REVISIÓN

La biología molecular en el diagnóstico y tratamientode las enfermedades respiratorias

X. Busquetsa y A.GN. Agustí

Servicio de Neumologia. •'Unidad de Investigación. Hospital Universitari Son Dureta. Palma de Mallorca.

Introducción

Afrontémoslo de entrada. No podemos escapar anuestra naturaleza mecánica, formada por engranajes degenes y protemas, pero sí podemos utilizar el conoci-miento de su funcionamiento para nuestro propio bene-ficio: el diagnóstico y la curación de las enfermedades.Esta perspectiva sienta las bases de la medicina del fu-turo y constituye la razón del auge extraordinario queha tenido, está teniendo y, es de prever, tendrá la biolo-gía molecular aplicada a la medicina.

Posiblemente, estamos asistiendo a una revolución enel campo del conocimiento médico sin parangón en lahistoria. Por ello, es un error grave considerar que "labiología molecular es una moda" o "no me afecta en mipráctica profesional". Los conceptos que de ella se deri-van son de tal importancia que, sin duda, cambiarán (dehecho ya lo están haciendo) la forma en que diagnosti-camos y tratamos a los pacientes. Es imprescindible,por tanto, que cualquier profesional sea capaz de, comomínimo, entender el lenguaje y los conceptos básicos deesta nueva disciplina. Sin embargo, su implantación enel ámbito médico ha sido tan rápida que muchos deellos no han podido asimilar su terminología ni sus con-ceptos básicos, por lo que no pueden valorar sus resul-tados y aportaciones. Esta revisión pretende contribuir acubrir esta laguna.

Para facilitar su lectura, se ha dividido en tres partesclaramente diferenciadas. La primera repasa la termino-logía y los conceptos básicos de biología molecular. Lasegunda describe las técnicas de laboratorio más fre-cuentemente utilizadas. La tercera discute algunosejemplos representativos de patología del aparato respi-ratorio en los que la aplicación de estos conceptos y téc-nicas de biología molecular ha facilitado (o, es de pre-ver, facilitará) su diagnóstico y tratamiento. Finalmente,esta revisión incorpora un diccionario terminológicoque, esperamos, facilite su lectura y comprensión. La

Correspondencia: Dr. A.GN. Agustí.Servicio de Neumologia. Hospital Universitari Son Dureta.Andrea Doria, 55. 07014 Palma de Mallorca.

Recibido: 16-12-97; aceptado para su publicación: 30-12-97.

Este estudio ha sido subvencionado, en parte, por ABEMAR.

(Arch Bronconeumol 1998; 34: 256-265)

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bibliografía también se ha separado en dos partes, enfunción de que se trate de lecturas de tipo general (enlas que se pueden ampliar los conceptos expresados enlas partes I y II) o referencias bibliográficas concretas(parte III).

Parte I. Conceptos fundamentales

Las técnicas de biología molecular disponibles hoydía permiten aislar, amplificar, manipular y secuenciar elácido desoxirribonucleico (ADN). Esto facilita la inves-tigación de aquellas piezas de la maquinaria celular quese activan (o reprimen) para permitir que la informacióngenética almacenada en el ADN dirija, a través del ácidoribonucleico mensajero (ARNm), la síntesis de proteí-nas. Esto contribuye a desvelar los mecanismos íntimosde cómo la vida cambia, se adapta y evoluciona. Esteconcepto de adaptación celular es fundamental. Es fácilcomprender que la información genética contenida en elADN es la causante de una serie de características orgá-nicas (fenotipo) que, en principio, son inmutables a tra-vés de la vida (sexo, talla, color de los ojos, etc.). Sinembargo, la extraordinaria importancia de la informa-ción genética del ADN radica en que permite que cadauna de nuestras células (y, por tanto, nosotros mismoscomo organismos) se adapte a circunstancias ambienta-les o microambientales cambiantes (hipoxia, temperatu-ra, pH, nutrientes, inflamación, etc.). Sin esta capacidadde adaptación celular, moriríamos rápidamente. Esta ca-pacidad depende de que un gen se exprese (active) o no(véase más adelante) en un momento determinado y enunas condiciones ambientales (microambientales) con-cretas. En definitiva, es esta extraordinaria capacidadplástica la que permite la vida.

Estructura del ADN

El ADN está constituido por una doble cadena de áci-do desoxirribonucleico, enrollada sobre sí misma enforma de doble hélice (fig. 1). Cada hebra de ADN estácompuesta por la secuencia variable de cuatro nucleóti-dos distintos (adenina [A], timina [T], guanina [GJ y ci-tosina [C]). La secuencia de nucleótidos de una hebradetermina la de la otra, ya que cada una de estas cuatro

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bases nitrogenadas se une de forma específica sólo conotra base nitrogenada determinada (pares de bases). Así,las adeninas de una cadena se unen (mediante enlacespuentes de hidrógeno) sólo con las timinas de la otra ca-dena (y las guaninas de una cadena sólo con las citosi-nas de la otra) (fig. 1). Este apareamiento específico delos nucleótidos se denomina complementariedad.

El ADN se encuentra en el núcleo celular, extremada-mente empaquetado en forma de cromosomas. Cadacromosoma es una molécula de ADN enrollada junto auna serie de proteínas (historias). El conjunto de ADN ehistonas se denomina nudeosomas. En las mitocondriasexiste otra molécula de ADN (ADNmit). Es una molé-cula de forma circular, mucho más pequeña que la exis-tente en el núcleo. En general, si no se menciona locontrario, al hablar de ADN (o genoma) suele estarserefiriendo al ADN nuclear.

¿ Qué es un gen ?

Un gen es una secuencia (trozo) de ADN que codifi-ca (contiene información necesaria para producir) unaproteína determinada. Todas nuestras células somáticasposeen los mismos cromosomas y, por tanto, la mismasecuencia de ADN (genes). Es decir, todas nuestras cé-lulas poseen el mismo potencial genético. Sin embargo,no todos estos genes están activados (expresados) si-multáneamente en todas las células. La expresión de di-ferentes genes en diferentes células y, en la misma célu-la, la expresión de diferentes genes a lo largo deltiempo, concede a nuestro organismo una plasticidadextraordinaria y una gran capacidad de adaptación. Almismo tiempo, sin embargo, esta extraordinaria com-plejidad genética nos hace muy vulnerables al error. Dehecho, se producen errores constantemente. Gracias aun complejo sistema de reparación genética, general-mente estos errores no tienen mayores consecuencias.Sin embargo, cuando el número de errores es muy ele-vado y/o los sistemas de reparación fallan, se produce laenfermedad (por ej., cáncer) (véase más adelante).

Estructura y función de los genes

El tamaño de los genes (longitud de la secuencia denucleótidos) es muy variable. Puede oscilar desde algu-nos cientos de nucleótidos (pares de bases) a varios mi-les, dependiendo del tamaño de la proteína que codifi-que y de las secuencias reguladoras contenidas en suinterior, ya que un gen contiene dos tipos de áreas obloques de información diferentes (fig. 2): los exones,cuya secuencia de nucleótidos codifica la secuencia deaminoácidos de la proteína final (véase más adelante), ylos intrones, que son secuencias de nucleótidos interca-ladas entre los exones que no codifican proteínas.

Transcripción y ARNm

La transcripción es el proceso de transferencia de in-formación de la molécula de ADN a la de ARNm me-diante la acción de la ARN polimerasa (fig. 3). La ARN

polimerasa sintetiza una cadena de ARN complementa-ria del ADN (ARN primario), en la que las timinas (T)se sustituyen por uracilos (U). Este proceso continúahasta que la ARN polimerasa se encuentra con una se-cuencia de nucleótidos denominada "secuencia de ter-minación" (ATT, ACT o ATC).

Poco antes de las secuencias de terminación, el ADNcontiene una larga repetición de timinas (hasta centena-res de ellas). Esta secuencia de timinas se transcribiráen el ARN primario en forma de una larga cola de ade-ninas (poly \A}). La función de la zona/w/v (A) es esta-bilizar el ARN primario. Por otra parte, la cadena deARN primario sufrirá el denominado proceso de cap-ping, que consiste en incorporar en su extremo 5' unamolécula de 7-metil-guanosina. El proceso de cappinges esencial para la síntesis de proteínas (traducción).

Para que se inicie la transcripción se requiere queunas proteínas denominadas factores de transcripciónse unan al ADN en las denominadas secuencias pro-motoras, específicamente en unos elementos regulado-res denominados bloque TATA y bloque CAAT (fig. 2

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y 3). Ambos bloques (TATA y CAAT) están situados adecenas de nucleótidos de distancia de la zona de ini-cio de la transcripción (fíg. 3). Mucho más alejados (acentenares o miles de nucleótidos) se encuentran otroselementos reguladores denominados "aumentadores"(enhancers) (fig. 3). Estos elementos aumentadorespueden modular la transcripción positiva o negativa-mente.

La función principal del ARN es servir de modelo(témplate) para la síntesis de proteínas en los ribosomascitoplasmáticos (traducción) (fig. 4). Sin embargo, antesde que el ARN primario que resulta del proceso detranscripción pueda cumplir esta función, debe sufriruna serie de modificaciones que lo transformarán en lamolécula final de ARN mensajero (ARNm) (fíg. 2). Es-tas modificaciones (que aún tienen lugar en el núcleo)consisten en la pérdida de los intrones y la reunión delos exones (spiicin^). Una vez en su forma final, la mo-lécula de ARNm migra desde el núcleo hasta el cito-plasma celular, donde se encuentran los ribosomas en-cargados de la síntesis proteica.

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Traducción y síntesis proteica

La secuencia de bases de la molécula de ARNm seemplea para generar una secuencia lineal y específicade aminoácidos (proteína). Este proceso se denominatraducción y tiene lugar en los ribosomas del citoplasmacelular (fig. 4). Los ribosomas generalmente se encuen-tran unidos (polirribosomas) y asociados al retículo en-doplásmico, formando el retículo endoplásmico rugoso.

En el ribosoma, la secuencia de nucleótidos delARNm es "leída" por una molécula especial de ARNdenominada ARN de transferencia (ARNt) (fíg. 4). ElARNt reconoce al ARNm en conjuntos de tres bases(nucleótidos) denominados tripletes o codones (fig. 4).Cada codón codifica (contiene información para la sín-tesis de) un aminoácido de la proteína. Este código (tri-plete = aminoácido) se denomina código genético. Hay64 posibles combinaciones de A, G, C, U y, en conse-cuencia, 64 posibles tripletes. Sin embargo, sólo existen20 aminoácidos. Por tanto, distintos tripletes deben co-dificar para un mismo aminoácido. Existen además tres

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tripletes que no codifican para ninguno (UAA, UAG yUGA); su función es detener el proceso de traducción.

Parte II. Técnicas de laboratorio

Encimas de restricción

Las enzimas de restricción (endonucleasas) son enzi-mas de origen bacteriano que permiten cortar y volver apegar fragmentos de ADN en lugares predeterminados,posibilitando así la génesis de nuevas secuencias deADN a nuestra conveniencia. Las enzimas de restric-ción también permiten obtener secuencias de nucleóti-dos con fragmentos de ADN procedentes de distintasespecies (quimeras). Existen centenares de enzimas derestricción disponibles comercialmente. Su uso ha revo-lucionado las técnicas de biología molecular.

Hibridación. Southern y Northern hlot

La hibridación consiste en el apareamiento específicode bases complementarias entre distintas moléculas de

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ácidos nucleicos. Las aplicaciones más conocidas de lahibridación son las técnicas de Southern y Northernblot. Ambas están basadas en la capacidad de un frag-mento de ADN (sonda) para "buscar", "encontrar" y"fijarse" (hibridar) en un fragmento complementario deADN (Southern) o ARNm (Northern).

En ambas técnicas, el ADN (tras digestión con enzi-mas de restricción) o el ARNm se someten a electrofo-resis (desplazamiento producido por un campo eléctri-co) en un gel de agarosa para separar los distintosfragmentos en función de su tamaño (fig. 5). Estos frag-mentos se transfieren a una membrana de nitrocelulosa-nailon que, a continuación, se baña en una solución dehibridación que contiene la sonda de interés (fig. 5).Esta sonda está marcada mediante un nucleótido radiac-tivo o un marcador fluorescente (biotina, fluoresceína,digoxigenina, etc.). La especificidad de la unión se pue-de modular alterando la "estringencia" de la hibrida-ción. Para ello, se modifica la concentración de sal de lasolución de hibridación y/o la temperatura a la que éstase realiza. Condiciones de hibridación de alta estringen-

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resultante será proporcional a su concentración inicial,y su posición en la membrana tendrá relación con supeso molecular (cuanto más pequeño sea éste, mayorserá el espacio recorrido en el gel) (fig. 5).

Hibridación in situ

Las secuencias de ADN (o ARNm) también puedenlocalizarse directamente en muestras de tejido mediantehibridación in situ. En este caso, el tejido objeto de es-tudio se fija y baña en una solución de hibridación se-mejante a la descrita en el apartado anterior. La ventajaque ofrece esta técnica es que permite la localizaciónprecisa en el tejido de una secuencia determinada deADN (o ARNm) y, por tanto, la identificación del tipocelular que expresa esa secuencia.

cia pueden identificar secuencias que se diferenciensólo en un nucleótido, mientras que condiciones de bajaestringencia permiten identificar nuevas secuencias deADN (genes) parecidos ("emparentados") con la sondaempleada. Al finalizar el período de hibridación, lamembrana se seca y se expone a una película radiográ-fica. El ADN (o ARNm) detectado por la sonda apare-cerá como una banda (fig. 5). La intensidad de la señal

Western blot

La técnica del Western blot permite evaluar la canti-dad existente de una proteína concreta en una muestradeterminada. Es similar a la técnica de Southern y Nort-hern blot, aunque no se basa en la hibridación de ácidosnucleicos. Consiste en realizar un extracto de todas lasproteínas del tejido y separarlas por su peso molecularmediante electroforesis en gel de acrilamida y SDS (do-cecil sulfato sódico). Las protemas se transferirán pos-teriormente a una membrana de nitrocelulosa. La prote-ína a determinar se detecta mediante un anticuerpoespecífico (anticuerpo primario). Este anticuerpo prima-rio será detectado a su vez mediante otro anticuerpomarcado radiactivamente o con fluorescencia (anticuer-

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po secundario). Al igual que se ha descrito anteriormen-te para el Southem o Northern blot, las membranas seexpondrán a una película de autorradiografía y la prote-ína se detecta en forma de banda, cuya intensidad esproporcional a su cantidad y su posición a su peso mo-lecular (fig. 6).

Polimerasas y reacción en cadenade la polimerasa (PCR)

Las polimerasas son complejos enzimáticos que diri-gen la replicación (duplicación) de una molécula deADN. Existen tres tipos fundamentales de polimerasas:ADN polimerasas, ARN polimerasas y transcriptasa in-versa. La ADN polimerasa replica una molécula deADN a partir de otra molécula de ADN. La ARN poli-merasa replica una molécula de ARN a partir de otra deADN (fig. 2). La transcriptasa inversa (obtenida a partirde retrovirus) permite obtener una copia de ADN(cADN) a partir de una molécula de ARNm.

El empleo de ADN polimerasa constituye la base dela conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR).Esta técnica permite amplificar secuencias de ADN apartir de una sola molécula de ADN y obtener más deun millón de copias. La PCR también permite amplifi-car ARN (RT-PCR) si previamente se emplea transcrip-tasa inversa para generar cADN a partir de ARNm. Bre-vemente, la PCR consiste en la repetición de variosciclos de calor (termociclar) que separan las dos cade-nas de ADN (desnaturalizar). A continuación, se añadeADN polimerasa, nucleótidos y cebadores (primers), yse inicia un ciclo de polimerización a la temperatura óp-tima de hibridación de los primers. La secuencia deADN (o de cADN) que se quiera amplificar debe serconocida a priori, ya que los primers deben hibridar deforma específica en la zona de la molécula de ADN aamplificar, y permitir así la acción de la ADN polimera-sa. Además, esta enzima debe ser resistente a la tempe-ratura, ya que de otra forma se inactivaría por efecto dela misma (por ej., Taq-polimerasa).

Secuenciación y clonación

Secuenciar ADN consiste en identificar la secuencialineal de nucleótidos que lo componen (fíg. 1). Su utili-dad radica en que, aplicando el código genético (véaseantes), la secuenciación de bases de un gen permite co-nocer la estructura de la proteína que codifica (secuen-cia de aminoácidos).

La clonación permite replicar múltiples fragmentosidénticos de una secuencia de ADN determinada. Latécnica básica de clonación consiste en insertar (me-diante enzimas de restricción) la secuencia de ADN deinterés en un plásmido (molécula de ADN bacterianaautorreplicativa). Este plásmido, conteniendo la secuen-cia de interés, se introduce en una bacteria (E. coli) quelo acepta en su interior y permite su replicación. Lasbacterias se cultivan utilizando los métodos habitualesdel laboratorio de microbiología; al dividirse, los plás-midos se replican en su interior. Cuando se ha consegui-do una colonia bacteriana lo suficientemente grande, se

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aislan los plásmidos y se liberan (mediante enzimas derestricción) las múltiples copias de la secuencia clona-da. Alternativamente, la colonia bacteriana puede utili-zarse como sistema de almacenamiento de la secuenciaclonada, ya que puede guardarse congelada a -80 °Cdurante años, sin pérdida de la viabilidad bacteriana odel plásmido.

Las técnicas de secuenciación y clonación han permi-tido determinar la estructura primaria de la proteína (se-cuencia de aminoácidos), producirla en grandes canti-dades y realizar mutaciones dirigidas a aminoácidosespecíficos point mustation). Con ello, se ha podidoexaminar como la variación de distintos dominios (zo-nas) de la proteína modifican su función.

Terapia genética

Los avances en el conocimiento de las bases molecu-lares de la expresión genética han desarrollado el poten-cial técnico suficiente para poder interferir y modificarterapéuticamente los distintos pasos que regulan la ex-presión de una proteína cuya malfunción esté en el ori-gen de una enfermedad determinada. Conceptualmente,la terapia genética supone insertar el gen correcto en eltejido afectado, en sustitución del gen defectuoso. Parala inserción del gen existen diversas técnicas. La trans-fección física utiliza, entre otros métodos, liposomas(vesículas lipídicas) para empaquetar la secuencia deADN a insertar en el tejido o célula diana. Los liposo-mas se fusionan con las membranas celulares y liberanen su interior la carga genética (ADN) que contienen.Se puede aumentar la especificidad de transfección enun determinado tipo celular del tejido si la secuencia deADN que se pretende transferir se acopla a un ligandoque sólo sea reconocido por aquellos tipos celulares queposean el receptor adecuado para dicho ligando. Encualquier caso, la expresión del nuevo ADN introducidomediante medios físicos no es estable a lo largo deltiempo, por lo que eventualmente ese gen dejará detranscribirse. Por el contrario, los métodos de transfec-ción viral permiten que, una vez infectada la célula, el

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gen de interés se incorpore de manera estable al genomacelular. Para ello, estos métodos utilizan retrovirus mo-dificados genéticamente para evitar que exista síntesisde proteínas virales o replicación viral. En cambio, elgenoma de estos virus contiene una o varias copias delARN del gen de interés, el gen de la transcriptasa inver-sa y los genes que regulan los elementos de control dela transcripción. Con todo ello se facilita la expresiónestable del gen insertado.

Parte III. Aplicaciones prácticas

Enfermedades infecciosas

Las técnicas de biología molecular son potencial-mente útiles en el ámbito de la patología infecciosa por-que permiten:

7. Identificar en el organismo (bacteria o virus) cau-sante de una infección pulmonar. Para ello basta detec-tar en el tejido infectado las secuencias de ADN especí-ficas del agente causal. Pueden emplearse técnicas dehibridación (Northem o Southern blot) o PCR. En elprimer caso se necesita una muestra relativamente abun-dante (mg) de tejido; en el segundo, la PCR permiteidentificar los genes del agente infeccioso con cantida-des de tejido muy pequeñas. La PCR se ha utilizado conéxito para detectar bajísimas concentraciones de Legio-nella pneumophila en agua de bebida'-2.

2. Acelerar el proceso diagnóstico. La realización delos métodos de identificación bacteriológica o viral tra-dicionales consume mucho tiempo y, en algunos casos,es cara. La PCR puede contribuir a solucionar este pro-blema porque permite amplificar con rapidez (minutos)pequeñas cantidades de ADN del agente causal. Estatécnica se ha utilizado con éxito en el diagnóstico de in-fecciones producidas por bacilo de Koch3, Pneumocys-tis carinii*, Mycoplasma pneumoniaes y diversos virusrespiratorios, incluyendo adenovirus, virus del herpessimple y citomegalovirus6.

3. Identificar fuentes de infección. En estudios epi-demiológicos es importante identificar el origen deuna epidemia con objeto de poder intervenir de formaeficaz. La práctica de un mapa de restricción facilitaesta tarea. Esta técnica consiste en cultivar la bacteriade interés (obtenida de cada uno de los posibles fo-cos), aislar su ADN y tratarlo con enzimas de restric-ción. Estas enzimas fragmentarán el ADN en lugaresdistintos, dependiendo de la secuencia de cada geno-ma bacteriano. Los fragmentos resultantes (fragmentosde restricción) pueden separarse mediante técnica deSouthern. El empleo de sondas específicas permiteidentificar la posición relativa de ciertas especies deADN y obtener un mapa de restricción característicopara cada bacteria. La comparación de mapas de res-tricción de cepas aisladas en distintos lugares (aireacondicionado, agua de bebida, etc.) lo que facilita laidentificación del origen de la infección7.

4. Determinar la expresión de genes importantes enla patogénesis de la enfermedad (p. ej., los que codifi-can para toxinas)8-9 o identificar secuencias de plásmi-dos que confieren resistencia a antibióticos10.

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Cáncer de pulmón

La biología molecular y el estudio del cáncer son dosdisciplinas íntimamente ligadas. Por una parte, la biolo-gía molecular ha ampliado de forma considerable nues-tro conocimiento de los mecanismos celulares que pro-ducen la transformación celular maligna. Por otra parte,el estudio de las causas moleculares del cáncer ha im-pulsado el desarrollo de nuevas técnicas de biologíamolecular.

El cáncer se produce, fundamentalmente, por una al-teración de los mecanismos genéticos que regulan la di-visión y diferenciación celular. Los genes implicados ensu patogénesis se pueden agrupar en tres grandes gru-pos:

1. Oncogenes dominantes, cuya sobreexpresión pro-duce la transformación maligna. Utilizando PCR se haamplificado ADN de tumores pulmonares y se ha obser-vado que, en muchos casos, existe una mayor expresiónde oncogenes dominantes (o de sus mutaciones). Unade las familias de oncogenes más estudiada es la familiaras (N-mí, fía-ras y Ki-ras). En condiciones normales,estos genes codifican unas proteínas de bajo peso mole-cular (21 kD) que regulan el sistema de transducción deseñales de los mecanismos de control de la división ce-lular. Sus mutaciones permiten la proliferación celulardesordenada. Otra familia de oncogenes que se sobreex-presa en el cáncer de pulmón es la familia myc (c-myc,N-wyc y L-myc). Estos genes codifican factores detranscripción para genes relacionados con la prolifera-ción celular. Otros oncogenes similares (también facto-res de transcripción) asociados a cánceres de pulmónson c-myb y c-jun.

2. Oncogenes recesivos (genes supresores de tumoreso antioncogenes). Su inactivación permite la desregula-ción de la división celular. El primer gen supresor de tu-mores identificado fue el gen del retinoblastoma (Rb).En un 90% de los tumores de pulmón de célula peque-ña, el Rb está completamente ausente"-12. Otro antion-cogén de gran importancia en el cáncer de pulmón es elp53, que codifica un factor de transcripción13-14. La in-troducción del gen de p53 nativo (no mutado) en célulasde carcinoma de colon suprime completamente su cre-cimiento neoplásico'5.

3. Genes que codifican factores de crecimiento o susreceptores. La disfunción de este tipo de genes desem-peña un papel muy relevante en el proceso de carcino-génesis. Por ejemplo, en ciertos cánceres de pulmón sehan identificado factores de crecimiento (transfemna,factor de crecimiento 1 parecido a insulina [IGF-1] yfactor de crecimiento epidérmico [EGF]) que puedenactuar de forma autocrina, es decir, que pueden actuarsobre la propia célula neoplásica que los produce, esti-mulando su división16'18.

Asma bronquial

La inflamación bronquial es un componente funda-mental en el asma bronquial. En consecuencia, el estu-dio de los mecanismos celulares y moleculares que sub-yacen en esta inflamación es de gran relevancia para la

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Fig. 7. Panel A: Las señales infla-matorias (atocinas, virus, radicalesoxidantes, etc.) activan la trans-cripción de genes inflamatorios(proteínas inflamatorias, moléculasde adhesión, TNF-a, interleucinas,etc.) mediante el factor de trans-cripción NF-KB (compuesto por lassubunidades p50 y p65). Normal-mente, NF-KB está unido a IkBa,protema que impide su transloca-ción al núcleo. Las señales inflama-torias fosforilan IkB. Esta fosfori-lación activa la degradación de IkBy permite la translocación al núcleo(donde actúa) de NF-kB. Panel B:mecanismo molecular de acción delos corticoides. Los corticoidesinactivan NF-kB mediante dosvías: a) el receptor glucocorticoide(RG) inactiva directamente NF-kBuniéndose a la subunidad p65 e im-pidiendo su translocación al nú-cleo, y b) el RG activado actúacomo factor de transcripción, pro-moviendo la síntesis de IkB y dif1-cultando aún más la acción de NF-kB.

mejor comprensión de la enfermedad y para el desarro-llo de alternativas terapéuticas más eficaces. El estudiode diversas citocinas y factores de transcripción nuclearse considera básico en este contexto.

Una citocina es una proteína producida por diversascélulas inflamatorias (tras el estímulo adecuado) y queejerce su acción sobre otra célula (diana) a través de unreceptor específico existente en dicho tejido diana. Enfunción de la ubicación de este último se diferencianefectos autocrinos (actúan sobre la misma célula queproduce la citocina), paracrinos (actúa sobre una célulavecina, cercana), o endocrinos (actúa sobre una céluladiana que está situada a gran distancia de la célula pro-ductora; se precisa que la citocina circule a través deltorrente sanguíneo). Existen muchas citocinas. Algunasde las más conocidas son el factor de necrosis tumoralalfa (TNF-a) y la familia de las interleucinas (IL) de lasque, actualmente, se conocen al menos 12 tipos (IL-1,IL-2, etc.). Aunque la biología molecular ha incremen-tado notablemente el conocimiento del papel de las ci-tocinas en las enfermedades inflamatorias, debido a suextrema complejidad todavía quedan muchos aspectospor definir. Es de prever que en el futuro puedan utili-zarse citocinas recombinantes (citocinas humanas o susreceptores clonados en plásmidos bacterianos para suproducción masiva), anticuerpos anticitocinas o implan-tación genética de oligonucleótidos antisentido comoestrategias para el control terapéutico de los procesosinflamatorios. Un oligonucleótido antisentido [antisen-se] es una copia de ADN complementaria pero de senti-do contrario al del ARNm que codifica para la proteínadefectuosa a inactivar. Al ser introducido en la célula,este oligonucleótido antisentido hibridará con su ARNme impedirá su traducción (producción de la proteína de-fectuosa).

El estudio del papel de los factores de transcripciónnuclear es otra área de investigación relevante en el ám-

bito de las enfermedades inflamatorias del pulmón. Eneste campo destaca el denominado factor nuclear-KB(NF-KB). NF-KB está compuesto por varias subunida-des proteicas (heterodímero)19, entre las que destacanp50 y p65 (fig. 7, panel A). En condiciones normales, elcomplejo NF-KB se localiza en el citoplasma celular, li-gado a otra proteína (I-KB) que impide su translocación(migración) al núcleo (fig. 7, panel A). Cuando se pro-duce una señal de activación determinada (citocina radi-cales libres 0¡), un tipo de enzima determinado (cinasa)fosforila I-KB, que se degrada y permite que NF-KB sedirija hacia el núcleo (fig. 7, panel A), donde, como to-dos los factores de transcripción, se fija en las regionespromotoras de los genes sobre los que actúa (fig. 3). Deesta forma, NF-KB estimula la expresión de muchas delas moléculas involucradas en la cascada inflamatoria,como nuevas citocinas, y moléculas de adhesión'9 que,a su vez, modulan la relación NF-KB/I-KB (fig. 7, panelA).

Los corticoides deben sus efectos antiinflamatorios asu acción sobre NF-KB y otros factores de transcripciónnuclear, como el factor de transcripción AP-1 (c-fos y c-jun)10'21. Los corticoides se unen a su receptor especí-fico (localizado en el citoplasma celular) y lo activan(fig. 7, panel B). El receptor activado se une al complejoNF-KB (o AP-1) e inhibe su translocación al núcleo22'25

(fig. 7, panel B). Por otra parte, los corticoides incre-mentan la transcripción de I-KB, por lo que, al aumentarla fijación de NF-KB, también se impide su transloca-ción al núcleo26 (fig. 7, panel B). Todo ello tiene comoconsecuencia la disminución de la expresión de diver-sos genes implicados en la respuesta inflamatoria (cito-cinas, moléculas de adhesión, etc.). Actualmente, NF-KB es un objetivo potencial para el desarrollo de nuevosagentes antiinflamatorios que intenten obviar los efec-tos secundarios indeseables asociados al tratamientocrónico con corticoides.

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Fibrosis quística. Terapia genética

Las técnicas de terapia genética son, sin duda, la basede la medicina del futuro, ya que presenta un gran po-tencial para la prevención y corrección de muchas en-fermedades. El progreso de este tipo de estrategia tera-péutica depende actualmente de la solución de losproblemas de seguridad que comporta y de la mejora dela especificidad de inserción del material genético sóloen las células en las que es necesario. Sin embargo, laterapia genética ya ha empezado a ensayarse en algunasenfermedades humanas, como la fibrosis quística (FQ).La FQ se caracteriza por la mutación de un canal decloro (CFTR) en la membrana celular. La introduccióndel gen normal (que codifica para el canal cloro no mu-tado) en cultivos de células epiteliales humanas obteni-das de pacientes con FQ es capaz de corregir la funciónanormal del canal27'29. Su eficacia clínica deberá serevaluada en ensayos clínicos controlados pero, sinduda, este tipo de tecnología abre posibilidades terapéu-ticas hasta ahora insospechadas para estos enfermos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los doctores B. Togores, J. Sauleday F. Barbé (Servicio de Neumología, Hospital UniversitarioSon Dureta, Palma de Mallorca) la lectura crítica del manus-crito, sus comentarios y sugerencias.

Diccionario terminológico básico

Antioncogén: gen cuya inactivación desregula la di-visión celular produciendo un fenotipo maligno.

ARN: ácido ribonucleico.ARN de transferencia (ARNt): molécula especial

de ARN ligada a un aminoácido que se une mediante untriplete de nucleótidos a un codón complementario en elARNm para sintetizar proteínas.

ARN mensajero (ARNm): molécula de ARN que sir-ve de modelo para la síntesis de proteínas en el ribosoma.

ARN polimerasa: enzima que cataliza la síntesis deARN a partir de ADN.

cADN: molécula de ADN sintetizada a partir deARNm.

clonación: introducción de moléculas de ADN enbacterias para sintetizar copias idénticas.

código genético: combinación de tripletes de nucleó-tidos que codifican para los aminoácidos.

codón: tres nucleótidos consecutivos que codificanpara un aminoácido o una señal funcional (inicio, termi-nación, spiicing).

complementariedad: unión mediante puentes de hi-drógeno de dos bases homologas de cadenas opuestasde ADN.

elemento: secuencia de ADN con una función regu-ladora de la transcripción.

enhancer: secuencia de ADN con una función regu-ladora de la expresión genética. Similar a elemento.

enzima de restricción: enzima bacteriana que reco-noce y corta secuencias específicas de ADN de doblecadena. Similar a endonucleasa.

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estringencia: condición en la hibridación de ácidosnucleicos que aumenta la especificidad de la unión.

exón: secuencia de un gen que codifica nucleótidospara aminoácidos de una proteína.

factor de transcripción: proteína que regula latranscripción de un gen.

fenotipo: manifestación en los caracteres de un indi-viduo (o célula) de su expresión genética.

gen: unidad funcional del ADN que contiene la in-formación necesaria para dar lugar a una proteína.

gen supresor de tumores: gen cuya activación des-regula la división celular produciendo un fenotipo ma-ligno. Conocido también como antioncogén.

genoma: el conjunto de todo el ADN contenido enlos cromosomas.

hibridación: unión de ácidos nucleicos o nucleótidoscomplementarios.

hibridación in situ: unión de una sonda al ADN enel propio tejido o célula.

histonas: familia de proteínas que empaquetan elADN en los cromosomas.

intrón: secuencia de nucleótidos de un gen que nocodifica para aminoácidos.

mapa de restricción: conjunto de bandas ADN carac-terísticas para una especie o individuo después de habertratado su ADN genómico con enzimas de restricción.

Northern blot: técnica de hibridación de sondas deARN, separadas por tamaño e inmovilizadas en mem-branas de nitrocelulosa-nailon.

nucleosomas: estructura en forma de cuenta de co-llar formada por la unión del ADN con las histonas.

encogen: gen cuya activación desregula la divisióncelular produciendo un fenotipo maligno.

PCR: reacción en cadena de la polimerasa.plásmido: anillo de ADN con capacidad autorrepli-

cativa que se encuentra en el interior de bacterias.polirribosomas: asociación de ribosomas.primer: pequeña secuencia de ADN complementaria

a la zona de inicio de transcripción necesaria para la po-limerización del ADN.

quimera: molécula de ADN recombinante de dos omás especies distintas.

replicación: duplicación de una molécula de ADNmediante la acción de ADN polimerasas.

ribosoma: estructura situada en el citoplasma celularen la que tiene lugar la síntesis de proteínas.

secuenciación: técnica que permite la lectura linealde los nucleótidos de un ácido nucleico.

sonda: fragmento de ADN o ARN utilizado para de-tectar y cuantificar ADN genómico o ARNm.

Southem blot: técnica de hibridación de sondas aADN separado por tamaño e inmovilizado en una mem-branas de nitrocelulosa-nailon.

spiicing: proceso por el cual regiones no codificado-ras del ARN primario son eliminadas para formar elARNm. Se denomina alternativo spiicing cuando esteproceso origina distintas proteínas a partir de un mismomensajero.

traducción: proceso por el cual la información gené-tica contenida en el ARNm es utilizada para sintetizarproteínas.

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X. BUSQUETS Y A.G.N. AGUSTÍ- LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL DIAGNÓSTICOY TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES RESPIRATORIAS

transcripción: proceso por el cual la informacióngenética contenida al ADN es utilizada para sintetizarARN.

transcriptasa inversa: enzima de origen retroviralque cataliza la formación de ADN a partir de un ARNhomólogo.

tripletes: tres nucleótidos consecutivos que codificanpara un aminoácido o una señal funcional. Similar acodón.

Western blot: técnica de detección y cuantificaciónde una proteína específica separada por tamaño e inmo-vilizada en membrana de nitrocelulosa-nailon.

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