustración 10. Perfil cromatográfico de los patrones trabajados. Las condiciones _____ 15
Ilustración 11. Comparación de espectros UV, patrón de Catequina. _______________ 17
Ilustración 12. Comparación de espectros UV, patrón de Rutina ___________________ 17
Ilustración 13. Comparación de espectros UV, patrón de Rutina. __________________ 18
Ilustración 14. Comparación de espectros UV, patrón de 5,7-dihidroxiflavanona. ______ 18
Ilustración 15. Comparación de espectros UV, 3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonona. ______ 19
Ilustración 16. Comparación de espectros UV, 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona. ____ 19
Ilustración 17. Comparación de espectros UV, 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona. ____ 20
Ilustración 18. Espectro UV de la señal correspondientes al TR 57,34 min (Rutina), para flor de G.elegans. Fuente: Autores __________________________________________ 21
Ilustración 19. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 68, 02 min (Quercetina), para hoja de A.satureioides. Fuente: Autores __________________________________ 21
Ilustración 20. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 87,3 min (5,7-dihidroxiflavanona), para flor de G.elegans. Fuente: Autores ______________________ 22
Ilustración 21. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 88, 34 min (3,5-dihidroxi-7-metoxiflavanona), para flor de A.satureioides. Fuente: Autores ____________________ 22
Ilustración 22. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 91,20 min (3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona), para hoja de A.bogotensis. Fuente: Autores ________________ 23
Ilustración 23. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 93,40 min (3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona), para flor de G.elegans. Fuente: Autores ___________________ 23
Ilustración 24. Curva de calibración a bajas concentraciones de Catequina __________ 24
Ilustración 25. Comparación del contenido en mg/100g de Rutina en hoja y flor, para las especies G. elegans y A. satureiodes ________________________________________ 26
Ilustración 26. Comparación del contenido en mg/100g de Quercetina en hoja y flor, parlas especies G. elegans, A. satureiodes y A. bogotensis.____________________________ 26
Ilustración 27. Comparación del contenido en mg/100g de Quercetina en hoja y flor, para las especies G. elegans, A. satureiodes y A. bogotensis. _________________________ 27
Ilustración 28. Comparación del contenido en mg/100g de Quercetina en hoja y flor, para las especies G. elegans, A. satureiodes y A. bogotensis. _________________________ 27
Ilustración 29. Cromatográma representativo de extracto de A. satureiodes hoja. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología ________ 28
Ilustración 30. Cromatográma representativo de extracto de A. satureiodes flor. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología. ________ 29
Ilustración 31..Cromatográma representativo de extracto de hoja A. bogotensis. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología ________ 29
Ilustración 32.Cromatográma representativo de extracto de flor A. bogotensis. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología ________ 30
Ilustración 33. Cromatográma representativo de extracto de hoja G.elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología. ________ 30
Ilustración 34.Cromatográma representativo de extracto de flor G.elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología ________ 31
Ilustración 35. Cromatográma representativo réplicas de hoja A. satureiodes. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología. ________ 31
Ilustración 36. Cromatográma representativo réplicas de hoja G. Elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología. __________________ 32
Ilustración 37 . Cromatográma comparativo extractos de flor G.elegans, A.satureioides y A.bogotenis Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología ____________________________________________________________ 33
Ilustración 38.Cromatográma comparativo extractos de hoja A. Satureioides, A Bogotensis y G. Elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología ____________________________________________________________ 34
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica (Herbario Nacional de Colombia) Fuente [15] __5
Tabla 2.Flavonoides Aislados de las especies G. elegans, A. Bogotensis, A. Satureioides y propiedades. Fuente [33] ________________________________6
Tabla 3. Nombres y estructuras de flavonoides trabajados en el proyecto _______9
Tabla 4 . Patrones de Flavonoides empleados en el estudio ________________16
Tabla 5. Contenido de flavonoides en los extractos cetónicos para las especies estudiadas (mg/100g). Los valores se reportan como el promedio ± la desviación estándar de tres experimentos independientes.Los valores reportados son la
media ± la desviación estándar SD de tres experimentos diferentes. ( Fuente: Autores ). _______________________________________________________25
1
ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-DAD, EN EXTRACTOS ACETONICOS DE LAS ESPECIES Gnaphalium elegans, Achyrocline
satureioides y Achyrocline bogotensis
1 INTRODUCCIÓN
El estudio científico de las plantas ha sido llevado a cabo por dos grandes ramas de la ciencia: la química y la biología, la biología se ha centralizado en el estudio taxonómico y morfológico de las plantas, mientras que la química, se ha
encargado del estudio de los compuestos químicos sintetizados por las plantas; los cuales son responsables de todos los procesos metabólicos de las mismas, así
como de las propiedades medicinales características de algunas de las especies existentes en el planeta.
El consumo directo o en forma de infusiones de algunas especies de plantas ha sido usado tradicionalmente por la “medicina” popular, quien le ha atribuido
“poderes curativos” a muchas de estas preparaciones. Hoy en día, y gracias a la experimentación en fitoquímica, se ha demostrado científicamente la actividad terapéutica de muchos extractos para diversas dolencias e incluso se ha
demostrado su utilidad en términos de protección y prevención de enfermedades. Las investigaciones en este campo han mostrado que las diferentes actividades
biológicas, a nivel terapéutico y/o protectivo, son debidas a un conjunto de metabolitos presentes en las plantas que han sido aislados y caracterizados en los últimos años. La identificación de especies vegetales promisorias y el aislamiento
de sus metabolitos responsables sigue siendo un campo de investigación en aumento, que demanda, cada vez más, herramientas que permitan acelerar dichas investigaciones, aprovechando al máximo los recursos disponibles y
asegurando una sostenibilidad ambiental.
Dentro de las especies que han sido identificadas con potenciales aplicaciones terapéuticas se encuentra Gnaphalium elegans, Achyrocline satureioides y Achyrocline bogotensis las cuales fueron objeto de estudio en esta investigación y
a partir de las cuales se desarrolló una metodología por HPLC-DAD que permitiera la identificación y cuantificación de algunos flavonoides en extractos acetónicos de
hoja y flor para las especies mencionadas. A partir del desarrollo de esta metodología también se obtuvieron perfiles cromatográficos característicos de cada una de estas especies, de donde se llevó a cabo un análisis para establecer
semejanzas y diferencias entre dichas especies.
2
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Realizar un estudio cromatográfico por HPLC-DAD, de los extractos acetonicos de
flor y hoja en las especies Gnaphalium elegans, Achyrocline satureioides y Achyrocline bogotensis.
2.2 OBJETIVO ESPECIFICOS.
Desarrollar una metodología analítica por HPLC, que permita la
identificación y cuantificación, de algunos flavonoides en extractos acetonicos de flor y hoja en las especies Gnaphalium elegans, Achyrocline
satureioides y Achyrocline bogotensis.
A partir de la metodología anterior, obtener los perfiles cromatográficos
característicos para los extractos acetonicos en las especies Gnaphalium elegans, Achyrocline satureioides y Achyrocline bogotensis.
Establecer diferencias y semejanzas en los patrones de elución
cromatográficos y en los contenidos de flavonoides, de los extractos de las distintas especies estudiadas.
3
3 MARCO REFERENCIAL
3.1 GENERALIDADES SOBRE LA FAMILIA Asteraceae
El botánico Francés Alexander Henri Gabriel de Cassini en 1816 utilizó por
primera vez el término Synanthereae, que hacía referencia a la familia de las compuestas - Asteraceaes. La familia Asteraceae está distribuida por todos los
continentes, exceptuando la Antártida; se han desarrollado especialmente en la región Andina y diversificando sus géneros dependiendo de la zona (neotropicales y templadas).[4, 11]. Dentro de esta familia se encuentra gran cantidad de plantas
vasculares, las cuales están compuestas por cerca de 23000 especies y alrededor de 1500 géneros [12]. En Colombia se reporta por el SIB 178 géneros [27] y por el
Herbario nacional aproximadamente 1945 especies [15].
3.2 GENERALIDADES SOBRE LOS GÉNEROS Gnaphalium y Achyrocline
Las plantas de los géneros Gnaphalium y Achyrocline, son conocidas
popularmente como vira-vira en la región Andina de América del Sur. Se conocen en Colombia a plantas del género Gnaphalium como don Alonso o lechuguilla y a plantas del género Achyrocline como Marcela [5, 29].
Los géneros Gnaphalium y Achyrocline se presenta en diversos climas extendiéndose por América del Sur y Centro, África tropical y zonas montañosas
de la Isla de Madagascar. Son plantas anuales o semestrales que crecen entre 2000 y 3000 metros sobre el nivel del mar, a una altura de 1,5 metros [17, 34, 35,
36 ]. En Colombia se han registrado plantas pertenecientes al género Gnaphalium, en las regiones de Antioquia, Caldas, Cundinamarca, Magdalena, Meta, Nariño, Tolima, Valle, Putumayo y en Bogotá que se encuentra distribuido en zonas de
llanura que comprendan 2500-2700 metros de altura; para el género Achyrocline se han distribuido en zonas de Boyacá Cundinamarca, Choco y Magdalena.
3.3 GENERALIDADES SOBRE ESPECIES Gnaphalium elegans, Achyrocline bogotensis y Achyrocline satureioides
3.3.1 Especie Gnaphalium elegans
Ilustración 1. Especie Gnaphalium Elegans.
Fotografía tomada en proyecto de investigación (Fuente: Autores)
Hierba de 2 metros de altura, con tallos erectos redondeados, cubiertos de pelos ramificados de color blanco en la parte superior. Hojas de color verde oscuras
4
alternas, las cuales no se unen directamente al tallo, con punta en forma de lanza y aguda, presentan un ancho de 0.5-2 centímetros y un largo de 4.5-6 centímetros .Inflorescencia abierta y de tamaño igual ramificado, sus flores son marginales,
femeninas, presentan un conjunto de pelos diminutos simples que rodean la flor de color blanco con numerosos aristas.[4]
3.3.2 Especie Achyrocline bogotensis
Ilustración 2. Especie Achyrocline bogotensis.
Fotografía tomada en proyecto de investigación. (Fuente: Autores)
Hierba erecta de 1 metro de altura, bien ramificada de tallos erectos los cuales exhiben en la superficie vellosidades cubiertas de pelos finos y suaves, con una
epidermis de color blanco. Sus hojas son alternas las cuales no se unen directamente al tallo, lineales, con punta de lanza, y su base se presenta agostada; en inflorescencia son de color amarillo, muestran unas ramitas que
sostienen unas 18 flores desplegando brácteas en varias series de color amarillo. Sus flores son marginales, femeninas con ventrículos internos tubulares, presenta
pelos numerosos y largos de color blanco al final de la flor, que sirven para dispersar la semilla. [2]
(A)Fotografía en laboratorio. (B) Fotografía en campo.
Ilustración 3. Especie Achyrocline Satureioides. (Fuente: Autores)
5
Hierba muy común erecta de 1 metro de alto, bien ramificada, el tallo presenta una epidermis de color blanco, con hojas alternas no unidas al tallo, lineales con punta de lanza, la base del tallo es larga densa de color blanco-lanosa. En inflorescencia
es de color amarillo oro. Flores marginales femeninas. Presenta pelos numerosos y largos de color blanco amarillento al final de la flor, que sirven para dispersar la
semilla [6].En la tabla 1 se muestra la Clasificación taxonómica para la especies Gnaphalium elegans, Achyrocline bogotensis y Achyrocline satureioides según la clasificación del Herbario Nacional.
Nombre Científico Gnaphalium elegans Achyrocline
bogotensis Achyrocline satureioides
Reino Plantae Plantae Plantae
Phylum Magnoliophytaa Magnoliophytaa Magnoliophytaa
Clase Magnoliopsida Magnoliopsida Magnoliopsida
Orden Asterales Asterales Asterales
Familia Asteraceae Asteraceae Asteraceae
Género Gnaphalium Achyrocline Achyrocline
Epíteto Específico Elegans Bogotensis Satureioides
Tabla 1. Clasificación taxonómica (Herbario Nacional de Colombia) Fuente [15]
3.4 ANTECEDENTES
Las especies Gnaphalium elegans, Achyrocline bogotensis y Achyrocline satureioides presentan en la medicina tradicional usos en el tratamiento de
enfermedades respiratorias, digestivas, renales, de la piel, cáncer de próstata, colón, páncreas y ceno, también se conocen como agentes antiinflamatorios y
antirreumáticos. [5, 26, 30, 32]. Estas propiedades curativas se le atribuyen a metabolitos secundarios como polifenoles, derivados de cafeilquínicos, alcaloides, taninos, antraquinonas,
saponinas, esteroles y triterpenos. Entre los metabolitos más estudiados por sus diversas propiedades medicinales se encuentran los flavonoides.
Para las especies Gnaphalium elegans, Achyrocline bogotensis y Achyrocline satureioides, se han aislado algunos flavonoides los cuales se presentan en la tabla 2 y al mismo tiempo se mencionan ciertas propiedades evidenciadas en
estudios fitoquímicos.
6
Especie
Compuestos Aislados
Propiedades
Autores
G. Elegans
Gnaphalin, luteolina, miricetina, 5,7-dihidroxi-3,6,8- trimetoxiflavona y
ácido(+) grandiflorénico.
Antinflamatorio
prostático, antimicrobiano
[32]
A. Bogotensis
Gnaphalin, metil-gnaphalin, javerianina,
quercetina, 7-glucósido de quercetina y
la 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona
Tratamiento de la Piel
y próstata.
[32]
[30]
A. Satureioides
Quercetina, Luteolin, 3- orto-metilquercetina.
Antinflamatorio Tratamiento de enfermedades estomacales
[16] [23] [32]
Tabla 2.Flavonoides Aislados de las especies G. elegans, A. Bogotensis, A. Satureioides y propiedades. Fuente [33]
3.4.1 Flavonoides Los flavonoides hacen parte de la subclase de poli fenoles más grande y
abundante del reino vegetal. Así mismo por su variedad de propiedades biológicas, se ha convertido en una de las moléculas más estudiadas por los investigadores. El primero de ellos fue Albert Szent-Györgyi (ganador del premio
Nobel de Fisiología y Medicina en 1937), quien los descubrió y dio el nombre de “Vitamina P”. [3] Estas moléculas consisten en dos anillos bencénicos A y C, que se conectan de
un anillo de pireno el cual contiene un átomo de oxígeno, B (Ilustración 4). Los flavonoides presentan distintos grupos orgánicos como sustituyentes, en las
posiciones 3, 5, 7, 3 ', 4', y 5’ las cuales son hidroxiladas, con frecuencia, uno o más de estos grupos hidroxilo está metilado, acetilado, o sulfatados. [39]
Ilustración 4. Estructura general de un flavonoide. Fuente [39]
O
O
R2
R3
R1
OH
A B
C1
2
345
6
78 1'
2'
3'
7
Actualmente se han identificado aproximadamente 6500 flavonoides diferentes, que están clasificados en varios grupos de acuerdo a variaciones estructurales que presenta la cadena central B, entre los principales grupos están: chalconas,
flavonas, flavonoles, flavononas, flavononoles, catequinas, etc., (Ilustración 5). Esta gran variedad de flavonoides se encuentran con frecuencia en las frutas,
granos, algunas verduras y plantas. Los flavonoides presentes en las plantas se encuentran distribuidos por todos los tejidos y se ha demostrado que la mayoría de veces están unidos químicamente a moléculas de carbohidratos. Esta clase de
unión entre un flavonoide y una o varias unidades de carbohidratos, se denomina glucósidos y generalmente en su estructura presentan O- o C-glucósidos unido al
carbono de las posiciones 6 ó 8. Carbohidratos (azucares) tales como: D-glucosa, L-ramnosa, galactosa, arabinosa, están unidos al grupo hidroxilo de las posiciones C-3 o C-7 del flavonoide. [23]
Ilustración 5. Clasificación de Flavonoides. Fuente [ 18 ]
O
O
O
O
O
OH
O
O
H
O
O
H
OH
O+
FLAVONAS
FLAVONOLES FLAVANONAS
FLAVANONOLES ANTOCIANIDINAS
8
El grupo de investigación PronalUDCA, nos permitió trabajar con estándares de flavonoides aislados y purificados de los cuales se presentan en la tabla 3, donde se especifica en que clasificación se encuentran, nombre y estructura.
Flavonoide Nombre Estructura
Catequina
OH
OH
OH
OH
OH
O
Rutina
OH
OH O
OH
OH
OH OH
O
O
O OH
O
CH3
OH O
OH
OH
Quercetina OH
O
OH
OH
OH
O
OH
5,7-dihidroxiflavanona
O
OOH
OH
9
Flavonoide Nombre Estructura
3,5.dihidroxi-7-metoxiflavanona
O
O
OH
OH
O
CH3
3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona
O
O
OH
OH
O
O
OCH3
CH3
CH3
5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona
OH
OH O
O
OCH3
O
CH3
OCH3
Tabla 3. Nombres y estructuras de flavonoides trabajados en el proyecto Fuente: Autores
3.4.2 Perfiles cromatográficos en fitoquímica (huellas dactilares).
Debido a la complejidad en cuanto a la cantidad de moléculas presentes en los
extractos provenientes de fuentes naturales como lo son las hierbas de uso medicinal, las corridas cromatográficas realizadas usando detectores como el UV/VIS muestran múltiples señales que forman un patrón a lo largo del tiempo de
duración de la corrida. Estos patrones de señales pueden llegar a ser
10
característicos de una especie e incluso de la región en la que se ha recolectado, llegando a ser tan específicos que se ha planteado que dichos patrones pueden funcionar como una huella dactilar en la identificación de la especie. Por tal razón,
hoy en día, el establecimiento de dichos patrones característicos puede resultar una herramienta muy útil que permita realizar una clasificación preliminar y rápida
de una especie recolectada con el fin de determinar su calidad y potencial terapéutico, permitiendo a su vez, la optimización de tiempo y recursos en las investigaciones de estas especies, y también la identificación y cuantificación de
moléculas con actividad biológica como lo son los flavonoides, como reporta el articulo [14] en la especie Mallotus donde la técnica de HPLC permitió por medio
de las señales características y por medio de un análisis de regresión multivariable construir un modelo de actividad antioxidante. [14]
La técnica de huellas dactilares en la actualidad está siendo usada como una
herramienta de cuantificación para muestras pertenecientes a productos de origen vegetal, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha aceptado la cromatografía
de huellas digitales como una técnica que permite la evaluación de calidad para la identificación de hierbas medicinales como principios activos de medicamentos a base de plantas. [14, 31]. Una huella digital obtenida mediante HPLC caracteriza
la composición de la muestra de una hierba y se puede utilizar para evaluar la autenticidad y la estabilidad de diversas muestras después de una recolección de
más de 10 especies del mismo género y sus puntos de recolección se mantengan controlados [22, 37].
4 METODOLOGIA
4.1 REACTIVOS
Los reactivos utilizados en la elaboración de la metodología fueron: Metanol HPLC
(JT.Baker), Ácido Acético al 2% (Quimint), Acetona grado reactivo (Supelco) y agua MilliQ obtenida de equipo MiliQ Ultra pure water Direct-Q3vHPLC.
Se utilizaron como patrones de referencia: 5,7-dihidroxiflavanona, 3,5.dihidroxi-7-metoxiflavanona, 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona, 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxi-flavona y rutina (Estos patrones fueron extraídos en el laboratorio de fitoquímica
de la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A), la Catequina, Quercetina y resveratrol son estándares certificados de Sigma (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA).
4.2 RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL MATERIAl.
Las especies Gnaphalium elegans, Achyrocline bogotensis y Achyrocline satureioides fueron recolectadas en el primer semestre del año 2015, para ello se
realizaron tres salidas de campo, en los alrededores del embalse del Neusa, ubicado entre los municipios de Cogua y Zipaquirá en el departamento de Cundinamarca, Colombia. Un ejemplar de la especie G. elegans fue identificado
en el Herbario Nacional de Colombia con el número (Col 555652), la especie A. bogotensis se identificó con el número (Col 585768). Una vez recolectadas las
11
especies, se procedió a la separación en hoja y flor de la planta fresca. Las muestras se almacenaron en nevera a temperatura de 6°C. (Ilustración 6).
Especie A. satureioides
Especie A. bogotensis
Especie G. elegans
Ilustración 6.Figuras de recolección y separación para las especies A. Satureioides, A Bogotensis, G.Elegans. (Fuente Autores)
4.3 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS DE HOJA Y FLOR POR SOXHLET
CON ACETONA.
El material fresco de A. satureioides, A. bogotensis y G. elegans , recolectado en salidas de campo distintas y siendo muestras independientes se separó para hoja
y flor respectivamente. Cada una de las muestras individuales se sometió a un proceso de extracción por reflujo asistido soxhlet con acetona [20, 25], por 7
horas. Una vez terminada la extracción se filtró con lana de vidrio, realizando varios lavados con acetona para recuperar el extracto acumulado en el remanente del material vegetal. El filtrado se concentró en un equipo rota-evaporador marca
Heidolph a presión reducida de 240 mbar, temperatura del baño de 50°C y 60 rpm, hasta obtener un extracto seco de cada una de las muestras de las especies anteriormente mencionadas. Al finalizar el proceso de extracción se obtuvieron 3
muestras independientes de cada una de las especies estudiadas. (Ilustración 6.).
Una vez concentrado el extracto para cada una de las muestras de hoja y flor se
registró el peso obtenido y se almacenó en nevera a °6 C, para ser analizado por HPLC-DAD. Figur
Ilustrac
12
ión 7. Extracto concentrado especies G. Elegans. Fuente: Autores
4.4 ANÁLISIS POR HPLC-DAD.
Para el análisis cromatográfico se utilizó un Cromatógrafo líquido con arreglo de diodos marca LaChrom (VWR HITACHI), el cual cuenta con una bomba automática (L-2200), un horno para la columna (L-2300) y un detector con arreglo
de diodos (L-2450). El sistema EZ Chrom Elite se utilizó para la adquisición y reproceso de datos.
La separación de los flavonoides se lleva a cabo utilizando una columna de fase reversa (RP-18) de longitud 250 mm y 4.6 mm de diámetro, tamaño de poro de 5μm (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Se mantuvo una temperatura controlada
del horno a 20°C.
Se utilizó metanol grado HPLC (A) y ácido acético al 2% (B), para programar el
gradiente de separación de los flavonoides. El siguiente gradiente fue programado para la separación de los flavonoides: 15-25% (A) en 0-15 min, de 25-35% (A) entre 15-45 min, de 35-50% (A) entre 45-65 min, de 50-65% (A) entre 65-90 min, a
un flujo de 1.0 mL/min. El volumen de inyección trabajo fue de 99 µL.
La absorbancia se registra simultáneamente en las longitudes de onda 254, 280,
320 y 360 nm, y se eligió la longitud 254nm para efectos de desarrollo de la metodología. De igual forma se obtuvieron los espectros UV de cada uno de los patrones de referencia.
La cuantificación de los flavonoides identificados se llevó a cabo mediante el método estándar externo, por comparación de la repuesta analítica obtenida para
las señales de los patrones (áreas) y mediante el uso de la siguiente ecuación.
CF=
Ecuación 1
Dónde: CF: Contenido del flavonoide (expresado en mg por cada 100 g de material fresco); AM: Área muestra, ASTD: Área de estándar, WSTD: Peso estándar, WMta: Peso de muestra, WExtracto: Peso total del extracto, WMaterial fresco: Peso total
material fresco, F.D: Factor de Dilución; P: Pureza estándar referencia (%).
Dada la complejidad de las muestras y con el fin de asegurar que las señales
obtenidas en cuenta correspondan a los analitos identificados mediante los patrones y no al ruido instrumental o a otra causa aleatoria, se tuvieron en cuenta, para la cuantificación, aquellas señales que se presentaron de forma consistente
en las tres réplicas para hoja y flor de cada una de las especies estudiadas.
Adicionalmente, se construyó una curva de calibración de Catequina a bajas
concentraciones, con el fin de establecer las señales mínimas detectables y cuantificables de este analito y extender estos límites a la evaluación de las demás señales obtenidas.
13
Para determinar las señales mínimas detectables y cuantificables se siguieron los lineamientos de la guía ICH “validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1)”.
Se partió de una solución madre preparada a una concentración de 510 µg/mL, pesando 5,1 mg de patrón certificado de Catequina, transfiriéndolo a un balón de
10 mL, se adicionó una porción de metanol, se llevó a ultrasonido hasta completa dilución y se completó a volumen con el mismo diluente. De la solución madre se tomaron alícuotas de 24 µL, 36 µL, 48 µL, 60 µL y 84 µL con una micro pipeta L-
100XLS+ (Marca Mettler Toledo), se transfirieron a balones aforados de 1 mL y se llevaron a volumen con un segundo diluente, formado por una relación de ácido
acético 2%-metanol (96:4), para obtener concentraciones de 12,24 µg/mL, 18,36 µg/mL, 24,48 µg/mL, 30,60 µg/mL y 42,84 µg/mL respectivamente. Se llevaron a cabo tres replicas por cada uno de los puntos de la curva y por último se
determinó la correlación de la curva por regresión lineal.
Las señales mínimas detectables y cuantificables se calcularon basadas en la guía
ICH “validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1)”.
4.5 PREPARACIÓN DE PATRONES Y MUESTRAS
Para cada uno de los extractos secos obtenidos de hoja y flor de cada una de las especies (tabla 5) se pesaron aproximadamente 0.200 g por muestra.
Posteriormente se transfirió a un balón de 10 mL, se adicionó una porción de metanol, llevándose a ultrasonido y se completó a volumen con el mismo diluente. De la solución anterior se tomó una alícuota de 5 mL y se aforo a un volumen final
de 10 mL con un segundo diluente, formado por una relación de ácido acético 2%-metanol (96:4); Todas las muestras fueron filtradas a través de filtros de jeringa de
tamaño de poro de 0.45 μm marca VWR International, (Lovaina, Bélgica).
Los patrones utilizados para la identificación y cuantificación de los flavonoides se combinaron y llevaron a volumen. La concentración final obtenida para cada uno
de los patrones de trabajo se reporta en tabla 5.
5 RESULTADOS Y DISCUSION
5.1 DESARROLLO DE LA METODOLOGÍA POR HPLC-DAD
Para el desarrollo de la metodología por HPLC-DAD para la identificación de los
flavonoides en los extractos de A. satureioides, A. bogotensis y G. elegans para hoja y flor, fue empleada una columna C18 (fase inversa ó reversa). El mecanismo
de acción que rige la separación se debe al carácter hidrofóbico que presentan las estructuras de los flavonoides y a la cadena carbonada (octadecilsilano) de la columna, es decir, como los flavonoides presentan en su estructura una parte
apolar significativa, la interacción con la parte apolar de la columna aumenta. En el caso de los flavonoides 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona y 5,7-dihidroxi-3,6,8-
trimetoxiflavona, en sus estructuras presentan un considerable carácter apolar por la presencia de los grupos metoxi, lo cual mostró mayor retención para estos dos
14
compuestos, quienes se eluyeron en los tiempos de 91,4 min y 94 min, respectivamente (Ilustración 8).
Metanol (MeOH) y ácido acético (AcOH), fueron seleccionados como fase móvil,
para la elución de cada uno de los patrones de flavonoides. Los flavonoides tienden a ser solubles en solventes polares, como el metanol [1,29]. El ácido
acético suprime la ionización de los flavonoides y mejora el factor de asimetría (tailing) de los picos cromatográficos. Para efectos del desarrollo de esta metodología se utilizó ácido acético a una concentración baja (ácido acético al 2%
v/v) [21], con el fin de no tener implicación en la estabilidad de la columna. Trabajos previos han reportado un gradiente de composición con metanol y ácido
acético al 2% [8 y 9].
Un primer gradiente utilizado con Fase móvil A MeOH y Fase móvil B AcOH 2.0 %, fue: 10-20% (A) en 0-25 min, de 20-30% (A) entre 25-35 min, de 30 -40% (A) entre
35-65 min; 40-60% (A) en 65-90 min, del cual se obtuvo el perfil cromatográfico que se observa en la Ilustración8. En este primer ensayo no se utilizó ácido
acético en la preparación de la muestra, condición a la que se le atribuye al bajo factor de asimetría (tailing), de igual forma se observa una señal ancha a los 80 minutos, la cual indica solapamiento de señales y baja resolución, porque se
inyectó una mezcla de 8 patrones y solo se resuelven 5 señales, razones que indican que el gradiente de composición no fue el óptimo.
.
Ilustración 8.Perfil cromatográfico primer gradiente, obtenido a partir del primer ensayo de
gradiente. (Fuente autores)
Un segundo gradiente ensayado, a partir de los mismos solventes, fue:20-35% (A) en 0-20 min, de 35-40% (A) entre 20-40 min, de 40 -55% (A) entre 40-60 min; 55-
65% (A) en 60-80 min, del cual se obtuvo el perfil cromatográfico que se observa en la ilustración 8, para este segundo ensayo se utilizó ácido acético al 2% en la
dilución final de la muestra lo cual mejoro el factor de asimetría. El resultado de la aplicación de este gradiente de composición muestra que los patrones de referencia lograron una mejor resolución, sin embargo, no están presentes los 8
patrones de referencia (ilustración 9).
15
Ilustración 9. Perfil Cromatográfico, obtenido a partir del segundo ensayo de gradiente. Fuente (Autores)
Finalmente una separación eficiente de los 8 patrones de flavonoides se logró
usando el tratamiento de la muestra y el gradiente de elución programado y descrito en el numeral 4.4 (ilustración 10). Los tiempos de retención y
concentración de cada uno de los patrones son registrados en la Tabla 5.
Ilustración 10. Perfil cromatográfico de los patrones trabajados. Las condiciones Condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología.
Fuente (Autores)
16
Abreviatura Nombre Concentración
µg / mL
T.R
1 Catequina 35,0 11.3
2 Resveratrol 35,0 49.8
3 Rutina 45,0 57.4
4 Quercetina 35,0 67.9
5 5,7-dihidroxiflavanona 25,0 87.2
6 3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonona
85,0 88.6
7 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona
30,0 91.4
8 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona
35,0 94.0
Tabla 4 . Patrones de Flavonoides empleados en el estudio Elaborada por Autores
En la ilustración 9, se observan ocho picos bien resueltos de los patrones de referencia, identificados por su tiempo de retención y caracterizados por su
respectivo espectro UV. Estos espectros UV se lograron obtener gracias al detector de arreglo de diodos (DAD), el cual realiza un barrido simultáneo de todas las longitudes de onda, permitiendo caracterizar a través de su espectro UV cada
una de las señales obtenidas en el perfil cromatográfico. Lo anterior es importante para descartar que las señales identificadas mediante los tiempos de retención de
los patrones pudieran ser debidas (o estar superpuestas) a otros compuestos, ya que por la complejidad en composición de las muestras trabajadas esto puede llegar a ser probable.
Los espectros de flavonoides identificados en este proyecto de investigación fueron comparados con espectros teóricos, algunos de estos reportados por
literatura y otros confirmados con bases de datos del grupo de investigación de productos naturales (PronaUDCA) de la universidad de ciencias ambientales y aplicadas U.D.C.A ( Ilustraciones 11-17)
Las ilustraciones 11, 12, 13, 14, 15, 16,17. Presentan la comparación de los espectros obtenidos y los espectros teóricos, los cuales muestran que no hay
diferencias significativas entre cada uno de los espectros y se observan máximos de absorbancia de estos espectros UV entre 254 y 320 nm. Estos máximos son distintivos de los flavonoides, los cuales presentan dos bandas de absorción
características en su estructura. Una primera banda en el rango de 245-285nm correspondiente al anillo A y una segunda banda entre 300 a 550nm la cual se presenta por la conjugación y sustitución del anillo C (Ilustración 4) [18]. De esta
manera los patrones de referencia permitieron caracterizar cada una de las señales obtenidas de los extractos de hoja y flor.
17
Espectro UV Teórico Espectro UV Muestra
[38]
Fuente: Autores
Ilustración 11. Comparación de espectros UV, patrón de Catequina.
Espectro UV Teórico Espectro UV Muestra
Fuente bases de datos del grupo de investigación de productos naturales. En metanol analítico (PronalUDCA)
Fuente: Autores
Ilustración 12. Comparación de espectros UV, patrón de Rutina
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
229 279 329 379 429
Ab
sorb
anci
a
λ de onda (nm)
11,3 min
Próximo a 280 nm
230 nm
256
349
Próximo 258
Próximo 352
nm
57,4 min
18
Espectro UV Teórico Espectro UV Muestra
Fuente bases de datos del grupo de investigación de productos naturales. En metanol analítico (PronalUDCA)
Fuente: Autores
Ilustración 13. Comparación de espectros UV, patrón de Quercetina.
Espectro UV Teórico Espectro UV Muestra
[7]
Fuente: Autores
Ilustración 14. Comparación de espectros UV, patrón de 5,7-dihidroxiflavanona.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
230 260 290 320 350 380 410
A
bso
rban
cia
λ de onda (nm)
67,9 min
254 nm
256-257 Próximo 372
87,2 min
290
19
Espectro UV Teórico Espectro UV Muestra
Fuente bases de datos del grupo de investigación de productos naturales. En metanol analítico (PronalUDCA)
Fuente: Autores
Ilustración 15. Comparación de espectros UV, 3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonona.
Espectro UV Teórico Espectro UV Experimental
Fuente bases de datos del grupo de investigación de productos naturales. En metanol analítico (PronalUDCA)
Fuente: Autores
Ilustración 16. Comparación de espectros UV, 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
229 279 329 379 429
Ab
sorb
anci
a
…
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
229 279 329 379 429
Ab
sorb
an
cia
λ (nm)
91,4 min
269
318
Próximo 270
Próximo 320
88,6 min 289
Próximo 333
290-292
331-333
20
Espectro UV Teórico Espectro UV Muestra
Fuente bases de datos del grupo de investigación de productos naturales. En metanol analítico (PronaUDCA)
Fuente: Autores
Ilustración 17. Comparación de espectros UV, 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona.
Las gráficas experimentales son los espectros registrados por el DAD a los
tiempos de retención de las señales de interés establecidos a partir de los estándares usados.
De la ilustración 18 a la ilustración 23 se muestran espectros representativos de
algunas de las muestras corridas para soportar la identificación de las señales respecto de los espectros de señales identificadas, mediante comparación con
tiempo de retención de los patrones, con los que se esperan teóricamente. Para todas las muestras se hizo la verificación de que la señal identificada por tiempo de retención correspondiera a su espectro teórico, siendo similares en todos los
casos. Los resultados de cuantificación se hicieron bajo la identificación de cada patrón por separado por tiempo de retención (Anexo 1).
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
229 279 329 379 429
Ab
sorb
anci
a
λ de onda (nm)
278
324
276
321
94,0 min
275-276
321-322
372-374
21
Ilustración 18. Espectro UV de la señal correspondientes al TR 57,34 min (Rutina), para flor de G.elegans. Fuente: Autores
Ilustración 19. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 68, 02 min (Quercetina), para hoja de A.satureioides. Fuente: Autores
Para el espectro UV de 5,7-dihidroxiflavanona al TR 87,3 min, de G.elegans en flor
(Ilustración 20), los máximos de absorbancias no son similares entre espectro teórico y el espectro de la muestra; pero como se muestra en el anexo 2 el tiempo de retención de la señal en la muestra corresponde al tiempo de retención del
patrón corrido individualmente por tales motivo queda abierta a futuros estudios para la identificación de este compuesto.
254
370
22
Teórico
Experimental
Ilustración 20. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 87,3 min (5,7-dihidroxiflavanona), para flor de G.elegans. Fuente: Autores
Ilustración 21. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 88, 34 min (3,5-dihidroxi-7-metoxiflavanona), para flor de A.satureioides. Fuente: Autores
292
289
290
273
Próximo 270
23
Ilustración 22. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 91,20 min (3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona), para hoja de A.bogotensis. Fuente: Autores
Ilustración 23. Espectro UV de la señal correspondiente al TR 93,40 min (3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona), para flor de G.elegans. Fuente: Autores
5.2 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES POR HPLC
5.2.1 Curva de Calibración a bajas concentraciones.
Para efectos de desarrollo de la metodología, se determinó cuáles son las señales mínimas detectables y cuantificables, para ello se tiene en cuenta los lineamientos
estipulados en la guía ICH “validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1)”. Estos parámetros son evaluados, especialmente porque se
tratan de extractos con matrices complejas.
Se realizó una curva de calibración de Catequina en un rango de 12 – 43 μg/ mL a
cinco niveles de concentración. La curva es lineal, con un buen coeficiente de correlación (r). La ecuación de la recta obtenida es y= 83757x - 169061 (n = 5, r2 =0,996). (Ilustración 24).
322
Próximo 320
276 321-322
321
24
Ilustración 24. Curva de calibración a bajas concentraciones de Catequina Elaborada por autores
Posteriormente, con base en la guía (ICH), un análisis de varianza (ANOVA) y la
ecuación de la curva de calibración, se estableció la concentración de 2,1 ug/mL como la mínima señal analítica detectable y la concentración de 6,3 µg/mL como la mínima señal analítica cuantificable.
5.2.2 Cuantificación de las señales obtenidas.
Una vez realizada la identificación se procedió a la cuantificación del analito a
partir del área obtenida y comparando con el área registrada para el estándar y aplicando la ecuación mostrada previamente en la descripción de la metodología. La tabla 5 resume los distintos flavonoides identificados y cuantificados para las
distintas muestras evaluadas.
Fue posible identificar por lo menos uno de los flavonoides, que fueron evaluados
por medio de los estándares de referencia, en cada uno de los extractos analizados de las tres especies. Las mayores concentraciones de los flavonoides identificados para los extractos de hoja se encuentran en las especies A.
bogotensis y G. elegans, mientras que la mayor concentración de flavonoides en los extractos de flor fueron encontrados en la especie A. satureioides. Estos
flavonoides reportan propiedades de protección de la radiación UV de la luz, reguladores de transporte hormonal y como protectores ante los herbívoros al generar sabores amargos [13], al mismo tiempo, se han encontrado estudios en
los cuales se reportan propiedades como agente antiflamatorio, antioxidante, acción antialérgica y protección contra el cáncer. Las altas concentraciones
observadas para los extractos de hoja y flor podrían explicarse por este hecho.
La identificación de flavonoides varia significativamente incluso en especies del mismo género, de esta manera se puede observar como dos de los tres
flavonoides presentes en hoja de satureioides (rutina y quercetina) no se presentan en hoja de bogotensis, de igual forma se observa en esta especie un
flavonoide adicional no presente en satureioides (5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona) [17]. Asimismo, tres de los cuatro flavonoides encontrados en flor de satureioides se encuentran ausentes en flor de bogotensis. La distribución de
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
0 10 20 30 40 50
Re
spu
est
a a
na
líti
ca
Concentración (µg/mL)
Curva de Calibración Catequina
25
flavonoides encontrados en G. elegans también cambia, principalmente en flor, respecto de los encontrados en las especies de Achyrocline. De acuerdo a esto, se pueden encontrar señales características e incluso exclusivas de una especie
que pueden permitir la caracterización e identificación de la especia mediante los perfiles cromatográficos obtenidos por la técnica de HPLC, utilizando solamente
algunos analitos de referencia.
Quercetina, 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona y 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona, se presentan en la tabla 5 como los flavonoides de mayor
contenido. Quercetina es también uno de los flavonoides que presenta una efectiva función antioxidante; su capacidad antioxidante es 5 veces mayor a lo
reportado por las vitaminas E y C. Igualmente, en experimentos in vitro se demostrado los efectos de inhibición en células cancerígenas en seres humanos. [19]
En estudios realizados en la especie A. bogotensis y el género Gnaphalium, se ha encontrado una fuerte actividad antioxidante en extractos de hojas y flor [2,24] por
los flavonoides 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona y 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona [30,25], y que en general, ha sido directamente relacionada con el
contenido de flavonoides y otros compuestos polifenolicos [8, 10]. En el estudio
realizado en este proyecto de investigación las especies A. satureioides, A. bogotensis y G. elegans, pueden presentar esta misma propiedad antioxidante, ya
que se encontraron uno o más flavonoides en sus extractos de hoja y flor (Tabla 5).
Tabla 5. Contenido de flavonoides en los extractos cetónicos para las especies estudiadas (mg/100g).( Fuente: Autores ).
5.2.3 Análisis estadístico.
Un análisis estadístico del contenido de rutina, quercetina, 3,5-dihidrox-6,7,8-trimetoxiflavona y 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona en los extractos de hoja y flor entre las especies A. satureioides, A. bogotensis y G. elegans mostró que no hay
una diferencia significativa (p > 0,05) entre el contenido promedio de rutina y 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona en las especies A. satureioides y G. Elegans (Ilustración 25 y 27 ), igualmente ocurre con el contenido promedio de Quercetina
Flor Hoja Flor Hoja Flor Hoja
Rutina 6,94 8,25 2,34
Quercetina 111,05 0,57 110,7 17,41
5,7-dihidroxiflavanona 1,7
3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonona 27,98
3,5-dihidroxi-6,7,8-Trimetoxiflavona 208,17 2,15 824,28 54,65
5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona 3,06 178,5 14,65 13,65
FLAVONOIDE A. satureides A. bogotensis G. elegans
26
entre las especies A. satureioides y A. bogotensis (Ilustración 26). Sin embargo, se estableció que hay una diferencia estadística significativa (p < 0,05) entre el contenido promedio de Quercetina y 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona en las
especies A. satureioides y G. Elegans; A. bogotensis y G. Elegans (Ilustración 26 y 28), asimismo se puede diferenciar entre las especies A. bogotensis y G. Elegans;
A. satureioides por el contenido promedio de 3,5-dihidrox-6,7,8-trimetoxiflavona (Ilustración 28). Los datos indican que el contenido de flavonoides es un parámetro con el cual se puede diferenciar entre cada una de las especies estudiadas en
este proyecto de investigación.
Ilustración 25. Comparación del contenido en mg/100 g de Rutina en hoja y flor, para las
especies G. elegans y A. satureiodes
Ilustración 26. Comparación del contenido en mg/100 g de Quercetina en hoja y flor,
parlas especies G. elegans, A. satureiodes y A. bogotensis.
2
8 7
1
3
5
7
9
11
HOJA FLORmg/
100g
de
mat
eria
l fer
sco
Rutina
17 1
111 111
020406080
100120
HOJA FLOR
mg/
100g
de
mat
eria
l
Quercetina
G. elegans A. satureioides A. Bogotensis
27
Ilustración 27. Comparación del contenido en mg/100 g de Quercetina en hoja y flor, para las especies G. elegans, A. satureiodes y A. bogotensis.
Ilustración 28. Comparación del contenido en mg/100 g de Quercetina en hoja y flor, para
las especies G. elegans, A. satureiodes y A. bogotensis.
5.3 PERFILES CROMATOGRÁFICOS DE LOS EXTRACTOS DE A. SATUREIOIDES, A. BOGOTENSIS Y G. ELEGANS
El perfil cromatográfico obtenido de los patrones (Ilustración 10) presentaron alta resolución para los picos de Catequina, rutina, Quercetina, 5,7-dihidroxiflavanona, 3,5.dihidroxi-7-metoxiflavanona, 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona y 3,5-dihidroxi-
6,7,8-trimetoxi-flavona, indicando que el método propuesto puede ser aplicado para identificar estos flavonoides en los extractos de hoja y flor de las especies del
genero Ganaphalium y Achyrocline .
Rutina, quercetina y 5,7-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona son identificados y marcados en el cromatográma para los extractos de hoja de la especie A.
satureioides Ilustración 29. Los picos de 40 a 70 min del cromatográma corresponden a los flavonoides de mediana polaridad (Rutina y Quercetina) y del
minuto 70 en adelante se encuentran los flavonoides de baja polaridad (5,7-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona). De igual forma, estos tres flavonoides son
55 2
208
824
0
250
500
750
HOJA FLOR
mg/
100g
de
mat
eria
l
3,5-dihidroxi-6,7.8-trimetoxiflavanona
G. elegans
A. satureioides
A. Bogotensis
14 15 3
179
0
50
100
150
HOJA FLOR
mg/
100g
de
mat
eria
l
5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona
G. elegans A. satureioides A. Bogotensis
28
identificados para los otros dos extractos de hoja, manteniendo los mismos tiempos de retención y solamente variando en la intensidad de los picos (ver anexo 3). Además, existe confirmación de los flavonoides encontrados en las tres
muestras de hoja por comparación de los espectros UV (ver anexo 4), con los espectros UV obtenidos en los patrones de referencia (Ilustración 11 a la
ilustración 17).
Ilustración 29. Cromatográma representativo de extracto de A. satureiodes hoja. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología
Quercetina, 3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonona, 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona y
5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona, son identificados y marcados en el cromatográma para los extractos de flor de la especie A. satureioides ilustración
30 Para los extractos de flor predominan los flavonoides de baja polaridad, es decir, aquellos que se presentaron desde el minuto 70 en adelante. Estos tiempos de retención se mantienen en los perfiles cromatográficos de los otros dos
extractos de flor y solo se aprecia un cambio en la intensidad de los picos en los tres perfiles (ver anexo 5). Igualmente, existe confirmación de los flavonoides
encontrados en las tres muestras de flor por comparación de los espectros UV (ver anexo 6), con los espectros UV obtenidos en los patrones de referencia (Ilustración 11 a la ilustración 17).
29
Ilustración 30. Cromatográma representativo de extracto de A. satureiodes flor. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología.
En la especie A.bogotensis, se identificaron dos flavonoides de baja polaridad en
los extractos de hoja (3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona y 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona) Ilustración 31. Para los extractos de flor se registró la presencia de un flavonoide de mediana polaridad (Quercetina), como se observa en la
ilustración 32. Sin embargo en los perfiles de los extractos 2 y 3 de hoja se presenta un corrimiento en los tiempos de retención para estos dos flavonoides,
en comparación con el tiempo de retención del patrón de referencia (ver anexo 7). Esto se puede presentar ya que al tratarse de un gradiente de composición tan extenso en términos de tiempo, se necesite un mayor período de equilibrio entre
inyecciones. Sin embargo, existe la confirmación de los flavonoides encontrados en las tres muestras de hoja por la comparación de los espectros UV (ver anexo 8)
con los espectros UV que fueron obtenidos en los patrones de referencia (lustración 11 a la ilustración 17).
Ilustración 31..Cromatográma representativo de extracto de hoja A. bogotensis. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología
30
Ilustración 32.Cromatográma representativo de extracto de flor A. bogotensis. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología
Los perfiles cromatográficos de los extractos de hoja y flor en la especie G.
elegans son presentados en las ilustración 33 y 34. La intensidad de los picos varía (ver anexo 11 y 13), pero en general los perfiles son bastante similares. Se identificaron rutina, 3,5.dihidroxi-7-metoxiflavanona, 5,7-dihidroxi-3,6,8-
trimetoxiflavona y 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxi-flavona, en los extractos de hoja y rutina, Quercetina, 5,7-dihidroxiflavanona y 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona en
los extractos de flor. Particularmente se observó la presencia de 5,7-dihidroxiflavanona en los extractos de flor, el cual es un flavonoide que se encuentra determinado especialmente en la miel y el propoleo. No obstante, ha sido reportado [40] en la especie G. purpurascens, lo cual puede ser un referente
para establecer que esta clase se flavonoide haya sido encontrado en el género
Gnaphalium (Ver Anexo 2). Asimismo el espectro UV obtenido (ver anexo 12 y 14 ) fueron comparados con los espectros UV de referencia (lustración 11 a la
ilustración 17).
Ilustración 33. Cromatográma representativo de extracto de hoja G.elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología.
31
Ilustración 34.Cromatográma representativo de extracto de flor G.elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología
5.4 COMPARACIÓN DE PERFILES DENTRO DE LA ESPECIE (REPLICAS) Y
ENTRE ESPECIES
5.4.1 Comparación de replicas
La ilustración 35, muestra las tres réplicas de hoja en la especie A.satureioides
cada una de estas replicas es una muestra diferente preparada bajo las condiciones que se establecieron en el numeral No.4.4 Se observaron en los cromatogramas, picos y áreas similares, lo cual puede ser un indicativo para
establecer un perfil cromatográfico característico en la especie A. satureioides en los extractos de hoja.
Ilustración 35. Cromatográma representativo réplicas de hoja A. satureiodes. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología.
Estos patrones de semejanzas entre las réplicas de los extractos de hoja y flor también se evidencian en las especies A.bogotensis y G.elegans. Ver anexo 15,
32
no obstante, como se observa en la ilustración 36., las réplicas de los extractos de hoja de la especie G.elegans, se presentan diferencias desde el minuto 80 en adelante, en donde no hay coincidencia entre las señales de las tres réplicas,
ocurriendo un posible solapamiento de las señales de la réplica número uno. Las diferencias en contenido son atribuibles a la cantidad de material fresco y extracto
que se utilizó para hacer el análisis cromatográfico.
Ilustración 36. Cromatográma representativo réplicas de hoja G. Elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología.
5.5 DIFERENCIAS Y SEMEJANZAS ENTRE ESPECIES
5.5.1 Extractos de flor.
La ilustración 37 ilustración presenta la comparación entre las especies G.elegans, A.satureioides y A.bogotenis de los extractos acetonicos de flor. Se observa, que del minuto 50 al minuto 80, se encuentra las señales de HPLC-DAD más intensas
no identificadas que están presentan en los tres perfiles. Al analizar los cromatogramas individualmente se encuentran señales que no fueron
identificadas, aunque por su intensidad y resolución en el perfil cromatográfico pueden ser marcadores importante de la especie, como es el caso de los extractos de flor de G. elegans con señales en tiempos de retención en 45,0, 47,3, 48,5 y
55,4 min, las cuales no están presentes en las especies A. bogotensis y A.satureioides. En la región del minuto 80 al 100, solamente se observa similitud
entre los perfiles de las especies del genero Achyrocline.
33
Ilustración 37 . Cromatográma comparativo extractos de flor G.elegans, A.satureioides
y A.bogotenis Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la metodología
5.5.2 Extractos de hoja.
En los extractos cetónicos de hoja ilustración 38, la región comprendida del
minuto 40 al 60 se presentaron dos señales definidas y con alta intensidad en el mismo tiempo de retención para las especies A.satureioides y A. bogotensis. Sin
embargo, en el perfil cromatográfico de la especie G.elegans estas señales presentan un corrimiento y de igual forma una menor intensidad. En la región descrita del minuto 70 en adelante hay semejanza entre los perfiles de las especie
A. satureioides y A. bogotensis, con excepción de la especie G.elegans en donde no se encuentran las mismas señales. Estas señales por encontrarse en esta
región del perfil cromatográfico posiblemente sean atribuibles a flavonoides de mediana polaridad.
34
Ilustración 38.Cromatográma comparativo extractos de hoja A. Satureioides, A Bogotensis y G. Elegans. Las condiciones cromatográficas corresponden a las descritas en la
metodología
6 CONCLUSIONES
Él estudió cromatográfico por HPL-DAD bajo las condiciones de una columna C18 (250 nm x 4,6 mm) con temperatura controlada a 20°C, un detector de arreglo de diodos con elección de longitud de onda a 254 nm, flujo de 1 ml/min, un volumen
de inyección 99 µL y bajo un gradiente de composición de Metanol-Ácido acético (2%), logro la separación de 8 compuestos polifenoles (7 flavonoides y 1
polifenol).
La metodología analítica por HPLC bajo las condiciones anteriormente descritas permitió la identificación de por lo menos uno de los 7 flavonoides, en los extractos
cetónicos de hoja y flor para las especies estudiadas, específicamente en la especie Gnaphalium elegans los flavonoides encontrados fueron; Rutina (T.R 58,0
min), Quercetina (T.R 68,0 min), 5,7-dihidroxiflavanona (T.R 87,0 min) , 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona (T.R 91,0 min) y 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona (T.R 94,0 min); para la especie Achyrocline satureioides los flavonoides
identificados fueron Rutina (T.R 58,0 min), Quercetina (T.R 68,0 min), 3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonona (T.R 88,3 min) , 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona
(T.R 91,0 min) y 5,7-dihidroxi-3,6,8-trimetoxiflavona (T.R 94,0 min), y en la especie Achyrocline bogotensis los flavonoides reconocidos fueron, Quercetina (T.R 67.5 min), 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona (T.R 91,0 min) y 5,7-dihidroxi-3,6,8-
trimetoxiflavona (T.R 94,0 min),
Se realizó una cuantificación preliminar por estándar externo para los flavonoides encontrados, que sirvió como marcador de diferenciación en los contenidos de los
flavonoides analizados, en donde el contenido vario en cada una de las especies estudiadas, lo cual puede servir como una herramienta complementaria en la
diferenciación de las especies.
Se establecieron patrones cromatográficos que en los cuales se identificaron señales características de cada uno de los extractos trabajados para determinar
las diferencias en dichos perfiles que pueden llegar a ser una herramienta en la identificación y diferenciación de las especies pertenecientes incluso al mismo
género.
35
7 RECOMENDACIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos y los perfiles cromatográficos en las especies G.elegans, A.satureiodes y A.bogotenis, se recomienda analizar las
señales no identificadas, pero representativas entre cada una de las especies, por un método confirmativo como espectrometría de masas o resonancia magnética
nuclear entre otras. Utilizar las mismas condiciones analíticas e instrumentales desarrolladas en el
presente trabajo con un número mayor de muestras y en diferentes especies de los géneros Gnaphalium y Achirocline, con el fin de comparar los perfiles
preliminares obtenidos y lograra establecer una huella dactilar para estas especies por análisis computarizado estadístico.
Realizar ensayos de cuantificación bajo curva de calibración a diferentes concentraciones de material (hoja y flor) y hacer adición estándar para la
identificación especifica de los patrones.
36
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40
9 ANEXOS
Anexo 1. Perfiles cromatográficos de cada uno de los patrones por separado: Catequina, Resveratol, Rutina, Quercetina, 5,7-dihidroxiflavanona, 3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonona, 3,5-dihidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona, 5,7-dihidroxi-3,6,8-
trimetoxiflavona. (8 Páginas).
Anexo 2. Perfiles cromatográficos 5,7-dihidroxiflavanona del patrón de referencia y
G. elegans de las 3 réplicas. (4 Páginas).
Anexo 3. Perfiles cromatográficos especie Achyrocline Satureioides hoja de las 3 réplicas (9 Páginas).
Anexo 4. Espectros UV de las señales identificadas de la especie Achyrocline satureiodes hoja (3 Páginas).
Anexo 5. Perfiles cromatográficos especie Achyrocline Satureioides flor de las 3 réplicas (9 Páginas).
Anexo 6. Espectros UV de las señales identificadas de la especie A Achyrocline
Satureioides flor (4 Páginas).
Anexo 7. Perfiles cromatográficos especie Achyrocline Bogotensis hoja de las 3 réplicas (8 Páginas).
Anexo 8. Espectros UV de las señales identificadas de la especie Achyrocline Bogotensis hoja (3 Páginas).
Anexo 9. Perfiles cromatográficos especie Achyrocline Bogotensis flor de las 3 réplicas (9 Páginas).
Anexo 10. Espectros UV de las señales identificadas de la especie A Achyrocline
Bogotensis flor (1 Páginas).
Anexo 11. Perfiles cromatográficos especie Gnaphalium elegans hoja de las 3
réplicas (7 Páginas).
Anexo 12. Espectros UV de las señales identificadas de la especie Gnaphalium elegans hoja (4 Páginas).
Anexo 13. Perfiles cromatográficos especie Gnaphalium elegans flor de las 3 réplicas (9 Páginas).
Anexo 14 Espectros UV de las señales identificadas de la especie Gnaphalium elegans flor (4 Páginas).
41
Anexo 15. Perfile cromatográficos sobrepuestos de las 3 réplica para las especie Gnaphalium Elegans, Achyrocline Satureioides y Achyrocline Bogotensis para hoja y flor (6 Páginas).