I.- Replicación del DNA:

LA REPLICACIÓN DEL ADN ES, CASI SIEMPRE, BIDIRECCIONAL.

Los experimentos de Meselson y Stahl verificaron de una manera clara la idea de que durante la replicación del DNA, cada hebra de la doble hélice sirve como molde para la síntesis de una hebra complementaria nueva. A medida que los biólogos iban desvelando los detalles moleculares de este proceso, fue quedando claro, que la replicación del DNA es un proceso complejo en el que participan numerosas enzimas y otras proteínas, e incluso el RNA. Examinaremos en primer lugar los aspectos fundamentales de este mecanismo de replicación, y después nos centraremos en alguno de sus detalles moleculares. Para ello, mencionaremos con frecuencia a la bacteria Escherichia coli, en la que el mecanismo de replicación se conoce especialmente bien. No obstante, las investigaciones desarrolladas en algunos virus de mamíferos como SV40, y en la levadura Saccharomyces cerevisiae, han comenzado a desvelar los detalles de la replicación del DNA en los organismos eucariotas. La replicación del DNA parece ser un acto teatral cuya representación y sus actores moleculares son básicamente los mismos en las células procariotas y en las eucariotas. Esto no es sorprendente en un proceso tan fundamental, que debió surgir al principio de la evolución de la vida. Los primeros experimentos en los que se logró visualizar directamente Ia replicación del DNA, fueron llevados a cabo por John Cairns. Cairns cultivó células de E. coli en un medio con el precursor del DNA, H-timidina, durante varios periodos de tiempo, y después utilizó la autorradiografia para examinar las moléculas de DNA capturadas durante el acto de replicación. Una de estas moléculas se muestra en Ia. Las dos estructuras con forma de Y, representan los sitios de la doble cadena en los que el DNA se está replicando. Estas horquillas de replicación se forman durante la duplicación, que comienza en un punto determinado del DNA y progresan a lo largo de él, desenrollando la hélice y copiando ambas cadenas a medida que avanzan. El sitio específico donde comienza Ia replicación contiene una secuencia de DNA especial denominada origen de replicación. Para comenzar Ia replicación, un grupo determinado de proteínas iniciadoras debe unirse al origen y usando la energía proveniente de la hidrólisis del ATP, desenrollan Ia doble hélice para permitir el acceso de toda la maquinaria de replicación al DNA de cadena simple.En Ia mayoría de los casos, la replicación del DNA se lleva a cabo desde el origen, de una manera bidireccional -es decir, se forman dos horquillas de replicación que se mueven en direcciones opuestas desde el origen-. En el DNA circular, este proceso se denomina replicación theta, porque se producen intermediarios que se asemejan a la letra griega theta. Casi todas las moléculas de DNA circular se replican de esta manera, comenzando en un origen único. La replicación theta no sólo tiene lugar en los genomas bacterianos como E. coli, sino también en el DNA circular de las mitocondrias, los cloroplastos, los plásmidos y algunos virus. Al final de un ciclo de replicación theta, los dos DNA circulares permanecen unidos y se requiere la acción de la topoisomerasa para separar los dos círculos.

EN LA REPLICACIÓN DEL DNA EUCARIOTA INTERVIENEN MUCHOS REPLICONES.-

A diferencia de lo que sucede en los cromosomas circulares bacterianos, en los cuales Ia replicación del DNA se inicia en un único origen, la replicación del DNA lineal de los cromosomas eucariotas se inicia en muchos sitios, formándose múltiples unidades de replicación conocidas como replicones. El DNA de un cromosoma eucariota típico puede contener varios centenares de replicones, cada uno con una longitud de

50.000-300.000 pares de bases. En el centro de cada replicón se encuentra un origen de replicación donde la síntesis de DNA se inicia por un proceso en el que participan varios grupos de proteínas iniciadoras. En primer lugar, se une al origen un complejo multiproteico conocido como Complejo de Reconocimiento de Origen (ORC). El siguiente componente que se une es eI complejo MCM, que contiene varias enzimas denominadas helicasas del DNA, que facilitan la replicación del DNA, desenrollándolo. Para el reclutamiento del complejo MCM al sitio de origen, se requiere un tercer grupo de proteínas, conocido como cargadores de helicasas, que median la unión de las proteínas del MCM al ORC. En este momento, el grupo completo de proteínas unidas al DNA se denomina complejo de pre replicación y se dice que el DNA está <autorizado> para replicarse. Sin embargo, la replicación no comienza hasta que se incorporan varias proteínas adicionales, incluidas las enzimas que catalizan la síntesis del DNA.Las secuencias del DNA que funcionan como orígenes de replicación presentan una gran variabilidad en los eucariotas. Dichas secuencia se identificaron por primera vez en levaduras ( S. cerevisiae),aislando fragmentos de DNA e insertándolos en otras moléculas de DNA, que no eran capaces de replicarse. El fragmento de DNA insertado se denominó secuencia de replicación autónoma o ARS, cuando confería a la molécula la capacidad de replicarse en la levadura. El número de elementos ARS que se han detectado en los cromosomas de las levaduras normales es parecido al número total de replicones, lo que sugiere que los elementos ARS funcionan como orígenes de replicación. Los elementos ARS de S. cerevisiae tienen una longitud de 100-150 pares de bases y contienen una secuencia central común de 11 nucleótidos, formada principalmente por pares AT, flanqueada por secuencias auxiliares que contienen regiones adicionales ricas en AT. Debido a que la doble hélice de DNA debe desenrollarse cuando se inicia la replicación, la presencia de tantos pares de bases AT en los orígenes de replicación es muy útil, ya que las bases AT están unidas por dos puentes de hidrógeno, y son más fáciles de romper que los pares de bases GC, que se unen mediante tres puentes de hidrógeno. Los orígenes de replicación de los organismos pluricelulares eucariotas son generalmente más grandes y variables que los elementos ARS de S. cerevisiae, pero también contienen regiones que son ricas en AT.Después de que se haya iniciado la síntesis del DNA en un origen de replicación, las dos horquillas de replicación continúan Ia síntesis en direcciones opuestas desde el origen, formando una burbuja de replicación, que aumenta de tamaño a medida que avanza en ambas direcciones. Cuando la burbuja de replicación creciente de un replicón se encuentra con la burbuja de un replicón adyacente, se une el DNA sintetizado por cada replicón. De esta manera, el DNA sintetizado en varios sitios de replicación se une finalmente para formar dos moléculas hijas de doble hebra, cada una de las cuales tiene una hebra parental y otra de nueva síntesis.

¿Por qué la replicación del DNA en eucariotas posee varios sitios de replicación y en los procariotas no? Dado que los cromosomas eucariotas contienen más DNA que los bacterianos, les llevaría mucho más tiempo replicar sus cromosomas en el caso de que la síntesis de DNA se iniciase desde un único origen de replicación. Es más, la tasa a la que la horquilla de replicación sintetiza DNA en eucariotas es menor que en bacterias (presumiblemente porque la presencia de nucleosomas frena e proceso de replicación). La medida de la longitud de DNA radiactivo sintetizado por células expuestas a 3H timidina durante periodos variables de tiempo, ha mostrado que la horquilla de replicación de los eucariotas sintetiza DNA con una tasa de 2.000 pares de bases por minuto, en comparación con los 50.000 pares de bases por minuto de las bacterias. Como un cromosoma humano medio contiene cerca de 108 pares de bases, ¡se tardaría más de un mes en replicar un cromosoma en el caso de que sólo tuviese un origen de replicación!

La relación entre la velocidad de replicación de un cromosoma y el número de replicones queda reflejada perfectamente si se comparan las tasas de síntesis de DNA de células embrionarias y células adultas de la mosca de la fruta Drosophila. Durante el desarrollo del embrión, cuando la división celular debe de tener lugar muy rápidamente, las células embrionarias utilizan simultáneamente un gran número de replicones activos que poseen sólo unos cientos de pares de bases de longitud. Como consecuencia, el DNA se replica muy rápidamente y la fase S sólo dura unos minutos. Las células adultas, por su parte, emplean menos replicones espaciados a intervalos de decenas, centenares o millares de pares de bases, haciendo que la fase S tarde casi 10 horas en completarse. Ya que la tasa de síntesis de DNA en cualquier horquilla de replicación es prácticamente la misma en las células embrionarias y en las adultas, está claro que la duración de la fase S viene determinada por el número de replicones y la frecuencia con la que son activados, y no por la velocidad a la que cada replicón sintetiza DNA.Los replicones no se activan todos al mismo tiempo durante la fase S del ciclo celular de una célula eucariota típica. En vez de eso, ciertos grupos de replicones suelen replicarse al inicio de la fase S, mientras que otros lo hacen más tarde. La información relacionada con el orden en el que los replicones son activados, se obtuvo de experimentos en los que se incubaron células en diferentes momentos del a fase S, con S-bromodeoxiuridina (BrdU), una sustancia que se incorpora al DNA en lugar de la timidina. El DNA marcado se puede separar del normal por centrifugación en equilibrio de gradiente de densidad, puesto que el DNA que tiene BrdU es más denso que el DNA normal. Después se analiza el DNA marcado con BrdU mediante su hibridación con diferentes sondas específicas para determinados genes. Estos estudios han mostrado que los genes que se expresan activamente en un determinado tejido se replican en la fase S antes que los genes que están inactivos, que lo hacen más tarde durante la fase S. Si se analiza el mismo gen en dos tipos celulares, uno de los cuales tiene eI gen activo y el otro no, se observa una replicación temprana sólo en el tipo celular en el que el gen se está transcribiendo.

LAS DNA POLIMERAZAS CATALIZAN LA ELONGACIÓN DE LAS CADENAS DE DNA.

Cuando se propuso por primera vez el modelo de la replicación semiconservativa a principios de la década de 1950, los biólogos pensaron que el proceso de replicación era tan complejo, que sólo podía ser llevado a cabo en células intactas. Sin embargo unos años más tarde, Arthur Kornberg descubrió que una enzima que habla aislado de bacterias podía copiar moléculas de DNA en un tubo de ensayo. Esta enzima, a la que denominó DNA polimerasa, necesitaba una pequeña cantidad de DNA que actuase como molde. En presencia de dicho molde, la polimerasa catalizaba la elongación de las cadenas de DNA usando como sustratos a los derivados de los nucleósido trifosfato de las cuatro bases que componen el DNA (dATP dTTP dGTP y dCTP). A medida que estos sustratos se incorporan en la cadena de DNA recién formada, se liberan sus dos grupos fosfato terminales. Los desoxinucleósidos trifosfatos son compuestos de alta energía cuya energía libre de hidrólisis es comparable a la del ATR por lo que la energía liberada cuando estos enlaces fosfato se rompen, dirige lo que de otro modo sería una reacción de polimerización termodinámicamente desfavorable. En la reacción de la DNA polimerasa, los nucleótidos entrantes están unidos covalentemente al extremo 3' de la cadena de DNA en crecimiento. Cada nucleótido adicional está unido a la cadena en crecimiento por un enlace fosfodiéster entre el grupo fosfato de su carbono 5' y el grupo hidroxilo del carbono 3' del nucleótido que fue añadido en el paso anterior. En otras palabras, la elongación de la cadena tiene lugar en el extremo 3' de una hebra de DNA, y se dice por lo tanto que Ia hebra crece en dirección 5' --->3'.

Poco después del descubrimiento de Kornberg, se descubrieron otras DNA polimerasas en células procariotas y eucariotas. La enzima descubierta por Kornberg en E. coli resultó no ser Ia responsable del a replicación del DNA en células intactas. Este hecho fue descubierto cuando Peter Delucia y John Cairns publicaron que ciertas cepas mutantes de la bacteria que no tenían la enzima de Kornberg, eran capaces de replicar su DNA y reproducirse normalmente. En ausencia de la enzima de Kornberg, era posible detectar varias enzimas de origen bacteriano que sintetizaban DNA. Estas otras enzimas se numeran usando números romanos (por ejemplo, DNA polimerasas II, III, IV y V) para distinguirlas de la enzima original de Kornberg, denominada DNA polimerasa I. Cuando se comparó por primera vez las tasas de replicación de varias DNA polimerasas en un tubo de ensayo, se encontró que sólo la DNA polimerasa III funcionaba lo suficientemente rápido para satisfacer la tasa de replicación de DNA de las células intactas, que incorpora como media 50.000 pares de bases por minuto en las bacterias. Estas observaciones sugerían que la DNA polimerasa III es la enzima principal en la replicación del DNA de bacterias, pero la evidencia resultaría más convincente si se demostrase que las células que no tienen DNA polimerasa III son incapaces de replicar su DNA. ¿Cómo es posible cultivar y estudiar células que han perdido la habilidad de llevar a cabo una función tan esencial como es la replicación del DNA? Una estrategia muy acertada se basa en el empleo de mutantes sensibles a la temperatura, que son células que producen proteínas que funcionan adecuadamente a una temperatura normal, pero que sufren daños considerables cuando aumenta ligeramente la temperatura. Por ejemplo, se han aislado bacterias mutantes en las que la DNA polimerasa III funciona correctamente a 37 °C, pero que pierde su función cuando la temperatura se eleva a 42 °C. Estas bacterias crecen normalmente a 37 °C, pero pierden la capacidad de replicar su DNA cuando la temperatura alcanza los 42 °C, lo que indica que la DNA polimerasa III desempeña un papel crucial en el proceso normal de replicación.

A pesar de que las observaciones anteriores indican que la DNA polimerasa III es esencial para la replicación del DNA en bacterias, no es la única enzima implicada. Como veremos a continuación, se requieren muchas otras proteínas para la replicación del DNA, incluyendo la DNA polimerasa I. Los otros tipos principales de DNA polimerasa de las bacterias (II, III y IV) desempeñan un papel más especializado en fenómenos relacionados con la reparación del DNA. Al igual que las bacterias, las células eucariotas disponen de varias DNA polimerasas. Hasta la fecha, se han identificado más de una docena de enzimas diferentes, cada una de ellas denominada con una letra griega distinta. Dentro de este grupo, las polimerasas α (alfa), δ (delta) y ε (épsilon) están implicadas en la replicación del DNA nuclear. La DNA polimerasa y “γ” (gamma) se encuentra únicamente en la mitocondria y es la principal polimerasa usada en la replicación del DNA mitocondrial. La mayoría de las polimerasas eucariotas restantes participan, tanto en la reparación del DNA, como en la replicación entre las regiones de DNA dañado.

EN LA SÍNTESIS DE DNA SE FORMAN SEGMENTOS DISCONTINUOS QUE SE ENSAMBLAN POR MEDIO DE LA DNA LIGASA.

El descubrimiento de la DNA polimerasa constituyó el primer paso en la elucidación del mecanismo de replicación del DNA. Uno de los primeros problemas conceptuales surgió del descubrimiento de que las DNA polimerasas sóIo pueden catalizar la incorporación de nucleótidos al extremo 3' de una cadena de DNA existente; en otras palabras, las DNA polimerasas sintetizan DNA en la dirección5 ' --->3 '

exclusivamente. Por lo tanto, las dos hebras de la doble hélice de DNA corren en direcciones opuestas. Así que, ¿ cómo puede una enzima que sólo funciona en la dirección 5' --->3 ' sintetizar ambas hebras de DNA en una horquilla de replicación, cuando sólo una de las cadenas discurre en dirección 5' --->3 ' ,y Ia otra lo hace en dirección3 ' --->5 '?La solución a este problema fue propuesta en 1968 por Reiji Okazaki, cuyos experimentos sugirieron que el DNA se sintetiza en pequeños fragmentos que se unen posteriormente. Okazaki aisló el DNA de bacterias que habían sido expuestas brevemente a un sustrato radiactivo que se incorporaba a las hebras de DNA de nueva síntesis. El examen de este DNA reveló que gran parte de la radiactividad se localizaba en pequeños fragmentos de DNA con una longitud de unos miles de nucleótidos. Después de exposiciones más prolongadas la, radiactividad se encontraba asociada a moléculas más grandes. Estos resultados llevaron a Okazaki a pensar que los fragmentos más pequeños de DNA, conocidos hoy en día como fragmentos de Okazaki, son los precursores de moléculas de DNA más Iargas de nueva formación. En investigaciones posteriores se puso de manifiesto que la conversión de los fragmentos de Okazaki en moléculas de DNA más grandes no tenía lugar en bacterias mutantes que no tenían la enzima DNA ligasa, que une los fragmentos de DNA, catalizando la formación de un enlace fosfodiéster dependiente de ATP, entre el extremo 3' de una cadena de nucleótidos y el extremo 5' de otra.

La DNA polimerasa sólo sintetiza DNA en la dirección 5' --- 3'. Según este modelo, la síntesis en la horquilla de replicación es continua para una hebra, en la dirección del movimiento de la horquilla de replicación, pero discontinua para la otra hebra en la dirección contraria. De esta manera las dos hebras hijas se pueden diferenciar por su modo de crecimiento. Una de las dos hebras nuevas, denominada cadena conductora, se sintetiza de una manera continua porque crece en la dirección5' -->3'. La otra hebra de nueva formación, denominada cadena retrasada, debe crecer en la dirección 3' -->5', ya que las dos cadenas de DNA están orientadas de manera opuesta. Como la DNA polimerasa no es capaz de incorporar nucleótidos en la dirección3 ' 5', la hebra retrasadas se forma como una serie de pequeños fragmentos de Okazaki discontinuos que se sintetizan en la dirección5 ' 3'. Estos fragmentos se juntan mediante una DNA ligasa para fabricar una nueva hebra continua de DNA 3' 5'. Los fragmentos de Okazak tienen una longitud de unos 1.000-2.000 nucleótidos en sistema bacterianos y virales, pero sólo de diez en células eucariotas. En E. coli, se utiliza la misma polimerasa, la polimerasa III, para sintetizar tanto los fragmentos de Okazaki de Ia cadena retrasada como la cadena conductora completa. En los eucariotas se cree que las DNA polimerasas δ y ε están implicadas en la síntesis de ambas cadenas, la conductora y la retrasada.

LA ACTIVIDAD EXONUCLEASA 3’5’ de la DNA ES RESPONSABLE DEL CONTROL DE CALIDAD.

En vista de la complejidad del modelo anterior, cabe plantearse la pregunta de por qué las células no han desarrollado simplemente una enzima que sintetice DNA en la dirección 3' 5'. Una posible respuesta se encuentra en la necesidad de corregir los errores durante la replicación del DNA. Alrededor de 1 de cada 100.000 nucleótidos que se incorporan durante la replicación del DNA no está apareado correctamente con la hebra molde del DNA. Estos errores se reparan habitualmente gracias a un mecanismo corrector de errores de apareamiento, en el que actúan las mismas moléculas de DNA polimerasa que catalizan la síntesis de DNA. La corrección de errores de apareamiento es posible debido a que además de catalizar la síntesis de DNA, casi todas las DNA polimerasas muestran actividad exonucleasa 3’ 5'. Una exonucleasa es una enzima que degrada ácidos nucleicos (normalmente DNA) desde un extremo, a diferencia de las endonucleasas que realizar cortes internos. Una

exonucleasa 3’ 5' es aquella que corta los nucleótidos desde el extremo 3' de una cadena de nucleótidos. Por lo tanto, la actividad exonucleasa 3' --->5 ' de Ia DNA polimerasa le permite retirar los nucleótidos incorrectamente incorporados desde el extremo 3' de una cadena de DNA en crecimiento. Esta capacidad de retirar los nucleótidos incorrectos puede mejorar la fidelidad de la replicación del DNA, dejándola en sólo unos pocos errores por cada mil millones de pares de bases replicadas. Si las células tuviesen una enzima capaz de sintetizar DNA en la dirección 3' --> 5' , no sería posible la corrección de errores de apareamiento, ya que la cadena de DNA en crecimiento poseería un nucleótido trifosfato en su extremo 5' .Si el nucleótido en 5' fuese una base incorrecta que necesitase ser eliminada, su retirada eliminaría también el grupo trifosfato que proporciona la energía libre que permite a la DNA polimerasa incorporar nucleótidos a la cadena de DNA en crecimiento, y por lo tanto la cadena no podría elongarse posteriormente.

LA REPLICACIÓN DEL DNA SE INICIA CON CEBADORES DE RNA.

Si la DNA polimerasa sólo puede incorporar nucleótidos a una cadena de nucleótidos preexistente, ¿cómo se inicia la replicación en una doble hélice de DNA? Poco después de que se descubriese en los fragmentos de Okazaki, los investigadores propusieron la implicación del RNA en el proceso de iniciación, tras las siguientes observaciones: ( I ) Ios fragmentos de Okazaki con frecuencia presentan fragmentos de RNA, con una longitud entre 3 y 10 bases, en su extremos 5' . (2) La DNA polimerasa pueden catalizar la incorporación de nucleótidos al extremo 3' tanto de cadenas de RNA como de DNA. (3) Las células poseen una enzima denominada primasa que sintetiza fragmentos de RNA de una longitud aproximada de l0 bases utilizando como molde el DNA, y (4) a diferencia de la DNA polimerasa, que sólo incorpora nucleótidos en los extremos de cadenas preexistentes, la primasa puede iniciar la síntesis de RNA desde cero uniendo dos nucleótidos.

Estas observaciones condujeron a la conclusión de que la síntesis de DNA se inicia través de la formación de pequeños cebadores de RNA. La primasa sintetiza los cebadores de RNA, utilizando una única cadena de DNA, como molde para guiar la síntesis de un fragmento complementario de RNA. La primasa es un tipo especial de RNA polimerasa, que participa únicamente en la replicación del DNA. Como las demás RNA polimerasas, y a diferencia de las DNA polimerasas, las primasas pueden iniciar la síntesis de una cadena de nucleótidos nueva, complementaria a una cadena molde, sin la necesidad de un cebador.

La primasa de E. coli es prácticamente inactiva a menos que esté acompañada de otras seis proteínas, formando un complejo llamado primosoma. Las otras proteínas del primosoma tienen la función de desenrollar el DNA parental y de reconocer las secuencias de DNA diana donde debe iniciarse la replicación. La situación en eucariotas es ligeramente diferente, por lo que no se usa el término primosoma. La primasa de eucariotas no está asociada de manera tan íntima a proteínas desenrollantes , sino que está estrechamente unida a la DNA polimeras alfa, que es la principal polimerasa implicada en la iniciación de la replicación del DNA.

Una vez que se ha fabricado un cebador de RNA, puede comenzar Ia síntesis del DNA, y la DNA polimerasa III (o la DNA polimerasa alfa, seguida por la DNA polimerasa δ en eucariotas) comienza a incorporar, sucesivamente, desoxinucleótidos al extremo 3' del cebador. En el caso de la hebra conductora, la iniciación a través de un cebador de RNA sólo tiene lugar una única vez, después de que se haya formado la horquilla de replicación; la DNA polimerasa puede incorporar nucleótidos en la dirección 5' --->3 ' d una manera continua. Por su parte, la hebra retrasada se sintetiza

como una serie de fragmentos de Okazaki discontinuos, cada uno de los cuales necesita ser iniciado por un cebador diferente. Para cada cebador, la DNA polimerasa III incorpora nucleótidos hasta que el fragmento en crecimiento alcanza el fragmento de Okazaki adyacente. En este punto, ya no es necesario el fragmento de RNA y se elimina. Para rellenar el espacio que deja, se sintetizan nucleótidos de DNA. Los cebadores de RNA en E. coli se eliminan por la actividad exonucleasa 5 ' 3' de la DNA polimerasa I (que es diferente de Ia actividad exonucleasa 3 ' --->5 ' correctora).A l mismo tiempo, la DNA polimerasa I sintetiza DNA en la dirección 5' ---> 3' habitual para rellenar los huecos resultantes. Los fragmentos adyacentes se unen posteriormente a través de una DNA ligasa.

¿Por qué las células usan cebadores de RNA que deben ser eliminados posteriormente en vez de usar simplemente un cebador de DNA desde el principio? De nuevo, la pregunta se responde por la necesidad de la corrección de errores. Ya hemos visto que la DNA polimerasa posee una actividad exonucleasa dirección 3' 5' que le permite eliminar los nucleótidos que no sean correctos del extremo 3' de una cadena de DNA. De hecho, la DNA polimerasa únicamente elongará una cadena de DNA si el nucléotido que se encuentra en eI extremo 3' está correctamente apareado. Pero una enzima que inicia la síntesis de una nueva cadena no puede llevar a cabo dicha función correctora, porque no se trata de unir un nucleótido a un extremo con bases apareadas preexistente. Como consecuencia las enzimas que inician la síntesis de ácidos nucleicos no son muy buenas corrigiendo errores. Utilizando RNA en vez de DNA para comenzar la síntesis, las células se aseguran que cualquier base incorrecta que se inserte durante la iniciación se encuentra restringida a las secuencias de RNA, que posteriormente serán eliminadas por la DNA polimerasa I.

EL DESENRROLLMIENTO DE LA DOBLE CADENA DE DNA REQUIERE LA PARTICIPACIÓN DE HELICASAS, TOPOISOMERASAS, Y PROTEÍNAS DE UNIÓN A DNA DE CADENA SENCILLA.

Durante la replicación, las dos hebras del DNA deben desenrollarse en cada horquilla de replicación con el fin de exponer las cadenas sencillas a las enzimas responsables de su duplicación. Existen tres clases de proteínas con funciones diferentes que facilitan el proceso de desenrollamiento: DNA helicasas, topoisomerasas,proteínas de unión al DNA de cadena sencilla.Las proteínas directamente responsables de desenrollar eI DNA, son las DNA helicasas. Usando la energía de hidrólisis del ATP, las helicasas desenrollan el DNA por delante de la horquilla de replicación, rompiendo los puentes de hidrógeno a medida que avanzan. Al menos dos helicasas están implicadas en la replicación del DNA en E. coli; una se une a Ia cadena patrón retrasada y se mueve en dirección5 ' 3', y la otra se une a la cadena patrón conductora y se mueve en dirección 3' 5'. Las dos forman parte del primosoma, pero la helicasa 5 ' -->3 ' es más importante para el desenrollamiento del DNA en la horquilla de replicación.El desenrollamiento asociado a la replicación del DNA podría provocar el superenrollamiento y embrollamiento en el resto del DNA, si no fuese por la acción de las topoisomerasas.Estas proteínas crean puntos de giro en la molécula de DNA realizando cortes en una o ambas cadenas de la doble hélice, para después repararlas rápidamente. De las aproximadamente10 topoisomerasas descritas en E coli, la que parece más importante en la replicación del DNA es la DNA girasa, una topoisomerasa de tipo II (una enzima que corta ambas cadenas del DNA). La DNA girasa introduce sobreenrollamientos negativos y relaja así los positivos, utilizando la energía derivada del ATP. La DNA girasa funciona como eI principal pivote que previene el sobreenrollamiento (sobreenroscamiento positivo) del DNA por delante de la horquilla de replicación. Esta enzima tiene además una función en la iniciación y la finalización de la replicación del DNA en E. coli, abriendo la doble hélice en el origen de

replicación y separando los dos DNAs circulares de las cadenas hijas, al final del proceso. Este fenómeno no se conoce tan bien en eucariotas, aunque se han aislado topoisomerasas de ambos tipos.

Una vez que ha comenzado la separación de las hebras, las proteínas de unión al DNA de cadena sencilla (SSB) se unen rápidamente a dichas cadenas sencillas manteniendo así desenrollado al DNA y por lo tanto accesible, a la maquinaria de replicación. Después de que un fragmento de DNA se haya replicado, las moléculas de SSB se despegan y son recicladas uniéndose al siguiente fragmento de cadena sencilla.