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Aplicaciones de la biología molecular a la patología tumoral

endocrinológica

Mercedes Robledo Hereditary Endocrine Cancer Group Human Cancer Genetics Programme

Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO, Madrid [email protected]

mailto:[email protected]

Biología Molecular

Objetivo común

Diagnóstico temprano, estratificación de riesgo,

terapia adecuada del paciente

Tejido enfermo (tumor)

Staudt LM, N Eng J Med 348: 1777-85 (May, 2003) Staudt LM, N Eng J Med 348: 1777-85 (May, 2003)

Herramientas bioinformáticas

Genes que co-expresan...

¿Qué tienen

en común?

Distintos fenotipos

¿Que genes son

los responsables?

Preguntas:

Genes que interaccionan en

una red (A,B,C..)...

¿Como es

la red?

A

B C

D E

Genes de una clase ¿Qué patrón(es) tienen? y...

¿hay más?

Clasificación molecular

Imprescindible: criterios clínicos homogéneos

Bien diferenciados Pobremente diferenciados y anaplásicos (<5 %)

PTC (85 %) FTC (10 %)

Subtipo clásico

Variante folicular

Oncocítico, de células claras, esclerosante difuso, de células altas, etc

Minimamente invasivo Invasivo

Carcinoma de tiroides derivado de célula folicular: heterogeneidad

Escenario

Diferenciación

Peor pronóstico

PTC clásico

Célula folicular tiroidea normal

TCVPTC PDTC

Carcinoma Anaplásico

Adenoma Folicular

FTC PDTC

p53 β-catenina

p53 β-catenina

BRAF RAS RET/PTC NTRK MET c-myc

RAS PAX8/PPAR

PIK3CA

Sobre-expresión de Ciclina D1 Infra-expresión de p27

Adenoma Folicular hiperfuncionante o tóxico

TSHR GNAS1 (Gsα)

PTEN

(Modificado de Kondo et al., 2006)

Tejidos congelados + Datos clínico-patológicos

21 Adenomas foliculares (FA) 46 Carcinomas bien diferenciados (13 FTC y 33PTC)

6 Carcinomas pobremente diferenciados (PDTC) 8 Carcinomas indiferenciados (ATC)

6 Tejidos tiroideos normales

% células tumorales

Caracterización de las mutaciones puntuales (BRAF, HRAS, NRAS y KRAS)

Estudio de los reordenamientos Determinación de los perfiles de expresión

H & E

Extracción ADN

Extracción ARN

OBJETIVOS

Identificación de rutas de señalización y genes específicos relacionados con la carcinogénesis

tiroidea, así como un predictor molecular de curso clínico.

Identificación de marcadores moleculares y rutas biológicas implicadas en la pérdida de diferenciación celular y mal pronóstico

ATC/PDTC vs PTC ATC/PDTC vs FTC

ATC/PDTC vs PTC 1594 + 1456 -

ATC/PDTC vs FTC - 1652 + 1566

ATC/PDTC

vs PTC

ATC/PDTC

vs FTC

Pérdida de diferenciación

ATC/PDTC vs WDTC: 1309 + 1339

A B +

+ -

-

T-REX

Base de datos GO

Progresión del Ciclo Celular *Mitosis

*Replicación y reparación del ADN

*Reorganización cromosómica y

biogénesis

*Reorganización de los filamentos de

actina y los microtúbulos

Marcadores de mal pronóstico previamente descritos en

distintos tipos de cáncer:

*Inhibidores de la apoptosis: BIRC5

*Activadores de proteínas control del huso mitótico (BUB1, BUB3,

KNTC2, MAD2, PLK4 y STK6)

*Marcadores del ciclo celular (CCNB1, CCNA2 y CDC2)

ATC/PDTC vs PTC

ATC/PDTC

vs FTC


FAtiGOplus

Términos KEGG Genes sobre-expresados Genes sub-expresados

Ruta de señalización de las MAP quinasas

AKT2, SOS1, FGFR1, MAPK12, ATF4, STMN1, MYC,

ELK1, TGFB2, RAC1, HRAS, CRKL, ARRB2, MINK1,

TGFBR2, NRAS, MAP4K4, MKNK1, MAPK8IP1, CDC25B,

MAP2K3, PRKCA y MAP3K8

PLA2G6, NF1, CASP2, DUSP14 y CASP9

Ciclo celular

MCM7, MAD2L1, CDK2, PKMYT1, HDAC2, ORC6L,

CDKN2C, GSK3B, E2F2, MCM10, CCNA2, TGFB2, MCM6,

CCNB2, BUB1, CCNE1, CDC25A, CDC6, CDC25B, MCM3,

PRKDC y CDC2

-

Adhesión focal

ABI2, ARPC1B, MYH10, PFN1, SOS1, FGFR1, ARPC3,

GNA13, ITGA5, RAC1, HRAS, SSH1, CRKL, ACTN2,

DIAPH3, NRAS, ITGA11, VIL1, F2R y PIK3CD

ARHGAP5, PPP1CA y PAK3

Regulación del citoesqueleto de actina

ABI2, ARPC1B, MYH10, PFN1, SOS1, FGFR1, ARPC3,

GNA13, ITGA5, RAC1, HRAS, SSH1, CRKL, ACTN2,

DIAPH3, NRAS, ITGA11, VIL1, F2R y PIK3CD

PPP1CA, AVIL y PAK3

Ruta de señalización de TGFβ GDF5, THBS1, MYC, FST, TGFB2, SMURF1, TGFBR2,

RBX1 y IFNG

PPP2CB, ID1, SMAD7, ID2, BMPR1A, ZFYVE16

y ID4

Ruta de señalización de WNT WNT5B, WNT8B, GSK3B, MYC, VANGL1, RAC1, RBX1,

PRKCA y DVL3 PPP2CB, SIAH1, CXXC4 y FZD5 Transición del epitelio a mesénquima (EMT): proceso de pasos

múltiples que lleva a la pérdida de polaridad de la célula epitelial, represión de marcadores epiteliales y sobre-regulación de proteínas mesenquimales.


Familia Génica Símbolo del Gen

Familias génicas con genes sobre-expresados

Familia de las metaloproteasas de la matriz extracelular (MMP) MMP1, MMP2, MMP10, MMP11, MMP19 y MMP25

Familias Alpha, beta y gamma tubulinas TUBG2, TUBB5, TUBB, TUBA8, TUBA6, TUBA3 y TUBA1

Familia de los enzimas E2 ubiquitin-conjugantes UBE2C, UBE2T, UBE2I, UBE2V2 y UBE2V1

Familia A de los antígenos del melanoma MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA10 y

MAGEA11

Familia de las ciclinas involucradas en la transcripción CCNE1, CCNB2 y CCNA2

Familia de las proteínas centroméricas CENPA, CENPB, CENPE y CENPF

Familia de las lamininas de la matriz extracelular de glicoproteínas LAMB1, LAMA3, y LMNA y el mediador de la interacción entre laminina B y

cromatina (LBR)

Familia del colágeno COL12A1, COL6A3, COL6A2 y COL1A1

Familia de las proteínas DEAD box DDX11, DDX55, DDX39, DDX21 y DDX10

Familia de las quemoquinas X CXCL10, CXCL11 y CXCL3

Familia de las proteínas relacionadas con la actina (ARPs) ACTRT1, ACTL7B, ARPC3 y ARPC1B

Familia de los factores proteicos de transformación del crecimiento TGFBR2, TGFB2, TBRG4 y TGFB1I1

Superfamilia de receptores y ligandos de los factores de necrosis tumoral Receptores: TNFRSF6B, TNFRSF19L; Ligandos: TNFSF7, TNFSF13B y

TNFSF11

Familia de quinasas relacionadas con NIMA (never in mitosis gene a) NEK2, NEK3 y NEK6

Familias génicas con genes sub-expresados

Familia de las fosfatasas 2 PPP2R5C, PPP2R5A y PPP2CB

Familia de las proteínas dominante negativo helix-loop-helix ID1, ID2 y ID4

Familia de las proteíans Heat-shock DNAJC4, DNAJB5 y DNAJB2,

Familia de proteínas aldehído deshidrogenasas: ALDH9A1, ALDH6A1, ALDH3A2 y ALDH1A1

Superfamilia de cadherinas integrantes de membrana que median la adhesión célula-célula dependiente

de calcio CDH1 y CDH12

ATC/PDTC vs PTC

ATC/PDTC

vs FTC


PubMed, Entrez Gene, …

Se expresan en muy pocos tejidos normales Asociados a un fenotipo agresivo

Resistencia a agentes quimioterapéuticos

¿Inmunoterapia anti-MAGE para los ATC/PDTC?

Procesos biológicos y rutas moleculares implicadas en la pérdida de

diferenciación del cáncer del epitelio folicular tiroideo.

Dianas potenciales para el diseño de terapias dirigidas.


Clase predictor

Clase real ATC/PDTC PTC/FTC Error

ATC/PDTC 16 0 0

PTC/FTC 2 26 0,0714

Mal pronóstico

Error Total: 0,0455

Buen pronóstico

ATC/PDTC vs PTC

ATC/PDTC

vs FTC


Prophet

* *DSVPTC

Seguimiento <2 años

Validación de la firma: de inmediata aplicación clínica


Son tumores relativamente frecuentes: representan el 16,7% de los tumores intracraneales (14.4% en estudios de autopsia y 22.5% en estudios radiológicos).

Shereen Ezzat. Cancer 2004;101:613–9

Comportamiento biológico muy variable (producción hormonal/ proliferación celular). Tras el tratamiento inicial, la posibilidad de persistencia de restos tumorales obligan en muchos casos a considerar una nueva intervención (dependiente de tamaño y de funcionalidad): necesidad de marcadores

Material:

40 no funcionantes: 22 invasivos y 18 no invasivos

19 adenomas (10 invasivos y 9 no invasivos), como serie independiente.

Caracterización:

Criterios histológicos, seguimiento radiológico, etc homogéneos para todos los pacientes.

Galland F, et al. Endocrine Related Cancer 17: 361-371, 2010.

35 genes seleccionados para validación.

Solo 4 confirmados en serie independiente: IGFB5, MYO5A, FLT3 y NFE2L1

IHC: fuerte tinción positiva de MYO5A entre los invasivos. Marcador de utilidad clínica

Correlación positiva entre MYO5A y PTTG.

Raverot G, et al. JCEM 95: 1708-1716, 2010.

94 pacientes con prolactinoma:

invasivos,

agresivos e

invasivos agresivos.

Diseño experimental:

1- Miden la expresión de 9 genes previamente seleccionados con perfiles de

expresión.

2- Siete de ellos muy correlacionados con progresión .

Controlados

por E2F y

E4F

S

G2

G0

G1

Quiescence Mitogenic

Cascades

pRB

INK4

(p15, p16, p18 y

p19)

p53

Cyclin D

p21Cip1

p27Kip1

CDK4

PTTG1/ Securin

Chromosome

segregation

Separase

CDK2

Cyclin A

CDK1

Cyclin B

M E2F

CDK6

Transcription

CDK1

Cyclin A CDK2

Cyclin E

CDK2

Cyclin E

Antimitogenic Signals

Antimitogenic Signals

Quereda V & Malumbres M, Journal of Molecular Endocrinology 42: 75-86, 2009

Adenomas hipofisarios:

Además de los marcadores que ya se conocen y están validados como de utilidad pronóstica, como PTTG1, VEGF, p27, AIP, p53, Ki67, etc...en los próximos años asistiremos a la identificación de una gran cantidad de marcadores siempre que existan proyectos de colaboración, en la que los tumores se caractericen de forma homogénea.

SDHA 2010

TMEM127 2010

SDHAF2 2009

KIF1B 2008

SDHB 2001

SDHC 2000

SDHD 2000

MEN1 1997

VHL 1993

RET 1993

NF1 1990

PCC/PGL

???

PCC/PGL

Otros signos

Heterogeneidad genética:

necesidad de marcadores diagnósticos

SDHB SDHD SDHC VHL RET NF1 SP FPCC VHL/ SDH RET/ NF1

López-Jiménez E, et al., Mol Endocrinol. 24(12):2382-91, 2010

Identificación de marcadores diagnósticos

- Los perfiles de expresión son específicos del background genético y no de la localización del tumor. - Los tumores clasificados como familiares sin mutación estaban distribuidos en dos subgrupos dentro del cluster 2: sugiere la existencia de más de un gen.

- VHL

- SDHB, SDHD, SDHC

- NF1

- RET

- FPCC y SP

84

PCC/PGL

VHL/SDH RET/NF1

- Ambas clases genéticas comparten un mismo perfil secretor de catecolaminas.

-Interesan las clases VHL y SDHB debido a su diferente pronóstico.

Secretores de

Norepinefrina

OH

HO OH

CH2 CH NH2

Resultados de Agrupamiento No Supervisado

Analisis Supervisado entre VHL y SDHB

• Se obtuvieron 782 genes diferencialmente expresados de forma significativa (FDR<0,05).

• Validación en muestras congeladas y parafinadas:

SD

H

B

SD

H

B

SD

H

B

SD

H

B

SD

H

B

SD

H

B

SD

H

B

SD

H

B V

HL

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

VH

L

UBXD3 (<0.001)

DDIT4L3 (<0.001)

PNMA3 (<0.001)

KIAA0644 (<0.001)

SPAG4 (<0.001)

TFAP2C (<0.001)

MTP18 (<0.001)

PLCH2 (<0.001)

RGS22 (<0.001)

EGFL7 (<0.001)

SPOCK2 (<0.001)

EGLN3 (<0.001)

EYA1 (<0.001)

TCERG1L (<0.001)

PTHLH (<0.001)

MT3 (<0.001)

THC2412859 (<0.001)

MT3 (<0.001)

A_24_P50666 (<0.001)

RARRES2 (<0.001)

GPR30 (<0.001)

BX647543 (<0.001)

FLI46266 (<0.001)

ACTA1 (<0.001)

ENST000003824 (<0.001)

CB305813 (<0.001)

APOBEC2 (<0.001)

TNT (<0.001)

SLC16A3 (<0.001)

ACTL8 (<0.001)

SLC2A1 (<0.001)

CGNL1 (<0.001)

BC038245 (<0.001)

LOC198437 (<0.001)

AK125302 (<0.001)

THC2437822 (<0.001)

DRD1P (<0.001)

CRTAC1 (<0.001)

MT1F (<0.001)

CRYBA2 (<0.001)

HSPB7 (<0.001)

BC047230 (<0.001)

THC2404004 (<0.001)

POPDC3 (<0.001)

A_24_P365349 (<0.001)

GCGR(<0.001)

CDH10 (<0.001)

SHD (<0.001)

ELOVL7 (<0.001)

RBM11 (<0.001)

Código de Color

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

RU

SPOCK2 EglN3 SLC2A1 SLC16A3 BNIP3 CDH10

VHL casos

SDHB casos


Tinción con antiEglN3 en tumores VHL

En busca de marcadores diagnósticos de clase genética

EglN3 es un buen marcador para la clase de tumores VHL utilizando qPCR

Tumores no VHL VHL

EglN3


SDHA 2010

TMEM127 2010

SDHAF2 2009

KIF1B 2008

SDHB 2001

SDHC 2000

SDHD 2000

MEN1 1997

VHL 1993

RET 1993

NF1 1990

PCC/PGL

???

PCC/PGL

Otros signos

MAX 2011

Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011 Jun 19;43(7):663-7

SDHA 2010 TMEM127

2010

SDHAF2 2009

KIF1B 2008

SDHB 2001

SDHC 2000

SDHD 2000

MEN1 1997

VHL 1993

RET 1993

NF1 1990

PCC/PGL

SDHB SDHD SDHC VHL RET NF1 SP TMEM127 FPCC

? López-Jiménez, E. et al, 2010.

Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011.

Fenotipo similar

A_23_P90696_TRIB2

A_23_P420551_CIT

A_23_P52227_GDF10

A_24_P355464_GDF10

A_24_P343695_RET

A_23_P40217_DOK5

A_23_P65779_STRA6

A_32_P111565_FTH1

A_24_P58337_FTH1

A_23_P57836_A_23_P57836

A_32_P187704_DA237404

A_32_P210168_LOC388135

A_24_P272993_MEG3

A_23_P99141_GPR162

A_23_P153676_TLE2

A_23_P85008_MAOB

A_23_P85015_MAOB

A_23_P51986_MTMR11

A_23_P60146_PDGFRL

A_23_P79622_FKBP7

A_23_P71880_SPINK4

A_24_P95070_ENST00000222543

A_24_P174353_A_24_P174353

A_23_P301942_NPPC

A_23_P74059_NPPA

A_32_P102581_BG708379

A_24_P944973_EGFL11

A_23_P51718_PABPC4

A_23_P345692_IL17D

A_23_P80462_ENST00000295943

A_23_P49546_GRIN2C

A_32_P157208_AY343891

A_23_P48988_SH3GL3

A_23_P81392_WWC1

A_23_P60130_MAL2

A_32_P183718_SP5

A_23_P135381_SP5

A_23_P129133_OCA2

A_24_P347185_NPFF

A_23_P204079_NPFF

A_23_P45345_HTATSF1

A_23_P160214_C1orf34

A_32_P71675_ENST00000378266

A_23_P1102_ACTA1

A_32_P49616_EEF1B2

A_24_P152433_ENST00000312528

A_32_P37495_LOC388002

“Cluster 2” PCCs FPCCs

-2 0 2 4

Color key

47 clones significantly differentially expressed

(FDR<0.15) 15 clones significantly differentially expressed

FDR<0.05

MEG3

The most significant downregulated gene (n-fold change 29):

Maternally Expressed Gene 3, imprinted gene proposed as TSG

MEG3

ch.14

Supervised analysis FPCC (3) vs. cluster 2 PCCs (42)

hsa-miR-337-5p

hsa-miR-337-3p

hsa-miR-127-3p

hsa-miR-136

hsa-miR-136*

hsa-miR-379

hsa-miR-411

hsa-miR-758

hsa-miR-495

hsa-miR-376c

hsa-miR-376a

hsa-miR-654-3p

hsa-miR-381

hsa-miR-539

hsa-miR-487a

hsa-miR-382

hsa-miR-485-5p

hsa-miR-485-3p

hsa-miR-154

hsa-miR-154*

hsa-miR-377*

hsa-miR-377

hsa-miR-369-5p

hsa-miR-410

Chr. 17

FPCC1

Chr. 18

Chr. X

FPCC2

Chr. 22

Chr. 7

Chr. 12

FPCC3

Array-CGH analysis of the three FPCC tumors:

Patients’ germline

DNA

c.295+1G>A

c.223C>T

c.1A>G

Tumor DNA

Los 3 pacientes eran portadores de mutaciones que conducían a

proteína truncada

b

IHC: tinción negativa

MAX

RET


Pacientes seleccionados (59): • Antecedentes familiares (5) • Feocromocitoma bilateral (22) • Edad de diagnóstico menor de 25 años (32)

REG

ISTRO

CLÍN

ICO

8 mutaciones diferentes (5 de proteína truncada y 3 missense)


3’ UTR

13% de los pacientes seleccionados portaban una mutación en MAX

• Preferente transmisión paterna (explica la ausencia de antecedentes familiares en 3 pacientes).

• 3 de los 8 casos índice mostraron metástasis o antecedentes familiares.

325 pacientes índice no sindrómicos (MEN2, VHL or NF1)

Algoritmo

One tumour

If negative screening

SDHB

SDHD SDHC,

SDHAF2**

> 40y.

SDHB PCC

PGL Thoracic-abdominal

PGL Head & Neck

SDHD

SDHB

< 40y.

PCC/PGL patients without any syndromic feature

Multiple tumours

H&N PGL PCC Bilateral

Multiple PGL + PCC

SDHD


SDHB, SDHD SDHC*

VHL RET

SDHB TMEM127

MAX

If neg screening

VHL

RET

SDHB

TMEM127

MAX

SDHB SDHC SDHAF2

VHL RET



Modified from Horm Metab Res 41:672-5, 2009; J Clin Endocrinol Metab 94:1701-5, 2009; Comino-Méndez, I., et al. Nat Genet. 2011 Jun 19;43(7):663-7

A los pacientes y a todos vosotros

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