karina angÉlica pÉrez cruz

UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas

Escuela de Graduados

SIacuteNTESIS CARACTERIZACIOacuteN ELECTROQUIacuteMICA Y REACTIVIDAD CON

ANIOacuteN SUPEROacuteXIDO DE NUEVAS CUMARINAS HIacuteBRIDAS

Tesis presentada a la Universidad de Chile

para optar al Grado de Doctor en Quiacutemica por

KARINA ANGEacuteLICA PEacuteREZ CRUZ

Directores de Tesis

Prof Dr Luis J Nuacutentildeez Vergaradagger

Prof Dr J Arturo Squella Serrano

Prof Patricio A Navarrete Encina

Santiago-Chile

2016

i


FACULTAD DE CIENCIAS QUIacuteMICAS Y FARMACEacuteUTICAS

INFORME DE APROBACIOacuteN TESIS DE DOCTORADO

Se informa a la Comisioacuten de Postgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y

Farmaceacuteuticas que la Tesis de Doctorado presentada por la Candidata


ha sido aprobada por la Comisioacuten Evaluadora de Tesis como requisito para obtener el

grado de Doctora en Quiacutemica en el examen de defensa de Tesis rendido el helliphelliphellipde

Diciembre de 2016

Directores de Tesis


Prof Dr Juan Arturo Squella S helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Patricio A Navarrete E helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Comisioacuten Evaluadora de Tesis

Prof Dr Antonio Zanocco Loyola (Presidente) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Dr Claudio Olea Azar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Dra Mariacutea Soledad Ureta Zantildeartu helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Dr David Pessoa Mahanna helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

ii

helliprdquoPues dando se recibe

Perdonando se es perdonado

Muriendo se resucita a la vida eternardquo

San Francisco de Asiacutes

iii

Se agradece en forma especial a las siguientes Instituciones por los aportes

financieros recibidos para el desarrollo y teacutermino de esta Tesis

- Conicyt Beca de Doctorado Nacional (2010) Beca de Apoyo de Tesis

(2011) y Beca de Asistencia a Congresos (2013)

- Universidad de Chile por las Becas Mecesup UCh061 (2011) Beca de la

Vicerrectoriacutea de Asuntos Acadeacutemicos (Estadiacuteas cortas de Investigacioacuten 2013)

y a la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas por Beca de Rebaja

Arancelaria (2015-2016)

- Fondecyt Proyecto ndeg 1110039 Profesor Luis J Nuacutentildeez Vdagger

iv

A G R A D E C I M I E N T O S

Al culminar esta etapa acadeacutemica soacutelo tengo expresiones de profundo

agradecimiento

A Dios -en el cual somos nos movemos y existimos- agradezco la hermosa Familia

que me ha acogido siempre pilar que ha sostenido mi carrera en los diacuteas alegres y en

aquellos aciagos Gracias a mis Padres Joseacute Mariacutea y Elsa por su amor su sabiduriacutea el

apoyo incondicional comprensioacuten y valores entregados desde mi maacutes tierna infancia

gracias por la disciplina y prestancia que me entregaron como legado fruto de una

educacioacuten esmerada empapada de Fe y conviccioacuten tesoros que van en mi espiacuteritu

siempre A mi hermana Andrea y mi cuntildeado Juan gracias por su carintildeo todo su

apoyo y comprensioacuten Tiacuteas Mary Florita y Carmen gracias por estos antildeos de amor

alegriacutea y entrega

Agradezco a mis Profesores Tutores Al Dr Luis Nuacutentildeez V vaya mi maacutes sentido

reconocimiento por invitarme a ser parte de su Investigacioacuten y entregarme

herramientas valiosas en mi formacioacuten de pre y posgrado gracias por la confianza

que depositoacute en miacute por la acogida y comprensioacuten que me brindoacute en tiempos

complejos instancias que siempre conservareacute en mi memoria

A los Profesores Dr J Arturo Squella S y Patricio Navarrete E expreso mi sincero

agradecimiento por su guiacutea y orientacioacuten en este proceso gracias por su acogida y

todos sus aportes para que este trabajo llegase a feliz teacutermino

Expreso mi gratitud a los Profesores Dr Domingo Gonzaacutelez A y Manuel Domiacutenguez

P de la Facultad de Quiacutemica de la Universidad de Sevilla por recibirme en su grupo

de trabajo y compartir parte de esta Investigacioacuten Tener la oportunidad de viajar y

haber conocido y compartido ese corto tiempo de estadiacutea con el Profesor Domingo ha

sido una de las experiencias maacutes valiosas educativas y formativas que conservo de

este periacuteodo como doctorando Gracias por su amistad

Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores de la Comisioacuten Examinadora a la

Dra Soledad Ureta Z por su tiempo buena disposicioacuten y valiosos aportes a este

trabajo al Dr Antonio Zanocco L por sus aportes realizados a este trabajo y su

buena voluntad al Dr David Pessoa M gracias por sus ideas y aportes realizados en

cada instancia En forma especial quiero agradecer al Dr Claudio Olea A quien

junto con ser parte de esta Comisioacuten me abrioacute generosamente las puertas de su

Laboratorio para aprender y desarrollar diversas teacutecnicas aplicadas en esta Tesis lo

cual fue un hermoso aporte Muchas gracias por su confianza por integrarme como

una alumna maacutes por su tiempo paciencia y por todos los momentos alegres que

compartiacute con su grupo Muchas gracias a sus alumnos ex-alumnos y miembros del

Laboratorio al Dr(c) Mauricio Moncada por su dedicacioacuten carintildeo y ensentildeanza en

este proceso gracias por la amistad y el apoyo que me ha brindado

v

Al Dr Germaacuten Barriga por los aportes en el tema de estudios teoacutericos al Dr Michel

Lapier por su colaboracioacuten con los estudios en ceacutelulas al Dr Francisco Mura por su

generosidad y colaboracioacuten al Dr Benjamiacuten Aguilera por su simpatiacutea y ayuda con

temas espectroscoacutepicos a la Dra Mariacutea Carolina Zuacutentildeiga y los MC boys Jorge

Beatriz Manuel Camilo Gabriela Estefaniacutea gracias por sus aportes a este trabajo y

los momentos agradables que compartimos Al Profesor Dr Javier Morales vaya mi

agradecimiento por su ayuda en el estudio y caracterizacioacuten de mis compuestos

Gracias a la Profesora Dra Mariacutea Baeacutez C por su colaboracioacuten y disposicioacuten en la

caracterizacioacuten de mis compuestos

Agradezco a todos los compantildeeros de laboratorio que he conocido en diversas

instancias A la Dra Paulina Sierra a Viviana Claudio Julio la Dra Paola Salgado

Camila Daniela Constanza Dr David Vaacutesquez Gracias por los momentos gratos y

su compantildeerismo

Deseo destacar la valiosa contribucioacuten de los funcionarios de la Biblioteca Ceacutesar

Leyton de nuestra Facultad Muchas gracias por la prontitud y agilidad en su servicio

que siempre ha sido de muy buen nivel

Agradezco ademaacutes la valiosa colaboracioacuten de las Secretarias de Decanato Sra

Cecilia Pinchetti y Ximena Berriacuteos Gracias por su siempre buena disposicioacuten

gentileza y voluntad con cada detalle de todo este proceso

Mi agradecimiento para todo el personal de Secretariacutea de Posgrado por su gestioacuten y

colaboracioacuten en todo el proceso acadeacutemico

vi

INDICE

Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i

Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii

Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi

Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x

Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi

Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii

Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx

1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1

112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2

113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4

12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10

123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11

13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

vii

131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25

413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies

radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28

421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28

422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37

423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante

espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38

424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad

frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales

de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma

(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

viii

4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)

mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44

4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45

4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47

4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48

4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49

5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50

51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50

52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54

53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia

de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70

54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad

frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74


oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74


(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82

543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot

teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86


545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100

546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102

ix

547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108

6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113

7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124

8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126

x

Iacutendice de figuras y tablas

Figuras

Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados

Figure 1 Scheme of studied compounds

Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)

Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann

Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol

Figura 14 Estructura de la suksdorfina

Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal

Gnidia socotrana

Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios

en la especie Streptomyces

Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante

Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-

dihidroxicumarina

Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1

Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5

Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6

Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7

Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8

Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico

xi

Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9

Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de

hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30

min (cumarina y aacutecidos benzoicos)

Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)

35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2

Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)

dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico

(Trolox)

Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio

Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)

Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido

DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo

Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4

2 mM en DMF + HFFTBA 02 M

Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11


Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3

Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M



Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3


Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol

Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en

DMF + HFFTBA 02 M

xii

Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de

barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en

DMF + HFFTBA 02 M

Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs


Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados

Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12

vs v12

para el precursor aacutecido protocateacutequico 4


Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-

oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+

en DMF+HFFTBA

(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color

rojo)

Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-

oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+

en DMF+HFFTBA


rojo)

Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-

oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+

en DMF+HFFTBA (izq)

Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)

Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de

concentraciones del compuesto 11

Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11

Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+

y el compuesto

antioxidante reductor

Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro

simulado (derecha)

xiii

Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del

compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten

del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2

Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del

compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con

adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4

Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del

compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con

adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10

Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del

compuesto hiacutebrido 11

Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121

formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado

utilizando el programa EPR-WINSIM (der)

Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-

DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM

Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten

superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs

Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa

S Ipa

0) vs concentracioacuten

de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)

Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora

Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a

10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin

Sketch del software ChemAxon164

Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT

Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT


xiv


Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-

oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118

Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-

oxidativo en etapas

Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a

anioacuten superoacutexido

xv

Tablas

Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC

2 mM DMF + HFFTBA 02 M

Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos

Valores en Gauss

Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados

Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n

Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo

FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra

Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)

Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados

Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)

concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto

Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los

compuestos

Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio

Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad

antioxidante para la cumarina y sus derivados

xvi

Glosario de abreviaturas

ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato

ADN Aacutecido desoxiribonucleico

ATCC American Type Culture Collection

HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio

CAC Capacidad antioxidante celular

CYP450 Citocromo P450

DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano

DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal

disoacutedica)

DMF NN-dimetilformamida

DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido

DMSO Dimetil sulfoacutexido

DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil

Epa Potencial de pico anoacutedico

EPR Electron paramagnetic resonance

ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno

EROs Especies reactivas de oxiacutegeno

xvii

fk Iacutendice de Fukui

FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma

HObull Radical hidroxilo

IA50 Iacutendice antioxidante 50

Ipa Corriente de pico anoacutedica

O2˙- Anioacuten radical superoacutexido

ONOObull Radical peroxinitrito

ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein

PBS Buffer fosfato salino

REE Resonancia de espiacuten electroacutenico

RObull Radical alcoxilo

ROOmiddot Radical peroxilo

TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina

Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico

VC Voltametriacutea ciacuteclica

VPD Voltametriacutea de pulso diferencial

xviii

RESUMEN

Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en

especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida

actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes

En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La

cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos

aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute

su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas

metodologiacuteas in vitro


Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea

ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una

aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas

Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a

traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de

OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix

acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron

discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el

proceso oxidativo

Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los

ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-

FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical

hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad

antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple

Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas

estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan

una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute

la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico

(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a


Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que

la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de

naturaleza lipofiacutelica

xx

SUMMARY

Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources

widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among

which their antioxidant capacity

In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described

Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic

acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their

antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated


The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential

pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the

redox processes in biological membranes

The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through

the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and

theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the

OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi

different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking

place

Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical

antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)

spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a

simple biological model in vitro

In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to

the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related

to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the

electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in

aprotic media against superoxide anion

In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the

antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media

Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal

Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la

lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten

ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800

cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos

secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su

biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados

por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos

estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa

(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-

patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2

El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo

caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya

semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b

A partir

de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes

naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en

aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868

W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del

orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado

de la semilla de Tonka5 8(ac)

Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies

vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales

familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae

Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae

Oleaceae Thymelaeaceae8b

112 Rutas de siacutentesis

Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del

estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las

principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin

Pechmann10

y Pechmann-Duisberg11

(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al

Introduccioacuten

3

condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones

plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)

libre de solventes13 (ab)

con promotores aacutecidos14

asistida por microondas15

entre otras


Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16

propuesta en 1898 Consiste en

una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo

acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)

Los autores Bigi y colaboradores17

describen el uso de un catalizador en base a

montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un

grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta

condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos

rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18

Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones

claacutesicas de Wittig19 ab

y Reformatsky20

ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en

los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados

OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4

cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21

reacciones libres de

solventes22

y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos

organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23

113 Principales aplicaciones

Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones

posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto

de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en

la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de

compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de

vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da

origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como

antioxidante

A Actividad bioloacutegica

La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como

anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-

hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado

Introduccioacuten

5

sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno

de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c

OOOO

OH HO


Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables

blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus

propiedades farmacoloacutegicas25ab

Su capacidad como agente antitumoral 26ab

se ha

estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas

Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas

humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este

derivado dihidroxilado27

En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores

aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos

ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28

Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se

encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo

Introduccioacuten

6

de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados

sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29

Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de

un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los

obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30

HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron

una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos

compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de

poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en

las que se utilizoacute31

Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab

Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y

Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c

Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies

vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33

Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como

compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36

inclusive con

potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten

sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como

Introduccioacuten

7

principio activo25a

estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis

disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida

como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos

anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez

maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37

O OO

O

O

OO


B Propiedades antioxidantes

El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe

mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio

celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la

cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de

origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo

ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como

Introduccioacuten

8

EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el

anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y

alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)

entre otras

Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las

cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies

reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema

relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y

estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de

estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39

Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un

conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo

aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados

poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40

Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en

que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los

derivados cumariacutenicos34

El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al

radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular

Introduccioacuten

9

estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar

especies radicales (Kim y cols 2008)41

Otro estudio en el que se ensaya un extracto

vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-

dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42

Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en

posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los

compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales

presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en

ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se

realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de

apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los

derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43

12 Compuestos polifenoacutelicos

121 Origen vegetal

Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se

han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como

metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten

UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a

Introduccioacuten

10

depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo

(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos

(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes

propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos

estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46

Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en

forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva

pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47

en vegetales cereales

y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos

provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria

alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de

origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48

122 Actividad bioloacutegica

Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)

haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras

publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con

la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres

estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a

traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de

publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y

Introduccioacuten

11

1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da

cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49

La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos

estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas

de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051

Compuestos como la

curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de

las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer

(Cimino y cols 2012)52

Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-

canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el

artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los

meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de

polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto

contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53

123 Polifenoles como antioxidantes

Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras

vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten

relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de

metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte

Introduccioacuten

12

realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el

organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute

directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya

que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos

como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54

Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido

polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a

DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean

que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener

aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55

Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como

antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido

ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad

de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de

especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56

trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se

estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu

(Andrade y cols 2005)57

Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio

debido a su capacidad antioxidante58-61

Jeong y colaboradores estudiaron el extracto

de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten

Introduccioacuten

13

butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en

ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este

extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como

el Alzheimer62

Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de

compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico

ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol

presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante

mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta

ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63

13 Compuestos hiacutebridos

Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer

diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes

factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener

nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura

distintos ingredientes activos64

Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los

nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias

implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las

interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los

faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los

efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos

Introduccioacuten

14

Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta

estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68

La revisioacuten realizada por

los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado

origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas

fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de

compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69

En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel

mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos

empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una

resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio

(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las

trioxaquinas70

las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por

Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos

promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71

Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en

algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72

Allen y

colaboradores73

mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las

que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de

propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a

Introduccioacuten

15

blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el

tratamiento de esta compleja patologiacutea

Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas

terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74

en vacunas de amplio espectro

frente al coacutelera75

en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76

y de dihidropiridinas

las cuales poseen actividad vasodilatadora77

por mencionar algunos ejemplos

131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas

Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica

que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que

se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de

estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-

blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a

importantes patologiacuteas y sus terapias 78

En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de

origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un

estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de

Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron

extraiacutedas purificadas y caracterizadas79

(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana

Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto

cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y

cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces

estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima

ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su

muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17

Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a

partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores

se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como

objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron

resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que

los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la

moleacutecula81

La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras

hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si

se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el

Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se

sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes

reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3

mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al

conocido y utilizado faacutermaco indometacina82

Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el

desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83

actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos

frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se

Introduccioacuten

18

mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la

actualidad

El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la

estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron

estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico

(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y

voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos

propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84

Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la

desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados

cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e

in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes

anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos

frente a la diabetes85

Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores

desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una

estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos

de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria

a nivel de mucosa gaacutestrica86

Introduccioacuten

19

Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo

realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)

los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de

capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias

en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es

capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87

O O

OH

O

R1

R2

R3


Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad

antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad

frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular

animal88

En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el

disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas

Introduccioacuten

20

enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a

los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo

clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia

gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para

diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples

actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico

Hipoacutetesis y objetivos

21

2 Hipoacutetesis

Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades

antioxidantes

Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido

protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad

de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical

hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora

3 Objetivos

31 Objetivos generales

- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados

cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente

- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de

cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante

diversas teacutecnicas in vitro


22

32 Objetivos especiacuteficos

Objetivos en siacutentesis

- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-

dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-

4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico

Objetivos en electroquiacutemica

- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida

DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso

diferencial (VPD)

Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante

- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-

utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica

- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)

obteniendo su iacutendice ORAC-FL

- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+

) de los compuestos a traveacutes de

la teacutecnica FRAP

- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping

utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)


23

- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos

- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los

compuestos y su actividad antioxidante

Materiales y meacutetodos

24

4 Materiales y meacutetodos

41 Materiales

411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis

Reactivos

- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck

- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich

- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich

- Pirogalol Merck

- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich

- NN-dimetilformamida PA J T Baker

- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich

- Carbonato aacutecido de sodio Merck

- Metanol PA JT Baker

- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck

- Cloroformo PA Merck

- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck

- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker

- Anhiacutedrido aceacutetico Merck

- Hidroacutexido de sodio PA Merck

- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3


25

- Acetona d6 Sigma-Aldrich

- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich

- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich

- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA

Equipamiento

Todo el material de vidrio utilizado fue clase A

- Balanza analiacutetica Precisa 125 A

- Rotavapor Heidolph VV 2000

- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2

- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002

- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus

412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica

Reactivos

- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck

- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich






26

- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck

Equipamiento

- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c

- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm

- Alambre de platino

- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments

- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler

- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf


radicalarias

Reactivos

- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal

disoacutedica) Sigma-Aldrich

- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich

- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich

- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-

Aldrich

- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30

- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich

- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)

- Acetato de sodio Merck


27

- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich

- Hidroacutexido de sodio Merck

- Fosfato diaacutecido de potasio Merck

- Etanol grado HPLC Merck

- Aacutecido aceacutetico glacial Merck

- N-octanol Merck

- Cloruro de zinc Merck

Equipamiento

- Balanza Precisa 40SM-200ordf

- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek

Instruments Inc (Winooski VT USA)

- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad

rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)

- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT

Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA


- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena

- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead


28

42 Meacutetodo

421 Procedimientos de siacutentesis

En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina

mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el

compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los

aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes

aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico

(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)

O

OH

OH

HO

aacutecido 34-dihidroxibenzoico

(aacutecido protocateacutequico)


dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29

Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos

hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute

A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1

Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-

cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la

mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se

tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h

La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con

vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado

con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten

en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta

sinteacutetica se presenta a continuacioacuten


O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30

B Procedimientos de acetilacioacuten

a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2

Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota

de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se

observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia

o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se

recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43


b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6

Seguacuten lo descrito en la literatura89

se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido

cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido

O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31

aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que

con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con

agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con

agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante

La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44

HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6


c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7

Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4

Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al

vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten

global se presenta en la Figura 45


32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7


d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8


Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de

color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura

46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33

C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general

En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90

los

derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada

5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el

aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente

y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un

matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se

agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC

de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar

cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado

prolijamente se filtroacute y secoacute

La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten

del derivado de aacutecido cafeico

Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico

O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34

Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante

el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla

de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se

agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h

Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo

formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua

posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3

a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La

Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada

Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9

O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9

hidroacutelisis baacutesica


35

En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas

hiacutebridas obtenidas

HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5


hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O

30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)

O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica

i) Celda electroquiacutemica

La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono

viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en

puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo

ii) Condiciones de trabajo

Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-

dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las

soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos

continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte

utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten

dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra

iii) Teacutecnicas empleadas

En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y

voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)


38

iv) Caacutelculos

El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el

software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten

Gaussiana (Ecuacioacuten 41)

119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2

1199082 Ecuacioacuten 41

423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de

resonancia de espiacuten electroacutenico

La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las

mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de

electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA

como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical

generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+

el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol

Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM


39

424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies

radicalarias

4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno

(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)

Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron

las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron

las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los

pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron

obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se

adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y

concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la

aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)

dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y

concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL

La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda

fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de

medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda

fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto

Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set


40

de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito

para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda

La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute

utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura

411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final

de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo

de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)

ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42

ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C

Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)


(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B

Materiales y Meacutetodos

41

Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio

Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la

concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de

la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar

Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el

mencionado Iacutendice ORAC

Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab

Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado

0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42

4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro

(FRAP)

Preparacioacuten de soluciones

i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato

Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua

ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute

a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado

ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74

Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de

KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar

iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM

En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua

ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar

iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ

Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten

HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz


43

N

N

N

N

NN


v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)

Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute

constantemente

vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP

Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten

1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz

vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio

Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten

fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y

58 microM


44

Ensayo de capacidad reductora

En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua

ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e

inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+

a Fe3+

en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de

absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor

de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos

para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra

4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica

spin trap

Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las

sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico

(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las

mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del

radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH

metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+

(como en la

metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes

en las estructuras propuestas91ab


45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V

Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se

tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de

solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de

agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute

su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del

radical hidroxilo

4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -

Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que

fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la

reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)


DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo


46


La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono

viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M

inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como

contra-electrodo

ii) Teacutecnica empleada

La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a

velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V

como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92

iii) Experimento

Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-

dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue

HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las

soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente

se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto

observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos

los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa

S) Ipa

0) el que

expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la

concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se


47

obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico

disminuye en un 50 (IA50)

4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)

Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio

celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93

Se emplearon ceacutelulas

EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de

50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo

RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos

fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados

con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino

Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y

10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron

lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de

600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas

a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten

a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de

capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y

el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten

CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43


48

4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos

La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y

distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten

octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas

espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas

Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol

saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se

obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en

estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las

curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada

Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la

fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente

ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44

Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45


49

Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de

la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil

una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo

condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL

4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui

La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el

meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96

Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)

Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales

se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales

Moleculares Frontera (Mulliken MOs)

Resultados y discusioacuten

50

5 Resultados y discusioacuten

51 Siacutentesis de los compuestos

Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y

espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo

4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)

1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686

(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)

13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358

15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas

color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl

4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)

1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -

CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto

878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68

Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular

C14H11O6Cl


51

Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)

1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H

Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13

C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323

14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten

158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6

Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)

1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H

Harom) 13

C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom

12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8

Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)

1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-

775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13

C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913

(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52

4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)

1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-

648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -

OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13

C RMN (DMSO d6 δppm) 6154

10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37

Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula

molecular C19H14O8

4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )

1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-

685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13

C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]

- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre

230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9


53

4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)


(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142

10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-

Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo

opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8


54

52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial

El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante

voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico

de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los

hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas

reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura

51 A y B)97

Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute

que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del

catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)

(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico

cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082

V)

Figura 51 A

Voltamperogramas de pulso

diferencial para los

precursores 1 2 3 y 4 2 mM

en DMF + HFFTBA 02 M

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55

Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11


En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de

oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el

catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute

que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes

como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se

obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal

a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la

sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo

benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito

para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56

Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad

de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de

oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de

comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico

Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se

incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la

velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad

de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal

de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes

positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de

reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se

apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido

de reduccioacuten

Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los

compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de

reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas

con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el

proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de

ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)


57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58

Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3


En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha

estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101

planteaacutendose que la oxidacioacuten en

medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H

+

(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad

y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de

especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos

de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como

resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por

ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en

profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de

00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59

barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la

escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten

de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la

oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas

OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O


Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de

oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de

pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y

potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que

los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y

caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se

realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a

que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido

en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la

velocidad de reaccioacuten


60

La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102

da cuenta de la relacioacuten entre el potencial

de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica

irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887

119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51

Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b

que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida

119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52

La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten

de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia

valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el

caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta

la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados

obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M

Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los

compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118

mVdec)103

para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa

lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)

El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute

contaminado103104

o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica

una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante

de la velocidad)105

De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9

(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212

mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del

18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62

electrodo se contamina (pasiva)106

con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a

la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos

productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo

Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el

logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido

(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056

(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo

La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros

experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102

119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53

Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol

K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa

(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de

Tafel107

(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v

es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre

Ip y vfrac12

da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la

pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta


63

Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12

encontraacutendose para todos los

compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y

099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra

del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto

que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones

poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de

electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada


barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +

HFFTBA 02 M

Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores

constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden

para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados

por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un

0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64

indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b

(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)

En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre

36bull10-6

y 41bull10-6

(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo

nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina

clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal

de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a

la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio

aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-

dihidroxilada 100ab

el aacutecido cafeico101

y la hidroquinona105

que dan cuenta de una sentildeal

en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite

inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-

electroacutenico

Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se

encuentran entre 37bull10-6

y 42bull10-6

como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al

comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce

que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa

tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se

esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la

pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de

Tafel) antes mencionado


65

Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso

electroquiacutemico (Eonset)108109

Este valor indica el potencial inicial con que el primer

electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del

electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta

tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido

aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una

vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la

velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del

intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual

incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se

observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el

aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de

oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor

facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una

correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados

obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en

medio aproacutetico (seccioacuten 6)


66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058

Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten

involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68

en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12

) vs v12

para los compuestos precursores 1 2 3 y

4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que

los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido

como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la

pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo

de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos

ampliamente descritos en la literatura100101105109

y el criterio de diagnoacutestico

mencionado por Pletcher y colaboradores111

Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12

) vs v

12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4


21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69

Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos

redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de

intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un

electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la

deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113

El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de

relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto

por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten

realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el

mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)

frente al anioacuten superoacutexido114

o como en el caso de estudio de las reacciones de

transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab

y otros co-factores

que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras

vegetales (Fotosistema II)116

En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes

profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo

de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales

de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la

serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y

colaboradores117

quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente

sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han

abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos


70

dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118

En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de

tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119

y frente al sistema

enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120

Rhile y colaboradores describen la siacutentesis

caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio

aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del

sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121

junto con

valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se

estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122

El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos

para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en

este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental

como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de

Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en

electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se

puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles


71

53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de

resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)

A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso

electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas

electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su

espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99

en que se

describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la

quelacioacuten con Zn2+

lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior

estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada

compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se

tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo

originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo

diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los

espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas


72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA

Campo Magneacutetico G

3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73


oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+

en DMF +

HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der

en color rojo)

Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una

especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol

presentes en los tres derivados en estudio

En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de

tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y

03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo

benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres

protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10

y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la

3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74

interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo

cumariacutenico


Valores en Gauss

Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G

132 098 030

215 156 -

235 122 -

Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la

oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-

oxidativo para los derivados en estudio

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75

54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies

radicalarias

En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento

de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies

radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo

(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de

los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la

capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in

vitro



El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos

oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo

En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido

a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de

datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de

obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies

EROsERNs123


76

En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno

(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada

de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124

En este trabajo los

autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar

capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del

orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja

unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios

conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125

En el

desarrollo posterior Ou y colaboradores126

proponen una mejora a la teacutecnica

cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-

estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de

hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la

utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio

de polifenoles y sus derivados127-128ab

en diferentes alimentos y bebidas129130

muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131


Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de

cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el

aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes

grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de

absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un

rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos


77

de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y

emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por

efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de

decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en

total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura

512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo

representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea

neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La

Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la

concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada

derivado

Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de


0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78

Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de

competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del

proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el

iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54


En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de

iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores

superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces

mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados

evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de

manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos

hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)

0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta

Concentracioacuten (mM)


79

Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos

estudiados

Compuesto iacutendice ORAC-FL

(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1

Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar

Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido

protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En

el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo

aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque

ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo

aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica

debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor


80

estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el

ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice

ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el

derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del

anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no

ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)

Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un

incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo

cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos

compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL

pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un

derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores

totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los

iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el

fenoacutemeno de sinergia

Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de

ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas

estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos

derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se

obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1


81

Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los

compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un

punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un

ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura

controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a

lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el

anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante

sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su

actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6

La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11

gt 9 gt 10 gt 1 gt 4

Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de

radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten

de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten

de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y

colaboradores 1981)132

120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82

donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los

radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la

reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por

moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri

es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada

con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la

expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6

[ABAP] Ecuacioacuten 55

Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los

resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se

resumen en la Tabla 54

Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a

los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico

estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor

al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten

(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor

complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134

el cual se forma

por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los

segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los

10-6

s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria


83


Compuesto na(plusmnSD) n

1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9

a Valores calculados en triplicado

Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados

cumariacutenicos135

y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar

ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-

PGR)136137


84

542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)

Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138

se propuso como una

medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)

enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos

Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de

plantas medicinales139

alimentos140

compuestos puros141

por mencionar algunos

ejemplos

En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos

polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo

de Fe2+

de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox

entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal

feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el

estatus redox dentro de la ceacutelula

En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en

cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de

hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el

fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos

experimentales obtenidos


85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul

[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+


y el compuesto


Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su

precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de

grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir

electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y

colaboradores142

quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica

sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles

enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales

responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles


86



En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los

resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de

1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el

derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra

Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo

cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie

reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una

disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la

esterificacioacuten

Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra

(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87

Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad

reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute

relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para

precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la

disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad

ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH

que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)

543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping

Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies

paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de

resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por

Zavoisky143

en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso

y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de

capacidad antioxidante en alimentos144

en el anaacutelisis del proceso oxidativo en

liacutepidos145

en el estudio de enfermedades parasitarias146

El creciente intereacutes de la

teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite

discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente

relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147

cuyo desbalance se traduce en cuadros

de estreacutes oxidativo148


88

En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar

la especie radicalaria OHmiddot

mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en

establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap

DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo

(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio

baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab

211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56

En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando

DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo

observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales

espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio

En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de

inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se

ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones

033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor

concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los

siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para

obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se


89

realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos

satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar

caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a

traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En

cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas

correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por

[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo

descrito en la literatura149

para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en

la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta

en color rojo (Figura 516 A-G)

N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90

Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del

compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del

radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2

Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del



3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91

Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del



Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del


3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E

Campo Mgneacutetico G

compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92

Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se

observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-

OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical

hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y

1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)

ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se

habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales

(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93

cumarina + OHbull cumarinabull + H2O

cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]



Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina

precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las

condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90

indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la

literatura para el estaacutendar Trolox

Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al

precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y

colaboradores150

indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de

la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8

que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute

un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en

que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la

inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151


94


Compuesto de inactivacioacuten bullOH

(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a

aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013

Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los

compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del

radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9

s se observa que todos los

compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso

de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en

su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido

4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos


95

anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una

alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de

actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos

candidatos como inactivadores de la especie OH

Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de

reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un

aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de

partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se

encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y

derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical

alrededor del 90


96

544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-

Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se

encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos

medios152

y en muestras como bebidas153

vegetales154

mediciones in situ sobre piel

humana155

por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y

colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la

determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea

ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea

y potenciometriacutea156

las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo

de estudios157158

En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente

al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del

electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica

ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110

y por otros

autores161

Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos

estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del

resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del

iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato

necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es


97

directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo

que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la

especie radical generada in situ



Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a

determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa

SIpa

0) y se graficoacute con respecto a la

concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo

lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y

097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0

Concentracioacuten mM


SIpa

0) vs concentracioacuten de

sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)

Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten

informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten

superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una

mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que

se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera

adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma

anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas

bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el

crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)

Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un

valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y


99

11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su

reactividad frente a la especie radical O2-

Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados

a Valor de estaacutendar Tolox ref 92

El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por

consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie

del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado

(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute

el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor

Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100

requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)

El segundo mejor inactivador de O2-

fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de

0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento

puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su

reactividad en la superficie del electrodo

En este ensayo frente al radical O2-

al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie

OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los

compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden

considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos

fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas

donde participan especies reactivas oxigenadas161162

Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados

y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron

una reactividad superior al estaacutendar Trolox


101

545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)

Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias

presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad

antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento

se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana

celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)

que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los

experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP

(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio

podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados

obtenidos se resumen en la Tabla 58

Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad

baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en

todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a

los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de

compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los

precursores ensayados


102



Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM

1 696plusmn 50 727plusmn 13







En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el

ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos

realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos

se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la

actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual

Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a

seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute

su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual

presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores


103

aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie

(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado

555 Estudio de hidrofobicidad relativa

En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las

propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse

mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta

resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre

otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas

computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD

obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras

semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute

calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad

razonable163

En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y

11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener

una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su

lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y

ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase

estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase


104

acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten

entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes

afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute

maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los

tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden

relativo de lipofilia fue el siguiente


compuestos

Compuesto Tiempo de retencioacuten

(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695

La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su

precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de

retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto

que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble

enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a


105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el

sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las

estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor

valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico

que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica

9 1 11 10


Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el

valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164

y

se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en

concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522

Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten


106




Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo

de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos

valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10

y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue

el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un

valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo

el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de

CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una

lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos

de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107

semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de

logD debido a su menor lipofilia

Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que

afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos

factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno

observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas

estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico

involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas

biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165

Otro factor presente es la

existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de

las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros

oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como

amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y

aacutecido) 166

Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se

emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible

que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e

interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de

citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no

bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que

involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento


108

anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables

asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la

simplicidad o lo acotado del mismo

556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice

de Fukui

Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los

distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0

relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio

correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk

+(Ecuacioacuten

57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio

teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles

rutina y quercetina167

1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57

Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que

participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis

resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas

complejas con diversos centros reactivos168

Los resultados obtenidos indican que en


109

la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en

posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0

(0071) por otra parte no se observaron

cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11

para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad

antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una

disminucioacuten en su reactividad (fk0

O7 = 00078 y fk0

O8 = 00021) haciendo menos

probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)

Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio

maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico

(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4

(fk0

O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los

compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico

conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En

las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el

precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11


110


Compuesto Iacutendice de Fukui

fk0

Iacutendice de Fukui

fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113

6 Discusioacuten General

Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las

siguientes evidencias teoacutericas y experimentales

En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-

oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos

ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica

Ipa vs vfrac12

indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los

derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo

mecanismo

Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante

oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los

respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas

En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local

encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash

permitioacute

identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto

las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder

electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas

en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a

aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder


114

electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con

menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan

mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11

mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad

electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor

densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH

presentan el mayor valor de fk-

Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito

con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de

acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos

catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se

inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico

realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH

ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash

00779 y 00890

respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con

una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y

6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica

que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en

posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716

respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido

protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual

forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta


115

informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en

posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)

Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se

puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente

soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le

confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como

intermediario en el proceso oxidativo

Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas

en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la

visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de

estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el

Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una

viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se

obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se

transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que

considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto

a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa

electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un

H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)

En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la

pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que


116

el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es

por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117

Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite

comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes

metodologiacuteas empleadas

En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta

investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con

distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte

que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies

radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el

ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron

valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor

cumariacutenico de forma individual

Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los

conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos

ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten

que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la

moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente

al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y

el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta

(10-9

s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes

reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como

reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que

tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical


118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM

1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007

2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006



9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011

10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004

11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002

Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de

actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para

sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten

superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron

resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9

y 11


119

En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros

antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en

algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo

que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para

aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en

medios no acuosos169170

investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los

denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172

los que han demostrado ser eficientes

como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo

realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico

que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso

de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173

Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los

aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas

caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash

OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia

de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174

Al apreciar las estructuras de los

derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los

aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha

sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente

a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de

4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de


120

actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten

con lo descrito por algunos autores175176

Junto con lo anterior se forma un eacutester de

aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo

disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor

estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el

ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a

considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-

Evans175

y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el

anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante

de un derivado polifenoacutelico

Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo

fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito

para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la

diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del

doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical

formado

El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0

-relacionado con los fenoacutemenos

de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados

donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta

actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la

cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el


121

ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del

anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las

simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)

donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el

anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el

doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario

de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el

heterociclo cumariacutenico

Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados

polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores

obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este

resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una

especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-

del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9

s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se

obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores

Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el

ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio

aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-

se puede establecer

una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el

valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el


122

potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al

anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset

para este ensayo



Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos

implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga

electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para

este ensayo

Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50

de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico

y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia

049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123

encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la

pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre

el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie

radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia

de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a

diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de

dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de

compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que

ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por

ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado

El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones

experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de

inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se

descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una

diferencia significativa entre los compuestos

Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante

celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que

esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a

la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias

observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no

se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula


124

versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran

principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos

hacia el interior de la ceacutelula

Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar

numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de

modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative

Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de

propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas

polifenoles177

El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios

celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de

permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)

dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las

moleacuteculas163

Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre

34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso

no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que

estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163

_que no es el caso de estos derivados-

Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple

sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies

radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas


125

bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el

descrito173

para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito

Conclusiones

126

7 Conclusiones

La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de

resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies

radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo

La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de

resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las

moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten

ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso

oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico

La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute

un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos

No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre

las distintas metodologiacuteas empleadas

Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten

electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten

superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la

reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica

estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad

De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la

hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados

Conclusiones

127

propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en

medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas

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in Oxidative Stress I Humana Press New York USA DOI 101007978-1-

60327-517-0_16

i


FACULTAD DE CIENCIAS QUIacuteMICAS Y FARMACEacuteUTICAS

INFORME DE APROBACIOacuteN TESIS DE DOCTORADO

Se informa a la Comisioacuten de Postgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y

Farmaceacuteuticas que la Tesis de Doctorado presentada por la Candidata


ha sido aprobada por la Comisioacuten Evaluadora de Tesis como requisito para obtener el

grado de Doctora en Quiacutemica en el examen de defensa de Tesis rendido el helliphelliphellipde

Diciembre de 2016

Directores de Tesis


Prof Dr Juan Arturo Squella S helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Patricio A Navarrete E helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Comisioacuten Evaluadora de Tesis

Prof Dr Antonio Zanocco Loyola (Presidente) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Dr Claudio Olea Azar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Dra Mariacutea Soledad Ureta Zantildeartu helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Prof Dr David Pessoa Mahanna helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

ii





iii










iv



agradecimiento




































v






















vi

INDICE


















vii























viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

129


1944














Res vol67 pp 1092- 10972008













6 ndeg 4 pp 710-714 2009

Bibliografiacutea

130






2010









pp 321-327 2009









1095ndash1106 2005








Bibliografiacutea

131




2015



























Bibliografiacutea

132


2015



















Res Rev vol 23 no 3 pp 322-345 2003









Bibliografiacutea

133







1471 2007






pp1821-1835 2011



cap1 pp1-36 2009





pp501ndash512 2003








Bibliografiacutea

134










632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







2005



Bibliografiacutea

135





258-265 2014





pp 232-244 2011














2004





Bibliografiacutea

136






2009



10 pp 632-646 2010




pp 97minus802 2014













vol14 pp 1483-1494 2009




Bibliografiacutea

137


















300-306 2006











Bibliografiacutea

138



8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



pp 2401-2404 1978




Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



pp 8896-8907 2007



Bibliografiacutea

139






New York 2001







357 pp 2027ndash2037 2004

















Bibliografiacutea

140





























12601-12609 1997

Bibliografiacutea

141



vol 63 ndeg12 pp 967-973 2015











8185ndash8190 2008






2010



vol 43 ndeg7 pp 1019 2010




pp 6075ndash6088 2006




Bibliografiacutea

142



2005




























pp 3273minus3279 2003

Bibliografiacutea

143




















57955 2016










ndeg 1 pp 119-123 2015

Bibliografiacutea

144



67 pp 958-963 2013





pp 963-968 2015



2006




1328-1336 2005






pp 114ndash142 2011











Bibliografiacutea

145













vol 121 pp 820ndash825 2010








pp 162ndash167 2006











Bibliografiacutea

146




pp157-160 2003




21 pp1-9 2008













143 2011



82 pp 1668 2004



361 2015




101111jphp12382 2014

Bibliografiacutea

147




101039C6FO00466K 2016



478 2016




852 2015



314ndash318 2012



vol53 pp1750minus1756 2005



20 ndeg 7 pp 933-956 1996








60327-517-0_16

ii





iii










iv



agradecimiento




































v






















vi

INDICE


















vii























viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

129


1944














Res vol67 pp 1092- 10972008













6 ndeg 4 pp 710-714 2009

Bibliografiacutea

130






2010









pp 321-327 2009









1095ndash1106 2005








Bibliografiacutea

131




2015



























Bibliografiacutea

132


2015



















Res Rev vol 23 no 3 pp 322-345 2003









Bibliografiacutea

133







1471 2007






pp1821-1835 2011



cap1 pp1-36 2009





pp501ndash512 2003








Bibliografiacutea

134










632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







2005



Bibliografiacutea

135





258-265 2014





pp 232-244 2011














2004





Bibliografiacutea

136






2009



10 pp 632-646 2010




pp 97minus802 2014













vol14 pp 1483-1494 2009




Bibliografiacutea

137


















300-306 2006











Bibliografiacutea

138



8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



pp 2401-2404 1978




Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



pp 8896-8907 2007



Bibliografiacutea

139






New York 2001







357 pp 2027ndash2037 2004

















Bibliografiacutea

140





























12601-12609 1997

Bibliografiacutea

141



vol 63 ndeg12 pp 967-973 2015











8185ndash8190 2008






2010



vol 43 ndeg7 pp 1019 2010




pp 6075ndash6088 2006




Bibliografiacutea

142



2005




























pp 3273minus3279 2003

Bibliografiacutea

143




















57955 2016










ndeg 1 pp 119-123 2015

Bibliografiacutea

144



67 pp 958-963 2013





pp 963-968 2015



2006




1328-1336 2005






pp 114ndash142 2011











Bibliografiacutea

145













vol 121 pp 820ndash825 2010








pp 162ndash167 2006











Bibliografiacutea

146




pp157-160 2003




21 pp1-9 2008













143 2011



82 pp 1668 2004



361 2015




101111jphp12382 2014

Bibliografiacutea

147




101039C6FO00466K 2016



478 2016




852 2015



314ndash318 2012



vol53 pp1750minus1756 2005



20 ndeg 7 pp 933-956 1996








60327-517-0_16

iii










iv



agradecimiento




































v






















vi

INDICE


















vii























viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

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1944














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133







1471 2007






pp1821-1835 2011



cap1 pp1-36 2009





pp501ndash512 2003








Bibliografiacutea

134










632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







2005



Bibliografiacutea

135





258-265 2014





pp 232-244 2011














2004





Bibliografiacutea

136






2009



10 pp 632-646 2010




pp 97minus802 2014













vol14 pp 1483-1494 2009




Bibliografiacutea

137


















300-306 2006











Bibliografiacutea

138



8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



pp 2401-2404 1978




Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



pp 8896-8907 2007



Bibliografiacutea

139






New York 2001







357 pp 2027ndash2037 2004

















Bibliografiacutea

140





























12601-12609 1997

Bibliografiacutea

141



vol 63 ndeg12 pp 967-973 2015











8185ndash8190 2008






2010



vol 43 ndeg7 pp 1019 2010




pp 6075ndash6088 2006




Bibliografiacutea

142



2005




























pp 3273minus3279 2003

Bibliografiacutea

143




















57955 2016










ndeg 1 pp 119-123 2015

Bibliografiacutea

144



67 pp 958-963 2013





pp 963-968 2015



2006




1328-1336 2005






pp 114ndash142 2011











Bibliografiacutea

145













vol 121 pp 820ndash825 2010








pp 162ndash167 2006











Bibliografiacutea

146




pp157-160 2003




21 pp1-9 2008













143 2011



82 pp 1668 2004



361 2015




101111jphp12382 2014

Bibliografiacutea

147




101039C6FO00466K 2016



478 2016




852 2015



314ndash318 2012



vol53 pp1750minus1756 2005



20 ndeg 7 pp 933-956 1996








60327-517-0_16

iv



agradecimiento




































v






















vi

INDICE


















vii























viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

129


1944














Res vol67 pp 1092- 10972008













6 ndeg 4 pp 710-714 2009

Bibliografiacutea

130






2010









pp 321-327 2009









1095ndash1106 2005








Bibliografiacutea

131




2015



























Bibliografiacutea

132


2015



















Res Rev vol 23 no 3 pp 322-345 2003









Bibliografiacutea

133







1471 2007






pp1821-1835 2011



cap1 pp1-36 2009





pp501ndash512 2003








Bibliografiacutea

134










632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







2005



Bibliografiacutea

135





258-265 2014





pp 232-244 2011














2004





Bibliografiacutea

136






2009



10 pp 632-646 2010




pp 97minus802 2014













vol14 pp 1483-1494 2009




Bibliografiacutea

137


















300-306 2006











Bibliografiacutea

138



8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



pp 2401-2404 1978




Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



pp 8896-8907 2007



Bibliografiacutea

139






New York 2001







357 pp 2027ndash2037 2004

















Bibliografiacutea

140





























12601-12609 1997

Bibliografiacutea

141



vol 63 ndeg12 pp 967-973 2015











8185ndash8190 2008






2010



vol 43 ndeg7 pp 1019 2010




pp 6075ndash6088 2006




Bibliografiacutea

142



2005




























pp 3273minus3279 2003

Bibliografiacutea

143




















57955 2016










ndeg 1 pp 119-123 2015

Bibliografiacutea

144



67 pp 958-963 2013





pp 963-968 2015



2006




1328-1336 2005






pp 114ndash142 2011











Bibliografiacutea

145













vol 121 pp 820ndash825 2010








pp 162ndash167 2006











Bibliografiacutea

146




pp157-160 2003




21 pp1-9 2008













143 2011



82 pp 1668 2004



361 2015




101111jphp12382 2014

Bibliografiacutea

147




101039C6FO00466K 2016



478 2016




852 2015



314ndash318 2012



vol53 pp1750minus1756 2005



20 ndeg 7 pp 933-956 1996








60327-517-0_16

v






















vi

INDICE


















vii























viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

129


1944














Res vol67 pp 1092- 10972008













6 ndeg 4 pp 710-714 2009

Bibliografiacutea

130






2010









pp 321-327 2009









1095ndash1106 2005








Bibliografiacutea

131




2015



























Bibliografiacutea

132


2015



















Res Rev vol 23 no 3 pp 322-345 2003









Bibliografiacutea

133







1471 2007






pp1821-1835 2011



cap1 pp1-36 2009





pp501ndash512 2003








Bibliografiacutea

134










632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







2005



Bibliografiacutea

135





258-265 2014





pp 232-244 2011














2004





Bibliografiacutea

136






2009



10 pp 632-646 2010




pp 97minus802 2014













vol14 pp 1483-1494 2009




Bibliografiacutea

137


















300-306 2006











Bibliografiacutea

138



8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



pp 2401-2404 1978




Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



pp 8896-8907 2007



Bibliografiacutea

139






New York 2001







357 pp 2027ndash2037 2004

















Bibliografiacutea

140





























12601-12609 1997

Bibliografiacutea

141



vol 63 ndeg12 pp 967-973 2015











8185ndash8190 2008






2010



vol 43 ndeg7 pp 1019 2010




pp 6075ndash6088 2006




Bibliografiacutea

142



2005




























pp 3273minus3279 2003

Bibliografiacutea

143




















57955 2016










ndeg 1 pp 119-123 2015

Bibliografiacutea

144



67 pp 958-963 2013





pp 963-968 2015



2006




1328-1336 2005






pp 114ndash142 2011











Bibliografiacutea

145













vol 121 pp 820ndash825 2010








pp 162ndash167 2006











Bibliografiacutea

146




pp157-160 2003




21 pp1-9 2008













143 2011



82 pp 1668 2004



361 2015




101111jphp12382 2014

Bibliografiacutea

147




101039C6FO00466K 2016



478 2016




852 2015



314ndash318 2012



vol53 pp1750minus1756 2005



20 ndeg 7 pp 933-956 1996








60327-517-0_16

vi

INDICE


















vii























viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

129


1944














Res vol67 pp 1092- 10972008













6 ndeg 4 pp 710-714 2009

Bibliografiacutea

130






2010









pp 321-327 2009









1095ndash1106 2005








Bibliografiacutea

131




2015



























Bibliografiacutea

132


2015



















Res Rev vol 23 no 3 pp 322-345 2003









Bibliografiacutea

133







1471 2007






pp1821-1835 2011



cap1 pp1-36 2009





pp501ndash512 2003








Bibliografiacutea

134










632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







2005



Bibliografiacutea

135





258-265 2014





pp 232-244 2011














2004





Bibliografiacutea

136






2009



10 pp 632-646 2010




pp 97minus802 2014













vol14 pp 1483-1494 2009




Bibliografiacutea

137


















300-306 2006











Bibliografiacutea

138



8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



pp 2401-2404 1978




Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



pp 8896-8907 2007



Bibliografiacutea

139






New York 2001







357 pp 2027ndash2037 2004

















Bibliografiacutea

140





























12601-12609 1997

Bibliografiacutea

141



vol 63 ndeg12 pp 967-973 2015











8185ndash8190 2008






2010



vol 43 ndeg7 pp 1019 2010




pp 6075ndash6088 2006




Bibliografiacutea

142



2005




























pp 3273minus3279 2003

Bibliografiacutea

143




















57955 2016










ndeg 1 pp 119-123 2015

Bibliografiacutea

144



67 pp 958-963 2013





pp 963-968 2015



2006




1328-1336 2005






pp 114ndash142 2011











Bibliografiacutea

145













vol 121 pp 820ndash825 2010








pp 162ndash167 2006











Bibliografiacutea

146




pp157-160 2003




21 pp1-9 2008













143 2011



82 pp 1668 2004



361 2015




101111jphp12382 2014

Bibliografiacutea

147




101039C6FO00466K 2016



478 2016




852 2015



314ndash318 2012



vol53 pp1750minus1756 2005



20 ndeg 7 pp 933-956 1996








60327-517-0_16

vii























viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

129


1944














Res vol67 pp 1092- 10972008













6 ndeg 4 pp 710-714 2009

Bibliografiacutea

130






2010









pp 321-327 2009









1095ndash1106 2005








Bibliografiacutea

131




2015



























Bibliografiacutea

132


2015



















Res Rev vol 23 no 3 pp 322-345 2003









Bibliografiacutea

133







1471 2007






pp1821-1835 2011



cap1 pp1-36 2009





pp501ndash512 2003








Bibliografiacutea

134










632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







2005



Bibliografiacutea

135





258-265 2014





pp 232-244 2011














2004





Bibliografiacutea

136






2009



10 pp 632-646 2010




pp 97minus802 2014













vol14 pp 1483-1494 2009




Bibliografiacutea

137


















300-306 2006











Bibliografiacutea

138



8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



pp 2401-2404 1978




Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



pp 8896-8907 2007



Bibliografiacutea

139






New York 2001







357 pp 2027ndash2037 2004

















Bibliografiacutea

140





























12601-12609 1997

Bibliografiacutea

141



vol 63 ndeg12 pp 967-973 2015











8185ndash8190 2008






2010



vol 43 ndeg7 pp 1019 2010




pp 6075ndash6088 2006




Bibliografiacutea

142



2005




























pp 3273minus3279 2003

Bibliografiacutea

143




















57955 2016










ndeg 1 pp 119-123 2015

Bibliografiacutea

144



67 pp 958-963 2013





pp 963-968 2015



2006




1328-1336 2005






pp 114ndash142 2011











Bibliografiacutea

145













vol 121 pp 820ndash825 2010








pp 162ndash167 2006











Bibliografiacutea

146




pp157-160 2003




21 pp1-9 2008













143 2011



82 pp 1668 2004



361 2015




101111jphp12382 2014

Bibliografiacutea

147




101039C6FO00466K 2016



478 2016




852 2015



314ndash318 2012



vol53 pp1750minus1756 2005



20 ndeg 7 pp 933-956 1996








60327-517-0_16

viii























ix





x


Figuras








Gnidia socotrana





dihidroxicumarina







xi









(Trolox)

















DMF + HFFTBA 02 M

xii



DMF + HFFTBA 02 M





vs v12





en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA


rojo)



en DMF+HFFTBA (izq)






y el compuesto



simulado (derecha)

xiii




















S Ipa










xiv





oxidativo en etapas



xv

Tablas




Valores en Gauss










compuestos




xvi










disoacutedica)









xvii

















xviii

RESUMEN















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xix



proceso oxidativo















xx

SUMMARY















OOH

HO O

Cl

HO

OOH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

HO

OO

OHHO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

xxi


place












Introduccioacuten

1

1 Introduccioacuten

11 Cumarinas

111 Origen vegetal










patoacutegenos34

O O

3

45

6

7

81

2


Introduccioacuten

2




A partir
















Pechmann10



Introduccioacuten

3






entre otras














y Reformatsky20



OH

+

OEt

O O H2SO4

O O

Introduccioacuten

4



solventes22











antioxidante





Introduccioacuten

5



OOOO

OH HO






se ha










Introduccioacuten

6


















inclusive con



Introduccioacuten

7

principio activo25a






O OO

O

O

OO









Introduccioacuten

8




entre otras
















Introduccioacuten

9















121 Origen vegetal





Introduccioacuten

10






















Introduccioacuten

11






Compuestos como la















Introduccioacuten

12























Introduccioacuten

13




el Alzheimer62



















Introduccioacuten

14













trioxaquinas70






Allen y

colaboradores73




Introduccioacuten

15























(Figura 15)

Introduccioacuten

16

O

OH

HO O

OH

O

O

OH


Gnidia socotrana






muerte celular80

O

HN

OH

O

OH

O

O

MeOO

H2N

HO



Introduccioacuten

17







moleacutecula81













Introduccioacuten

18


actualidad


















Introduccioacuten

19







O O

OH

O

R1

R2

R3





animal88



Introduccioacuten

20








21

2 Hipoacutetesis


antioxidantes





3 Objetivos








22









diferencial (VPD)












23





24


41 Materiales


Reactivos




- Pirogalol Merck






- Acetona PA Merck

- Etanol PA Merck








25





Equipamiento








Reactivos








26


Equipamiento








radicalarias

Reactivos






Aldrich






27






- N-octanol Merck


Equipamiento












28

42 Meacutetodo








O

OH

OH

HO




dihidroxicumarina

OH

OH

O

HO

O

OH

OH

HO

OH


29














O

OH

OH O

Cl

HO

OH

OH

OEt

Cl

O O

+

H2SO4

1 h

1


30













O

OH

HO O

Cl

Ac2O H2SO4

45 degC 30 min

O

O

O O

Cl

5

O

O


31






HO

HO

OH

O

O

O O

NaOH 30 min

AcO

AcO

OH

O

6








32

O

HO

HO

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

AcO

AcO

OAc

OH

7






46

O

OH

OH

OHO

O O

H2SO4 30 min

O

OAc

OAc

OH

8



33



los













O

OAc

OAc O

Cl

OAc

OAc

HO

O

+ DBU

DMF seco

O

OAc

OAc O

OAc

OAc

O

O


34











O

OAc

AcO O

OAc

OAc

O

O N2 tdeg amb

O

OH

HO O

OH

OH

O

O

9



35



HO

O

OH

OH4

OH

OH

HO

O

OH

3

OH

OH

HO

O

2

O

OH

HO O

Cl1

ii

HO

O

OAc

OAc8

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

O

OAc

AcO O

Cl5




O

OH

HO O

Cl

HO

OH

OH

OEtCl

O O

+

1

i


36

HO

OOAc

OAc

OAc

OAc

HO

O

OAc

7

OAc

OAc

HO

O

6

OOH

HO O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

9

10

11

OOAc

AcO O

Cl5

iiiiv

8




37

















38

iv) Caacutelculos




119910 = 1199100 + 119860

119908 radic120587 119890

minus2(119909minus119909119888)2












39


radicalarias



















40









ONaO O

ONa

O

A

O

HO

OH

O

C



(Trolox)

-Cl H2N+

NH2

N

N+NH2 Cl-

NH2

B


41









0 1000 2000 3000 400000

02

04

06

08

10

ABCneta

Antioxidante

Blanco

F

F0

Tiempo s


42


(FRAP)
















43

N

N

N

N

NN




constantemente







58 microM


44





a Fe3+






spin trap







(como en la




45

-10 -08 -06 -04

Ipa0

O2 + e

- O

2

-

O2

-O

2 + e

-

10 A

E vs Ag|AgCl V






radical hidroxilo








46





contra-electrodo





iii) Experimento








S) Ipa

0) el que




47






















48













ecuacioacuten

119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897

[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44


119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897



49













50








13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358






878)13

C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549

11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68


C14H11O6Cl


51




C RMN

(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323





Harom) 13


12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66


C13H12O8



775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13


(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61


C11H10O6


52




OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13


10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292

14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371

[M+H]+ 369 [M-H]

- 181 [M+H]

+ 163 [M-H2O+H]

+ 145 [M-H2O+H]

+ 135 [M-

HCOOH+H]+ 179 [M-H]

- 161 [M-H2O-H]

- 135 [M-CO2-H]

-Rendimiento 37


molecular C19H14O8




C RMN

(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292

13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz

361 [M+H]+ 359 [M-H]

- 171 [M+H]

+ 153 [M-H2O+H]

+ 125 [M-CO2H+H]

+ 169

[M-H]- 125 [M-CO2-H]




53





10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343

14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-

H]- 137 [M-H2O+H]

+ 109 [M-HCOOH+H]

+ 153 [M-H]

- 108 [M-CO2-H]

-




54







51 A y B)97






V)

Figura 51 A





00 03 06 09 12 15 18 21 24

OO H

O H

H O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OOH

OH O

Cl

A

2A

E vs Ag|AgCl V

1

2

3

4


55












para 11

00 03 06 09 12 15 18 21 24

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OH O O

O

OO H

O H

O H

OOH

OH O

OH

OH

O

O

B

E vs Ag|AgCl V

9

10

11

2A


56













de reduccioacuten








57





-03 00 03 06 09 12 15

A

II

I

OOH

OH O

OH

OH

O

O

100 A

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

03 06 09 12 15

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

0 V - 13 V

0 V - 06 V

00 03 06 09 12 15 18

A

II

I

I

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

3 Vs

005 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12

B

II

I

E vs Ag|AgCl V

-02 V - 06 V

-02 V - 11 V


58







+








00 03 06 09 12 15

I

II

I

A

100 A

OHO O

O

OOH

OH

OH

005 Vs

3 Vs

E vs Ag|AgCl V

00 03 06 09 12 15

II

I

IB

E vs Ag|AgCl V

-01 V - 07 V

-01 V - 14 V


59





OH

OH-2e- -2H+

2e- 2H+

O

O













60




irreversible

119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887

2[104 minus log (

119887




119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887

2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52






obtenidos


61


DMF + HFFTBA 02 M



mVdec)103




contaminado103104



de la velocidad)105




18 21 24 27 30 33 36

090

093

096

099

102

105

OOH

OH O

OH

OH

O

O

r = 098638

m = 008548

Ep

a1 (

V)

logv (mV12

s-12

)


62











119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879

119887 119865)

12

11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53




Tafel107



Ip y vfrac12




63











HFFTBA 02 M





0 10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

Ipa (

A)

V12

(mV12

s-12

)

OOH

OH

HO

m = 40 10-6

r = 099988


64




36bull10-6

y 41bull10-6







dihidroxilada 100ab






electroacutenico



y 42bull10-6









65




















66




-05 00 05 10 15 20

20 A

Eonset

E vs Ag|AgCl (V)

15 18 21 24 27 30 33 3606

07

08

09

10

11

12

OOH

OH

HO

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

HO O

Cl

Eon

set

(V)

logv (mV12

s-12

)


67



Compuesto

119837119845119848119840119816119849119834120783

119837119845119848119840119855 (microAmVs

-1)

119837119816119849119834120783 119837119855120783120784

(microAmV12

s-12

)

119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

119835 = 120784 119837119812119849119834120783

119837119845119848119840119855

(mVdec)

Eionset

(mV)

056 36bull10-6

61 122 059

053 41bull10

-6 106 212 059

048 36bull10-6

55 110 050

O

OH

OH

HO

052 41bull10-6

44 88 079

047 40bull10-6

85 170 064

049 37bull10-6

67 134 075

044

42bull10-6

70 140 058



OHO O

O

OOH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

O

HO

O

OH

HO O

Cl


68


) vs v12











) vs v



21 28 35 42 49 5626

28

30

32

34O

OH

OH

HO

r = -099302

V12

(mV12

s-12

)

Ipa

V12 (

A

mV

12s-1

2)


69














y otros co-factores








colaboradores117





70




y frente al sistema






junto con











71







en que se











72



en DMF + HFFTBA


rojo)



en DMF + HFFTBA


rojo)

3440 3450 3460 3470 3480 3490

O

OH

HO O

OH

OH

O

OA


3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

B



73



en DMF +


en color rojo)










3440 3450 3460 3470 3480 3490

OHO O

O

OOH

OH

OH

C



74


cumariacutenico


Valores en Gauss


132 098 030

215 156 -

235 122 -




O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH


75


radicalarias







vitro









EROsERNs123


76




En este trabajo los






En el


















77











derivado



0 2000 4000 6000

02

04

06

08

10

F

F0

Tiempo (s)

control

16 M

12 M

081 M

045 M

020 M


78













0 1 2 3 4 50

1000

2000

3000

4000

r = 099309

AB

C n

eta



79


estudiados


(plusmnSD)

1 091 plusmn 010

2 347 plusmn 010

3 391 plusmn 009

4 069 plusmn 001

9 239 plusmn 003

10 174 plusmn 005

11 262 plusmn 004

Trolox 1










80






















81

















120591 = 119899 [119860119903119874119867]



82







expresioacuten133

Ri = 136 bull 10-6











el cual se forma



10-6



83



1 28 plusmn 03 3

2 39 plusmn 01 4

3 141 plusmn 14 14

4 24 plusmn 01 3

9 58 plusmn 04 6

10 49 plusmn 01 5

11 86 plusmn 01 9



cumariacutenicos135



PGR)136137


84



se propuso como una





alimentos140

compuestos puros141


ejemplos



de Fe2+











85

NN

NN

Fe 3+N

N

N

N

N

N

NN

NN

NN

Fe2+N

N

N

N

N

N

NN

Antioxidante

amarilloazul



y el compuesto






colaboradores142






86











esterificacioacuten


(plusmnSD)

1 1302 plusmn 197

2 2727 plusmn 321

3 4768 plusmn 215

4 868 plusmn 93

9 2052 plusmn 186

10 3182 plusmn 681

11 2624 plusmn 335


87












Zavoisky143





liacutepidos145









88





















89












N+

O-

+ OHN

O

OH


simulado (derecha)


90







3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

B


compuesto 2

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

C


compuesto 3

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

D


compuesto 4

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

A


compuesto 1

control


91






3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

G


compuesto 11

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

E


compuesto 9

control

3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

F


compuesto 10

control


92








(Figura 518)




3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540

DMPO oxidado

N+

O-

+ OHNO

OH



93












colaboradores150








94



(plusmnSD)

1 923 plusmn 74

2 983 plusmn 27

3 995 plusmn 08

4 927 plusmn 29

9 981 plusmn 18

10 982 plusmn 25

11 980 plusmn 99

Trolox 31plusmn 25a











95











alrededor del 90


96




medios152


vegetales154


humana155







de estudios157158





y por otros

autores161







97








SIpa




097267

-10 -08 -06 -04 -02

Ipa0

10A

blanco

0049 mM

0099 mM

0149 mM

0199 mM

0249 mM

0299 mM

E vs Ag|AgCl V


98

007 014 021 02800

03

06

09

r = 099074

IA 50

(Ip

a0-

Ipa

S)

Ip

a0



SIpa















99










Compuesto IA 50 mM

(plusmnSD)

1 0183 plusmn 0007

2 0125 plusmn 0006

3 0104 plusmn 0004

4 0115 plusmn 0005

9 0141 plusmn 0011

10 0064 plusmn 0004

11 0137 plusmn 0002

Troloxa

197


100


















101



















102





















103













razonable163








104








compuestos


(min)

1 5138

9 5760

10 4031

11 4695







105

O

OH

HO O

Cl

O

OH

OH O

OH

OH

O

O

OHO O

O

O

OH

OH

OH

OH

OHO O

O

OOH

OH

OH






9 1 11 10




y





106














-3 -2 -1 0 1 2 3 4

20

40

60

80

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

OOH

HO O

Cl

OHO O

O

OOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

O

O

logDteor

C

AC

(1

0

32

4


107















aacutecido) 166









108





de Fukui





+(Ecuacioacuten




1198911198960 =

119891119896minus+ 119891119896

+

2 Ecuacioacuten 57







109








O7 = 00078 y fk0






(fk0







110



fk0


fk-

O7 00771

O7 01373

O8 00391

O8 00757

O7 00078 O7 00072

O8 00021 O8 00036

O3 00389 O3 00779

O4 00489 O4 00890

O7 00719 O7 01276

O8 00365 O8 00716

O3 00025 O3 00050

O4 00025 O4 00049

O5 00002 O5 00004

O7 00739 O7 01316

O8 00378 O8 00742

O3 00004 O3 00008

O4 00003 O4 00005

OHO O

O

OOH

OH

OH

7

8

3

4

OHO O

O

OOH

OH

OH

OH

7

8

3

4

5

OOH

HO O

OH

OH

O

O

7

8

3

4

O

OH

HO O

Cl

7

8


111

OOH

OHO

Cl


OOH

OH O

OH

OH

O

O



112


OHO O

O

OOH

OH

OH


OHO O

O

OOH

OH

OH

OH


113







Ipa vs vfrac12



mecanismo






permitioacute







114















00779 y 00890










115























116


por etapas

OH

HO

OH

HO

O

HO

O-

HO

-e- + B

+e- + HB+

+ B-e-

+e-

+e-

-e-

+ HB+

+ B

+HB+



OH

HO - e

+ e

OH

HO

-H+

O

HO


oxidativo en etapas


117



















(10-9






118



Compuesto ORAC-FL

FRAP

eq Trolox

10 microM

inactivacioacuten

OHmiddot

CAC

1 microM 10 microM

O2-

IA 50 mM













y 11


119


























120









Evans175









formado








121




















se puede establecer




122



para este ensayo






este ensayo




049 056 063 070 077

006

009

012

015

018

11

3

1

42

9

10

Eonset

vs Ag|AgCl V

IA50

mM


123























124









polifenoles177





moleacuteculas163










125


descrito173


Conclusiones

126

7 Conclusiones




















Conclusiones

127



Bibliografiacutea

128

8 Bibliografiacutea









2006



















Bibliografiacutea

129


1944














Res vol67 pp 1092- 10972008













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Bibliografiacutea

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1095ndash1106 2005








Bibliografiacutea

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cap1 pp1-36 2009





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632959 doi1011552012632959






Rev vol 253 pp 2665ndash2685 2009




1813 2007







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258-265 2014





pp 232-244 2011














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Bibliografiacutea

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300-306 2006











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8397-8404 2014





6136minus6145 2013




2011



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Chem vol 47 pp 4653-4356 1999







1103 2008



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60327-517-0_16

karina angÉlica pÉrez cruz

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