UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BARCELONA

EFECTOS FISIOLGICOS Y COMPARTIMENTACIN RADICULAR EN

PLANTAS DE Zea mays L. EXPUESTAS A LA TOXICIDAD POR PLOMO

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BARCELONA

FACULTAD DE CIENCIAS LABORATORIO DE FISIOLOGA VEGETAL

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA ANIMAL, BIOLOGIA VEGETAL Y ECOLOGA

VB Los directores de la Tesis Dr. Juan Barcel Coll Dr. Benet Guns Forcadell

Tesis presentada por

DIANA GARCA VARGAS

Para optar al grado de Doctora en Ciencias Biolgicas

Por la Universidad Autnoma de Barcelona

Juan Barcel Coll, Catedrtico de Fisiologa Vegetal y Benet Guns Forcadell,

Profesor Titular de Universidad de Fisiologa Vegetal de la Facultad de Ciencias de la

Universidad Autnoma de Barcelona.

CERTIFICAN:

Que la biloga Diana Garca Vargas, ha realizado bajo su direccin en el Laboratorio

de Fisiologa Vegetal de la Facultad de Ciencias de la Universidad Autnoma de

Barcelona, el trabajo que para optar al grado de Doctora en Ciencias (Seccin Biologa)

presenta con el ttulo:

EFECTOS FISIOLGICOS Y COMPARTIMENTACIN RADICULAR EN

PLANTAS DE Zea mays L. EXPUESTAS A LA TOXICIDAD POR PLOMO.

Considerando concluida la presente memoria, autorizamos su presentacin, a fin de que

pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente.

Y, para que as conste, firmamos el presente certificado a 3 de julio de 2006.

Juan Barcel Coll Benet Guns Forcadell

Especialmente para mis padres, mis hermanos y mi esposo.

AGRADECIMIENTOS

Muchas personas se vieron implicadas durante m trabajo doctoral. Primero que

todo, quiero agradecer al Dr. Juan Barcel Coll, quien ha dado la idea para trabajar en

este proyecto, siempre crey en m y gestion los recursos para realizar la investigacin

experimental a travs del proyecto BFU 2004-02237-CO2-01 del Ministerio de

Educacin y Ciencia de Espaa y los proyectos 2001SGR 00200 y 2005R-00785 de la

Generalitat de Catalunya.

Quiero agradecer al profesor Benet Guns Forcadell por aceptar la supervisin

de esta tesis y quien acept ser codirector de la misma. Quien condujo la tcnica de

sonda de presin, las determinaciones de los parmetros hdricos en las plantas, as

como los anlisis de microscopa de epifluorescencia y, los anlisis de polarografa

junto con Rosa Padilla. Quien siempre tuvo disposicin para discutir los resultados de la

investigacin. Por su calidad docente como mentor de esta tesis doctoral.

A las personas que trabajan en la unidad de Fisiologa Vegetal por su oportuna

ayuda durante los ltimos tres aos: Charlotte Poschenrieder, Josep Allu, Merc

LLugany, Roser Tolr, Xavi Feixa, Isabel Corrales, Montserrat Amens, Livia Chaves,

Sandra Martn, Rosa Padilla, y Carmen Naya.

Estos pequeos logros personales son posibles gracias al apoyo emocional y

buenos deseos de mis seres queridos durante m bsqueda del saber.

TABLA DE CONTENIDOS 1. INTRODUCCIN

1.1 Estrs por metales pesados..1

1.2 Estrs por plomo......6

1.3 Distribucin de plomo en la raz.9

1.4 Plomo en el apoplasto......9

1.4.1 Pared celular .................................................................................9

1.4.2 Membrana plasmtica..................................................................10

1.5 Transporte de plomo......................11

1.6 Efectos fisiolgicos......................14

1.6.1 A altas concentraciones de Pb.. 14

1.6.2 A bajas concentraciones de Pb...15

1.6.3 Efectos ultraestructurales...............................................................15

1.7 Efectos bioqumicos16

1.7.1 Efectos sobre las actividades enzimticas......17

1.7.2 Efectos sobre la fotosntesis..........................................................19

1.7.3 Efectos sobre la respiracin y contenido en ATP.......................21

1.7.4 Efectos sobre la absorcin de nutrientes........................................22

1.7.5 Efectos sobre las relaciones hdricas.............................................23

1.8 Tolerancia al plomo.......................24

1.8.1 Metabolismo oxidativo...................................................................24

1.8.2 Mecanismos de proteccin vegetal.................................................25

1.8.3 Mecanismos de tolerancia al plomo...26

1.9 Remediacin de suelos contaminados con plomo...29

2. OBJETIVOS...35

3. MATERIAL Y MTODOS......................41

3.1 EXPERIMENTOS REALIZADOS..41

3.2 Muestra biolgica.......................42

3.3 Material vegetal y condiciones de cultivo43

3.4 Mediciones realizadas....44

3.4.1 Actividad del Pb libre.....................................................................44

3.4.2 Medida de la actividad nitrato reductasa.......................................44

3.4.3 Medida del crecimiento..45

3.4.3.1Determinacin del peso fresco, peso seco y contenido hdrico.........45

3.4.3.2 Medida del rea foliar ....46

3.4.3.3 Medicin de la longitud radicular......46

3.4.3.3.1 Crecimiento absoluto...46

3.4.3.3.2 Medida de la extensibilidad de

coleptilos.. 46

3.4.4 Medida de relaciones hdricas y fotosntesis..48

3.4.4.1 Determinacin del potencial hdrico de la parte area48

3.4.4.2 Determinacin del potencial osmtico de raz y parte area........48

3.4.4.3 Determinacin de la conductividad hidrulica y funcionalidad de acuaporinas mediante sonda de presin........49

3.4.4.4 Medicin de la tasa de transpiracin y fotosntesis...51

3.4.5 Compartimentacin. ..52

3.4.5.1 Medida del Pb total....52

3.4.5.2 Medida del contenido y especiacin del Pb en exudados de xilema y en solucin nutritiva.....54

3.4.5.3 Visualizacin de la variacin en el calcio citoplasmtico en puntas de raz..54

3.4.5.4 Compartimentacin y visualizacin de la penetracin de Pb en puntas de raz56

3.4.5.4.1 Visualizacin del Pb apoplstico..56

3.4.5.4.2 Visualizacin del Pb simplstico..57

3.4.6 Visualizacin de la viabilidad celular en el pice radicular mediante tincin vital..........................................57

3.4.7 Tratamiento estadstico..........58

4. RESULTADOS .........63

4.1. Efectos sobre la actividad nitrato reductasa. .63

4.2. Efectos sobre el crecimiento..63

4.2.1 Efectos sobre peso fresco, peso seco y contenido hdrico.....63

4.2.2 Efectos sobre el rea foliar........67

4.2.3 Efectos sobre la longitud radicular........67

4.2.4 Efectos sobre la extensibilidad, plasticidad y elasticidad ........68

4.3. Efectos sobre relaciones hdricas y fotosntesis.......................70

4.3.1 Efectos sobre el H2O de parte area, de raz y parte area y de exudados.........70

4.3.2 Efectos sobre la conductividad hidrulica y la funcionalidad de las acuaporinas. .......72

4.3.2.1 Efectos sobre la presin hidrosttica de la raz...................................................................................72

4.3.2.2 Efectos sobre el mdulo ................................................72

4.3.2.3 Efectos sobre t...........................73

4.3.2.4 Efectos sobre LPr............................................................................................74

4.3.3Efectos sobre la tasa de transpiracin y fotosntesis......78

4.4. Anlisis de compartimentacin 80

4.4.1 Contenido total de Pb en raz y parte area...... 80

4.4.2 Anlisis de exudados y contenido en Pb en exudados y solucin nutritiva..........81

4.4.3 Efectos sobre la compartimentacin de Pb....84

4.4.3.1 Pb apoplstico..85

4.4.3.2 Pb simplstico..........87

4.4.4 Efectos sobre las variaciones de calcio citoplasmtico.....89

4.5. Tincin vital89

5. DISCUSIN.......95 6. CONCLUSIONES...113

7. BIBLIOGRAFA.....117

1

1. INTRODUCCIN

1.1 Estrs por metales pesados.

Algunos metales como el Mn+2, el Fe+3, el Zn+2 o el Cu+2 son esenciales para el

desarrollo normal de las plantas ya que son componentes estructurales y/o catalticos de

protenas y enzimas. Algunos metales, como el Cr+3, V, Ti, Co y Se, a pesar de no ser

esenciales, son beneficiosos. Sin embargo, la actividad humana libera, sobre todo al

suelo, grandes cantidades de metales. El exceso de Al+3, Cd+2, Hg+2, As+3 o Pb+2,

resultan de especial relevancia txica para las plantas.

La fitotoxicidad por metales txicos se manifiesta particularmente en suelos cidos

y afecta tanto el crecimiento como a la formacin de races laterales y secundarias.

Adems, la acumulacin de Cd+2 o Pb+2 supone un peligro adicional al integrarse en la

cadena trfica.

Actualmente se conocen aun poco los mecanismos especficos de absorcin de

metales pesados por las membranas vegetales. Sin embargo, se sabe que por difusin,

flujo en masa e intercambio catinico, los metales alcanzan fcilmente la raz para

seguir la ruta apoplstica o la ruta simplstica. Este rgano constituye la entrada

principal de metal pesado en plantas superiores. La raz posee cargas negativas en sus

clulas rizodrmicas, pertenecientes a polmeros como los grupos carboxilo del cido

pctico y diversas protenas estructurales y enzimticas. Estas cargas negativas, al

unirse en el espacio de la rizosfera a cargas positivas, como las de los cationes metlicos

Pb+2, forman una interfase en equilibrio. Estos cationes entraran por la pared celular,

que es hidrfila y facilita el transporte e intercambio de iones y una vez all, se unirn a

las cargas negativas de la pared celular y sern transportados radialmente, en parte por

la va apoplstica y en parte por la va simplstica. En las zonas apicales jvenes la

banda de Caspari no se ha formado y todo el metal pasa apoplsticamente hasta la zona

vascular, lo que no sucede con races adultas, donde la diferenciacin de tejidos y

formacin de endodermis y exodermis obliga a abandonar la va apoplstica y utilizar la

simplstica (Barcel et al., 2005).

Recientes estudios han demostrado el uso de transportadores en membrana, los

cuales tienen diferente afinidad por algunos metales y facilitan su paso a travs de la

misma. La principal familia se denomina ZIP (ZRT, IRT-like Proteine) (Guerinot,

2

2000).

Respecto al transporte a larga distancia, se considera que los metales viajan desde la

raz hasta el xilema de las hojas como iones libres o acomplejados con un cido

orgnico, siguiendo la corriente de la transpiracin (Longnecker y Robson, 1993). En el

floema se considera la translocacin sistmica de metales absorbidos por las hojas desde

la atmsfera y la acumulacin va floema en semillas y/o frutos. La solubilidad del

metal en el floema se dificulta por la presencia de P y por el pH alcalino. Sin embargo,

se pueden formar complejos con aminocidos o con la nicotinamida.

El primer compartimento celular en contacto con los metales pesados en el espacio

del apoplasto es la pared celular, donde los iones se adsorben a las cargas negativas de

la misma y se almacena gran proporcin de los metales pesados antes de ser absorbidos

por las races. Estos metales se almacenan como precipitados o en forma cristalina en

las paredes de las clulas epidrmicas o del crtex exterior y se ha observado que se

puede favorecer in vitro el desplazamiento de los iones adsorbidos en la pared celular

con soluciones de intercambio catinico.

Algunos metales pueden ocasionar reduccin de la elasticidad y de la extensibilidad

de las paredes celulares (Guns et al., 1997). Estas alteraciones fisicoqumicas de las

paredes celulares se sugiere que pueden deberse a trastornos enzimticos en la

biosntesis de los constituyentes macromoleculares de la pared, cambios en la

distribucin de cargas y en el ensamblaje de los polmeros, cambios en la distribucin

de los microtbulos y del sistema endomembranoso (aparato de Golgi) y/o cambios en

la adhesin entre pared y membrana citoplasmtica.

El segundo compartimento celular en contacto con los iones metlicos es la

membrana plasmtica; por lo tanto, el centro controlador del sndrome txico de la

absorcin de ion metlico hacia el interior de las clulas es el plasmalema. Los efectos

iniciales sobre la membrana citoplasmtica dependen de la actividad inica en la

superficie externa del plasmalema de las clulas radiculares segn clculos utilizando el

mtodo de Gouy-Chapman-Stern (Kinraide, 1994), aunque generalmente los efectos

observados se traducen en rotura de membranas, prdida de la compartimentacin

celular y, como sntomas finales, apoptosis y necrosis.

En condiciones normales, las cargas negativas del plasmalema estn neutralizadas

por cationes como Ca+2 y Mg+2 proporcionando estabilidad a la membrana. Cationes

3

txicos como el Hg+2, con elevada afinidad por los grupos sulfhidrilo de las membranas

ocasionan cierre de las acuaporinas o canales hdricos y excesivo flujo de K+ (Ernst,

1998), a la vez que puede ocasionar la inhibicin competitiva de canales inicos como

el canal de Ca+2.

Aunque el mecanismo primario responsable de la disfuncin de las membranas es la

peroxidacin de lpidos, no se puede confundir el estrs oxidativo de la fase

degenerativa con el metabolismo oxidativo causado por cationes metlicos. Existen

varias estrategias de accin directa e indirecta de los iones metlicos para generar

radicales libres de oxgeno y de especies reactivas al oxgeno (ROS) que, a su vez,

daan crnicamente las membranas, los cidos nucleicos y la fotosntesis (Dietz et al.,

1999).

Los metales pesados inhiben el flujo de electrones de la cadena de transporte o del

Ciclo de Calvin; por lo tanto, cuando la intensidad lumnica es alta, el aparato

fotosinttico absorbe ms energa lumnica que la que suele utilizarse en reacciones

metablicas normales. Como consecuencia, el aparato fotosinttico transfiere la energa

a los nicos aceptores disponibles en los cloroplastos: los radicales de oxgeno, donde

sucede la reaccin de Mehler, cuyo producto, el radical anin superxido, forma

perxido de hidrgeno. El exceso de perxido de hidrgeno fomenta la formacin de

radicales hidroxilo (OH-), oxidantes fuertes de cidos orgnicos que pueden iniciar la

formacin en cadena de nuevos radicales altamente txicos para las clulas.

Adicionalmente, la inhibicin de la cadena de transporte electrnico fotosinttico

tambin puede favorecer la transferencia de energa desde la clorofila excitada por la luz

hacia el O2 formndose oxgeno en estado de singlete, el cual, debido a su elevada

reactividad es altamente txico para las clulas.

La reaccin de defensa de las clulas consiste en la produccin de enzimas

antioxidantes como la peroxidasa y superxido dismutasa (SOD), mediante la cadena

redox ascorbato-glutatin; sin embargo, la toxicidad de los metales pesados ocasiona

disminucin de la capacidad antioxidante de las clulas (Van Assche y Clijters, 1990).

Tambin se ha observado la inhibicin de la asimilacin de CO2, tanto por aumento en

la resistencia estomtica, como de la resistencia mesoflica. Plantas expuestas a Cd, Al,

Cu, Cr, Ni, Zn o Hg mostraron cierre estomtico por dficit hdrico inducido por los

metales a causa de sus efectos txicos iniciales en las races y su interferencia con la

4

absorcin y translocacin del agua.

La reduccin de la apertura estomtica en la inhibicin de la fotosntesis inducida

por metales pesados seguramente depende del tipo de metal (Poschenrieder y Barcel,

1999). El Cd y el Al inhiben, con similar intensidad, la fotosntesis y la transpiracin,

mientras que Zn, Pb y Cu pueden causar una drstica reduccin en la eficiencia del uso

del agua, lo que sugiere que factores diferentes a los propios del cierre de estomas

juegan un papel en la inhibicin de la fotosntesis por estos metales.

Las adaptaciones especficas de las plantas al estrs por metales se basan en

mecanismos de resistencia que reducen su entrada en la planta, o que, una vez

absorbidos, permiten su almacenamiento en lugares no perjudiciales para las clulas.

Inicialmente se manifiestan los mecanismos de prevencin o avoidance segn

Levitt (1980), que permiten mantener una baja concentracin de metal en el simplasto

tales como:

o la exudacin de sustancias hacia la rizosfera. o la inmovilizacin en el apoplasto. o la secrecin foliar. o la volatilizacin. o el eflujo.

La absorcin de metales puede disminuir por unin a cidos orgnicos exudados al

suelo por los pices radiculares o por los localizados en las paredes celulares, as como

por la restriccin de su transporte a travs de la membrana plasmtica. La naturaleza

quelante de metales de los cidos orgnicos es caracterstica de cada especie. Para el

maz y la juda es el citrato, y para el trigo es el malato (Tudela y Tadeo, 1993).

Adicionalmente, los metales tambin tienen afinidad por fenoles y ciertos

aminocidos tales como los siderforos de origen microbiano y los fitosiderforos

exudados por las propias plantas. El muclago (mucopolisacridos) segregado por la

cofia, mantiene hmeda la zona apical radicular y favorece la penetracin de la raz a

travs del suelo; adems, puede retener en sus cargas negativas cationes como Pb2+,

Cu2+ o Cd2+ previniendo la entrada de estos iones txicos al pice radicular (Marschner,

1995).

La inmovilizacin acumula una proporcin importante del contenido total de

metales de una planta en tres fracciones apoplsticas radiculares: en el espacio libre de

5

agua para las formas solubles; en el espacio libre de Donnan formado por cargas

negativas de los cidos poligalacturnicos, los cuales se unen a los cationes metlicos

en funcin de la secuencia Al > Pb > Cr > Cu > Zn = Mn (Ernst et al., 1992, Rengel,

1997) y en la superficie, pared o espacios intercelulares de las races como depsitos

slidos (Barcel y Poschenrieder, 1999).

El eflujo activo a travs del plasmalema puede cambiar las propiedades

fisicoqumicas del suelo y la especiacin de los metales manteniendo bajas

concentraciones de metales en el simplasto.

Una vez han entrado los metales en la clula, empiezan a funcionar los mecanismos

de tolerancia que permiten soportar altas concentraciones de metal en el simplasto y

facilitan el almacenamiento de los iones txicos en lugares no perjudiciales para las

clulas. Estos mecanismos son:

o Desintoxicacin (complejos con cidos orgnicos). o Compartimentacin (acumulacin en vacuola). o Actividad de enzimas tolerantes.

Los metales absorbidos en la clula pueden ser eliminados del citoplasma por unin

a los mismos cidos que tambin estn presentes en la pared, o mediante enlaces tiol a

pptidos de bajo peso molecular ricos en el aminocido cistena (fitoquelatinas).

Posteriormente, los metales unidos a estos compuestos son almacenados en la vacuola

(Ernst, 1975). Las fitoquelatinas son ricas en grupos SH, por lo que tambin se les

conoce como cadistinas.y presentan elevada afinidad para cationes de metales. Los

diferentes iones metlicos tienen diferente capacidad de inducir la sntesis de

fitoquelatinas, segn la progresin Hg > Cd > As > Ag > Cu > Ni > Pb > Zn. La

sensibilidad al Cd aumenta en plantas tratadas con BSO (un inhibidor de la sntesis de

fitoquelatinas) y en mutantes de Arabidopsis thaliana con bajos niveles de glutatin el

cual es un precursor de la sntesis de fitoquelatinas. Parece que la sntesis de

fitoquelatinas es esencial para niveles constitutivos normales de tolerancia al Cd, Hg y

As, pero no para la tolerancia normal al Cu o Zn. La hiptesis de que las fitoquelatinas

acten como posible forma de transporte de metales, especialmente del Cd, las

relaciona, adems, con la compartimentacin vacuolar. No obstante, la elevada

tolerancia al Cd seleccionada bajo condiciones naturales en metalofitas no se debe,

aparentemente, a las fitoquelatinas. As, a igual concentracin externa, algunos ecotipos

6

sensibles al Cd de Silene vulgaris sintetizan ms fitoquelatinas que los tolerantes. El

estmulo de la sntesis de fitoquelatinas es una respuesta a la presencia de elevadas

concentraciones internas de iones metlicos txicos de forma que ms que un sntoma

de tolerancia, parece ser un marcador bioqumico de la tensin sufrida por la planta (De

Knecht et al., 1994).

El anlisis de la actividad enzimtica en medios con concentraciones crecientes de

metales pesados, por regla general, muestra que no hay diferencias sustanciales entre

metalofitas y plantas no tolerantes en la sensibilidad de las enzimas citoplasmticas a la

toxicidad de iones metlicos (Ernst et al, 1992). Sin embargo, se han observado

diferencias en la actividad de enzimas extracelulares tales como fosfatasa cida en

ecotipos de Agrostis tenuis con tolerancia diferencial al Cu (Woolhouse y Walter,

1983). Esta observacin implica que diferencias en la tolerancia a elevadas

concentraciones tisulares de metales pesados se deben, por regla general, a diferencias

en la especiacin y/o compartimentacin de estos metales. No obstante, hasta la fecha

hay pocos datos para poder establecer, con carcter general, una clara relacin entre la

especiacin apoplstica y/o simplstica de los metales, las actividades enzimticas y las

diferencias genticas en la tolerancia (Poschenrieder y Barcel, 2003).

1.2 Estrs por plomo

El plomo es un miembro del Grupo IVB de la tabla peridica de los elementos.

Tiene dos estados de oxidacin, Pb (II) y Pb (IV), que son estables, pero la qumica

ambiental del elemento es dominada por el ion plumboso (Pb2+). El Pb elemental es un

denso metal azul grisceo (11.3 g/cm3 ) con punto de fusin a 327 C y de ebullicin a

1744 C. El bajo punto de fusin permiti fundirlo y trabajarlo en las sociedades

primitivas. El metal es muy blando y tiende a deslizarse. Es por eso que fcilmente se

puede cortar y moldear y durante mucho tiempo ha sido usado sobre tejados o para la

fabricacin de caeras. El plomo metlico es relativamente opaco a la radiacin

ionizante, y hace de escudo de defensa al trabajar con rayos X y radioistopos.

El plomo se une a otros metales fcilmente: el Pb/Sb es principalmente usado para

hacer placas de bateras pero tambin es usado para las balas de las armas y

frecuentemente sta aleacin se usa para soldar. El plomo metal en combinacin con

PbO2, es usado para fabricar el plomo cido en los electrodos de acumuladores y

7

bateras. Otros componentes inorgnicos son ampliamente usados. Por ejemplo, el

cromato amarillo para pintar las calzadas y muchas otras pinturas contienen xidos de

plomo. Tambin se usan jabones de plomo para promover la polimerizacin en la

industria petroqumica del plstico. Existe una extensa qumica orgnica de los

compuestos del plomo (IV), especialmente tetra-alquilos y tetra-arilos (Greninger,

1974).

El plomo no es un elemento esencial o beneficioso para las plantas y animales. Es

un veneno bien conocido para los mamferos y en humanos se teme a los sndromes

clnicos de la toxicidad por plomo.

El plomo afecta el sistema nervioso humano, la produccin de clulas sanguneas,

los riones, el sistema reproductivo y la conducta. La intoxicacin producida por el

plomo se denomina saturnismo y sus sntomas se manifiestan como la aparicin de

fatiga, dolores de cabeza, dolores musculares y de estmago, anorexia, estreimiento y,

en su fase ms crtica, "clico del plomo", es decir, calambres abdominales intensos,

acompaados de nuseas, vmitos y presin arterial elevada. Han sido observados casos

concretos en nios que han estado en contacto con el suelo o con partculas en

suspensin (Wixson, 1994) que presentaron plomo en sangre. Segn Nriagu, (1978) el

plomo ha sido el veneno de la antigedad porque reside en el suelo y, debido a su baja

solubilidad, resiste la degradacin microbiana; en suma, permanece biodisponible para

el futuro.

La contaminacin por plomo originariamente es debida a la extraccin de minerales

de plomo del suelo utilizando el calor en los afloramientos naturales. El agua

transportada por percolacin, lixiviacin o escorrenta, es decir, por procesos propios

del ciclo hidrolgico transporta plomo en pequeas partculas provenientes de las minas

(Laxen y Harrison, 1977). Otras actividades antropognicas hacen que predomine en las

zonas rurales, urbanas e industriales.

Las principales fuentes de contaminacin por plomo son:

o Deposicin area en minas explotadas o Gases contaminantes urbanos o Partculas de combustible no quemado o Deposicin de residuos slidos urbanos (Chaney y Ryan, 1994) o Fundicin de minerales

8

o Efluentes de plantas de reciclaje de bateras industriales o Chimeneas de fbricas o Aditivos para pinturas y gasolina (Eick et al., 1999) o Uso de municiones militares (Shmaefsky, 2003; Brian, 2003) o Procesos de plateado y terminacin de metales o Uso de fertilizantes (Stefanov et al., 1995; Shmaefsky, 2003)

El plomo se une preferentemente a oxgeno, grupos amino o sulfhidrilo y ocasiona

estrs inico debido a su elevado ndice de covalencia. En la mayora de los casos, el

catin libre (Pb2+) suele ser la forma ms fitotxica.

Los factores que afectan la disponibilidad y absorcin de plomo son el tamao de

las partculas del suelo y la capacidad de intercambio catinico, adems de los factores

de la planta tales como la superficie de la raz, los exudados de la raz, la micorrizacin

y la tasa de transpiracin (Davies, 1995).

El plomo est clasificado como un cido dbil de Lewis dado que es una sustancia

que sin contener hidrgeno se comporta como un cido siendo capaz de aceptar un par

electrnico mediante la formacin de enlaces covalentes coordinados segn la Teora de

Lewis Gilbert Newton (1875-1946). Por lo tanto, el plomo presente en el suelo esta

estrechamente ligado a la materia orgnica de las plantas o materia coloidal del suelo o

como precipitado. Todas estas formas reducen la absorcin de plomo por las races de

las plantas.

La absorcin de plomo como plomo metal en el suelo sigue la relacin de Langmuir,

incrementndose en funcin del incremento del pH desde 3.0 hasta 8.5 (Lee et al.,

1998). En este sentido, Nikazar y Afshari (2005) en un estudio sobre la adsorcin de Pb

(), Cd () y Cr (VI) sobre paja y salvado de trigo empleando tcnicas de columna

observaron que la adsorcin de Pb (), Cd () y Cr (VI) aumenta al crecer el pH, y

disminuye cuando se aumenta la temperatura y la velocidad de flujo de la solucin. Sin

embargo, Blaylock et al. (1997) han mostrado que en el suelo con un pH entre 5.5 y 7.5

la solubilidad del plomo es controlada por fosfato o precipitados de carbonato y muy

poco plomo est disponible para las plantas incluso aunque stas presenten la capacidad

gentica para acumularlo.

En la investigacin sobre la fitototoxicidad del plomo predomina el estudio de la

capacidad de acumulacin del plomo y su posible transmisin hacia el hombre a travs

9

de la cadena trfica. Por tal razn, las plantas son tiles para conocer los mecanismos de

absorcin y transporte de plomo con el objeto de conseguir la seleccin y el desarrollo

de variedades tolerantes, capaces de aumentar la acumulacin del elemento en sus

tejidos.

1.3 Distribucin de plomo en la raz

Hacia la superficie de la raz el Pb2+ se une a los grupos carboxilo del cido urnico

del muclago. El muclago establece una barrera importante protegiendo el sistema

radicular del metal entrante. Algunas de las uniones de los metales son liberadas cuando

el muclago es biodegradado (Morel et al., 1986).

Los microorganismos del suelo pueden afectar la disponibilidad del metal pesado

por procesos de biosorcin, bioacumulacin y solubilizacin. Adicionalmente, las

ectomicorrizas pueden influenciar la entrada, transporte y toxicidad del Pb2+ en abeto

noruego (Marschner et al. 1996).

1.4 Plomo en el apoplasto

1.4.1 Pared celular

La retencin de plomo en las races est basada en la unin de Pb2+ hacia iones con

sitios intercambiables sobre la pared celular formando depsitos en la misma. Esta

precipitacin extracelular corresponde principalmente a la forma de carbonato de

plomo.

La adicin de quelantes sintticos, tal como H-EDTA o EDTA, en combinacin con

un bajo pH, previene la retencin de Pb2+en la pared celular, permitiendo su absorcin y

translocacin hacia la parte area (Jarvis y Leung, 2002), siendo la localizacin del

metal mayor en races que en otras partes de la planta. El Pb2+ se une fuertemente a los

grupos carboxilo del cido galacturnico y al propio cido galacturnico en la pared

celular, el cual restringe su transporte va apoplasto (Rudakova et al., 1988).

1.4.2 Membrana plasmtica

En general, las plantas dicotiledneas acumulan significativamente altas cantidades

de plomo en races en comparacin con las races de las plantas monocotiledneas

10

(Huang y Cunningham, 1996). El plomo transportado desde el suelo hacia las clulas

tiene que cruzar la membrana plasmtica de las clulas de la raz. Una posible va de

transporte de plomo a travs de la membrana plasmtica parece que es a travs de los

canales catinicos de la msma, tales como canales de Calcio. En este sentido, ha sido

caracterizado un canal de Ca+2 operado por voltaje en la membrana plasmtica de raz

en trigo y maz (Marshall et al., 1994; Huang et al., 1994). Huang y Cunningham

(1996) encontraron que el Pb2+ inhibe significativamente el voltaje medido como

consecuencia de la actividad de los canales de Ca+2 en el plasmalema de races de

trigo. La inhibicin de los canales de Ca+2 por Pb2+ puede originarse por bloqueo del

canal por el Pb2+ o debido a transporte competitivo de Pb2+ a travs del canal de Ca+2.

Los bloqueadores de los canales del calcio son capaces de inhibir la proliferacin

celular y la falta de calcio ocasiona la apoptosis o muerte celular. En este sentido,

Tomsig y Suszkiw (1991), observaron permeacin de plomo a travs de los canales de

calcio en clulas cromafnicas de mdula de glndulas suprarrenales de bovino. Estos

investigadores encontraron que el voltaje emitido por transporte de plomo fue

bloqueado por nifedipina (bloqueador del canal de Ca+2 ) e incrementado por BAY

K8644, un canal de calcio tipo-L que inhibe el flujo de Ca+2 a travs de un receptor con

un ligando de glutamato Donald (1999). Su toxicidad depende parcialmente de su

activacin por voltaje emitido (sensibilidad al txico plomo) por los canales de calcio.

Sin embargo, se puede hacer reversible la toxicidad por despolarizacin, ya que puede

beneficiar la supervivencia de las clulas a travs de otros mecanismos diferentes al

flujo de calcio a travs del voltaje emitido por los canales de calcio.

Por otra parte, el Ca2+ bloquea el transporte de Pb2+ dentro de la raz y, en

consecuencia, disminuye la toxicidad por Pb2+ sobre el crecimiento de la misma. El

efecto protector del Ca+2 sobre la toxicidad del Pb2+ puede ser relacionada con su

inhibicin para ser acumulado el metal pesado en la punta de la raz, sitio

potencialmente blanco de la toxicidad del Pb2+. El Mg2+, a pesar de que bloquea tanto

como el calcio la absorcin de Pb2+, no mejora la toxicidad por Pb2+ sobre el

crecimiento de la raz tanto como el calcio. Estos resultados sugieren que el efecto

protector del Ca+2 sobre la toxicidad del Pb2+ involucra mltiples mecanismos,

incluyendo la competicin para entrar, y que el Pb2+ y el Cd2+ pueden competir con

cationes divalentes por el transporte dentro de las races de plantas de arroz (Yo-

11

Young., et al. 2002).

1.5 Transporte de plomo

El plomo se mueve predominantemente dentro del apoplasto de la raz en una forma

radial a travs del crtex y se acumula cerca de la endodermis. La endodermis acta

como una barrera parcial al movimiento de plomo entre la raz y la parte area. Tal y

como muestran la mayora de datos referidos a la elevada acumulacin de plomo en

races comparada con la de la parte area (Jones et al., 1973; Verma y Dubey, 2003). En

semillas de Oryza sativa L. germinadas durante 10 20 das en cultivos de arena con

solucin nutritiva a la que se aadi 500 M o 1000 M Pb(NO3)2, el crecimiento de las

races fue reducido entre un 22 % y un 42 %, mientras que el crecimiento de la parte

area fue reducido en un 25 %, ya que la localizacin de plomo absorbido fue 1.7 a 3.3

veces ms alta en las races que en la parte area. El transporte limitado de plomo desde

las races hacia otros rganos es debido a la barrera de la endodermis de la raz. Parece

ser que la banda de Caspari de la endodermis es el mayor factor limitante que restringe

el transporte de plomo dentro del tejido del cilindro central (Seregin e Ivanov, 1997).

Sin embargo, parece haber controversia sobre el movimiento del plomo en la raz pues,

si bien Lane y Martin (1977) afirman que el plomo se mueve en el simplasto, segn

Broyer et al., (1972) el movimiento del plomo en la raz sigue primariamente la va del

apoplasto debido a que una proporcin representativa de plomo es extrada del agua.

Tericamente, segn Snchez y Aguirreola (1993) se pueden resumir tres vas

anatmicamente diferentes a travs de las cuales podra moverse el agua:

En primer lugar, la ruta externa al citoplasma vivo, es decir, el continuo de paredes

celulares externo a la membrana celular. Esta va se denomina apoplasto. El apoplasto

de la raz representa, aproximadamente, un 10% del volumen de la misma y equivale al

espacio libre.

En segundo lugar, existe la posibilidad de que el agua atraviese la pared celular y el

plasmalema, para entrar luego en el citoplasma. Posteriormente, se movera a lo largo

del continuo citoplasmtico a travs de los plasmodesmos que conectan el citoplasma

con las clulas adyacentes. Esta ruta, que representa la porcin viva de la clula, se

denomina va del simplasto.

Finalmente, existe la posibilidad de que el agua atraviese tanto el plasmalema como

12

el tonoplasto, de tal manera, que la vacuola pasara a ser una parte integral de la va de

transporte.

La posibilidad de transporte simplstico del plomo ha sido demostrada en races de

cebolla e hipoctilos de berro (Wierzbicka, 1987). Altas concentraciones de plomo

causan lesiones e interrupcin en la funcin de la barrera del plasmalema tanto en la

permeabilidad selectiva del plasmalema como en el tonoplasto.

Se ha demostrado que el plomo se retiene ms en la superficie del plasmalema que

en las paredes celulares. El plomo puede entrar en clulas daadas junto con otros

componentes como determinados colorantes, los cuales no entran en clulas no daadas

(Seregin et al., 2004).

El patrn de distribucin de plomo en la raz difiere considerablemente dependiendo

de concentraciones de plomo y variando segn la concentracin (Seregin et al., 2004).

A bajas concentraciones de plomo predomina el flujo de iones plomo en el apoplasto,

mientras que a altas concentraciones, la barrera funcional de plasmalema es daada y

una gran cantidad de plomo penetra dentro de las clulas.

En general, la aparente concentracin de plomo en partes areas de la planta decrece

con la distancia desde las races. La principal causa es que la mayor concentracin de

plomo se halla en las paredes celulares de la raz a diferencia de otras partes de la

planta. Adicionalmente, se presentan uniones con el plomo en tejidos lignificados con

mayor frecuencia que en tejidos no lignificados. En este sentido, Suchodoller (1967)

observ mayor retencin de plomo en la epidermis de la raz de cebada y una mnima

cantidad en los tejidos vasculares, lo que sugiere que hasta cierto punto la localizacin

de plomo en diferentes tejidos de la planta es tambin dependiente de la especie.

En semillas, la testa previene la entrada de plomo dentro de los tejidos internos hasta

su ruptura por el desarrollo de la radcula. Una vez la testa se rompe, el plomo entra

rpidamente, con notables excepciones, en las regiones meristemticas de la radcula e

hipoctilos. En los cotiledones, el plomo se mueve a travs de los tejidos vasculares y

tiende a acumularse en reas discretas en las partes dstales (Lane y Martin, 1977).

El contenido de plomo en varios rganos de la planta tiende a decrecer en el

siguiente orden: races > hojas > tallos > inflorescencia > semillas. Sin embargo, este

orden puede presentar variaciones intraespecficas (Antosiewicz, 1992).

En plantas de cebolla (Allium cepa), el plomo absorbido es localizado en altas

13

concentraciones en las puntas de la raz seguidas por partes proximales de la raz,

mientras que bajas concentraciones han sido encontradas en la base de la raz (Michalak

y Wierzbicka, 1998). Las hojas difieren su capacidad para acumular plomo dependiendo

de la edad. El mximo contenido de plomo es encontrado en hojas senescentes y el

mnimo en hojas jvenes (Godzik, 1993).

Estudios ultraestructurales han revelado que cantidades variables de depsitos de

plomo estn presentes principalmente en el espacio intercelular, pared celular y

vacuolas, mientras que pequeos depsitos de este metal han sido vistos en el retculo

endoplasmtico, dictiosomas y vesculas derivadas de los mismos. La pared celular y la

vacuola juntas suman 96% del plomo absorbido (Wierzbicka y Antosiewicz, 1993).

El factor por el cual el plomo es encontrado en el retculo endoplasmtico y

dictiosomas est aparentemente relacionado con la secrecin del metal de la superficie

celular dentro de la vacuola. Puesto que una pequea cantidad de plomo alcanza el

ncleo, cloroplastos y mitocondrias, es lgico suponer que ejerce su efecto txico sobre

estos orgnulos.

Los gradientes del potencial electroqumico entre vacuolas y la solucin externa de

clulas de la hoja de Potamogeton sp., vara entre [-150 y -240 mV], lo cual debe

favorecer una entrada pasiva de plomo dentro de las vacuolas durante el tratamiento con

este metal (Denny y Weeks, 1968).

De particular inters es la invaginacin del plasmalema para formar vacuolas

pinocitticas en muchas especies de plantas, tal como en Stigeoclonium. La formacin

de tales vacuolas es importante para el secuestro del exceso de iones metlicos de forma

que dichas vacuolas podran proteger los contenidos celulares de los efectos txicos del

plomo (Silverberg, 1975). Frecuentemente, en regiones muy prximas a los

plasmodesmos, se encuentran partculas grandes de plomo ocupando una elevada

porcin del volumen de la pared celular. En otras regiones donde la pared celular es ms

gruesa y substancial, partculas pequeas se sitan dentro de la pared celular hacia la

periferia. La deposicin de aquellas partculas pequeas de plomo ocurre posiblemente

a travs de la accin de vesculas pinocitsicas (Ksiazek et al., 1984).

Por otro lado, el estudio de la localizacin del plomo en clulas de plantas acuticas

an est en proceso de investigacin. Plantas de Lemma minor L. tratadas durante una

hora con plomo mostraron contenidos elevados de plomo en vacuolas pequeas, a la vez

14

que en tratamientos a ms largo plazo (6 y 12 h) se observ un incremento del

contenido en Pb en la pared celular (Samardakiewicz y Wozny, 2000). La localizacin

de plomo en la pared celular posiblemente es consecuencia de una redistribucin de

plomo y refleja un incremento en el transporte apoplstico A su vez, la presencia de

plomo en vesculas pequeas en Lemma minor sugiere que la endocitosis juega un papel

importante en la entrada de plomo en estas plantas.

1.6 Efectos fisiolgicos

La fitotoxicidad por plomo ocasiona desordenes en las actividades fisiolgicas

normales de las plantas hasta matar eventualmente las clulas a altas concentraciones

(Ernst, 1998; Seregin e Ivanov, 2001). Los principales procesos fisiolgicos afectados

son la actividad enzimtica, la nutricin mineral, el potencial hdrico, el estatus

hormonal, la estructura de la membrana y el transporte de electrones.

Los sntomas de toxicidad por Pb pueden dividirse en sntomas no especficos y

especficos. Segn Burton et al. (1984), los sntomas visuales no especficos consisten

en una inhibicin rpida del crecimiento radicular, reduccin del rea foliar, clorosis y

aparicin de manchas pardo-rojizas fenlicas en tallos, pecolos y hojas, y necrosis

foliar. Por otra parte, segn Mishra y Choudhari (1998), la toxicidad por plomo inhibe

la germinacin de las semillas y retarda el crecimiento de las plantas. Los sntomas

especficos consisten en una disminucin del porcentaje e ndice de germinacin, de la

proporcin longitud radicular/parte area, del ndice de tolerancia a plomo y mercurio,

y del peso seco de las races y de la parte area.

La anterior sntesis permite introducir varias investigaciones publicadas sobre

efectos adversos por plomo en plantas. Estos efectos se pueden separar en dos grupos:

efectos adversos a altas concentraciones de plomo y efectos adversos a bajas

concentraciones de plomo.

1.6.1 A altas concentraciones de Pb

Los efectos ocasionados por el plomo a altas concentraciones son:

Disminucin del 14 al 30 % en la germinacin de semillas de arroz y

reduccin del crecimiento de semillas de 13 a 45 % con 1mM Pb (Verma

y Dubey, 2003).

15

Reduccin del nmero de semillas en germinacin y encogimiento del

hipoctilo de Lupinus (Wozny, et al., 1982).

Inhibicin de crecimiento de la raz a 10-2 - 10-6 M Pb in vitro o con un

contenido superior a 10 mg / kg de contenido de plomo en el suelo

(Breckle, 1991).

A nivel celular el plomo inhibe las actividades de enzimas que contienen

grupos sulfhidrilo (-SH) necesarios para su actividad (Van Assche y

Clijsters, 1990).

1.6.2 A bajas concentraciones de Pb

Los efectos ocasionados por el plomo a bajas concentraciones son:

Mayor sensibilidad en el desarrollo y la extensin de la raz principal a

diferencia de las races laterales (Obroucheva et al., 1998).

Incremento del contenido de plomo en las races en relacin directa con

la concentracin en niveles de entre 0.1 y 2 M de Pb en Picea abies.

Paralelamente, cuando se realiza una exposicin de las plantas a 0.5 M

de Pb durante 4 semanas se reduce el crecimiento de las races primaria,

secundaria y terciaria (Godbold y Kettner, 1991).

En semillas de Zea mays, se ha observado una fuerte inhibicin del

crecimiento de la raz primaria y una corta zona de ramificacin cuyas

races laterales son ms compactas, ocupando una posicin mucho ms

ntima en la punta de la raz con respecto a races crecidas en la ausencia

de plomo (Obroucheva et al., 1998).

1.6.3 Efectos ultraestructurales

Estudios sobre el crecimiento radicular, divisin celular, morfologa cromosmica y

de los nucleolos de las clulas de las puntas de raz de Allium cepa L. a diferentes

concentraciones de Pb(NO3)2, realizados por Yang et al. (2000), pusieron de manifiesto

una inhibicin en el crecimiento radicular. Este efecto fue posteriormente confirmado

por la presencia de irregularidades mitticas y adhesin de los cromosomas.

Durante la interfase, las clulas de las races tratadas con Pb presentaban

micronucleosis, irregularidad en la forma del ncleo y descomposicin del material

16

nuclear (Wierzbicka, 1994). Paralelamente, se detectaron perturbaciones en el

alineamiento de los microtbulos a una concentracin dependiente de una concentracin

inicial de 10 M, lo que contribuye a la inhibicin del crecimiento de la raz (Yang et

al., 2000).

El plomo destruye los microtbulos del huso mittico causando cmitosis

(colchicina-mitosis) caracterizada por bloqueo celular en prometafase. En otras

palabras, el plomo inhibe la formacin del huso cromtico. Este bloqueo, sin embargo,

no es permanente (Wierzbicka, 1994).

En conclusin, los microtbulos de diferentes regiones del meristemo de la raz y de

diferentes estadios del ciclo celular muestran susceptibilidad diferencial al plomo.

Poschenrieder et al (2004) hallaron que el Al induce alteraciones de la organizacin y

orientacin de los microtbulos antes de que se produzca la inhibicin de la elongacin

radicular.

A partir de las anteriores experiencias se ha propuesto como hiptesis que la

inhibicin del crecimiento radicular bajo toxicidad con plomo puede ser un resultado de

la inhibicin de la divisin celular de las puntas de la raz (Eun et al., 2000).

1.7 Efectos bioqumicos

Los primeros estudios sobre la accin del plomo a nivel bioqumico se centraron en

descripciones sobre la considerable reduccin de la sntesis de DNA, RNA y protenas

en el embrin axial, y en los endospermos de plantas de arroz en germinacin sometidos

a concentraciones crecientes de plomo (Maitra y Mukherji, 1977).

Asimismo se ha aceptado que la toxicidad por plomo adems de disminuir los

niveles del contenido de protenas en tejidos tambin causa alteraciones significativas

en la composicin lipdica (Przymusinski et al., 1991; Stefanov et al., 1995). En el caso

de P. vulgaris y Z. mays se observaron cambios sustanciales a nivel de glucolpidos,

especialmente monogalactosil y diacilgliceroles, los cuales fueron asociados con

alteraciones en la permeabilidad de la membrana en los cloroplastos (Stefanov et al.,

1993). Especficamente, al incubar cloroplastos con concentraciones constantes de sales

de plomo, los niveles de cidos grasos insaturados ascendieron notablemente con

respecto a los cidos grasos saturados (18:3) (Stefanov et al., 1995).

Los datos sobre la disminucin en el peso seco presentan variabilidad. As,

17

(Kosobrukhov, 2004) observaron una disminucin en Plantago major bajo tratamiento

con plomo pero en ciertos casos, tales como en plantas de maz, se ha observado un

aparente incremento en el peso seco de los rganos de las plantas que fueron

correspondidos con un incremento de la sntesis de polisacridos de la pared celular al

ser expuestos a tratamientos con plomo (Wierzbicka, 1998).

Por otra parte, Malkowski et al., (2002) trabajando con maz con concentraciones de

plomo 10-4 10-3 M, observaron que el crecimiento del mesoctilo y del coleptilo

fueron afectados de forma similar; sin embargo, la concentracin de plomo en el

mesoctilo fue tres veces mayor que en el coleptilo, proponiendo que la disminucin

del crecimiento de la parte area en maz no es una consecuencia de la liberacin de

potasio o de la acumulacin de plomo en la raz, sino que es debido a una seal no

conocida inducida en las races, como respuesta a la exposicin por plomo la cual es

transmitida a la parte area.

1.7.1 Efectos sobre las actividades enzimticas

Las actividades de un amplio rango de enzimas de diferentes vas metablicas son

afectadas por el plomo. La inhibicin del 50 % de la mayora de enzimas se produce a

una concentracin de entre 10-5 y 210-4 M de plomo. A esta concentracin se hace

referencia en trminos de la constante de inactivacin (Ki).

La inhibicin sobre la actividad enzimtica es causada por la interaccin de Pb con

los grupos sulfidrilo (SH) que estn presentes en el centro activo de los enzimas, los

cuales son esenciales para la estabilizacin de su estructura terciaria. Adems, la

reaccin con los grupos (SH) puede bloquear los grupos COOH con iones plomo, lo

que parecer tambin juega un papel importante en la inhibicin de la actividad

enzimtica bajo el tratamiento con este metal (Levina, 1972).

18

El plomo forma un mercptido con el grupo (SH) de la cistena y tambin forma

complejos con grupos fosfato. La inhibicin de metaloenzimas bajo tratamiento con

plomo parece ser debida a un desplazamiento del metal esencial por plomo. La

inhibicin de la actividad enzimtica debida al plomo no parece ser especfica para este

metal: tales inhibiciones son tambin evidentes con otros cationes que tienen

PROCESOS

METABLICOS

ENZIMAS ESPECIES

VEGETALES

EFECTO

DEL Pb

REFERENCIAS

Sntesis de Clorofila

-amino levulinato dehidrogenasa

Pennisetum typhoideum

( - ) Prassad &

Prassad (1987)

Ribulosa-1,5 bis fosfato Avena sativa ( - ) Moustakas et al. (1994)

Fosfoenol Piruvato Zea mays ( - ) Vojtechova

Fijacin de CO2

Carboxilasa & Leblova (1991)

Gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa

Spinach oleracea ( - ) Vallee & Ulmer (1972) Ciclo de Calvin

Ribulosa 5 fosfato kinasa

Spinach oleracea ( - ) Vallee & Ulmer (1972)

Glucosa 6-fosfato Spinach oleracea ( - ) Vallee & Ulmer (1972) Va Pentosa Fosfato Dehidrogenasa

Nitrato reductasa Cucumis sativus ( - ) Burzynski (1984) Asimilacin De N2 Glutamina sintetasa Glicine max ( - ) Lee et al. (1976)

Deoxyribonucleasa Hydrilla verticillata

( + ) Jana & Choudhary (1982) Enzimas Nucleolticas

Ribonucleasa Hydrilla verticillata

( + ) Jana & Choudhari (1982)

Hidrlisis de Protenas

Proteasa Hydrilla verticillata

( + ) Jana & Choudhari (1982)

Fosfohidrolasa Alcalina fosfatasa Hydrilla verticillata

( + ) Jana & Choudhari (1982)

Acido fosfatasa Glycine max ( + ) Lee et al. (1976)

Metabolismo De Glucosa

-amilasa Oryza sativa ( - ) Mukherji & Maitra (1977)

ATP sintetasa Zea mays ( - ) Tu Shu & Brouillette (1987) Generacin de Energa ATPasa Zea mays ( - ) Tu Shu & Brouillette (1987)

Catalasa Oryza sativa ( - ) Verma & Dubey (2003)

Guiacol peroxidasa Glicine max ( + ) Lee et al. (1976)

Ascorbato oxidasa Phaseolus aureus ( + ) Rashid & Mukherjee (1991)

Ascorbato peroxidasa Oryza sativa ( + ) Verma & Dubey (2003)

Glutatin reductasa Oryza sativa ( + ) Verma & Dubey (2003)

Metabolismo Antioxidativo

Superxido dismutasa Oryza sativa ( + ) Verma & Dubey (2003)

Tabla 1: Inhibicin (-) o incremento (+) de la actividad enzimtica en plantas tratadas con Pb. Tomado de

Sharma y Dubey (2005).

19

comparables afinidades por grupos proteicos funcionales. Sin embargo, las actividades

de algunos enzimas se han visto incrementadas al ser expuestas a plomo. Tales

resultados aparentemente conciernen a cambios en la sntesis enzimtica,

inmovilizacin de los inhibidores de los enzimas, o como un resultado efector de

molculas, las cuales son sintetizadas bajo fitotoxicidad con plomo.

Las actividades enzimticas afectadas por la toxicidad por Pb han sido ampliamente

reportadas por varios investigadores basndose en los principales procesos metablicos

que suceden en las especies vegetales. Los efectos del plomo se presentan con un signo

(+/-) indicando un incremento o un decrecimiento de la actividad enzimtica por accin

del plomo (Tabla 1).

1.7.2 Efectos sobre la fotosntesis

El proceso de la fotosntesis de las plantas es alterado en los cloroplastos por la

toxicidad por plomo causando innumerables efectos adversos. Sin embargo, se pueden

resumir a continuacin para facilitar su comprensin:

o Disminucin de la tasa fotosinttica o Distorsin de la ultraestructura del cloroplasto o Restriccin de sntesis de clorofila, plastoquinona y carotenoides o Obstruccin de transporte de electrones o Inhibicin de actividades enzimticas del ciclo de Calvin. o Deficiencia de CO2 como un resultado de cierre estomtico.

Los cloroplastos son los principales rganos indicadores de los daos ocasionados

por el plomo sobre el proceso metablico de la fotosntesis. Plantas de Ceratophyllum

demersum crecidas en medio acutico con Pb (NO3)2 mostraron distintos cambios en la

ultraestructura de los cloroplastos (Rebechini y Hanzely, 1974). Las clulas de las hojas

de tales plantas exhibieron reduccin de apilamientos de granas junto con una reduccin

en la cantidad de estroma en relacin con la del sistema lamelar. Tambin exhibieron

ausencia de granos de almidn. El tratamiento con plomo tambin cambi la

composicin lipdica de las membranas tilacoidales en hojas de Zea mays L. (Stefanov

et al., 1995).

El plomo perjudica la absorcin de elementos esenciales tales como hierro y

magnesio en plantas de pepino y, como consecuencia, inhibe la sntesis de clorofila

20

(Burzynski, 1987). Estos daos de los aparatos fotosintticos son debido a la afinidad

del plomo por ligandos de protenas N- y S- (Ahmed y Tajmir-Riahi, 1993). Asimismo

se ha observado degradacin de la clorofila debido al incremento de la actividad

clorofilasa (Drazkiewicz, 1994). Tambin se ha hallado que la clorofila b es ms

afectada que la clorofila a por tratamiento con plomo en abetos de Noruega (Vodnik et

al., 1999).

Acerca del efecto sobre la obstruccin del transporte de electrones (Rashid et al.,

1994) se sabe que el plomo afecta el sitio donador y el sitio receptor del fotosistema II

(PS II), el complejo citocromo b/f y el fotosistema I (PS I). Esto ha sido en su mayor

parte aceptado ya que la inhibicin del transporte de electrones del PS I es ms sensible

que la del PS II en cloroplastos de espinaca (Mohanty et al., 1989; Sersen et al., 1998).

El plomo tambin causa una fuerte disociacin del polipptido extrnseco del

complejo disociador de oxigeno del PS II originando desplazamiento de Ca, Cl- y Mn

desde este sitio donador del PSII (Rashid et al., 1991). Esto hace proponer que los

cambios conformacionales de las LHC II (Light Harvesting Complexes) subunidades

fundamentales del PSII, conllevan al no ensamblaje de los componentes redox, de los

cofactores y de las protenas extrnsecas, conduciendo a la degradacin de las

subunidades PSII (Ahmed y Tajmir-Riahi, 1993). En suma, el plomo in vitro altera los

complejos protena-pigmento responsables de la absorcin de la radiacin incidente.

Retomando esta ltima anotacin Sarvari et al. (2002) probaron concentraciones de

plomo en el desarrollo del tilacoide de pepino y lamo, y observaron incremento del

contenido de clorofila en las LHC II a bajas concentraciones de plomo, mientras que a

una concentracin de 50 mM de plomo el nivel de clorofila decreci en las plantas. Este

hecho ha sido comprobado nuevamente en segmentos de hojas de Pisum sativum

tratados a 50 mM Pb por Sengar y Pandey, 1996. Consecuentemente, el nivel de

concentracin de plomo dentro de la hoja puede incidir directamente en la sntesis de

clorofila.

Para limitar la descripcin sobre los mltiples efectos del plomo en el proceso

fotosinttico existen otras hiptesis importantes para cerrar el tema, como la de Bazzaz

et al., (1975) quien considera que el decrecimiento de la fotosntesis en maz es el

resultado del cierre estomtico. Hiptesis respaldada por Kosobrukhov et al., (2004)

quienes consideran que la actividad fotosinttica es gobernada por factores como el

21

tamao de la clula estomtica, el nmero de estomas, la conductancia estomtica y el

rea foliar.

1.7.3 Efectos sobre la respiracin y contenido en ATP

Con el objeto de determinar los efectos sobre la respiracin se han realizado

experimentos in vitro con preparaciones de mitocondrias de clulas vegetales de

Nicotiana tobacum L. var. Xanth encontrndose que la tasa de respiracin disminuye

cuando se incrementan las concentraciones de plomo aplicadas (Reese y Roberts, 1985).

Adems de las mitocondrias se han aislado cloroplastos de diferentes especies de

plantas para mostrar que el plomo afecta el flujo de electrones va el sistema de

transporte de electrones (Miles et al., 1972; Bazzaz y Govindjee, 1974). De este modo,

parece ser que el Pb a elevadas concentraciones ocasiona desacoplamiento de la

fosforilacin oxidativa (Miller et al., 1973; Koepfe, 1977; Ernst, 1980), mayor

oxidacin de sustratos (glicina, succinato, malato), incremento de la demanda de ATP

como de ATP / ADP e incremento de la actividad de NAD+malato-deshidrogenasa a

altas concentraciones (Romanowska et al., 2002), y por el contrario, se estimula la

respiracin a bajas concentraciones (Lee et al., 1976), lo cual ha sido demostrado en

hojas cortadas (Lamoreaux y Chaney, 1978), en protoplastos aislados (Parys et al.,

1998) y en mitocondrias (Koeppe y Miller, 1970).

En relacin con los enzimas fotorrespiratorios el mecanismo sobre la estimulacin

de la respiracin por plomo an no est claro. Se plantean varias incongruencias; una de

stas es que se inhibe la actividad cloroplstica de la ATP sintetasa /ATPasa (Tu Shu y

Brouillette, 1987) y no se afectan otros enzimas como NADH-hidroxipiruvato

reductasa, glicolato oxidasa y el enzima NAD-mlico (Romanowska et al., 2002) bajo

exposicin a plomo.

Aunque la sensibilidad de la fotofosforilacin a los iones de los metales pesados est

bien documentada, no hay un acuerdo general sobre el sitio de accin ni sobre el

mecanismo sealado. Solamente algunos experimentos pueden sugerir diferentes

mecanismos existentes para la accin de los iones de los metales pesados sobre la

actividad ATPasa cloroplstica cuando estos iones metlicos son aplicados bajo

condiciones in vivo o in vitro.

22

1.7.4 Efectos sobre la absorcin de nutrientes

Muchas de las acciones atribuidas al plomo parecen ser indirectas como un resultado

del desequilibrio mineral dentro de los tejidos. As, se sabe que altas concentraciones de

plomo en el suelo causan desequilibrio en las proporciones de nutrientes minerales

dentro de los tejidos de las plantas en crecimiento.

Cambios significativos se han observado tanto en los contenidos de nutrientes como

en las proporciones internas de nutrientes en plantas bajo la toxicidad con plomo

(Kabata-Pendias y Pendias, 1992). En la mayora de los casos, el plomo bloquea la

entrada de cationes (K+, Ca+2, Mg+2, Mn+2, Zn+2, Cu+2, Fe+3) y aniones (NO3-) en el

sistema radicular.

Hasta el momento, los mecanismos sugeridos para regular la entrada de micro- y

macronutrientes bajo toxicidad por plomo consisten en el mecanismo fsico y qumico.

El primer mecanismo, se relaciona con el tamao de los radios inicos del metal,

que pueden actuar bloqueando el acceso de muchos iones en los sitios de absorcin de

las races (Godbold y Kettner, 1991). Aunque tanto el contenido de plomo en la punta

como en la base de la raz pueden parecer similares, el plomo altera los niveles de

elementos minerales en las mismas. En las puntas de la raz los niveles de Ca+2, Fe+3 y

Zn+2 decrecen despus de la exposicin a Pb. En el abeto noruego, despus de aplicar

plomo se presenta la inhibicin del crecimiento de la raz que puede ser debido a una

disminucin de los niveles de Ca+2, puesto que en las puntas de la raz un 40 % del Ca+2

absorbido es usado para su crecimiento, de forma que pueden decrecer la divisin o la

elongacin celular (Haussling et al., 1988). Concomitantemente, en agujas de abeto

noruego los niveles de Ca+2 y Mn+2 decrecen con el tratamiento con plomo, lo cual no

puede ser un resultado del decrecimiento en el nmero de las puntas de raz y de los

sitios destinados para el flujo de solutos apoplstico a travs de la endodermis.

Al valorar el nivel de manganeso bajo condiciones de tratamiento con plomo, se

observ una disminucin del mismo en agujas de Picea abies (Sieghardt, 1988). En

plantas de Cucumis sativa el plomo disminuye la absorcin de K+, Ca+2, Mg+2, Fe+3 y

NO3- y, en Zea mays la absorcin de Ca+2, Mg+2, K+ y P (Walker et al., 1977).

El plomo influye en la distribucin total de los elementos nutritivos dentro de los

diferentes rganos de la planta. Ya que, la distribucin total de Mn y S cambi a favor

de la raz por encima de la parte area bajo condiciones de toxicidad con plomo, lo cual

23

representa retencin de estos iones en la raz. Con respecto al contenido de fsforo, en

Pisum sativum siempre se han hallado correlaciones negativas con el contenido de

plomo en el suelo, y tambin se ha detectado que la actividad fitasa es afectada por el

contenido de plomo (Paivoke, 2002).

En relacin con el nitrgeno sucede que el contenido de nitrgeno en la raz es

significativamente reducido bajo toxicidad por plomo. La absorcin de nitrato declina

en plantas de pepino expuestas a plomo con una concomitante bajada de la actividad

nitrato reductasa NR y afecta el metabolismo del nitrgeno. El descenso de la absorcin

de nitrato debido al plomo puede ser como resultado del estrs hdrico creado por el

plomo (Burzynski y Gabrowski, 1984).

En ciertas especies como Pisum sativum, incrementa el contenido de nitrgeno de

races bajo tratamiento con plomo a una concentracin de 2 mmol kg -1 de suelo, lo cual

probablemente ocurre debido a efectos inhibitorios de plomo sobre la actividad nitrato-

reductasa (Paivoke, 2002).

El segundo mecanismo sugerido para explicar la disminucin de la absorcin de

micro y macronutrientes bajo toxicidad con plomo se relaciona con el desorden que

induce el plomo en el metabolismo celular causando cambios en las actividades

enzimticas de la membrana y en la estructura de la membrana. Aparentemente, un

ejemplo puede ser el eflujo de K+ desde las races, el cual es debido a la extrema

sensibilidad de la ATPasa y de los grupos SH de las protenas de la membrana celular

hacia el plomo.

1.7.5 Efectos sobre las relaciones hdricas.

Una disminucin en la tasa de transpiracin y en el contenido hdrico de los tejidos

ocurre en plantas crecidas bajo exposicin con plomo. Varios mecanismos se han

sugerido para comprender cmo el plomo induce estos efectos. Inicialmente, el plomo

retarda el crecimiento dando como resultado una reducida rea foliar, y por consiguiente

una desventaja para los rganos con mayor transpiracin en las plantas, las hojas (Iqbal

y Moshtaq, 1987). As, se ha observado que las clulas guarda generalmente presentan

un tamao menor al ser tratadas con plomo.

El plomo baja el nivel de componentes que estn asociados con el mantenimiento

de la turgencia celular y de la plasticidad de la pared celular. De esta forma, baja el

24

potencial hdrico dentro de la clula. Los iones metlicos, incluyendo el plomo,

incrementan el contenido en ABA e inducen el cierre estomtico. Desordenes en la

respiracin y en la fosforilacin oxidativa observados bajo toxicidad con plomo tambin

pueden causar desajustes en el rgimen hdrico. As, experimentos con fragmentos de

epidermis flotando en solucin con plomo han mostrado que el plomo induce el cierre

de estomas (Bazzaz et al., 1974). Experimentos con hojas separadas de maz y soja han

indicado que los metales incrementan la resistencia estomtica no nicamente cuando se

aplican directamente a clulas guarda o clulas epidrmicas sino tambin cuando stos

alcanzan los conductos del xilema (Bazzaz et al., 1974).

Una hiptesis unificada con respecto al cierre estomtico inducido por plomo indica

que tal efecto es debido a la inhibicin de un sistema de energa o debido a alteraciones

de flujos de K+ a travs de las membranas (Bazzaz et al., 1974).

1.8 Tolerancia al plomo

1.8.1 Metabolismo oxidativo

Uno de los efectos del plomo consiste en la induccin del estrs oxidativo en partes

de plantas en crecimiento debido a un aumento de la produccin de Especies Reactivas

del Oxgeno (ROS) provocando un desequilibrio del estado redox celular.

Un nmero de diferentes ROS: el anin superxido (O2-), oxgeno singlete (1O2),

perxido de hidrgeno (H2O2) y el radical hidrfilo (OH) son producidos durante el

metabolismo normal oxidativo en organismos aerbicos, pero estas ROS pueden ser

severas cuando se producen elevadas cantidades, puesto que aunque algunas ROS

pueden funcionar como importantes seales moleculares alterando la expresin gnica y

modulando la actividad de protenas especficas de defensa. Todas las ROS pueden ser

extremadamente dainas para los organismos a altas concentraciones.

El plomo induce la produccin de ROS dentro de las plantas y sta depende de la

intensidad del estrs, perodos repetitivos de estrs, tipo de especie y edad de la planta

(Asada, 1994; Chaitnya y Naithani, 1999; Verma y Dubey, 2003).

La peroxidacin de lpidos, la cual es conocida como un indicador de dao

oxidativo, involucra la degradacin oxidativa de residuos acil grasos poliinsaturados de

membrana (Girroti, 1990). Los iones de plomo inducen la peroxidacin lipdica, por lo

25

tanto decrece el nivel de cidos grasos saturados e incrementa el nivel de cidos grasos

insaturados de membrana en varias especies de plantas (Halliwell y Gutteridge, 1999).

Aunque la generacin de ROS es suave bajo condiciones normales, el plomo acelera

este proceso (Verma y Dubey, 2003). En el estudio de caso de Oryza sativa se han

expuesto a 500 y 1000 M Pb (NO3)2 en un medio con arena. Durante un perodo de 5

a 20 das se ha incrementado el nivel de lpidoperoxidasas del 21 al 177 %, indicando

que el plomo induce estrs oxidativo en estas plantas (Verma y Dubey, 2003).

1.8.2 Mecanismos de proteccin vegetal

Existe un amplio rango de mecanismos de proteccin en las clulas vegetales que

sirven para eliminar las especies reactivas de oxgeno (ROS) antes de que puedan daar

partes sensibles de la maquinaria celular. Es conveniente dividir estos mecanismos en

dos grupos, estos son, antioxidantes-no-enzimticos tales como tocoferoles,

carotenoides, componentes del cido ascrbico (AsA) y glutatin (GSH), incluyendo

sus formas oxidadas, -el cido dehidroascrbico (DHA) y GSSG y, antioxidantes

enzimticos tales como catalasa, peroxidasas y superxido dismutasas (SOD)- adems

de los enzimas del ciclo ascorbatoglutatin, tales como: ascorbato peroxidasa (APX),

monodehidroascorbato reductasa (MDHAR), dehidroascorbato reductasa (DHAR) y

glutatin reductasa (GR) dependiente de NADPH (Verma y Dubey, 2003) .

Este mecanismo funciona con la base qumica del Ciclo Haber Weiss y el

mecanismo Fenton, los cuales generan H2O2 y radicales hidrxilo (-OH) desde el anion

superxido O2-.

El plomo no es un metal oxido-reductor como el hierro. Por eso el estrs oxidativo

parece ser un efecto indirecto de la toxicidad del plomo llevando a produccin de ROS,

aumentando el estado pro-oxidante de la clula por reduccin de las molculas de

glutatin reducido (GSH), activando sistemas calciodependientes y afectando los

procesos mediados por el hierro (Pinto et al., 2003).

Entre los enzimas antioxidantes, se encuentra la catalasa, que descompone H2O2

produciendo agua y oxgeno. Se ha observado disminucin en la actividad catalasa

sobretodo en dos isoenzimas de la catalasa en la parte area de plantas tratadas con

plomo (Verma y Dubey, 2003). Estas isoformas estn controladas por diferentes genes

(Frugoli et al., 1996). Tal disminucin parece ser debida a una menor sntesis de enzima

26

o a un cambio en el ensamblaje de subunidades enzimticas (Hertwig, 1992).

La toxicidad por plomo induce la actividad peroxidasa en plantas de soja, arroz, etc.

(Lee et al., 1976; Verma y Dubey, 2003). Este enzima ha sido ampliamente aceptado

como un enzima de estrs en plantas (Gaspar, 1982; Subhashini y Reddy, 1990), y se

cree que el incremento de su actividad se debe a la liberacin de peroxidasa localizada

en la pared celular (Gaspar, 1982).

La actividad superxido dismutasa (SOD) se ha detectado en plantas de Lupenus

lutius y O. sativa (Przymusinski et al., 1995; Verma y Dubey, 2003). El incremento de

la SOD en respuesta a la presencia de plomo es debido a la sntesis de novo de protena

enzimtica (Lozano et al,. 1996).

El estrs por plomo en plantas de arroz tambin se manifiesta como un incremento

de la actividad de la APX y de la GR (Verma y Dubey, 2003). Aunque la APX es

considerada el enzima clave del mecanismo de defensa antioxidativo (Sharma y Dubey,

2004) porque condiciona la concentracin celular de O2- y H2O2, parece ser que dos

enzimas (SOD y GR) combaten los daos ocasionados por el estrs oxidativo inducido

por el plomo en plantas de arroz (Verma y Dubey, 2003).

Bajo la toxicidad con plomo tambin se incrementa la actividad GR cuya funcin de

defensa es reciclar glutatin oxidado para reducirlo a glutatin (GSH/GSSG) y a

glutatin total (Foyer et al., 1997). El incremento en la actividad GR bajo estrs ha sido

atribuido a sntesis de novo del enzima (Baisak et al., 1994).

1.8.3 Mecanismos de tolerancia al plomo

Baker (1981) ha sugerido dos estrategias bsicas relacionadas con la absorcin del

metal y la tolerancia de las clulas vegetales. Las respuestas celulares al estrs txico

son tolerancia por exclusin y tolerancia por acumulacin.

La estrategia por exclusin consiste en el mantenimiento de niveles bajos y

constantes del metal en el suelo, y se mantiene hasta que las concentraciones en el

mismo alcanzan niveles crticos a partir de los cuales no pueden ser mantenidos y se

produce toxicidad. Por otra parte, la tolerancia por acumulacin consiste en concentrar

el metal activamente dentro de los tejidos vegetales, implicando procesos fisiolgicos

altamente especializados. En este sentido, Berry W.L. (1986) sugiri tres estrategias

bsicas de respuesta: evitacin, detoxificacin y tolerancia bioqumica, cada una de las

27

cuales afecta las concentraciones del metal en los tejidos en diferentes formas.

La tolerancia por exclusin esta relacionada con la capacidad de las plantas para

transportar oxgeno y perder radicales de oxgeno por las races resultando en una gran

habilidad para modificar la rizosfera e inmovilizar metales en la msma. Estas

observaciones se han deducido colectivamente en Typha latifolia por Ye et al., 1997,

quienes sostienen que Typha latifolia es una planta que puede colonizar tanto reas

contaminadas con plomo como no contaminadas con plomo, y que, por lo tanto, sirve

como indicador biolgico de investigacin. As, se ha encontrado que sus hojas pueden

mantener bajas las concentraciones de plomo bajo estrs con plomo.

Un aspecto importante de la tolerancia por exclusin se ha encontrado en las races

de arroz, donde se sintetiza oxalato por oxidacin de glicolato para obtener glioxilato y

luego oxidacin de glioxilato para obtener oxalato. As, pues, las variedades tolerantes

de arroz autorregulan la sntesis y secrecin de oxalato, un compuesto que precipita el

plomo y reduce su absorcin por las races (Yang et al., 2000). Tambin se ha

observado que los grupos COO- del cido urnico del muclago se unen al plomo

restringiendo su entrada a la raz (Morel et al., 1986).

Por otro lado, la fuerte unin del plomo a los grupos carboxilo de los carbohidratos

de la pared celular disminuye el transporte por va apoplstica (Rudakova et al., 1988).

Este mecanismo de tolerancia se presenta en Anthoxanthum odoratum, ya que la

observacin de las puntas de raz mediante microscopa electrnica revel la presencia

de plomo tanto en la pared celular como en el citoplasma. As, se sugiere que el

mecanismo de tolerancia de esta planta est asociado con la capacidad de restringir la

localizacin del plomo en la pared celular (Qureshi et al., 1986).

Dentro de la clula, la mayor parte de plomo es secuestrado en la vacuola en forma

de complejos. Esto puede representar otro mecanismo de detoxificacin de plomo en

plantas. Por ejemplo, la pinocitocis es observada en clulas foliares de muchas plantas

tratadas con sales de plomo en solucin debido a estas vesculas pinocticas, las

partculas de plomo pueden ser descargadas dentro de la vacuola (Wierzbica y

Antosiewicz, 1993).

La acumulacin total de un exceso de aminocidos en respuesta al plomo puede ser

conocida como una importante respuesta adaptativa de las plantas para evitar la

toxicidad al plomo. Varios trabajos han enfatizado la importancia de la sntesis de

28

compuestos quelantes del metal tales como aminocidos afines a la prolina para evitar la

toxicidad de metales pesados (Alia y Saradhi, 1991). En estudios de toxicidad por Cu en

Silene armeria se ha considerado que prolina y glicina pueden estar implicadas en la

detoxificacin del Cu en races (Barcel et al. 2005).

Plantas expuestas a plomo y otros metales pesados altamente contaminantes como

Cd, Zn, Cu, Hg sintetizan cistena y polipptidos de bajo peso molecular llamados

fitoquelatinas (Cobbet, 2000). Las fitoquelatinas (PCs) forman una familia de

estructuras repetitivas del dipptido -Glu-Cis seguidos por una estructura terminal Gli;

(-Glu-Cis) n-Gli, donde n alcanza un valor mximo de 11, pero generalmente se sita

en el rango de 2 a 5 (Zenzk, 1996). En muchas especies se ha demostrado que los

metales Cd y Pb, se unen a las fitoquelatinas despus de inducir su produccin (Grill et

al., 1987). Adems, la capacidad de unin de las fitoquelatinas a los diferentes metales

difiere, ya que compuestos de Cd se unen con ms fuerza a las PCs que los del Pb,

debido a que ste ltimo presenta un radio inico de conformacin octahedral y tiene un

nmero de coordinacin alto (Pb, 6 8).

La induccin de las PCs se ha demostrado en cultivos de Rauwolfia serpentina a las

que se aadi 1 mM Pb a su medio. Tal sntesis fue acompaada por una disminucin

del glutatin celular total (Grill et al., 1987). Estos resultados reforzaron la creencia

con respecto a que la sntesis de fitoquelatinas parte del glutatin y que tal sntesis es

debida a la transpeptidacin de dipptidos de -glutamil cisteinil desde glutatin por la

accin de una enzima constitutiva presente, la PC sintetasa (Chen et al., 1997). Las

uniones entre fitoquelatinas y los iones de plomo llevan al secuestro de iones plomo en

plantas y de esta forma sirve como un importante componente que favorece el

mecanismo de detoxificacin en vegetales.

Adems de las estrategas vegetales de tolerancia por exclusin y por acumulacin,

se ha de tener en cuenta otros sistemas de defensa no-especficos que se manifiestan

cuando las plantas sufren estrs por plomo. Estos sistemas de defensa no-especficos

incluyen sntesis de substancias osmticamente activas (prolina) y poliaminas

(putrescina), antioxidantes, aminocidos, cambios en la composicin qumica de la

pared celular (deposicin de callosa y suberina), y cambios en el balance hormonal,

principalmente sobre el etileno y ABA (Seregin e Ivanov, 2001).

Hay diferentes opiniones sobre los mecanismos de defensa no especficos mediante

29

el cual las sustancias osmticamente activas como la prolina alivian los efectos de la

toxicidad del metal dentro de la clula. Paleg et al., (1984) han demostrado que la

prolina libre acta como osmoprotectora; Sharma y Dubey (2004), como protena

estabilizadora (Farago y Mullen, 1979), como quelante del metal; (Mehta y Gaur,

1999), como inhibidor de la peroxidacin lipdica (Alia et al,. 2001) o como un radical

libre reciclador o como un productor de oxgeno singlete.

1.9 Remediacin de suelos contaminados con plomo

La remediacin de suelos contaminados con plomo representa un significativo

desafi para muchas industrias e instituciones gubernamentales. Hasta la fecha las reas

contaminados con plomo han sido remediadas con una amplia gama de tcnicas basadas

en la ingeniera (Salt et al., 1995).Los suelos excesivamente contaminados inicialmente

son excavados, estabilizados con cemento y luego localizados en terrenos seguros. Este

proceso es costoso y requiere lugares de restauracin adicionales a los terrenos de

partida.

Desde hace unos aos el concepto de usar plantas para remediar la contaminacin de

los suelos ocasionada por los metales pesados, denominado fitorremediacin, ha

recibido gran atencin (Raskin et al., 1994; Vassil et al., 1998; Jarvis y Leung, 2002;

Barcel, 2003; Barcel y Poschenrieder, 2003).

La fitorremediacin puede involucrar dos procesos: fitoestabilizacin y

fitoextraccin. La fitoestabilizacin reduce a niveles constantes la contaminacin del

suelo o la biodisponibilidad del metal pesado, mientras que, la fitoextraccin usa plantas

para extraer el contaminante del suelo. El concepto de usar plantas para acumular metal

para su posterior procesado es tcnica y econmicamente atractivo.

Por razones prcticas, la concentracin de plomo en la parte area es el parmetro

fisiolgico ms importante para evaluar el potencial de fitoextraccin de plomo de las

plantas (Huang y Cunningham, 1996). Esto es debido a que la acumulacin de plomo en

races es significativamente superior que en la parte area, posiblemente debido a la baja

translocacin de plomo desde las races hacia la parte area (Cunningham et al., 1995;

Verma y Dubey, 2003). Sin embargo en Thlaspi rotundifolium, se ha encontrado una

alta acumulacin de plomo en la parte area en relacin con la raz, ya que acumula

entre 130 y 8200 mg Pb.kg-1 de peso seco de la parte area (Reeves y Brooks, 1983).

30

Por lo tanto algunas especies vegetales tienen la capacidad de translocar plomo con

mayor eficiencia que otras. A razn de que su crecimiento es lento y su biomasa es

pequea, no obstante, estas especies no son candidatos vegetales ideales para hacer

fitoextraccin de plomo de suelos contaminados. En algunos cultivos de Brassica

juncea se ha determinado una acumulacin tan alta como el 1.5 % de Pb en la parte

area cuando crece en solucin nutritiva con 760 M Pb (Kumar et al,. 1995). Sin

embargo, un ao despus se observ que la concentracin de plomo en la parte area de

maz era ms alta que la acumulada por el mejor cultivo acumulador de plomo cuando

las plantas fueron crecidas sobre un suelo contaminado con plomo (Huang y

Cunningham, 1996).

Los resultados de experimentos de quelacin indicaron que la concentracin de

plomo en la parte area puede ser incrementada dramticamente cuando la

concentracin de plomo en el suelo es incrementada por la adicin de un quelante

sinttico al suelo contaminado. Es decir, el uso de quelantes en el suelo puede favorecer

la toxicidad del plomo. El quelante sinttico EDTA forma un complejo soluble con

muchos metales, incluyendo plomo (Kroschwitz, 1995) y puede solubilizar plomo desde

partculas del suelo (Vassil et al., 1998). La aplicacin de EDTA a suelos contaminados

ha mostrado que la absorcin por plantas causa que el plomo se acumule por encima del

1% (p/p) de la biomasa seca de la parte area (Huang y Cunningham, 1996; Huang et

al., 1997). Las grandes partculas de Pb no pueden cruzar fcilmente la banda de

Caspari debido a su tamao y a sus cargas caractersticas, pero una vez forman un

complejo con tales quelantes, como EDTA, su solubilidad incrementa y el tamao de la

partcula decrece haciendo creer que son parcialmente invisibles hacia aquellos

procesos que normalmente deberan prevenir su movimiento sin restriccin tal como

precipitacin con fosfatos y carbonatos o uniones a la pared celular mediante el

mecanismo de intercambio catinico (Jarvis y Leung, 2002).

El mecanismo por el cual los solutos se mueven simplsticamente se ha considerado

como un tipo de transporte que utiliza una molcula de alta selectividad, que se opone a

la difusin facilitada (Raven et al., 1999). Aunque es claro que este mecanismo no

involucra el transporte de plomo, y que el movimiento de partculas cargadas de plomo

a travs de esta va podran ser impedidas por su extensin, parecer ser que el complejo

plomo-quelante facilita su transporte va simplasto pudiendo pasar por esta va

31

sucesivamente. Como punto final es importante controlar el uso y manejo de quelantes

aadidos a los suelos, ya que el plomo acomplejado se moviliza dentro de las partculas

del agua y se facilita su migracin a otros medios en el ambiente. (Huang y

Cunningham, 1996).

Otra tecnologa limpia prometedora es la rizofiltracin para eliminar contaminantes

tales como metales pesados de aguas contaminadas utilizando races de plantas

(Dushenkov et al., 1995). Basndose en este planteamiento, Tung y Temple (1996)

determinaron la deposicin de plomo en las puntas de las races de maz mediante

estudios de microscopa electrnica e histoqumica realizados en plantas incubadas en

un medio con 0.66 mM Pb durante 19 das. Estos autores observaron una fuerte

deposicin tanto en la superficie como en los tejidos internos dentro de los 2 primeros

milmetros de la raz principal y de las races secundarias.

Malkowski et al., (2002) tambin han encontrado mayor acumulacin de plomo en

las puntas de las races de Zea mays L., en las puntas de las races se hall una

concentraci de Pb de 138,430 mg Kg-1 en comparacin con la acumulacin en la parte

basal de la raz de 26,833 mg Pb.Kg-1.

A partir de las anteriores investigaciones, se deduce que de todo el sistema radicular,

aproximadamente el 50 % del plomo es acumulado en los primeros 8 mm de la parte

apical de la raz, y a su vez, que los sistemas radiculares con mayor ramificacin pueden

absorber ms cantidad de plomo u otros metales pesados, a diferencia de plantas que

tienen races largas y sistemas radiculares poco ramificados.

Actualmente se est avanzando en el conocimiento y desarrollo de la investigacin

en tecnologas como la fitoremediacin y rizofiltracin, ya que parecen ser tecnologas

de futuro con un gran potencial para limpiar los suelos contaminados con plomo y otros

metales pesados.

OBJETIVOS

35

2. OBJETIVOS

El presente trabajo se inscribe en una de las lneas de investigacin que se llevan a

cabo en el Laboratorio de Fisiologa Vegetal de la Facultad de Ciencias de la

Universidad Autnoma de Barcelona bajo la direccin del Dr. Juan Barcel Coll y la

Dra. Charlotte Poschenrieder sobre la fitotoxicidad por metales pesados y, de una forma

ms genrica, el estrs abitico en vegetales. En dicho contexto, las investigaciones

llevadas a cabo en nuestro laboratorio han ido evolucionando a la par que ha aumentado

la experiencia del equipo en las distintas tcnicas de estudio de los procesos y

mecanismos responsables de las respuestas de los vegetales a las situaciones adversas.

A lo largo del tiempo que se ha dedicado a la investigacin de estos fenmenos,

tanto las tcnicas como los enfoques han variado desde el anlisis de nutrientes a nivel

de rgano entero hasta la aplicacin de tcnicas de marcaje molecular y

micromanipulacin celular en lnea con los avances desarrollados en este campo tanto

por equipos nacionales como internacionales, manteniendo siempre una plena

integracin en los mismos como avala el nivel de las publicaciones y contribuciones a

congresos alcanzado.

En este contexto se ha realizado el presente trabajo, con el nimo de dilucidar

algunos de los mecanismos ms inmediatos de la actuacin de un metal tan txico para

los seres vivos como es el plomo.

La experiencia acumulada tanto por nuestro equipo como por los ms relevantes

equipos en el mbito internacional en el campo de la fitotoxicidad por metales txicos,

sean pesados o no, nos ha mostrado que los mecanismos ms inmediatos de su

actuacin propenden a actuar sobre el primer rgano que entra en contacto con ellos,

verbigracia, la raz, y que los sntomas visuales que puedan aparecer pertenecen a

estadios ya desarrollados de fenmenos que se manifiestan a tiempos muy tempranos de

la entrada en contacto con las condiciones adversas. Es por ello que en este trabajo se ha

aprovechado la experiencia en las tcnicas de visualizacin ms inmediatas a nivel de

las zonas ms sensibles de la raz, a tiempos cortos, sin olvidar el estudio de fenmenos

que requieren de un cierto tiempo para manifestarse, a la hora de planear los diferentes

experimentos objeto del presente estudio.

36

Siguiendo esta lnea, se plante un conjunto de experimentos que van desde el

momento casi inmediato de exposicin al metal hasta niveles que llegan hasta las 48

horas de exposicin al mismo, en el intento de dilucidar la secuencia de mecanismos

que pueden dispararse como consecuencia y/o respuesta a las condiciones adversas

impuestas por el medio. De esta forma, se dise una seri