jornadas de actualizaciones en hematologÍa: actualizaciÓn de la lma hospital universitario la fe 6...

JORNADAS DE ACTUALIZACIONES JORNADAS DE ACTUALIZACIONES EN HEMATOLOGÍA: EN HEMATOLOGÍA:

ACTUALIZACIÓN DE LA LMAACTUALIZACIÓN DE LA LMA

Hospital Universitario La FeHospital Universitario La Fe

6 a 8 de Mayo de 20086 a 8 de Mayo de 2008

CARACTERIZACIÓN DE LAS CARACTERIZACIÓN DE LAS

LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDASLEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS

Hospital Universitario La FeHospital Universitario La Fe

6 de Mayo de 20086 de Mayo de 2008

Lourdes Cordón

Lab. Citometría de Flujo

Servicio de Hematología y Hemoterapia

Hospital Universitario La Fe

Valencia, 6 de mayo de 200810 10 10 10 100 1 2 3 4

JESUS CERVERO LLACER MO.001CD45 APC ->

CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA

CARACTERIZACIÓN DE LA LMA CARACTERIZACIÓN DE LA LMA

CITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO

Análisis multiparamétrico.Proporciona información sobre:

- Tamaño (FSC) y complejidad (SSC) de las células.- Expresión de antígenos.

0 256 512 768 1024

J ORDI BONILLO ALOY PL D.S..115FSC-Height ->

0 256 512 768 1024

JOAE MANUEL SOBEJANO LOPEZ.012FSC-Height ->

CITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO

10 10 10 10 100 1 2 3 4

JOAE MANUEL SOBEJANO LOPEZ.012CD45 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4


DIAGNÓSTICO DE LA LMADIAGNÓSTICO DE LA LMA

CLÍNICA

CITOGENÉTICA + FISH

BIOLOGÍA MOLECULAR

MORFOLOGÍA

CITOQUÍMICA

CITOMETRÍA DE FLUJO

DIAGNÓSTICO

VENTAJAS DE LA CMF EN EL DIAGNÓSTICO VENTAJAS DE LA CMF EN EL DIAGNÓSTICO DE LA LMADE LA LMA

- Rapidez.- Especificidad.- Elevada sensibilidad (10-4 ó 10-5).- Análisis objetivo y reproducible.

OBJETIVOS DE LA CFM EN LMAOBJETIVOS DE LA CFM EN LMA

- Identificación línea: linfoide ó mieloide.- Nivel de diferenciación.- Detección de perfiles inmunofenotípicos

anómalos.- Diagnóstico de:

- LMA M0- LMA M7- LA bifenotípicas- LA bilineales

- Inmunofenotipo de células raras:- Células dendríticas.- Mastocitos.

- Correlación con alteraciones citogenéticas específicas.

- Valor pronóstico del inmunofenotipo.- Evolución:

- Detección y seguimiento de EMR.

OBJETIVOS DE LA CFM EN LMAOBJETIVOS DE LA CFM EN LMA

EXPRESIÓN ANTÍGENICAEXPRESIÓN ANTÍGENICA

-Línea granulocítica: CD11b, CD13, CD15, CD16, CD33, CD65, CD117, MPOcMPOc.

-Línea monocítica: CD11b, CD11c, CD14, CD36, LISOZIMALISOZIMAc.

-Línea eritroide: glicoforina A, CD71.

-Línea megacariocítica: CD41, CD42, CD61.

-Línea B: CD10, CD19, CD22, CD79acCD79ac.

-Línea T: CD2, CD3cCD3c, CD4, CD7.

-Línea NK: CD16, CD56.

-Antígenos no específicos de línea: 7.1, CD34, CD45, HLA-DR.

PANEL INICIALPANEL INICIAL

FITC PE PerCP APC

Control Control Control

CD4 CD8 CD3

CD16 CD19 CD3 CD45

CD20 CD10 CD19 CD34

CD34 CD33 HLA-DR CD45

CD2 CD5 CD7

CD36 CD13 CD45 CD34

CD15 CD117 CD34 CD45

CD61 CD34 CD45

PANEL LMAPANEL LMAFITC PE PerCP APC

CD34 CD22 CD38 CD45

CD34 CD38 CD45 CD19


CD45 CD4 CD34 CD117

CD71 GA CD45 CD34

CD33 CD56 CD45 CD34

CD9 CD11c CD34 CD45

CD41 CD11b CD34 CD45


CD11b CD13 CD34 CD45

CD65 7.1 CD45 CD34

MPOc CD117 CD45 CD34

CD19 CD79ac CD34 CD45

CD45 CD3c CD34 CD117

TdTc CD117 CD45 CD34

IgMc CD19 CD45 CD34

CD33 MPOc CD45 CD34

MONOBLASTO PROMONOCITO MONOCITO

101

102

103

MADURACIÓN MONOCÍTICAMADURACIÓN MONOCÍTICA

(Adaptado de Orfao et al. Haematologica, 2003 )

CD34CD34

CD117CD117

HLA-DRHLA-DR

CD33CD33

CD13CD13

CD11bCD11b

CD11cCD11c

CD36CD36

CD14CD14

CD15CD15

MONOBLASTO

CD34CD34

CD117CD117

HLA-DRHLA-DR

CD33CD33

CD13CD13

CD11bCD11b

CD11cCD11c

CD36CD36

CD14CD14

CD15CD15

MIELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO METAMIELOCITO SEGMENTADO

CD13CD13

CD33CD33

CD34CD34

HLA-DRHLA-DR

CD117CD117

CD15CD15

CD65CD65

CD11bCD11b

CD16CD16

CD10CD10

101

102

103

MADURACIÓN GRANULOCÍTICAMADURACIÓN GRANULOCÍTICA


PROERITROBLASTO ERITROBLASTO HEMATÍE

101

102

103

MADURACIÓN ERITROIDEMADURACIÓN ERITROIDE

CD71CD71

CD45CD45

Glicoforina AGlicoforina ACD34CD34

CD117CD117

HLA-DRHLA-DR


INMADURO MADURO

101

102

103

MADURACIÓN MEGACARIOCÍTICAMADURACIÓN MEGACARIOCÍTICA

CD117CD117

CD36CD36

CD41CD41

CD42CD42

CD61CD61CD34CD34

HLA-DRHLA-DR


LMA: CLASIFICACIÓN FABLMA: CLASIFICACIÓN FAB

FAB Leucemia Serie

M0 Mieloblástica mínimamente diferenciada Granulocítica

M1 Mieloblástica sin maduración Granulocítica

M2 Mieloblástica con maduración Granulocítica

M3 Promielocítica Granulocítica

M4 MielomonocíticaGranulocítica y

monocítica

M5 Monoblástica/monocítica Monocítica

M6 EritroideEritroblástica y granulocítica

M7 Megacarioblástica Megacariocítica

Wood B. Multicolor immunophenotyping: Human immune system hematopoiesis. Methods Cell Biol 2004; 75: 559-576.

CLASIFICACIÓN FAB: CLASIFICACIÓN FAB: INMUNOFENOTIPOINMUNOFENOTIPO

LMA: CLASIFICACIÓN MIC-MLMA: CLASIFICACIÓN MIC-M

Anomalía cromosómica Subtipo FAB Genes participantes

t(8;21)(q22;q22) M2/M4 eto / aml-1

t(15;17)(q22;q21) M3 pml / rarα

inv(16)(p13;q22) / t(16;16) M4-Eo myh-11 / cbfβ

t(9;11)(p21-22;q23) M5 af-9 / hrx

t(11;19)(q23;p13.1) mll / ell

t(11;19)(q23;p13.3 mll / enl

t(?;11)(?;q23) M4/M5 hrx

t(6;9)(q23;q34) M2/M4 dek / can

t(8;16)(p11;p13) M5 moz / cbfβ

inv(3)(q21;q26) / t(3;3) M4 evi-1 / evi-1

t(1;3)(p36;q21)

t(3;21)(q26;q22) evi-1? / aml-1

t(9;22)(q34;q11) M1 abl /bcr

t(1;22)(p13;q13 M7

LMA: CLASIFICACIÓN EGILLMA: CLASIFICACIÓN EGIL

Línea mielomonocítica:

α-MPO+, CD13+, CD33+, CD65+ y/o CD117+ (al menos dos marcadores positivos).

Línea eritroide (M6):

Inmaduro: inclasificable por marcadores.

Maduro: Glicoforina A +.

Línea megacariocítica (M7):

CD41+ y/o CD61+ (de superficie o citoplasmáticos); habitualmente CD34+, CD33+ y/o CD13+.

Mieloide (M0):

Inmunofenotipo idéntico a las de linaje mielomonocítico con citoquímica negativa para MPO y con antígenos específicos de línea linfoide (CD3, CD79a, CD22) negativos.

LMA TdT+.

LMA con marcadores linfoides (Ly+LMA).

LMA: CLASIFICACIÓN EGILLMA: CLASIFICACIÓN EGIL

Score Linfoide B Linfoide T Mieloide

2 CD79ac CD3 ó CD3c MPO

IgMc Anti-TCR

CD22c

1 CD19 CD2 CD117

CD20 CD5 CD13

CD10 CD8 CD33

0,5 TdT CD10 CD65

CD24 TdT CD14

CD7 CD15

CD1a CD64

Una puntuación de 2,5 se considera suficiente para asignar linaje.

CD79a puede ser también expresado en una subpoblación de leucemia / linfoma linfoblástico T.

LMA: CLASIFICACIÓN OMSLMA: CLASIFICACIÓN OMS

LMA con traslocaciones citogenéticas recurrentes:

- LMA t(8;21)(q22;q22) (aml-1/eto) (M2)

- LMA-Eo inv(16)(p13;q22) ó t(16;16)(p13;q11) (cbfβ/myh-11) (M4-Eo)

- LMA 11q23 (mll)

- LPA t(15;17)(q22;q11-12) y variantes (pml-rarα) (M3)

LMA con displasia multilineal.

LMA secundarias a tratamiento previo.

LMA: CLASIFICACIÓN OMSLMA: CLASIFICACIÓN OMS

LMA no clasificable en otra categoría:

- Leucemia mieloide aguda indiferenciada (M0)

- Leucemia mieloide aguda mínima maduración (M1)

- Leucemia mieloide aguda con maduración (M2)

- Leucemia aguda mielomonocítica (M4)

- Leucemia aguda monocítica (M5a y M5b)

- Leucemia aguda eritroide (M6)

- Leucemia aguda megacariocítica (M7)

- Leucemia aguda con basofilia (M2 con basofilia)

- Panmielosis aguda con mielofibrosis

- Leucemias agudas bifenotípicas

INMUNOFENOTIPO:Bajo SSC/FSCMarcadores mieloides positivosMPO-/+ CD13+CD33-/+ CD117+Marcadores linfoides negativos

LMA M0LMA M0

Incidencia 2% - 7%MPO- por citoquímica ó <3%

0 256 512 768 1024

ISIDRO CASTELLO CLIMENT MO.115FSC-Height ->

SSC/FSC

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ISIDRO CASTELLO CLIMENT MO.115CD45 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ISIDRO CASTELLO CLIMENT MO.117CD13 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ISIDRO CASTELLO CLIMENT MO.116CD117 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ISIDRO CASTELLO CLIMENT MO.130CD33 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ISIDRO CASTELLO CLIMENT MO.115CD34 FITC ->

LMA M0LMA M0

CD34/SSCCD45/SSC CD117/SSC

CD33/SSCCD13/SSC

INMUNOFENOTIPO:No fenotipo característicoBajo SSC/FSCMPO+ CD13+CD33+ CD34+CD15-/+

LMA M1LMA M1

Incidencia 15% - 20%Blastos ≥ 90% C.N.E.MPO+ ≥ 3% por citoquímica

INMUNOFENOTIPO:CD34-/+ HLA-DR-/+CD117-/+ CD13+CD33+ MPO++CD15+/++ CD11b+

LMA M2LMA M2

Incidencia 30%Blastos 30% - 89% C.N.E.MPO+

LMA M3LMA M3

INMUNOFENOTIPO:Alto SSC/FSCMPO++h CD13+CD33+ CD117+CD34- HLA-DR-CD2-/+ (M3v) AUTOFLC.

0 256 512 768 1024

PEDRO PARRA SANJUAN MO.002FSC-Height ->

FSC/SSCIncidencia 5% - 15%

LMA M3LMA M3

CD117/SSCSSC/CD45

CD45/CD34

CD13/CD45

HLA-DR/CD45 CD33/CD45

LMA M3LMA M3

CD34

CD13

CD34

CD33

CD15

CD34

Sistema de puntuación inmunofenotípica de la M3:- CD13 + patrón heterogéneo- Patrón maduración CD15/CD34- Población mayoritaria

Otros antígenos significativos:- CD33 + patrón homogéneo- HLA-DR -

Orfao et al. Haematologica 1999, 84:405-412.

M3 OTRAS LMA

LMA M3LMA M3

Técnica PGM3:

INMUNOFENOTIPO:

Blastos:Bajo SSC/FSC CD13+CD33+ CD34+CD117+ CD11c+d

Monocitos:CD34- CD117-CD11b+ CD11c++HLA-DR+ CD14++CD64+

LMA M4LMA M4

Incidencia 15% - 20%

LMA M4LMA M4

0 256 512 768 1024

VANESA VICEDO GRACIA SP.309FSC-Height ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

VANESA VICEDO GRACIA SP.309CD45 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

VANESA VICEDO GRACIA SP.309CD34 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

VANESA VICEDO GRACIA SP.315CD11c PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

VANESA VICEDO GRACIA SP.322MPOc FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

VANESA VICEDO GRACIA SP.306CD13 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

VANESA VICEDO GRACIA SP.304CD33 PE ->

CD45/SSCFSC/SSC

CD13/SSC

CD34/SSC

MPOc/SSCCD33/SSC CD11c/SSC

LMA M5LMA M5

M5a M5b

Incidencia 15%

LMA M5LMA M5

INMUNOFENOTIPO:CD4 +CD36 +CD14 +LISOZIMAc +

CD14/CD45

SSC/FSC

CD13/CD33

CD56/SSC

CD2/CD117CD11c/CD15

INMUNOFENOTIPO:Glicoforina A+CD71+CD34+CD36+

LMA M6LMA M6

SSC/CD45

CD34/CD45

CD71/CD45

Incidencia 4% - 5%

GA/CD34

LMA M7LMA M7

Muy infrecuenteMorfología indiferenciadaMPO-

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ENRIQUE MONTOLIU NAVARRO.010CD61 FITC ->

CD61/SSC

10 10 10 10 100 1 2 3 4

KEVIN ZUÑIGA YANZAPANTA BIS.016CD61 FITC ->

0 256 512 768 1024

KEVIN ZUÑIGA YANZAPANTA BIS.023FSC-Height ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

KEVIN ZUÑIGA YANZAPANTA BIS.031MPOc PE ->

LMA M7LMA M7

CD61/SSCFSC/SSC

CD41/SSCMPOc/SSC CD61/SSC

INMUNOFENOTIPO:CD41+CD42a+CD42b+CD61+CD45- ó +MPO-

LEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICALEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICA

Incidencia: < 3% de las LA

Coexpresión de antígenos de dos ó más líneas.

LEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICA (EGIL)LEUCEMIA AGUDA BIFENOTÍPICA (EGIL)

Score Linfoide B Linfoide T Mieloide

2 CD79ac CD3 ó CD3c MPO

IgMc Anti-TCR

CD22c

1 CD19 CD2 CD117

CD20 CD5 CD13

CD10 CD8 CD33

0,5 TdT CD10 CD65

CD24 TdT CD14

CD7 CD15

CD1a CD64

Una puntuación de 2,5 se considera suficiente para asignar linaje.

CD79a puede ser también expresado en una subpoblación de leucemia / linfoma linfoblástico T.

LA bifenotípica (mieloide y linfoide T)


10 10 10 10 100 1 2 3 4

J.LUIS CUARTERO SAEZ MO.011CD19 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

JOSE L.CUARTERO SAEZ MO.005CD19 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


CD19/CD33 CD19/CD79ac CD19/MPOc


LA bifenotípica (mieloide y linfoide B)

LEUCEMIA AGUDA BILINEALLEUCEMIA AGUDA BILINEAL

Incidencia: < 1% de las LA Identificación de dos ó más clones de diferente línea celular.

LEUCEMIA DE CÉLULAS DENDRíTICASLEUCEMIA DE CÉLULAS DENDRíTICAS

INMUNOFENOTIPO:CD123 ++ HLA-DR++CD4+ CD56 +CD7.1+

MPOc- CD3c-CD79ac-

Feuillard J. et al. Blood 2002; 99:1556-1563.Bueno C. et al. Haematologica 2004

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ANTONIO PUERTO CAMARA SP.145Anti-HLA-DR PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ANTONIO PUERTO CAMARA SP.145CD56 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ANTONIO PUERTO CAMARA SP.144Anti-HLA-DR PerCP ->

HLA-DR/CD123HLA-DR/CD56CD56/SSC

INMUNOFENOTIPO:

CD117+++

Mastocitos neoplásicos:

SSC monocitos

CD2+

CD25+ (más frecuentemente positivo)

CD11c+

LEUCEMIA AGUDA DE MASTOCITOSLEUCEMIA AGUDA DE MASTOCITOS

CD117/SSC

CD117/CD45

FSC/SSC

Escribano et al, Cytometry Part B (Clinical Cytometry), 2004; 58B; 1-8.

Adaptado de Orfao et al. Cytometry Part A 58ª: 62-71 2004

CORRELACIÓN CON ALTERACIONES CORRELACIÓN CON ALTERACIONES CITOGENÉTICAS ESPECÍFICASCITOGENÉTICAS ESPECÍFICAS

- Diagnóstico:

1. Inmunofenotipos leucémicos

2. Diseño de paneles de seguimiento específicos

- Evolución:

3. Muestras adecuadas

4. Aplicación de los paneles de seguimiento

5. Adquisición en “segunda ventana”

LMA: ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUALLMA: ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL

5%

10-5

E.Indetectable

EMR

Recaída

Tiempo

MORFOLOGÍA

CITOGENÉTICA

PCR

CITOMETRÍA

% Blastos en M.O.


Sensibilidad de la CMF 10-4 - 10-5


Inconvenientes:

- EMR: > 80% de LMA

- Expresión en células leucémicas con el mismo fenotipo de células normales

- Dificultad: > 2 clones leucémicos

- Procesamiento muestras antes de 6 horas

PETHEMA LMA2007:

- Momento: post-inducción en RC morfológica:

- EMR < 0,1% Negativa

- EMR > 0,1% Positiva

PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS ANÓMALOSANÓMALOS

- Infidelidad de línea.

- Asincronismos madurativos.

- Infra- ó sobreexpresión.

- Fenotipos ectópicos.


Infidelidad de Línea

0 256 512 768 1024

J.LUIS CUARTERO SAEZ MO.006FSC-H ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

J.LUIS CUARTERO SAEZ MO.006CD15 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


FSC/SSC CD19/CD15 CD19/MPO

CD19: linfoide B / CD15 y MPO: mieloide

Asincronismo Madurativo

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ROCIO MERINO SALCEDO MO.008CD34 FITC ->

CD34/CD22

CD34: inmaduro

CD22: B maduro


CD34/CD22


Sobreexpresión Antigénica

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ROCIO MERINO SALCEDO MO.007CD19 PerCP ->

CD19/CD10+++

CD19/CD10


Fenotipos ectópicos

Detección de células con inmunofenotipo típico de un tejido en una localización anormal.

Por ejemplo:

Células T CD4+/CD8+ normales en timo, detectadas en adenopatía, LCR, etc.

San Miguel JF et al. Blood 2001


CD34 Blastos inmaduros

Mal pronóstico

CD56 Localización extramedular (LPA)

Mal pronóstico en subgrupo de t(8;21) y t(15;17)

CD7 Mal pronóstico

LMA inmaduras (M0, M1 en relación con citogenética de mal

pronóstico)

CD2 En LMA muy mal pronóstico, excepto si hay inv(16): baja tasa de RC

LMA: INMUNOFENOTIPO Y PRONÓSTICOLMA: INMUNOFENOTIPO Y PRONÓSTICO

n EMR SLR / Rec Evaluación

San Miguel

Blood 1997 ;90:2465.Blood 2001; 98:1746

126 (44) < 10-4

> 10-4 - < 10-3

> 10-3 - < 10-3

> 10-2

100% SLR a 3 años

85%55%15%

RC

Venditti

Blood 2000; 96:3948

63 > 3,5 x 10-4

< 3,5 x 10-4

17 / 22 (77%)

5 / 29 (17%)

Tras Consolidación

Kern

Blood 2004; 104:3078

62 log-diff > 2,28

log-diff < 2,28

26% SLR a 2 años

83%

RC y Tras C

Feller1

Leukemia 2004; 18:1380

51 > 1%

< 1%

RR 6.1 RC

Coustan-Smith2

Br J Haematol 2003; 123:243

46 >0,1%

<0,1%

33% SLR a 3 años

72%

RC

Perea

Leukemia 2005; e-public

55 >0,1%

<0,1%

67% SLR a 2 años

21%

Fin del tto

Kern

Haematol; 2004; 89:528

106 log-diff > 2,28

log-diff < 2,28

65% SLR a 2 años

37%

Día +16

LMA: INMUNOFENOTIPO Y PRONÓSTICOLMA: INMUNOFENOTIPO Y PRONÓSTICO

Presencia de EMR post-inducción: factor pronóstico importante asociado a recaídas.

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

CLÍNICA

CITOGENÉTICA + FISH

BIOLOGÍA MOLECULAR

MORFOLOGÍA

CITOQUÍMICA

CITOMETRÍA DE FLUJO

DIAGNÓSTICO INTEGRADO

EMREMR

LÍNEA CELULARLÍNEA CELULAR

ESTADIO ESTADIO MADURATIVOMADURATIVO

PERFIL INMUNOFENOTÍPICOPERFIL INMUNOFENOTÍPICOFACTORES FACTORES PRONÓSTICOPRONÓSTICO

GRACIAS

jornadas de actualizaciones en hematologÍa: actualizaciÓn de la lma hospital universitario la fe 6...

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