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LEVADURAS DE INTERÉS LEVADURAS DE INTERÉS MÉDICOMÉDICO

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

Levaduras de Importancia MédicaLevaduras de Importancia Médica

Levaduras del género Candida Levaduras del género Cryptococcus Levaduras del género Malassezia Levaduras del género Trychosporon Levaduras del género Rhodotorula Levaduras del género Saccharomyces

Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género CandidaCandida

Levaduras del géneroLevaduras del género CandidaCandida

Agentes de candidiasis superficiales y Agentes de candidiasis superficiales y profundas.profundas.

Más de 150 especies descritas: Más de 150 especies descritas: C.albicans, C.tropicalis, C. famata, C.albicans, C.tropicalis, C. famata, C.parasilopsis C.lipolytica, C.glabrata, C.parasilopsis C.lipolytica, C.glabrata, C.krusei,C.lusitaniae, C.dubliniensis,C.krusei,C.lusitaniae, C.dubliniensis, etc. etc.

¿Qué importancia tiene identificar las ¿Qué importancia tiene identificar las especies?especies?

Aumento de la incidencia de las Aumento de la incidencia de las candidiasis sistémicas.candidiasis sistémicas.

Aumento en la frecuencia en la aparición Aumento en la frecuencia en la aparición de especies de de especies de CandidaCandida “no albicans” “no albicans”

Resistencia a antifúngicosResistencia a antifúngicos

Levaduras del géneroLevaduras del género CandidaCandida

Identificación de Levaduras del Identificación de Levaduras del género género CandidaCandida

Estudio macro y micromorfológico de las Estudio macro y micromorfológico de las colonias.colonias.

TermotoleranciaTermotolerancia Sensibilidad a la cicloheximida (Micobiotic)Sensibilidad a la cicloheximida (Micobiotic) Pruebas biológicasPruebas biológicas Pruebas bioquímicasPruebas bioquímicas Métodos enzimáticosMétodos enzimáticos Identificación del genotipoIdentificación del genotipo


Estudio macroscópico de la colonia: Estudio macroscópico de la colonia: Colonias blanquecinas, opacas, cremosas,Colonias blanquecinas, opacas, cremosas, lisas, rugosas, cerebroides.lisas, rugosas, cerebroides.


• Estudio microscópico de la coloniaEstudio microscópico de la colonia (ex. fresco, Gram): (ex. fresco, Gram): Levaduras ovaladas, 3-5 Levaduras ovaladas, 3-5 µµ, con pseudofilamentos,, con pseudofilamentos, producción de pseudomicelio o micelioproducción de pseudomicelio o micelio verdadero, Gram (+)verdadero, Gram (+)


Candida albicans

Siembra en Agar Harina de Maíz(clamidosporos +)

Siembra en Suero Humano Normal(tubos germinales +)

Auxanograma(Prueba de asimilación de Hidratos de Carbono)

ZimogramaPrueba de fermentación de Hidratos de Carbono

Candida no albicans

Siembra en Agar Harina de Maíz(clamidosporos -)

Siembra en Suero Humano Normal(tubos germinales -)

Aislamiento de una levadura no capsulada y sin pigmento

Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género Candida: Candida: Pruebas biológicasPruebas biológicas

Tubos germinales:Tubos germinales:

• Se utiliza un repique de 24 hs.Se utiliza un repique de 24 hs.• Suspensión en suero humano, conejo, oveja, caballo.Suspensión en suero humano, conejo, oveja, caballo.• Incubación a 35-37 ºC por 2-4 hs.Incubación a 35-37 ºC por 2-4 hs.• Ventajas:Ventajas: bajo costo, fácil realización, resultado rápido. bajo costo, fácil realización, resultado rápido. • Desventajas:Desventajas: Aprox. 5 % de las cepas de Aprox. 5 % de las cepas de C. albicansC. albicans no no

los producen.los producen.• Requieren para su observación, personal experimentadoRequieren para su observación, personal experimentado

TUBOS GERMINALES

Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género Candida: Candida: Pruebas biológicasPruebas biológicas

Producción de clamidosporos:Producción de clamidosporos:• Se utilizan medios pobres AHM-Tween 80Se utilizan medios pobres AHM-Tween 80• Estructuras de resistenciaEstructuras de resistencia• Se utilizan repiques de 24 hs.Se utilizan repiques de 24 hs.• Se observan a las 72 hs. hasta los 7 días. Se observan a las 72 hs. hasta los 7 días. • Personal experimentadoPersonal experimentado• 5-7% de las cepas de 5-7% de las cepas de C. albicansC. albicans no los no los

producenproducen• Son de bajo costoSon de bajo costo

CLAMIDOSPOROS

Agar morfología en placaAgar morfología en placaAgar lecheAgar leche

Identificación de Levaduras del género Identificación de Levaduras del género CandidaCandida: Pruebas bioquímicas: Pruebas bioquímicas

Asimilación de hidratos de carbonoAsimilación de hidratos de carbono Auxanograma convencionalAuxanograma convencionalZimograma convencionalZimograma convencional

Sistemas comerciales de identificación Sistemas comerciales de identificación

Métodos enzimáticosMétodos enzimáticos FluorogénicosFluorogénicos Cromogénicos Cromogénicos

AuxanogramaAuxanograma Método de estudio bioquímico para Método de estudio bioquímico para

identificación de levaduras del género identificación de levaduras del género Candida.Candida. Asimilación de carbohidratos en aerobiosis. Asimilación de carbohidratos en aerobiosis. Repiques de 24 hs de la cepa a estudiar.Repiques de 24 hs de la cepa a estudiar. Lectura luego de 24 hs a 48 hs previo pasaje Lectura luego de 24 hs a 48 hs previo pasaje

por estufa a 37 C.por estufa a 37 C. Halo de crecimiento alrededor del disco, Halo de crecimiento alrededor del disco,

evidencia asimilación del carbohidrato. evidencia asimilación del carbohidrato.

Auxanograma convencionalAuxanograma convencional

Zimograma convencionalZimograma convencional Método de estudio bioquímico para identificación de Método de estudio bioquímico para identificación de

levaduras del género levaduras del género CandidaCandida. . Asimilación de carbohidratos en anaerobiosis.Asimilación de carbohidratos en anaerobiosis. Medio líquido alcalino con indicador de Ph.Medio líquido alcalino con indicador de Ph. Repiques de 24 hs.Repiques de 24 hs. Lectura a las 24 a 48 hs, previo pasaje por estufa a Lectura a las 24 a 48 hs, previo pasaje por estufa a 37 C.37 C.

Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género Candida: Candida: APIAPI

METODOS BIOQUIMICOS

Interpretación:


Métodos enzimáticosMétodos enzimáticosSe detectan 2 enzimas: L-prolina Se detectan 2 enzimas: L-prolina aminopeptidasa y aminopeptidasa y ββgalactosaminidasa mediante galactosaminidasa mediante métodos fluorogénicos y cromogénicos.métodos fluorogénicos y cromogénicos.

* Tienen buena sensibilidad y especificidad* Tienen buena sensibilidad y especificidad * Lectura entre 5 minutos – 48 hs. de incubación* Lectura entre 5 minutos – 48 hs. de incubación * Adecuados para la identificación de * Adecuados para la identificación de C.albicansC.albicans

Métodos EnzimáticosMétodos Enzimáticos Ventajas:Ventajas: - - No requieren personal especializado No requieren personal especializado

para su lectura.para su lectura. - - Permiten la identificación rápida de Permiten la identificación rápida de

C.albicans.C.albicans. DesventajasDesventajas - - Requieren de gran presición Requieren de gran presición

(flurogénicos)(flurogénicos)

Medios CromógenosMedios Cromógenos

Medios CromógenosMedios Cromógenos

CHROMagar CandidaCHROMagar Candida Candida ID/ID2Candida ID/ID2 Agar BiggyAgar Biggy CHROMalbicansCHROMalbicans Albicans IDAlbicans ID

CHROMagar CandidaCHROMagar Candida

Medio ampliamente difundido en nuestro Medio ampliamente difundido en nuestro mediomedio

Identificación de levaduras del género Identificación de levaduras del género CandidaCandida

Diagnóstico de especie mediante el Diagnóstico de especie mediante el desarrollo de colonias pigmentadas de desarrollo de colonias pigmentadas de diferentes coloresdiferentes colores

CHROMagar CandidaCHROMagar Candida

Evaluación del medio cromógeno CHROMagar Evaluación del medio cromógeno CHROMagar CandidaCandidaTMTM para la indentificación de levaduras de para la indentificación de levaduras de

interés médicointerés médico

Objetivo (I)Objetivo (I) Determinar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del Determinar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del

CHROMagar Candida, con respecto a la metodología CHROMagar Candida, con respecto a la metodología convencional para la identificación de levaduras del convencional para la identificación de levaduras del género género CandidaCandida

Objetivo (II)Objetivo (II) Evaluar el comportamiento del método CHROMagar Evaluar el comportamiento del método CHROMagar

Candida cuando se incluyen levaduras de otros géneros Candida cuando se incluyen levaduras de otros géneros como como Cryptococcus, TrichosporonCryptococcus, Trichosporon y y RhodotorulaRhodotorula en en dicho mediodicho medio

CONCLUSIONESCONCLUSIONES El medio es confiable sobre todo para la identificación de El medio es confiable sobre todo para la identificación de C. albicansC. albicans..

Recomendamos utilizar dicho medio para identificar especies de Recomendamos utilizar dicho medio para identificar especies de CandidaCandida luego de tener certeza de que la cepa pertenece a éste luego de tener certeza de que la cepa pertenece a éste género (como lo especifica el fabricante). Por tanto no es posible género (como lo especifica el fabricante). Por tanto no es posible prescindir del estudio morfológico.prescindir del estudio morfológico.

Es necesario utilizar otra metodología para la identificación precisa de Es necesario utilizar otra metodología para la identificación precisa de las especies de las especies de CandidaCandida “no albicans” identificadas por este medio. “no albicans” identificadas por este medio.

No es conveniente utilizar el medio para el aislamiento primario a No es conveniente utilizar el medio para el aislamiento primario a partir de especímenes biológicos, porque induce a resultados falsos partir de especímenes biológicos, porque induce a resultados falsos positivos, fundamentalmente cuando identifica a las especies como positivos, fundamentalmente cuando identifica a las especies como “no albicans”.“no albicans”.

Es de destacar que el medio facilita el reconocimiento de distintas Es de destacar que el medio facilita el reconocimiento de distintas especies que pueden coexistir en la misma muestra. especies que pueden coexistir en la misma muestra.

Candida ID/Candida ID2Candida ID/Candida ID2

Medio cromógenoMedio cromógeno: Aislamiento selectivo de : Aislamiento selectivo de levaduras e identificación de levaduras e identificación de C. albicansC. albicans

Colonias de Colonias de C. albicansC. albicans: azul hidrólisis : azul hidrólisis específica de la hexosaminidasa (sustrato específica de la hexosaminidasa (sustrato cromogénico)cromogénico)..

Colonias rosadas: hidrólisis de otro sustrato Colonias rosadas: hidrólisis de otro sustrato que sirve para diferenciar “otras levaduras”que sirve para diferenciar “otras levaduras”

Lectura: 24-48 hs.Lectura: 24-48 hs. Apropiado para separar cultivos mixtosApropiado para separar cultivos mixtos ID2 = (-) bacterias ID2 = (-) bacterias

Candida IDCandida ID

Albicans IDAlbicans ID

C.albicans

Agar BiggyAgar Biggy


Aglutinación de partículas de látexAglutinación de partículas de látex• Las partículas están recubiertas de AcLas partículas están recubiertas de Ac monoclonales que se unenmonoclonales que se unen específicamente con Ag de específicamente con Ag de C. albicansC. albicans y y C. C.

kruseikrusei• Son métodos rápidos Son métodos rápidos • Sensibles y específicos Sensibles y específicos • No requieren personal entrenadoNo requieren personal entrenado• MUY COSTOSOSMUY COSTOSOS

Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del gen. gen. CandidaCandida

Técnicas de biología molecularTécnicas de biología molecular

- Se basan en PCRSe basan en PCR- Más rápidos para la identificación de Más rápidos para la identificación de Candida spp.Candida spp. que los métodos fenotípicos. que los métodos fenotípicos.- Permite identificar aquellas especies que no han podido Permite identificar aquellas especies que no han podido

ser determinadas por métodos fenotípicosser determinadas por métodos fenotípicos- Muy costososMuy costosos- No son aplicables a laboratorios clínicosNo son aplicables a laboratorios clínicos- Laboratorios de referencia - Laboratorios de referencia - Requiere personal especializado- Requiere personal especializado

Gracias

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