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LA CÉLULA COMO UNIDAD VITAL

LA CITOLOGÍA

En el siglo XVII aparece la Citología como ciencia debido a:

Aparición de Bacon, Descartes...: lo que era una ciencia especulativa pasó a basarse en la experiencia y la observación.

Avances tecnológicos: uso de lentes para aumentar el tamaño de las cosas.

Curiosidad científica.

LA INTERDISCIPLINARIDAD, LA COOPERACIÓN Y LA

CURIOSISDAD CIENTÍFICA HAN SIDO Y SON LA

CLAVE DE LA MAYORÍA DE LOS AVANCES CIENTÍFICOS

HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA

¿De qué están compuestos los seres vivos?

Hasta el siglo XV se consideraba, tomando como base las ideas de

Hipócrates (600 a.c.), que los seres vivos estaban formados por una sustancia o “crasis” a base de diferentes jugos o

“humores”


EL MICROSCOPIO

• Se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, en opinión de los holandeses


ROBERT HOOKE


LEEUWENHOEK POPULARIZÓ EL USO DEL MICROSCOPIO (1964)

HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA: DESARROLLO DE LA MIROSCOPÍA

HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA : LA TEORÍA CELULAR

• Schleiden y Schwan son considerados los autores iniciales de la Teoría Celular, complementada luego por Virchow (omnis cellula e cellula) y universalizada a todos los tejidos por Ramón y Cajal (Premio Nobel en 1906).

• La Teoría Celular se puede resumir:– Existen seres unicelulares y pluricelulares: todos los organismos son

células o están formados por ellas.– La célula es la unidad estructural, fisiológica y reproductiva de los seres

vivos → Es la unidad de vida independiente más elemental.

Ramón y CajalRodolfo Virchow

COMPONENTES COMUNES EN LA MAYORÍA DE CÉLULAS

• MEMBRANA PLASMÁTICA

• CITOPLASMA

• INFORMACIÓN GENÉTICA

¿ QUIÉN SE SALE DE LA NORMA?

NIVELES DE ORGANIZACIÓN CELULAR

CÉLULA PROCARIOTA CÉLULAS EUCARIOTAS

Bacillus anthracisTejido Cartilaginoso

CÉLULAS PROCARIOTAS CÉLULAS EUCARIOTAS

ORIGEN 3500 ma aprox 1500 ma aprox

TAMAÑO Generalmente de 0,2μ a 10 μm Generalmente de 10μ a 100 μm

ORGANISMOS Archaeas y Bacterias Protoctistas, hongos, plantas y animales

E. NUCLEAR No Si

ADN 1 molec ADN bc circular sin histonas

Cromosomas

TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

En = compart. e incluso al = t. Separadas espacial y temporalmente

NUCLEOLO No Si

RIBOSOMAS 70 S 80S

CITOESQUELETO NO SI

ORGÁNULOS Pocos o ninguno Numerosos, sistema de memb

MEMB. PLASMÁT. Sin esteroles Con esteroles

PARED CELULAR Si, con PG Solo en vegetales, de celulosa

ORGÁNULOS ENERGÉTICOS

mesosomas Mitocondrias y cloroplastos

METABOLISMO De todos los tipos Generalmente aerobio

DIV. CELULAR Bipartición o gemación Mitosis y meiosis

CÉLULA PROCARIOTA

Organización Celular Procariota: REINO MONERAS

DOMINIO ARQUEA DOMINIO BACTERIA

Ferroplasma acidiphilum

CÉLULA EUCARIOTA

Organización Celular Eucariota: DOMINIO EUCARYA

Reino Protoctista

Reino Hongos

Reino Vegetal

Reino Animal

Saccharomyces cerevisiae Scytalidium thermophilum

Klebsormidium sp Xilema y floema de pinoParamecium sp

Epitelio Cúbico Simple humano

http://es.wikipedia.7val.com/;s=gSSgcQ9J5BWqG_9zjrzZ4Q1/wiki/Archivo:Hefezellen.jpg

LOS TRES DOMINIOS DE WOESE (1990)

El Sistema de los Tres Dominios, propuesto por Woese, es un modelo evolutivo de clasificación basado en las diferencias en las secuencias del ARNr 16S y ARNt de la célula, la estructura de los lípidos de la membrana, y la sensibilidad a los antibióticos.

I. EL ORIGEN DE LA VIDA

• Hace 4500 ma, en La Tierra...

• En 1922, Oparin propone: compuestos orgánicos simples pudieron originarse a partir de una mezcla de moléculas orgánicas (Síntesis prebiótica).

Cambios Geológicos Descargas eléctricas

Bombardeo de meteoritosSin oxígeno

II. EL ORIGEN DE LA VIDA• En 1952 Stanley Miller (1952): Oparin

tenía razón.

III. EL ORIGEN DE LA VIDA

Una vez surgidos los primeros compuestos orgánicos, éstos pudieron combinarse entre sí hasta dar lugar a una molécula con capacidad de copiarse a sí misma, posiblemente ARN, y posteriormente aparecerían el ADN y las proteínas. Estas moléculas se rodearon de membrana y establecieron el control sobre su replicación: ¡ Las primeras células vivas!

III. EL ORIGEN DE LA VIDA: otras teorías

Cometas y condritas

las arqueobaterias

¿Panspermia ?

LOS PRIMEROS SERES VIVOS

• BACTERIAS ANAEROBIAS CON METABOLISMO FERMENTATIVO

• CIANOBACTERIAS

• ATMÓSFERA CON OXÍGENO Evidencia de vida más

antigua de la que hay registro fósil en la

Tierra

• PRIMERAS CÉLULAS CON RESPIRACIÓN AEROBIA

Estromatolito fósil. 3500ma

Origen de las células eucariotas: Teoría Endosimbiótica

LINN MARGULIS


Actualmente la idea más aceptada es que:

1.- El núcleo se formó por invaginación de la membrana plasmática y de ahí se originaron también los orgánulos membranosos del sistema de endomembranas.

2.- Mitocondrias y Cloroplastos se originaron por endosimbiosis.


CÉLULA HOSPEDADORA: Una Archea que perdió la pared.CÉLULAS SIMBIONTES: Una bacteria púrpura no sulfurosa: MITOCONDRIA. Una Cianobacteria: CLOROPLASTO.

Plantas y algas Animales, hongos y protozoos

• Las mitocondrias tienen su propio ADN en una sola molécula continua, como las de las procariotas

• Muchas de las enzimas de las membranas celulares de las mitocondrias se encuentran también en las membranas de las bacterias.

• Las mitocondrias solo se forman por fisión binaria a partir de otras mitocondrias

• Varias especies de Cianobacterias viven dentro de otros organismos como plantas y hongos, lo que demuestra que esta asociación no es difícil de mantener

EVIDENCIAS A FAVOR DE LA TEORIA ENDOSIMBIÓTICA

Pruebas en contra de la teoria ENDOSIMBIÓTICA

Las mitocondrias y los plastos contienen intrones, una característica exclusiva del ADN

eucariótico. Por tanto debe de haber ocurrido algún tipo de transferencia entre el ADN nuclear

y el ADN mitocondrial/cloroplástico.

http://es.wikipedia.org/wiki/Mitocondrias

http://es.wikipedia.org/wiki/Intron

ORIGEN DE LA CÉLULA EUCARIOTA: Consideración actual

Actualmente se considera que la evolución pudo darse a través de dos vías:

• La aparición de membrana nuclear, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, vacuolas y lisosomas se explicaría mediante la Teoría autógena.

• La aparición de mitocondrias y cloroplastos se explicaría mediante la Teoría endosimbiótica.

http://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_nuclear

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA

Necesidad del desarrollo de técnicas que permitan observar su estructura, y aclarar su composición y arquitectura molecular.

NECESIDAD DE CONOCER LA CÉLULA (Aplicaciones farmacéuticas, médicas, industriales,

conocimiento...)

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS

Básicamente se cuenta actualmente con cinco modalidades principales para abordar el estudio de las células, y frecuentemente suelen utilizarse en forma conjunta más de una de ellas: 1 - Observación de la estructura de las células por medio de microscopios (“In vivo” o “post mortem”).2 - Fraccionamiento de células y análisis de sus moléculas (citoquímica).3 - Aislamiento y cultivo de células.4 - Localización de moléculas biológicas por medio de isótopos radioactivos o anticuerpos marcados. 5 - Utilización de la tecnología del ADN recombinante.

1. Métodos de estudio de la morfología y estructura celular

• El pequeño tamaño y la transparencia a la luz visible de la célula han propiciado el desarrollo de una gran variedad de técnicas, enfocadas a aumentar el poder resolutivo y el contraste.

• El estudio de la morfología de las células puede llevarse a cabo en dos condiciones:– Métodos de estudio “in vivo”. – Métodos de estudio “post-mortem”.

1.1.Métodos de estudio “in vivo”.

• Estudian al organismo vivo. Consisten en una observación directa, ayudada por instrumentos ópticos más o menos complejos.

• El problema que presenta este tipo de estudios es que el contraste que presentan las estructuras biológicas puede ser mínimo y es necesario aumentarlo. Esto se consigue mediante colorantes intravitales o determinado tipo de microscopios (de campo oscuro, de contraste de fases...)

• Observación “in vivo” al microscopio óptico de una gota de agua de maceta. (protozoo)

Organismo unicelular ciliado (Vorticella sp).

Observación “in vivo”

1.2. Métodos de estudio “post-mortem”.Es un método que consiste en preservar la morfología y composición de las células tras su muerte con el fin de estudiar los detalles de la morfología celular. Los pasos que se siguen, antes de la observación al microscopio, son:

Fijación de células• Los fijadores suelen actuar sobre las proteínas celulares

precipitándolas. Este proceso permite detener los procesos vitales.• La fijación se puede realizar mediante métodos físicos, como la

congelación, o métodos químicos, como el tetraóxido de osmio, líquido de Bouin, aldehídos...

• Tras la fijación de las muestras se procede a la obtención de cortes finos (se utilizan los llamados microtomos, en el que se introduce la muestra previamente endurecida e incluida en una parafina o resinas epoxi, que es el método más usual).

Tinción.• La tinción nos permite crear contrastes artificiales para facilitar la

observación• Las tinciones son sustancias de naturaleza orgánica y aromática, y

se reconocen 2 grandes grupos: ácidos y básicos..

Microtomo

Ultramicrotomo

1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN

1.3.1. Tinción general. Una de las tinciones más utilizada es la hematoxilina-eosina:

• Los ácidos nucleicos y otros componentes

ácidos de la célula tienen afinidad por los colorantes básicos. (hematoxilina)

• El citoplasma, de naturaleza básica, se tiñe con colorantes ácidos. (eosina)

Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).


1.3.2. Técnicas específicas.– Tinción de Feulgen: específica para el ADN.

Tiñe el núcleo de color morado)– Tetraóxido de osmio o Sudán III para lípidos.– Las proteínas se colorean de azul con

nihidrina.– La celulosa o el almidón con Lugol, etc.


1.3.3. Tinción diferencial: utilizan al menos dos colorantes distintos; es el caso de la llamada tinción de gram que permite diferenciar bacterias gram + (color azul) de bacterias gram – (color rojo), en base a su pared celular.

Tinción de Gram

Gram +Gram -


1.3.4. Las tinciones también pueden utilizarse para poner de manifiesto determinada actividad enzimática. Por ejemplo, la existencia de fosfatasa ácida, característica de los lisosomas, se puede observar mediante la técnica de Gomori.

TÉCNICA DE GOMORI

1. Incubación del tejido con glicerofosfato de sodio.

2. Se añade nitrato de plomo. (con el fósforo liberado por la fosfatasa ácida, forma fosfato de plomo, que precipita y es fácilmente identificable al m.e.)

Ganglio linfático de rata.


1.3.5. Tinción con colorantes fluorescentes.– Naranja de acridina, se tiñen específicamente

el ADN y ARN.– Tinción de Auramina, etc.

Mycobacterium

(bacterias ácido alcohol resistentes)

Tinción de Auramina: Consiste en teñir con Auramina (Colorante fluorocrómico), decolorar con ácido alcohol, contracolorear con permanganato potásico, lavar con agua abundante y dejar secar

1.4.TIPOS DE MICROSCOPIOS

1.4.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA


Las dos características más importantes de un microscopio son:– Amplificación: aumento del objetivo x aumento del ocular

– Poder de resolución (distancia mínima para que dos puntos próximos se vean como puntos diferentes) , que depende de:

• Longitud de onda de la luz incidente: a menor longitud de onda, mejor resolución (= menor poder de resolución).

• Índice de refracción del medio que se encuentra entre la muestra y el objetivo. (aire)


• CONCLUSIÓN:– El principal factor limitante es la longitud de

onda de la luz visible, es imposible construir un microscopio con un poder de resolución inferior a 0,2 micrómetros.

– Los objetivos de inmersión tienen un poder de resolución mayor, ya que utilizan una sustancia viscosa como el aceite (indice de refracción=1,5) frente al aire (índice de refracción=1).

1.4.1. TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

1.4.1.1. M. de Campo Claro: para observar muestras “in vivo”.

1.4.1.2. M. de Campo Oscuro: para observar microorganismos; en él un disco opaco bloquea la luz, de forma que sólo la luz refractada por la muestra alcanza el objetivo y la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro.

1.4.1.3. M. de Contraste de Fases: se basa en que las diferentes estructuras celulares tienen distinta densidad y, por tanto, varía su índice de refracción.

1.4.1.4. M. de Interferencia Diferencial de Nomarsky: utiliza un prisma refringente que divide la luz en dos rayos polarizados que interfieren entre sí, rpoporcionando una imagen de la célula que parece tridimensional.

Funcionamiento del microscopio de campo oscuro

¿Qué microscopio se ha utilizado?

Fibroblasto en cultivo. A) Microscopía de campo claro (B) Microscopía de contraste de fase (C) Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) – Nomarski. (D) Microscopía de campo oscuro (tomada de Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)

1.4.1.TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS

1.4.1.5. M. de Fluorescencia: emplea una lámpara especial y un filtro que permiten emitir luz a diferentes longitudes de onda y excitar ciertas moléculas (fluorocromos) capaces de emitir fluorescencia (absorción de una determinada λ y emisión de luz de una λ mayor → visible)

El microscopio de fluorescencia Olympus BX61, acoplado con una cámara digital

Microscopía de fluorescencia

Se observa una micrografía de una célula en mitosis. Para obtener esta imagen, se emplearon tres moléculas fluorescentes distintas con el fin de teñir tres componentes celulares diferentes. Se usó un anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente verde para detectar a los microtúbulos, otro anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente roja para detectar a los centrómeros, y un colorante fluorescente azul para teñir el ADN, que se encuentra condensado formando los cromosomas. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).

Microscopía de fluorescencia

1.4.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

• Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. Como la longitud de onda de los electrones es menor que la de la luz, el poder de resolución aumenta considerablemente (unos 0,2 nanómetros).

• El haz debe proyectarse en un sistema al vacío.• Las lentes de cristal son sustituidas por lentes

electromagnéticas (electroimanes).• Existen dos tipos de microscopios electrónicos:

el de transmisión (TEM) y el de barrido (SEM).

1.4.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE

TRANSMISIÓN (MET)

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE

BARRIDO (MEB)

El haz de electrones atraviesa la muestra.

El haz de electrones no atraviesa la muestra.

La imagen se forma por la dispersión de los electrones en función del espesor, de la densidad molecular y del nº atómico de los átomos de la muestra.

La imagen se forma por el reflejo del haz de electrones al incidir sobre la superficie de la muestra en función del relieve → IMAGEN TRIDIMENSIONAL.

Se le añaden átomos pesados para acentuar la dispersión electrónica.

Previamente a la observación se realiza la vaporización de un metal pesado

“C. albicans en estado reproductivo”

¿ QUÉ MICROSCOPIO SE HA UTILIZADO?

Detalle de una célula


Ameba Alga unicelular


ASTROCITO “Mycobacterium tuberculosis”


Leptospirillum

1.4.2.1. Técnicas específicas de microscopia electrónica.

• Difracción de rayos x

• Criofractura

Zónula ocluyente de epitelio

2. FRACCIONAMIENTO CELULAR. CITOQUÍMICA

El objetivo del fraccionamiento celular es disgregar las células separando los orgánulos principales de modo que, sus funciones individuales puedan ser estudiadas.

El instrumento usado para fraccionar las células es la centrífuga capaz de girar a diversas velocidades. La más poderosa, llamada ultracentrífuga puede dar vueltas tan rápidamente como 80000 revoluciones por minuto (RPM)

2. FRACCIONAMIENTO CELULAR. CITOQUÍMICA

De estas fracciones se pueden obtener muestras puras de los diversos componentes celulares mediante técnicas bioquímicas como:

• Cromatografía: separa los componentes de una mezcla de sustancias haciendo que éstas se desplacen por un medio como, por ejemplo, papel.

• Electroforesis: separa proteínas según la carga, ya que las hace desplazarse en un campo eléctrico.

• Coloración: consiste en hacer visible los compuestos químicos conociendo sus diferentes afinidades tintoriales.

• Marcaje con isótopos. (AUTORRADIOGRAFÍA)• Inmunocitoquímica..

3. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS.

Cultivar células en el laboratorio permite contar con poblaciones homogéneas de células vivas, interactuando unas con otras en condiciones controladas, en las que pueden realizarse diferentes estudios experimentales. En este sentido, la manipulación de células resulta mucho más sencilla y precisa que el trabajo con animales de laboratorio; además, representa una posibilidad éticamente aceptada de realizar experimentación con células de origen humano.

3.1. Aislamiento de células: pasos

a)Reducir el tejido a una suspensión de células libres. Esto se consigue utilizando medios químicos que provocan la disgregación de las células.. (Por ej. Tripsina)

b)Aislamiento de cada tipo de ellas, lo que puede hacerse separando las células más grandes o las más densas...o mediante citómetro.

c)Actualmente se cuenta con aparatos que realizan una separación automática muy precisa y rápida, son los llamados clasificadores celulares activados por fluorescencia, o citómetros.

CitómetroSepara células previamente disgregadas, algunas de las cuales se han marcado específicamente con fluorescencia. Las células están contenidas en un medio líquido, en muy baja concentración, y pasan por el aparato dentro de pequeñas gotitas, cada una de las cuales contiene sólo una célula, o ninguna. Por medio de un rayo láser, el citómetro detecta la presencia o no de fluorescencia, proporcionando una carga eléctrica distinta según el caso, lo que permite la clasificación final de las células.

• Los citómetros permiten también realizar el recuento de las células mientras se realiza la separación. Esta técnica es llamada citometría de flujo, y se la utiliza en investigación y en análisis para el diagnóstico médico oncológico o inmunológico. Una vez aisladas las diferentes poblaciones de células, pueden utilizarse directamente para análisis bioquímico, o bien destinarse al cultivo celular in vitro.

3.2. Cultivo de células• Los cultivos se realizan dentro de recipientes de vidrio o plástico

(generalmente cápsulas de Petri o botellas). • Los materiales a ser cultivados (células de uno o más tipos, tejidos,

o bien órganos o trozos de órganos) deben extraerse y mantenerse en soluciones similares a los líquidos tisulares, en condiciones estériles para evitar el crecimiento de bacterias u hongos.

• Las células aisladas pueden cultivarse en suspensión, flotando en el medio, o bien adheridas a una superficie de vidrio o plástico. Sobre este sustrato las células crecen formando una capa única o monocapa.

• Los cultivos celulares pueden observarse en cualquier momento en que sea necesario, utilizando contraste de fases en "microscopios invertidos". Estos son aparatos adaptados especialmente para la visualización de materiales de considerable grosor; para ello los objetivos están situados debajo de la platina y la iluminación se realiza desde arriba de la misma.

4. Localización de moléculas biológicas por medio de isótopos

radioactivos o anticuerpos marcados.

4.1. Autorradiografía

4.2. Inmunocitoquímica

4.1. Autorradiografía

• Consiste en incubar las células en presencia de determinados isótopos radiactivos que podrán ser incorporados a determinadas moléculas.

• Estos radioisótopos son instables y emiten radiaciones ionizantes que se pueden registrar con aparatos, como el de Geiger, o bien mediante su impresión en una película fotográfica.

4.2. Inmunocitoquímica

• La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo puede aprovecharse para poner en evidencia, específicamente, una molécula determinada, en una célula o tejido. Así puede saberse el tipo de actividad de esa célula, o distinguirla de otras. Para ello se utilizan anticuerpos marcados que se unen específicamente a determinadas moléculas de dicha célula, las que son reconocidas como antígenos.

la cÉlula como unidad vital. la citologÍa en el siglo xvii aparece la citología como ciencia...

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