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PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Dra. Natalia Izurieta CergneuxPRÁCTICA No. 5 – LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
La identificación
definitiva de una
especie requiere de
pruebas
bioquímicas.
Permiten conocer
las actividades
metabólicas y
enzimáticas de los
microorganismos.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Identificar los productos finales de los procesos metabólicos
Se debe conocer:
1.- Cambios que se producen
2.- Reacciones químicas que ocurren
3.- Enzimas que intervienen
4.- Productos intermedios
5.- Secuencias de las reacciones bioquímicas
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Los microorganismos se cultivan en medios S/D
SS + SD PB Las pruebas bioquímicas disponibles para la identificación de
microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son:
1.- Pruebas IMVIC
2.- Prueba de TSI
3.- Prueba de Ureasa
4.- Movilidad
PRUEBAS IMVIC
Incluyen un grupo de cuatro pruebas usadas para diferenciar a los
microorganismos entéricos (Familia Enterobacteriaceae)
Las pruebas son:
INDOL
ROJO DE METILO
VOGES – PROSKAUER
CITRATO.
PRUEBA DE INDOL
FUNDAMENTO:
TRIPTOFANASA
H2O + TRIPTOFANO INDOL + AC. PIRUVICO + NH3
PROTOCOLO: Se inocula en caldo triptosa e incuba a 35 - 37°C
durante 24 horas.
Luego de este período, se añaden 5 gotas del reactivo de Kovacs.
INTERPRETACIÓN:
NEGATIVO POSITIVO
POSITIVO NEGATIVO
PRUEBA DE CITRATO
Na2CO3CITRATO PIRUVATO CO2 + Na + H2O
Ph ALCALINO
AZUL DE
BROMOTIMOL
COLOR AZUL
PRUEBA +
Agar Citratado de Simmons
PRUEBA DE CITRATO
PROTOCOLO
1.- Se inocula el agar de superficie inclinada con una sola
estría en la superficie.
2.- Se incuba a 35 - 37°C durante 24 horas y se realiza la
lectura de la prueba.
PRUEBA DE CITRATO
INTERPRETACIÓN:
Es positiva cuando se observa
crecimiento a lo largo de la
estría, y este se acompaña o
no de un viraje del indicador
de verde a azul. El cambio de
color del medio a azul indica
una reacción positiva.
POSITIVO NEGATIVO
PRUEBA DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER
GLUCOSA
ACIDO MIXTA
ACIDOS MIXTOS -pH por debajo de 4,4
INDICADOR ROJO DE METILO
COLOR ROJO – MR +
BUTILENGLICOLICA
ACETIL-METILCARBINOL (ACETOÍNA)
REACTIVO DE BARRET
COLOR ROSADO – VP +
PRUEBA DE ROJO DE METILO
FUNDAMENTO:
GLUCOSA FERMENTACIÓN ÁCIDO MIXTA
ÁCIDOS LÁCTICO, ACÉTICO Y SUCCÍNICO
+CO2, H2 y ETANOL
pH ÁCIDO
5 GOTAS ROJO DE METILO
COLOR ROJOPOSITIVONEGATIVO
PRUEBA DE ROJO DE METILO
PROTOCOLO: (caldo MRVP)
1.- Se Inocula el medio con un
cultivo puro joven.
2.- Se incuba a 35 – 37°C
durante 48 horas.
3.- Luego de terminado el
tiempo de incubación se
añaden 5 gotas del reactivo de
Rojo de Metilo (no agitar).
INTERPRETACIÓN:
SIN INOCULAR NEGATIVO POSITIVO
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER
FUNDAMENTO:
GLUCOSA FERMENTACIÓN BUTILENGLICÓLICA
ACETIL-METIL-CARBINOL
(ACETOÍNA)
2-3 BUTANODIOL, ETANOL, H2 y CO2
REACTIVO DE BARRETT
KOH 40%
NEGATIVO POSITIVO
PRUEBA TSI (TRIPLE SUGAR IRON)
Medio S/D
Permite evidenciar:
1. Capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa,
sacarosa y lactosa en un único medio.
2. Permite la identificación de la producción de SH2.
PRUEBA TSI
Esta prueba tiene como objetivo diferenciar entre:
Bacterias fermentadoras de la GLUCOSA
Bacterias fermentadoras de la LACTOSA
Bacterias fermentadoras de la SACAROSA
Bacterias aerogénicas
Bacterias productoras de SH2
PRUEBA TSI
FUNDAMENTO:
El extracto de carne y peptona aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosa son los HC fermentables.
El rojo de fenol es el indicador de pH.
Por la fermentación de los azúcares, se producen ácidos que se
detectan por el indicador de pH.
PRUEBA TSI
PROTOCOLO:
1.- Se inocula los tubos de TSI
con punta.
2.- Se introduce la punta hasta
3 a 5 mm del fondo del tubo.
3.- Luego de retirar el asa del
fondo, se estría el pico con un
movimiento en zigzag, de un
lado al otro.
4.- Se incuba a 35 - 37°C
durante 24 horas.
ESTRIACION EN ZIGZAG
INOCULACION CON PUNTA
PRUEBA TSI
INTERPRETACIÓN:
Se debe considerar los
cambios de color en el
pico y el fondo del tubo y
la formación de burbujas.
Cuando el medio es
ácido (A) este se torna de
color amarillo y cuando
es alcalino (ALK)
permanece de color rojo.
PRUEBA TSI
El medio contiene 0.1% de glucosa y 1% de lactosa y sacarosa
respectivamente.
Si el microorganismo sólo fermenta la glucosa, el ácido producido en
el fondo acidifica el medio en esa zona y se torna de color amarillo.
Cuando el microorganismo fermenta la lactosa y la sacarosa, el ácido
producido es suficiente como para virar el color del medio a amarillo.
El medio permanece rojo cuando no se produce fermentación de
ninguno de los azúcares.
PRUEBA TSI
Si hay formación de gas
durante el proceso de
fermentación, en el fondo del
medio se observan burbujas o
la ruptura del agar.
Si las bacteria son productoras
de SH2 este se evidencia como
un precipitado negro en el
fondo del tubo.
Tubo C 1 2 3 4 4A 5
Fermentación de Glucosa - - + + + + +
Producción de gas - - - + + + +
Fermentación de Lactosa y Sacarosa - - - - + + +
Producción de SH2 - - - - - - +
PRUEBA DE LA UREASA
FUNDAMENTO:
UREAUREASA
2 MOLÉCULAS DE NH4
pH ALCALINO
ROJO DE FENOL
COLOR FUCSIA
RESULTADOS
+ -
PRUEBA DE LA UREASA
PROTOCOLO:
1.- Se siembra el microorganismo en estudio en caldo urea o agar úrea de
Cristensen.
2.- Se incuba a 35 - 37° C durante 24 horas.
INTERPRETACIÓN:
POSITIVONEGATIVO
Agar Úrea de Cristensen
NEGATIVO POSITIVO