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Paludismo

La investigacion del paludismo en la eraposgenomicaPaul Horrocks,1 Sharen Bowman,2 Susan Kyes,3 Andrew P. Waters4 y Alister Craig5

La secuenciacion del genoma de Plasmodium falciparum promete revolucionar la forma en que se llevara a cabo lainvestigacion sobre el paludismo. Mas alla del simple descubrimiento de genes, la secuencia genomica facilitara ladeterminacion completa de la expresion genica del parasito durante las fases de su desarrollo, los mecanismospatogenicos, y su respuesta a variables ambientales como los tratamientos farmacologicos y la dotacion genetica delhuesped. En este artıculo se describe la situacion actual del proyecto de secuenciacion del genoma de P. falciparum yla extraordinaria informacion que ha aportado. Se resume tambien la aplicacion de la bioinformatica y de losinstrumentos analıticos desarrollados para los estudios de genomica funcional. El objetivo de estas actividades es laidentificacion racional y documentada de nuevas estrategias y dianas terapeuticas, basada en un profundoconocimiento de la biologıa de los plasmodios.

Artıculo publicado en ingles en el Bulletin of the World Health Organization, 2000, 78 (12): 1424–1437.

Introduccion

El desarrollo de las tecnologıas de secuenciacion delgenoma a lo largo de los ultimos cinco anos hagenerado una gran cantidad de informacion sobresecuencias que ha culminado en el reciente anunciode un borrador del genoma humano. Debido a sumenor tamano, los genomas de microorganismospatogenos se han prestado aunmas a esos metodos, yactualmente estan bien representados en elmundo dela genomica. Aunque no siempre sirven comomicroorganismos «modelo», la trascendencia de esospatogenos para la medicina y la agricultura ha hechoque la explotacion de las bases de datos de secuenciasse convierta en una gran prioridad. ¿Pero como puederepercutir realmente la identificacion de largascadenas de A, C, G y T en el objetivo de reducir lacarga de morbilidad, en particular en los paıses endesarrollo? Hasta el momento, la secuenciacion degenomas se ha circunscrito en su gran mayorıa almundo desarrollado, donde los recursos y lainfraestructura cientıfica han permitido crear centros

de secuenciacion muy productivos. No obstante, eluso de la informacion sobre las secuencias no tienepor que quedar limitado de ese modo, siempre ycuando haya recursos para formacion.

El aspecto mas importante de la era posgeno-mica, es decir, la que comienza al completarse lasecuenciacion, es probablemente el analisis de lassecuencias primarias. Este campo, lo que se conocecomo bioinformatica, comprende una serie deanalisis teoricos cuyo fin es convertir la secuenciade ADN en informacion biologica. Una parteimportante de esta disciplina implica la identificacionde genes mediante una serie de procedimientos, quevan desde la determinacion de las similitudes conotros genes descritos anteriormente hasta el uso demodelos informaticos basados en los datos existen-tes. Posteriormente se hacen predicciones sobre lafuncion biologica y la forma molecular (genomicaestructural), cosas ambas que abren amplias perspec-tivas de desarrollo.

El conocimiento de la secuencia completa delgenoma de un patogeno tambien permite a loscientıficos investigar el comportamiento de losmicroorganismos con una base mas amplia. Ahora,en lugar de estudiar el efecto de un tratamientofarmacologico o de la diferenciacion en uno o dosgenes, es posible estudiar la variacion simultanea detodos los genes utilizando el analisis transcripcionalglobal. Se puede asimismo examinar la distribucionde las proteınas o modificar geneticamente el micro-organismo (transfeccion), y establecer ası unarelacion directa entre esos efectores biologicos y elfenotipo visible. La tecnologıa para llevar a cabo esosexperimentos es consecuencia directa del interes porexplotar las secuencias genomicas.

1 Post-Doctoral Research Assistant, Molecular Parasitology Group,Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, Oxford,Inglaterra.2 Manager, Malaria Sequencing Project, Pathogen Sequencing Unit,Sanger Centre, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Inglaterra.3 Post-Doctoral Research Assistant, Molecular Parasitology Group,Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, Oxford,Inglaterra.4 Reader, Department of Parasitology, Leiden University MedicalCentre, Leiden, Paıses Bajos.5 Senior Lecturer, Liverpool School of Tropical Medicine, PembrokePlace, Liverpool L3 5QA, Inglaterra (e-mail: [email protected]).(Correspondencia.)

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Cabe prever que la capacidad para identificar ycaracterizar la huella genetica de los agentes pato-genos ayudara a reconocer elementos clave deldesarrollo y los mecanismos patogenicos de losmicroorganismos causantes de enfermedades, y acentrar nuestras investigaciones en el desarrollo denuevos tratamientos. En el caso de Plasmodium

falciparum, es posible identificar los genes y lasproteınas que actuan en determinadas etapas delciclo de vida, verificar su funcion mediante tecnicasde modificacion genetica, y utilizar candidatosprometedores en la produccion de vacunas. Las vıasmetabolicas del parasito que no estan presentes en elhuesped son otra posible diana de inhibidorespotentes no toxicos para el ser humano; ademas, sepodrıa interferir en los mecanismos de farmaco-rresistencia del parasito, y alargar ası la vida eficaz delos medicamentos actuales. La secuencia del genomade P. falciparum brindara muchas oportunidades parainvestigar el paludismo, pero esto es solo el principio:el reto es convertir esas oportunidades en tratamien-tos eficaces sobre el terreno.

El genoma de Plasmodium falciparum

El genoma de P. falciparum consta de tres compo-nentes: una repeticion lineal de un elemento de 6 kbsituado en las mitocondrias, un ADN circular de35 kb en el interior de una estructura parecida alplastido (el apicoplasto), y 25–30 Mb de ADN

nuclear (ADN genomico). El ADN nuclear seorganiza en 14 cromosomas de tamano comprendi-do entre 0,75 y 3,5 Mb, segun se ha determinadomediante electroforesis en gel con campo pulsatil(PFGE) y recuento de cinetocoros por microscopiaelectronica. Otras pruebas indirectas del numero decromosomas proceden de estudios geneticos quedemuestran la existencia de 14 grupos de ligamiento.

La organizacion del genoma nuclear es lapropia de los organismos eucarioticos, con cromo-somas lineales unidos en cada extremo a secuenciastelomericas. La plasticidad del genoma, observadaen muchos aislamientos del parasito e identificadamediante polimorfismos de longitud en la PFGE, seatribuye con frecuencia a deleciones e inserciones deADN en el seno de secuencias subtelomericas,regiones que contienen series ordenadas de repeti-ciones en tandem.

El Consorcio del Plasmodiumfalciparum Genome Project

Antes del desarrollo de la tecnologıa del cromosomaartificial de levadura (yeast artificial chromosome, YAC) elacceso al genoma del parasito era relativamentelimitado debido a que, por su contenido extraordi-nariamente alto de [A+T], los insertos en clones deplasmidos bacterianos convencionales eran ines-tables. Sin embargo, este genoma, cuyo contenidode [A+T] se calcula en un 80%, pudo mantenerseestable en el constructo pYAC4, como se demostrocon la creacion de varias genotecas de YAC paradistintos clones de P. falciparum (1). En 1993, unconsorcio de laboratorios distribuidos por todo elmundo constituyo el Wellcome Trust MalariaGenome Mapping Project con el proposito deensamblar secuencias contiguas (contigos) de YACpara cada cromosoma, ası como de desarrollartecnicas relacionadas con el YAC, las etiquetas desecuencias expresadas (EST), la bioinformatica y lacartografıa genetica (2). Este consorcio comprendioque la secuenciacion de todo el ADN nuclear era unaposibilidad real, pero considero que el empeno estabaerizado de dificultades debido al sesgo extremo en elcontenido de bases.

La secuenciacion del genoma ha demostradoser una estrategia muy capaz y eficiente para conocerla dotacion genica completa de organismos tandiversos como Mycobacterium tuberculosis (3), Saccha-romyces cerevisiae (4) y Caenorhabditis elegans (5). Lasventajas que ofrece este instrumento para lainvestigacion del paludismo desembocaron en 1996en la creacion de proyectos piloto, con la finalidad dedeterminar la posibilidad de secuenciar todo elgenoma, en tres centros de secuenciacion genomicaa gran escala: el Sanger Centre (Inglaterra), elPrograma del Paludismo de The Institute forGenomic Research (TIGR), el Naval MedicalResearch Centre (NMRC) (EE.UU.) y la Universidadde Stanford (EE.UU.). Tanto el Wellcome Trust,como el Burroughs Wellcome Fund, junto con el

Tabla 1. Resumen de la evolucion del Malaria Genome Project

Cromosoma Tamano (Mb) Estadoa

14b 3,4 Cierre tardıo13c 3,2 Cierre12d 2,4 Cierre tardıo11b 2,4 Cierre10b 2,1 Cierre

9c 1,8 Secuenciacion aleatoria en curso8c 1,7 Secuenciacion aleatoria en curso7c 1,7 Secuenciacion aleatoria en curso6c 1,6 Secuenciacion aleatoria terminada5c 1,4 Cierre4c 1,2 Cierre tardıo3c 1,06 Terminado2b 0,95 Terminado1c 0,7 Cierre tardıo

a Secuenciacion aleatoria (shotgun) = fase de la secuenciacion en la que no se seleccionanclones.

Cierre = la fase de secuenciacion aleatoria deja lagunas en la secuencia del cromosoma quehan de completarse mediante tecnicas combinatorias basadas en la informacion sobre lassecuencias que las flanquean. En ocasiones se dispone de los datos de la secuencia, pero hande extraerse manualmente de la base de datos computadorizada.

Cierre tardıo = en ocasiones quedan algunas lagunas que no es posible colmar mediantetecnicas de secuenciacion a gran escala, y es preciso aplicar metodos dirigidos muyconcretamente a ellas.b The Institute for Genomic Research, Malaria Program, Naval Medical Research Centre.c The Sanger Centre.d Universidad de Stanford.

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Instituto Nacional de Alergia y EnfermedadesInfecciosas y el Ministerio de Defensa de los EstadosUnidos de America, aportaron fondos para losproyectos piloto y, tras el exito cosechado, acordaronfinanciar todo el proceso de secuenciacion (6; vease laevolucion en la tabla 1). Colaboran tambien en elproyecto otros grupos que complementan la labor delos centros de secuenciacion a gran escala en diversasareas, como la generacion de material cromosomico,la obtencion de informacion cartografica adicional,las pruebas con cepas bacterianas mas tolerantes alADN rico en [A+T], y la preparacion de un depositode reactivos para P. falciparum (MR4, http://www.malaria.mr4.org/).

Una estrategia similar se esta aplicando en todoslos centros de secuenciacion a gran escala, en los cualeslos cromosomas individuales se escinden a partir degeles en campo pulsatil, se clonan como pequenosinsertos en un vector bicatenario y se secuencian ensentido directo e inverso para generar una informacionde pares leıdos que se utiliza para completar las lagunas.Se utilizan sitios etiquetados por su secuencia ymarcadores microsatelitales polimorficos del crucegenetico HB3xDd2 (7), junto con el mapa optico (8)de los fragmentos de restriccion ordenados, para ubicarlos contigos en cada cromosoma o para confirmar quelos datos de la secuencia se han ensamblado correcta-mente. Ademas, para facilitar la asignacion y ordenacionde las secuencias de una determinada region cromoso-mica, los grupos del Sanger Centre y de la Universidadde Stanford utilizan una tecnica de secuenciacionaleatoria (shotgun) (cobertura 1–2) con clones YACseleccionados a partir de los contigos cromosomicos deYAC, generados en el proyecto original de cartografia-do de P. falciparum. En los tres centros de secuenciacion,el objetivo es una tasa de error inferior a 1 por cada10 000 bases.

Una vez completada la secuencia de unaseccion del cromosoma, se analiza para identificarvarias caracterısticas, como regiones presuntamentecodificadoras de proteınas, ARNt y secuenciasrepetidas. Se buscan en bases de datos similitudescon secuencias de proteınas y EST. Tambien se estanrealizando otros analisis para determinar si laspredicciones poseen dominios codificadores deproteınas, secuencias senal, posibles regiones trans-membrana o cualquier otro rasgo distintivo. Para laidentificacion de regiones codificadoras de proteınasse dispone de varios programas informaticos comoHexamer/Genefinder (R. Durbin, P. Green,L. Hillier, software inedito, 1998), y GlimmerM (9),pero existen ya o se estan desarrollandomuchos otrosprogramas de prediccion de genes.

Estos instrumentos identifican eficazmentemarcos de lectura abiertos (open reading frames, ORF)largos y unicos, o los genes con dos o tres exonesrelativamente grandes. Sin embargo, los actualesprogramas generadores de predicciones genicasproporcionan datos contradictorios en el caso de losgenes multiexonicos, sobre todo de los que contienenexones pequenos (10, 11). Estas predicciones contra-dictorias estan siendo analizadas en la actualidad

mediante ensayos basados en la reaccion en cadena dela polimerasa previa transcripcion inversa (RT–PCR)(figura 1). Por consiguiente, la anotacion de lassecuencias actuales y futuras de P. falciparum es unproceso continuo en el que tanto las prediccionescomo las anotaciones van ganando en exactitud amedida que se dispone de mas informacion, como laobtenida con la RT–PCR y la secuenciacion de EST.

Analisis del genoma dePlasmodium falciparum

Se han identificado en total 424 genes codificadoresde proteınas predichos y 3 genes de ARNt en loscromosomas 2 y 3, los dos cromosomas cuyasecuencia se ha completado (12, 13). Aproximada-mente el 37% (158) de esos genes poseen unhomologo facilmente identificable en otras especies.Esta similitud permite suponer una funcion y,efectivamente, muchos de los genes identificadosparticipan en el metabolismo del parasito. Alcomparar las secuencias codificadoras de proteınaspredichas con sus homologas de otras especies,resulta interesante comprobar que la mayorıa de lasproteınas de P. falciparum presentan inserciones desecuencias de baja complejidad, a menudo series deun mismo aminoacido (generalmente asparagina,lisina o acido glutamico), o repeticiones en tandem dela secuencia correspondiente a un peptido corto. Sehabıan identificado con anterioridad ejemplos de estetipo de regiones, que muestran polimorfismo entrelos distintos aislamientos del parasito.

P. falciparum contiene dos organelas que seconsideran originadas a partir de procesos deendosimbiosis: las mitocondrias (14) y los apico-plastos (15, 16). La naturaleza caracterıstica delapicoplasto y las funciones fundamentales quedesempena hacen de el un candidato preferente parael desarrollo de farmacos antipaludicos. Al igual quemuchos elementos extranucleares, muchos de losgenes necesarios para la funcion de la organela estancodificados en el nucleo. En el estudio de lasproteınas predichas codificadas en los cromosomas2 y 3, se identifico en varias de ellas una posiblesecuencia senal del apicoplasto, indicativa de que estecontiene sistemas de la sintasa de acidos grasos detipo II, propia de los plastidos bacterianos y vegetales(17, 18). Este hallazgo respalda la hipotesis de que elapicoplasto tiene su origen en las algas, y constituyeuna diana muy especıfica para el diseno racional defarmacos.

La busqueda en las bases de datos deP. falciparum permite tambien identificar facilmenteotras proteınas con muchas probabilidades dedesempenar un papel decisivo en el metabolismodel parasito. Aplicando esta estrategia, Jomaa et al.(19) identificaron dos proteınas de P. falciparum quemostraban similitudes con enzimas pertenecientes ala vıa de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato de la sıntesisde los isoprenoides, utilizada por las algas verdes yalgunas bacterias, pero no por los animales. Se ha

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comprobado en un modelo experimental de palu-dismo en roedores, ası como en cultivos deP. falciparum, que los antibioticos desarrollados parainhibir esta vıa tienen actividad antipaludica.

Las busquedas en bases de datos permiten laidentificacion «virtual» de proteınas de P. falciparum

homologas de las de otras especies, pero el analisiscomparativo de la organizacion de la secuencia (12,13) ha desempenado un importante papel al revelarsecuencias subtelomericas codificadoras que de otromodo hubieran pasado inadvertidas. Un estudio masdetenido de las cuatro secuencias subtelomericas deP. falciparum disponibles muestra que tanto el ordende las secuencias repetidas como el de los miembrosvariantes de las familias multigenicas se conservan(figura 2). Los miembros de las familias multigenicasvar, rif, stevor y Pf60 estan presentes en los cuatrotelomeros y se han identificado tambien nuevasfamilias multigenicas asociadas a telomeros (proteı-nas codificadas por telomeros conservadas, CTP).Tanto los genes var, como Pf60 y stevor estan yarelativamente bien caracterizados, pero el gen rif

requirio un analisis mas detallado.

La familia var es una familia de genes muypolimorficos constituida por unas 50 copias

por genoma haploide (20–22). Codifica las variantesde PfEMP-1 (proteına-1 de membrana eritrocıticade P. falciparum) expresadas en la superficie de loseritrocitos, desde los ultimos estadios anulares delparasito hasta la esquizogonia. Cada gen var secompone de dos exones (figura 3). El exon1 codifica la porcion extracelular y muy variable dePfEMP-1, que incluye entre uno y siete dominios detipo proteına de union a antıgenos Duffy (DBL),con al menos una region interdominios rica encisteına (CIDR) (23). El extremo 3’ del exon 1codifica la region transmembrana semiconservadade la proteına, y el exon 2 codifica su regioncitoplasmica semiconservada. PfEMP-1 intervieneen la citoadherencia de los eritrocitos infectados adistintos receptores de las celulas endoteliales delhuesped, ası como en la union a eritrocitos noinfectados, formando rosetas. Se ha correlacionadoel fenotipo de citoadherencia o formacion de rosetasde un determinado eritrocito infectado con lagravedad de la enfermedad y su patogenia (veaseuna revision en 24).

Los miembros de la familia Pf60 contienen unexon 3’ muy similar a la secuencia del exon 2 del genvar (25, 26), y presentan multiples organizaciones

Paludismo


posibles del exon 5’. Una proteına del gen Pf60, la 6.1,se expresa en el nucleo de los parasitos presentes en lasangre en fase asexuada tardıa; esta constituida por7 exones y emplea un mecanismo de lectura a travesde un codon finalizador interno (27). Segun losanalisis de Pf60 basados en la hibridacion, existen140 copias por cada genoma haploide, pero dado quelas secuencias son muy similares a las del gen var, unaestimacion ajustada rondarıa los 90 genes de Pf60 porgenoma haploide.

El gen rif se describio originalmente comoun fragmento repetido de ADN de 1 kb aproxima-damente en el genoma de P. falciparum, un marcode lectura abierto (ORF) anomalo, sin codoniniciador logico de metionina (28). Carecıa de sentidobuscar los exones en direccion 5’, dado que en esemomento regıa el dogma de que la mayorıa de losgenes de P. falciparum no tenıan intrones. Finalmentese descubrio la secuencia entre dos genes var (22),y ya a partir de los primeros datos de la secuenciagenomica hechos publicos se identifico al gen rif

como emparentado con el gen stevor (29). En esteanalisis se localizo el pequeno exon en direccion 5’para las secuencias tanto del gen stevor como del gen rif(figura 3), y se comprobo que ambos tipos desecuencias contienen las regiones transmembranapredichas, que orientarıan la proteına predicha enforma de bucle en la superficie externa de unamembrana celular. Las secuencias del gen rif sondistintas a las del gen stevor ymuchomas polimorficas;se calculan unas 200 copias del gen rif por genomahaploide (13, 30), frente a 34 miembros aproxima-damente de la familia stevor (29).

Todavıa no se sabe con certeza donde y cuandose expresan las proteınas STEVOR (31), aunque larelativa ausencia de polimorfismo lleva a considerarimprobable que lo hagan en la superficie de loseritrocitos. Por el contrario, en el caso del gen rif, elgran numero de copias muy polimorficas apunta auna ubicacion expuesta a presiones inmunitarias/

selectivas del huesped. En efecto, se ha comprobadoque las secuencias del gen rif codifican las rifinas,proteınas con variantes clonales de 35–44 kDexpresadas en la superficie de los eritrocitosinfectados (30), y que el suero de individuos inmunescontiene anticuerpos frente a estas proteınas (32). Lasrifinas y PfEMP-1 comparten la misma ubicacion enla celula, pero todavıa no se conoce la funcion de lasprimeras. Pese a que los genes var se transcribendurante todos los estadios anulares del desarrollo, ylos genes rif solo se expresan durante breve tiempo enel estadio anular tardıo/pigmentado precoz deltrofozoıto, ambos tipos de proteınas se detectan enla superficie de los eritrocitos aproximadamente en elmismo momento (primeras etapas del trofozoıto)(25, 33). Son necesarios nuevos estudios paradeterminar si estas proteınas guardan relacion entresı en el genoma, desde el punto de vista tantofuncional como fısico.

El ultimo segmento que quedaba por secuen-ciar en el cromosoma 3 abarcaba una region conpredominio extremo de [A+T]: 97,3% en 2,6 kb. Alcompararla ulteriormente con la secuencia delcromosoma 2, se identifico una region similar encomposicion y longitud. Ambas regiones ricas en[A+T] se localizan en areas cromosomicas pobres engenes, formando parte de la region intergenica maslarga del cromosoma 3. En un analisis mas detenidose comprobo la presencia de secuencias repetidasespecıficas de cada cromosoma. Por consiguiente, suestructura y el predominio de [A+T] llevan asospechar que estas regiones son centromeros.Existen estructuras centrales ricas en [A+T] en loscentromeros de Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccha-

romyces pombe, y las de este ultimo contienen complejassecuencias especıficas de cada cromosoma. Aunquehasta la fecha no se ha demostrado que estas regionesfuncionen como centromeros de P. falciparum, se haidentificado recientemente un tercer ejemplo de estaestructura en el cromosoma 1.



Genomica funcional

El acceso a un numero cada vez mayor desecuencias genomicas de microorganismos patoge-nos ha reforzado el impulso en pro de unainvestigacion «global». Quienes han establecido elparadigma para estos estudios han sido los investi-gadores de levaduras, que tienen acceso a lasecuencia completa del genoma de S. cerevisiae desde1996 (4). Aunque implıcito en la secuenciaciongenomica, el desarrollo de tecnicas para el estudio delos parametros funcionales en genomas completosha evolucionado hacia un nuevo campo deinvestigacion denominado «genomica funcional».En el caso de P. falciparum persisten diversasdificultades tecnicas, pero los investigadores estanya aplicando la genomica funcional al estudio de lascaracterısticas biologicas del parasito.

Bioinformatica

Al convertir los datos brutos de la secuenciagenomica en informacion util para el biologo, labioinformatica abarca tanto la secuenciacion como lagenomica funcional. Sus instrumentos mas impor-tantes son probablemente los buscadores capaces decribar grandes cantidades de informacion en busca desimilitudes significativas entre secuencias, ası comolos algoritmos de prediccion de regiones codifica-doras de proteınas (vease supra). En cuanto a los

primeros, existen en Internet varias paginas quepermiten buscar homologıas en una secuenciaproblema (vease la tabla 2) y presentan los resultadoscomo multiples series de alineamientos. Aunqueexisten errores en la definicion de genes «in silico» (esdecir, en modelos de genes predichos por ordena-dor), es evidente que estas tecnicas han generado unnumero enorme de funciones genicas potenciales,susceptibles de verificacion en el laboratorio. Quizalas formas mas sencillas son las anotaciones desecuencias cromosomicas completas basadas eninformacion de alta calidad. Las tablas de genesresultantes pueden dividirse en: genes con funcionconfirmada en P. falciparum; secuencias que muestranhomologıa con genes conocidos en otros micro-organismos; secuencias quemuestran homologıa congenes de funcion desconocida en otros micro-organismos; y secuencias especıficas de P. falciparumcuya funcion se desconoce. Uno de los supuestosbasicos es que la secuencia anotada contiene todos losgenes y que las predicciones para la secuenciacodificadora son correctas. Aunque esto es ciertoen gran medida, los genes «ausentes» y la identifica-cion incorrecta de sitios de corte y empalme hangenerado cierta controversia. Por ello, una partefundamental de todo sistema bioinformatico consisteen proporcionar software que permita examinar losdatos de las secuencias genomicas, para quelaboratorios independientes puedan pronunciarsesobre las secuencias codificadoras.

Paludismo


La difusion de las secuencias antes de supublicacion acelera el acceso a la informacion, lo cualha facilitado ya notablemente la investigacion delpaludismo. Sin embargo, varias paginas de Internetofrecen cada una informacion sobre partes distintasde la secuencia genomica de cromosomas diferentes.La pagina del National Center for BiotechnologyInformation de los Estados Unidos (NCBI, vease latabla 2) ha intentado agrupar toda la informaciondisponible sobre P. falciparum (ası como sobre otrasespecies de Plasmodium y del parasito apicomplejoemparentado Toxoplasma gondii ). Una iniciativa re-ciente, financiada por Burroughs Wellcome Fund, hacreado una base de datos completa (http://www.PlasmoDB.org). En su forma actual, Plas-moDB proporciona la informacion siguiente: esque-mas de la secuencia completada y anotada tanto enformato de consulta en la red como en disco optico;una base de datos relacional que deberıa facilitar laintroduccion y el analisis de datos de expresion; unabase de datos «BLASTable» con la informacion masreciente sobre la secuencia genomica (completa eincompleta); resultados, consultables como texto, deuna busqueda completa con BLAST de todos losdatos sobre P. falciparum en las bases de datosGenBank y EMBL; y diversos instrumentos mas parala extraccion de informacion significativa en bases dedatos. Ademas del evidente interes de PlasmoDBpara la comunidad de investigadores del paludismo, elPrograma Especial de Investigaciones y Ensenanzassobre Enfermedades Tropicales de PNUD/BancoMundial/OMS se ha comprometido a proporcionarun servicio de ayuda en lınea para PlasmoDB (y otrasbases de datos de parasitos) mediante la formacion decientıficos/bioinformaticos de paıses en desarrollo.

Micromatrices genicas

Las micromatrices son matrices de alta densidad deADN problema colocado en soportes de vidrio ofiltros. Se han utilizado en varios estudios, especial-mente para S. cerevisiae. El ADNproblema se presentaen dos formatos basicos: fragmentos de ADN(generados habitualmente por PCR), o bien oligonu-cleotidos. Los fragmentos obtenidos mediante PCRpara P. falciparum se han generado a partir de los datosde la secuencia genomica (D. Carrucci, comunicacionpersonal, 1998), o mediante la amplificacion desecuencias de una genoteca obtenida con la endonu-cleasa del frijol mungo. En el estudio de dichagenoteca (34) se crearon matrices a partir de unagenoteca al azar y se cribaron con ARNm procedentede los estadios asexuado (trofozoıto) y sexuado(gametocito). Se marcaron los ARN con distintosfluorocromos y se permitio que se hibridaran con lasmatrices. Los genes transcritos durante los estadiosasexuados se marcaron en verde, los transcritosdurante los estadios sexuados lo fueron en rojo, ylos transcritos durante ambos estadios lo fueron enamarillo (verde + rojo). Partiendo de este unicoensayo, los autores identificaron varios genes

regulados durante el desarrollo, incluidos algunosque ya habıan sido identificados con anterioridad, loque confirma la eficacia del metodo.

Las posibilidades que ofrecen este tipo detecnicas de laboratorio son considerables, peroobligaran a manejar y analizar minuciosamente losdatos. Hayward et al. (34) identificaron sus genescandidatos mediante la secuenciacion de los insertostras la hibridacion, pero, una vez secuenciado todo elgenoma, la ubicacion de cada ORF se almacenaracomo parte de la informacion de lamatriz. Unamatrizque abarcase todos los genes del genoma deP. falciparum por duplicado constarıa de 12 000–14 000 celdillas aproximadamente; por consiguiente,cada procedimiento generarıa al menos 14 000 datoscuantitativos por sonda, ademas de la informacionbasal de la matriz. Es facil comprender que, sin unabase de datos muy eficiente, la eficacia y la precisionde cualquier analisis se verıa muy mermada, sobretodo porque las modificaciones transcripcionalesprobablemente esten definidas por «agregados» degenes (35), lo cual complica la interpretacion de lacontribucion de cada uno de ellos. Para aprovechar almaximo los resultados, la base de datos ha de seraccesible a la comunidad cientıfica y, como se ha vistoen el caso de C. elegans (http://www.wormbase.org),es indispensable una base de datos centralizada.

Tambien se esta llevando a cabo el analisistranscripcional de P. falciparummediante el metodo deanalisis en serie de la expresion genica (Serial Analysisof Gene Expression, SAGE, 36; D. Wirth, comuni-cacion personal, 1998). Esta tecnica utiliza laamplificacion del ARNmmediante PCRpara obteneretiquetas de secuencias cortas exclusivas de cada gen.Las etiquetas se concatenan para formar cadenaslargas y se clonan en vectores adecuados. Lasecuenciacion de muchas etiquetas permite no soloidentificar que gen se esta expresando, sino tambiencuantificar el grado de expresion mediante elrecuento del numero de veces que aquellas aparecen.Es una tecnica de manejo mas difıcil que lahibridacion en matrices, pero su principal ventaja esque pueden utilizarse cantidades relativamentepequenas de material, factor de especial importanciacuando el numero de muestras es limitado (porejemplo, muestras tomadas sobre el terreno). En el

Tabla 2. Direcciones de Internet sobre bioinformatica aplicadaa Plasmodium falciparum

http://www.sanger.ac.uk/Projects/P_falciparum (datos de la secuencia genomica)http://www.tigr.org/tdb/edb/pfdb/pfdb.html (datos de la secuencia genomica)http://sequence-www.stanford.edu/group/malaria/index.html (datos de la secuenciagenomica)

http://www.PlasmoDB.org (base de datos «oficial» del Plasmodium GenomeConsortium)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Malaria (informacion sobre genetica/bibliografıa/datosde la secuencia genomica)http://www.ebi.ac.uk/parasites/parasite-genome.html (informacion general/proteomica)

http://sites.huji.ac.il/malaria/ (vıas metabolicas)



caso de ambas tecnicas es importante llevar a cabo latransferencia de tecnologıa, no solo en los aspectosmecanicos, como la robotica y el analisis de imagen,sino tambien en la valoracion de los supuestos y laslimitaciones. Por ejemplo, ninguna de las dos tecnicaspuede detectar los productos de empalmes alterna-tivos de ARNm.

Lasmatrices de alta densidad no solo se utilizanen el analisis transcripcional, sino que tienen tambienaplicaciones en el analisis del genoma, en particular enforma de matrices de oligonucleotidos. La granespecificidad de la hibridacion de oligonucleotidosofrece una alta capacidad de discriminacion, que llegahasta las sustituciones de un solo nucleotido. Sinembargo, el alto costo de la sıntesis quımica impide suuso mientras no se complete el proyecto desecuenciacion de P. falciparum. Un ejemplo de estetipo de estrategia procede, una vez mas, de S. cerevisiae(37), en el que se identifico la variacion alelica de losgenomas de dos cepas de la levadura unicamente porhibridacion de su ADN genomico en matrices deoligonucleotidos. La aplicacion de esta tecnologıa apoblaciones naturales de parasitos constituira uninstrumento muy poderoso para la epidemiologıamolecular. No obstante, sera necesario reunir lainformacion demuchos genomas de P. falciparum paraabarcar por entero la verdadera amplitud de genesmuy variantes y recombinogenicos, como var.

Proteomica y genomica estructural

Uno de los mayores retos tecnicos planteados a lagenomica funcional consiste en el analisis de laexpresion de las proteınas (proteomica). Aunque elanalisis transcripcional aplicado a genomas comple-tos ha generado informacion muy util, es evidenteque la correlacion entre la concentracion de ARNm yde proteına no es perfecta (38). En los ultimos anos sehan desarrollado con rapidez tecnicas para identificarlas proteınas en general. Sin embargo, el avance masimportante en la secuenciacion del genoma se debe ala aplicacion de la espectrometrıa demasas al analisis ycaracterizacion de las proteınas, mediante la combi-nacion de la masa (y por tanto la composicion enaminoacidos) de fragmentos peptıdicos con una basede datos de todas las combinaciones disponibles depeptidos, derivadas de los datos de la secuenciagenomica (vease una revision en 39). Estas tecnicaspermiten identificar proteınas individuales a partir demezclas complejas resueltas mediante cromatografıao electroforesis bidimensional (2-D). Estos metodos,unidos a las mejoras en la reproducibilidad de laelectroforesis bidimensional, han facilitado el analisisdiferencial de la composicion proteica de dospoblaciones de celulas.

Las aplicaciones de esta tecnologıa, porejemplo en el analisis del efecto de tratamientosfarmacologicos, ocupan un lugar importante en lainvestigacion del paludismo. Persisten tambienproblemas de ındole practica, sobre todo relativos alas proteınas de la membrana, escasamente represen-

tadas cuando se utilizan tecnicas proteomicas clasicas(40). Sin embargo, la tecnologıa siguemejorando (41),y la recompensa sera una clara definicion del espectrode proteınas que intervienen en procesos biologicoscruciales del parasito.

Las interacciones proteına-proteına desempe-nan un papel importante en la biologıa celular. Una vezmas, los instrumentos para investigar este fenomeno sehan desarrollado en las levaduras mediante el «sistemade dos hıbridos». En dicho sistema, los ORF sefusionan al dominio de transcripcion-activacion deGal4 en una cepa de levadura y se criban emparejan-dolos con una segunda cepa en la cual secuenciascodificadoras especıficas se han fusionado con eldominio de union al ADN de la proteına Gal4. Lasinteracciones proteicas positivas se detectan por lacapacidad de la progenie de la levadura para crecer enmedios selectivos. Este procedimiento se ha ampliadorecientemente para permitir a los investigadores unanalisis general de las interacciones proteına-proteınade unos 6000 ORF de levadura (42), el cual haaportado nuevos datos y confirmado anteriorescribados especıficos. La aplicacion de esta tecnica a lainvestigacion del genoma de microorganismos pato-genos ampliara la informacion funcional.

Uno de los objetivos de la biologıa compu-tacional consiste en predecir la funcion biologica deuna proteına a partir de su secuencia primaria. Esaaplicacion se materializa hoy principalmente en elcampo de la genomica estructural, que estudia laestructura tridimensional de las proteınas en elcontexto de la secuencia de aminoacidos. Aunquetodavıa queda mucho por hacer, el hecho de que seconozca la estructura cristalina de un numero cada vezmayor de moleculas biologicas ha conducido ya a lageneracion de reglas/motivos aplicables a la busquedade informacion estructural (43). A medida que sedisponga de mas informacion, incluida la integracionde datos funcionales referidos a residuos activos, estosalgoritmos computacionales mejoraran.

Metabolomica y vacunomica

Una de las muchas consecuencias de la genomicafuncional ha sido la genesis de un nuevo vocabulariopara abarcar las muchas aplicaciones de la metabo-lomica y la vacunomica. Ası, toda la dotacion deARNm y proteınas de un organismo se ha denomi-nado transcriptoma y proteoma, respectivamente. Enla misma lınea, el empleo de informacion genomicapara facilitar el estudio de los procesosmetabolicos seha denominado metabolomica (44, 45). Es evidenteque la aplicacion de las similitudes de secuencias a laidentificacion de componentes de vıas conocidasrepercutira grandemente en este campo de investi-gacion, pero tambien se han propuesto cribadosfuncionales. Por ejemplo, mediante la expresion detodos los ORF predichos de un genoma comoproteınas de fusion heterologas, se podrıan buscarfunciones enzimaticas especıficas. Esta estrategiaserıa tambien aplicable a la determinacion de las

Paludismo


reacciones inmunitarias protectoras del huespedmediante la inmunizacion con mezclas de proteınas.Otro campo de investigacion emparentado con estees el denominado vacunomica; en el se utilizanplasmidos de vacunas de ADN que contienen ORF(derivados del proyecto de secuenciacion) parainmunizar a animales de experimentacion y, en elcaso de los microorganismos patogenos, paradetectar un posible efecto protector (46). Esta formade proceder permitirıa obtener posibles vacunas, yademas los sueros resultantes podrıan utilizarse paradeterminar la ubicacion de cada proteına en la celula.

A medida que aumente el numero de genomassecuenciados y los investigadores se acostumbren apensar en terminos «globales», se ampliara rapida-mente la cantidad de informacion generada por lagenomica funcional. Los retos consistiran entoncesen desarrollar sistemas para analizar esta informaciony mantener la atencion centrada en las cuestionesbiologicas. Es evidente que, en el caso del paludismo,una buena manera de afrontar dichos retos serıa elestudio de los propios parasitos, facilitado por loscruzamientos geneticos (47) y la tecnologıa de lamanipulacion genetica (vease mas abajo).

Transfeccion dePlasmodium falciparum

La transfeccion o introduccion de ADN exogeno enorganismos vivos puede ser uno de los instrumentosmas poderosos para el analisis del genoma delparasito, y permite abordar especıficamente cuestio-nes relacionadas con la funcion genica. Sin embargo,hasta que se demostro por vez primera la expresionde la luciferasa en el modelo del paludismo de lospollos, P. gallinaceum, los investigadores no habıanpodido modificar o inactivar los componentes delgenoma de P. falciparum (48). Tras la publicacion deeste trabajo, se consiguio la transfeccion deP. falciparum con la introduccion de un plasmidoportador del gen indicador que codifica la cloranfe-nicol acetiltransferasa (CAT) en los estadios intra-eritrocıticos facilmente cultivables (49). A este logrosiguio pronto la transfeccion estable de un plasmidoportador de un marcador seleccionable mediante lapirimetamina (mdhfr-ts, un gen mutante de ladihidrofolato reductasa-timidina sintetasa), y suulterior integracion en el genoma por recombinacionhomologa (50). Los plasmidos descritos en estosinformes iniciales, ası como un sistema de expresiontransgenica (expresion de un gen indicador proce-dente de un plasmido estabilizado por medio demdhfr-ts (51)) han proporcionado la base de todos losestudios ulteriores en P. falciparum.

En varios estudios se han utilizado los genesindicadores de la CAT y la luciferasa para determinarla estructura y funcion de las unidades transcripcio-nales de P. falciparum. Se ha comprobado que lospromotores de P. falciparum poseen la clasica estruc-tura bipartita: un promotor basal regulado porfactores reguladores en sentido 5’, mientras la

estabilidad del transcripto esta dirigida por secuenciasreguladoras en 3’ (52–57). Asimismo, el contextonuclear en el que se situan los promotores desempenaun papel fundamental en su funcion, lo que indica quefenomenos tales como la expresion genica especıficade cada estadio y los cambios de expresion entremiembros de la familia multigenica var puedendeberse a factores epigeneticos, como la organizacionde la cromatina (58, 59).

Estudios mas avanzados, en los que se hanaplicado la inactivacion genica y la sustitucion dealelos, constituyen la base de una serie de informesrecientes en los que se analizan aspectos de labiologıa de P. falciparum, como la citoadherencia, lagametogenesis y la farmacorresistencia (tabla 3). Lainactivacion del gen que codifica la proteına rica enhistidina asociada a los botones (knob-associatedhistidine-rich protein, KAHRP), localizada en estasestructuras electrodensas de la superficie de loseritrocitos parasitados, demostro que se trata de unaproteına importante para la formacion de dichosbotones (51). Estudios complementarios demostra-ron que la estructura de boton brinda un apoyocrucial a la proteına PfEMP-1 durante su interaccioncon los receptores del huesped en condiciones deflujo fluido. Pfg27, una proteına expresada pocodespues de que el parasito emprenda la diferencia-cion sexual, es tambien esencial, ya que lainactivacion de este gen produjo el aborto de lostransfectantes en fases tempranas de la gametoge-nesis y dio origen a parasitos muy vacuolados y congrandes alteraciones morfologicas (60).

El papel de las mutaciones en genes queconfieren resistencia a una amplia gama de anti-paludicos se ha estudiado tambien modificando losORF en lugar de inactivandolos (61). En elegantesestudios, basados en la introduccion de mutacionesepidemiologicamente asociadas a farmacorresistenciaen parasitos farmacosensibles, se ha demostrado tantoel papel de la dihidropteroato sintasa en la resistencia ala sulfadoxina como el del homologo 1 de laglicoproteına P (Pgh-1) en la polifarmacorresistencia(62). Estos estudios se han utilizado tambien parademostrar la situacion inversa, en la quemutaciones decg2, un gen candidato de la resistencia a la cloroquina,no conferıa resistencia a parasitos sensibles, lo quecondujo a nuevas investigaciones en las que seidentifico un candidato mas prometedor (D. Fiddock,T. Wellems, comunicacion personal, 1999).

La limitacion principal de este tipo de estrategiaexperimental es que los parasitos intraeritrocıticosinvestigados son haploides. La inactivacion selectivade genes esenciales condujo inevitablemente a lamuerte del parasito; ademas, cualquier efecto sobre laviabilidad del parasito situara a esta parte de lapoblacion en desventaja para su multiplicacion. Esteproblema puede soslayarse parcialmente medianteseleccion o con vıas alternativas que permitan superaresa desventaja.

Las propuestas de un consorcio de laborato-rios, similar a la red EUROFAN de S. cerevisiae, parainactivar sistematicamente todo gen identificado en el



proyecto de secuenciacion del genoma han tenido encuenta muy diversas cuestiones, como la malaviabilidad del parasito, la escasa eficiencia de latransfeccion, el numero de laboratorios capaces decrearmutantes y el costo unitario de cada inactivaciongenica (63). Aunque quedan todavıa muchas cues-tiones por resolver, se ha acordado que deberıarealizarse algun tipo de analisis sistematico de ladotacion genica del parasito. Sin embargo, queda pordeterminar si se asignara a cada laboratorio una partedel genoma o si se recurrira a una estrategia tematica(basada en el interes de cada laboratorio por un temaconcreto, como la invasion eritrocıtica, la citoadhe-rencia o la gametocitogenesis).

Modelos experimentalesde paludismo

La ausencia de sistemas de cultivo in vitro parala mayor parte de los estadios del desarrollo deP. falciparum y las consideraciones eticas necesariaspara el uso de chimpances y monos del NuevoMundo ponen de relieve las ventajas de los sistemasbasados enmodelos experimentales de paludismo. Latransfeccion en modelos de paludismo animal ha

abierto todo el ciclo vital del parasito, incluidas lasetapas que transcurren en el mosquito, a un analisiscrıtico imposible de realizar en los parasitos humanos(64). Ademas, la eficiencia del proceso de transfec-cion, que facilita las sustituciones de genes por doblecruzamiento, y la rapida seleccion de transfectantes invivo, han desembocado en un acopio acelerado denueva informacion sobre las caracterısticas biologicasde las especies de Plasmodium.

Tras los primeros informes sobre transfeccionen P. berghei, modelo experimental de paludismo enroedores, en el ano 1995 (65), la inactivacion de losgenes que codifican la proteına del circumesporozoı-to (CS) (66) y la proteına anonima relacionada con latromboespondina (TRAP) (67) demostro la utilidadde este metodo en la investigacion de las funciones:ademas de su participacion en el reconocimiento y lainvasion de las celulas del huesped, se les atribuyerona las proteınas CS y TRAP nuevos papeles en laformacion del esporozoıto y la movilidad pordeslizamiento, respectivamente. Se ha demostradola existencia de caracterısticas biologicas recurrentes:por ejemplo, la proteına CTRP, homologa de laproteına TRAP, interviene en la movilidad deloocineto y, por consiguiente, en la capacidad parainfectar a los mosquitos.

Tabla 3. Genes modificados o inactivados en Plasmodium

Gen diana de Plasmodiuma Fenotipo Referencia

CS de Pb Inhibicion de la formacion de esporozoıtos, perdida de la infectividad 66TRAP de Pb Los esporozoıtos no se deslizan y son menos infectivos 67CTRP de Pb, Pf Los oocinetos no tienen movilidad y no pueden invadir 83–85

el epitelio intestinal ni evolucionar a oocistosKAHRP de Pf Los eritrocitos infectados carecen de «botones» y su union 51

a CD36 es menor en condiciones de flujoG27 de PF Inhibicion total (inactivacion en 3’) o importante (inactivacion en 5’) 60

de la gametocitogenesis.

Gen de Plasmodium modificado Manipulacion y fenotipo Referencia

Mutacion de DHPS de Pf La introduccion de mutaciones observadas sobre el terreno genera 61resistencia a la sulfadoxina.

Sustitucion de pgh1 de Pf La introduccion de mutaciones observadas sobre el terreno genera resistencia 62a la mefloquina, la halofantrina y la quinina. Tambien resistencia a lacloroquina con especificidad de cepa.

TRAP de Pb Sustitucion por TRAP de Pf. Los esporozoıtos pueden deslizarse 86e invadir las glandulas salivales; conservan la capacidad infectante

TRAP de Pb Sustitucion por mutantes de TRAP de Pf. Los esporozoıtos TRM no se 86deslizan ni invaden las glandulas salivales, pero conservan la capacidadinfectante. Los esporozoıtos Amut no invaden las glandulas salivales,pero conservan la capacidad infectante.

TRAP de Pb Sustitucion por mutante de TRAP de Pb. Los esporozoıtos Cyt ~S y ~L 87no se deslizan con normalidad, no pueden invadir las glandulas salivalesy no son infectantes. Los esporozoıtos Cyt/MIC–2 pueden deslizarse einvadir las glandulas salivales; poseen capacidad infectante.

Proteına transportadora La etiqueta verde fluorescente de la proteına demuestra la necesidad 80de acilos de Pf de una secuencia guıa bipartita para dirigir correctamente la proteına hacia

el apicoplasto y la conservacion de la secuencia guıa en los apicoplastos.MSP1 de Pf En la sustitucion del C terminal por el de P. chabaudi se constata que MSP-1 88

conserva su funcion y su capacidad para la variacion antigenica.

a Salvo en los casos indicados, los loci diana se inactivaron tras la integracion. Los genes de P. berghei se indican con las letras Pb o PB,y los de P. falciparum con Pf o PF.

Paludismo


Los huespedes animales, faciles de obtener ybien caracterizados desde el punto de vista inmuno-logico, permiten investigar toda una gama deinteracciones huesped-parasito. Tras el exito de estetrabajo, en el Centro de Investigacion Bioquımica enPrimates (Paıses Bajos) se ha logrado la transfeccionde dos modelos de paludismo en primates. TantoP. knowlesi (68) comoP. cynomolgi (69) se transfectaroncon estructuras plasmıdicas completamente hetero-logas, portadoras de un marcador DHFR-TS deToxoplasma gondii seleccionable por farmacos ycontrolado por secuencias reguladoras de P. berghei.Una ventaja particular de los modelos de paludismoen primates es que permiten estudiar a los parasitostransfectados tanto en sus huespedes naturales comoen los artificiales. Dentro de estrictos lımites eticos, elempleo de estos sistemas facilita la realizacion deanalisis muy utiles de las interacciones huesped-parasito, y permitira estudiar los mecanismos querigen la respuesta inmunitaria del huesped, ademas deproporcionar un modelo experimental para evaluarlas vacunas.

Los modelos de paludismo animal compartenmuchas caracterısticas con sus equivalentes huma-nos, como los ciclos vitales, las restricciones en lascelulas huespedes y las reacciones inmunitarias. Porejemplo, la infeccion de los macacos por P. cynomolgies un modelo especialmente bueno para la infeccionpor P. vivax, con la cual comparte la preferencia porlos reticulocitos y la formacion de hipnozoıtos (69).Aunque disponemos de mucha informacion sobrelosmodelos de paludismo animal, en particular acercade los antıgenos vacunales homologos, sabemoscomparativamente poco de estos sistemas a escalamolecular. Los programas informaticos para lasecuenciacion de genotecas de EST, ası como lasecuenciacion genomica aleatoria de pequena cober-tura, han supuesto ya un impulso fundamental para laaplicacion de modelos animales a la biologıa delpaludismo humano y deberıan verse respaldados poractividades de secuenciacion a mayor escala. El usode modelos animales permitirıa pensar en estrategiasprogramaticas intensivas para el estudio de la funciongenica con metodos de inactivacion/etiquetado.

Allı donde especies de Plasmodium comoP. knowlesi y P. cynomolgi proporcionan modelos parala infeccion y la inmunidad, el apicomplejo estre-chamente emparentado T. gondii ofrece un modelopara el estudio de muchos aspectos biologicos dePlasmodium (70). En este parasito, los sistemas detransfeccion estan bien desarrollados, con unatransformacion muy eficiente y numerosos marca-dores tanto para la seleccion positiva como para lanegativa (71). El sistema, apto para su manipulacionexperimental, ha resultado de gran utilidad en laresolucion de cuestiones como la estructura y lafuncion del plastido (72), la invasion de celulashuespedes, la farmacorresistencia, la virulencia y laexpresion genica. A diferencia de las especies dePlasmodium, que integran moleculas de ADNexclusivamente por recombinacion homologa,T. gondii admite tambien la integracion no homologa,

permitiendo ası etiquetar todo el genoma yconsiderar la funcion genica desde una perspectivafenotıpica. Para ello, Plasmodium necesitara unsistema basado en transposones con especificidadsimple del sitio de reconocimiento, como elelemento mariner de Drosophila, que se transfiereeficazmente a diversos genomas eucarioticos, in-cluido el de Leishmania major (73).

Para continuar con el asalto sistematico algenoma de Plasmodium son necesarios avances de altoy bajo nivel tecnologico, como mejores metodos decultivo para ciertos parasitos humanos y modelosanimales en fase hematica, el desarrollo de gametos, yel cultivo eficiente de esporozoıtos. Dichos avances,unidos a los progresos en la tecnologıa de transfec-cion, como los metodos para aumentar la eficienciade esta, los nuevos marcadores y la adopcion delsistema Tet-represor, haran de la transfeccion uninstrumento mas fiable y sensible. Sin embargo, solose podran explotar plenamente estos avances cuandose combinen con el conocimiento del genomacompleto del parasito.

Genomica comparativa

Ya se han mencionado las dificultades que puedeentranar la anotacion de un genoma completo, enparticular la asignacion de funciones a genesdesconocidos y la identificacion correcta de genesque contienen numerosos exones. En ultima instan-cia, el acceso a la secuencia completa o muy extensadel genoma de una especie emparentada sera uninstrumento sumamente valioso que ayudara aevaluar con precision el potencial codificador de ungenoma (74). Los estudios de cromosomas deespecies causantes de paludismo en roedores hanrevelado diferencias escasas o nulas en el ligamientogenico (75), ası como la existencia de grandes gruposde ligamiento conservados entre estas especies delpaludismo de roedores y P. falciparum (76). Un analisislimitado, pero mas detallado, revelo que la organiza-cion del genoma esta muy conservada en las regionesinternas no subtelomericas del cromosoma (77, 78).

Por consiguiente, se espera que la alineacion delas regiones ortologas del cromosoma muestrefronteras intron-exon detalladas y ayude a identificargenes codificadores de antıgeno ortologos, peropolimorficos, ası como centromeros y genes especı-ficos de especies. En este ultimo caso, es probableque tambien resulte util la comparacion con elgenoma de un apicomplejo mas distante. Puede queel orden de los genes no este bien conservado, perolas comparaciones intergenomicas mostraran mu-chas caracterısticas destacadas de los apicomplejos,como el apicoplasto (79–81). La facilidad detransformacion de Toxoplasma gondii y su idoneidadpara los estudios citobiologicos, unidas a la genomicacomparada, brindan una oportunidad excelente paraprofundizar en la biologıa del paludismo, ası comopara desarrollar dianas farmacologicas (19, 82) yposiblemente vacunas.



Conclusion

La capacidad de secuenciar genomas completos hatenido gran repercusion en la manera de enfocar lasinvestigaciones cientıficas. A medida que aumenta elnumero de genomas completos de microorganismospatogenos, crece tambien el impulso en pro deldesarrollo de tecnicas que utilicen esta informacion.En paralelo al proyecto del genoma de P. falciparum, seestan desarrollando tambien tecnicas como latransfeccion, las micromatrices y la proteomica, asıcomo el analisis bioinformatico, y se estan aplicando acuestiones biologicas fundamentales. Se espera que eluso conjunto de estos instrumentos proporcione unabase predictiva para la puesta en marcha deinvestigaciones biologicas basadas en hipotesis.

Para materializar estas expectativas esfundamental un respaldo financiero continuo, quepermita seguir desarrollando tecnicas y recursosdestinados a explotar la secuencia genomica. Losavances que aportaran informacion biologica sobreel parasito estan representados tanto por las basesde datos relacionales de acceso publico como porlos analisis detallados, ya sean comparativos o deencuestas. Es preciso subrayar que el objetivoglobal de estas costosas iniciativas es lograr lacuracion del paludismo, y que la contribucion deesta estrategia tecnologica podrıa ser inmensa. Elreto actual para la comunidad cientıfica reside enseguir difundiendo esta tecnologıa y concentrarlos esfuerzos en el desarrollo de nuevos farmacosy vacunas. n

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Paludismo


la investigacioń del paludismo en la era posgeno´mica · se resume tambień la aplicacioń de...

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