introducción a la histopatología ii

PATOLOGA HUMANA UNIDAD I: Salud y Enfermedad. Lesin y Muerte Celular. Clase 4: Introduccin a la Histopatologa II

Jueves 27 de marzo Odontologa 2014 Pgina 1

INTRODUCCIN A LA HISTOPATOLOGA II

Dra. Sonia Vsquez

Recordemos que el resultado de la biopsia es el

diagnstico histopatolgico -tejidos-, en cambio en el

estudio citolgico tendremos las caractersticas de las

clulas y para esto, se debe conseguir que la clula est

lo ms aislada posible. Microscpicamente se pueden

usar una serie de tinciones segn lo que se quiera

observar, puede ser la estructura de la clula, el ncleo

o el citoplasma de sta.

El estudio citolgico, es un mtodo bastante simple y

sencillo para el paciente, que no requiere ninguna

tcnica anestsica, provoca pocas molestias y es

bastante rpido, comparado con todo el procesamiento

que tiene una muestra de tejido. Para realizar este

frotis, necesitamos un portaobjetos, un estabilizante y

para tomar la muestra se usa un palito de helado o unos

cepillos especiales para obtener el frotis, con

estos ltimos se obtiene una mejor calidad de muestra

que con el palito de helado.

Para realizar la fijacin se utiliza alcohol al 95%, a

diferencia del frotis en el estudio histolgico en donde

se usa formalina tamponada al 10%.

El frotis es un raspado de alguna zona o lesin para la

obtencin de clulas, por lo tanto el raspado no puede

ser muy suave, sino que debe ser con cierta presin.

En resumen, los pasos que hay que seguir para la toma

del frotis son los siguientes:

Limpieza de la zona en donde se har la

muestra.

Raspado con una paleta o cepillo, el cual

tambin se utiliza mucho en la deteccin

del cncer cervicouterino.

Extendido en el portaobjetos.

Fijacin inmediata con alcohol al 95%, puede

tomarse con una jeringa el alcohol y depositarlo

en el portaobjetos.

Identificacin con el nombre del paciente y la

zona en la que fue tomada la muestra.

Envo al laboratorio con una descripcin de

la lesin e informacin clnica relevante.

El portaobjetos tiene una parte esmerilada -opaca- para

escribir el nombre del paciente, la zona en la que se

est tomando la muestra y si alcanza el nombre del

profesional que tom la muestra, es muy importante

que esto vaya escrito con lpiz de mina, ya que otro tipo

de lpiz se disolver cuando sea sumergido en el

alcohol. Entonces se enva al laboratorio, en donde hay

diferentes tipos de tinciones segn lo que se quiera

observar en la muestra, el ms utilizado es

hematoxilina-eosina o PAS, el cual es muy til para la

identificacin de hongos en la boca.

Veremos un ejemplo de esta paciente que presenta unas

lesiones blancas en la lengua, las cuales se desprenden

con el raspado y permiten fcilmente hacer el estudio

citolgico.



Luego se realizar el extendido de la muestra y

posteriormente la fijacin con alcohol al 95% y se

identifica la muestra, recuerden que la muestra de

biopsia o citolgicos son muestras nicas, por lo tanto

no pueden perderse bajo ninguna circunstancia.

En este caso se utiliz la tincin de PAS, lo que permite

ver ciertas estructuras caractersticas que llaman la

atencin, lo que habitualmente se ven son clulas y

bacterias propias de la boca, pero aqu llaman la

atencin otro tipo de estructuras que se ven en esta

paciente, por lo tanto esas lesiones blancas que

desprendan de la cavidad oral, correspondan a una

infeccin.

Adems del raspado, se puede obtener la muestra por

la tcnica PAAF (Puncin aspiracin con aguja fina), en

los casos en que sospechemos que hay cierto contenido

en la lesin, y sera difcil hacer un extendido de la

muestra.

En este caso, una nia de 12 aos, tena un aumento de

volumen en una glndula salival submandibular, que

haba sido diagnosticado como un tumor, por lo que le

retiraran completamente la glndula. Antes de tomar la

biopsia se realiz una puncin para ver si haba algn

contenido y se obtuvo un lquido amarillento y

pegajoso, parecido a la saliva, debido a esto la nia tuvo

que hacerse una sialografa para observar las

estructuras que haban adentro, para esto se le inyect

un medio de contraste, luego de una semana cuando

estuvieron listos los resultados de la sialografa, la nia

ya no tena nada porque haba un taponamiento de la

glndula, el cual al inyectar al medio de contraste se

destap. Esta nia gracias a que se hizo estos exmenes

antes, evit una ciruga de extirpacin de la glndula,

por esto es que es muy importante que el paciente se

haga todos los exmenes necesarios antes de una

ciruga.

Consideraciones (muestras tanto las histopatolgicas

como las citolgicas)

Observar desde el menor aumento al mayor

aumento, vemos primero lo que se ve con la

lupa, luego lo que se ve con el 10x en el

microscopio, el aumento menor da estructura

general o una orientacin.

Recorrido sistemtico de la muestra, toda la

muestra tiene que ser observada.

El tejido tiene conformacin tridimensional en

el plano, todas las estructuras son



tridimensionales (depende de cmo pase el

corte del tejido vamos a ver las estructuras).

Tejidos bsicos que deberamos encontrar, el

tipo de clulas

La cantidad de sustancia intercelular

Los artefactos, podran quedar producto de la

confeccin de la muestra.

Hay que repasar las estructuras normales de la cavidad

oral para poder identificar las patologas.

Examinacin macroscpica:

Tejido vivo: examen clnico.

Cadver: autopsia.

Examinacin microscpica:

Tejido vivo: biopsia y muestra citolgica

Cadver: necropsia.

INTRODUCCIN A LA HISTOPATOLOGA

(LABORATORIO)

TM. Wendy Donoso

Lo que le voy a presentar hoy da es ver un poco que es

lo que pasa en el laboratorio. En ese sentido voy a ser

bien enftica en el rol que cumplen ustedes, la toma de

muestra y la fijacin. Hay muchas cosas que se puede

hacer en un laboratorio, tanto con un fin clnico, para

ayudar al paciente y en la parte de investigacin, previa

autorizacin del paciente y as aportar en el

conocimiento.

Cuando requerimos el anlisis de una biopsia o una

muestra citolgica, el propsito es obtener un

preparado observable al microscopio. Habitualmente se

trabaja con microscopa ptica para el diagnstico

clnico, aunque tambin podemos observar con

microscopia de fluorescencia y electrnica.

La toma del material y la fijacin son pasos ajenos al

laboratorio, se hacen antes, y la muestra debe ser

representativa de la lesin, debe llegar en el fijador

adecuado, y se deben respetar sus tiempos, estos pasos

dependen de nosotros. Una vez que la muestra llega al

laboratorio, el patlogo hace una microscopia y

posteriormente se har un procesamiento histolgico si

es un tejido, o citolgico si son clulas.

El material de estudio sern las biopsias y las muestras

citolgicas. Un factor muy importante en las biopsias es

que deben estar en un recipiente apropiado, debe ser

idealmente un envase de plstico, de boca ancha y

apropiado segn el volumen de la muestra. Recordar

tambin que la proporcin del fijador debe ser de 10 a

20 veces el volumen de la muestra. Otro factor

importante es la identificacin de la muestra, y el

formulario de solicitud de examen.

Fijacin

Su propsito es mantener la estructura de la muestra, lo

ms similar posible, de acuerdo a como estaban en vida.

Una vez que se saca el tejido, ste deja de recibir

nutrientes como el oxgeno principalmente, se activan

enzimas y se degrada el tejido de manera interna, si

este proceso se contina en el tiempo llegamos a la

degradacin de la materia orgnica por bacterias y

microorganismos ambientales, lo que se llama

putrefaccin. La fijacin busca inhibir los procesos

autolticos. El proceso debe ser rpido, para que el

medio ambiente no influya sobre la muestra, por lo que

debemos tener a nuestro alcance todo el material que

necesitaremos para el proceso de fijacin de la muestra.

En el mbito odontolgico debemos tener mayor

cuidado con la manipulacin de la muestra, debido a

que sta es de pequeo tamao y la mayora de las

veces se saca la totalidad de sta por lo que se

convierte en una muestra nica. No puedo ir a buscar

otra muestra. Por ejemplo, al tomar un hemograma, si

es que a la persona que lo est tomando se le olvida

mezclar la sangre con el producto en el tiempo

adecuado, entonces la sangre coagula. En ste caso



puedo volver a llamar al paciente y tomar una nueva

muestra de sangre, pero en las biopsias no puedo hacer

eso. Sobre todo si es una muestra pequea.

Tipos de fijadores

-Mtodos fsicos: Interacta con las molculas de la

muestra. Tenemos:

Congelacin: Usualmente ocupadas en las

biopsias intraoperatorias, que van a ser

examinadas rpidamente. Lo que hace el doctor

es sacar la muestra desde el paciente, meterla

en un recipiente con hielo para mantener los

tejidos en ptimas condiciones y llevarlo as

hasta el lugar donde ser examinado.

Calor-microondas: Sirve para poder acelerar los

procesos. Por ejemplo, en una muestra fijada en

formalina se dice que el tiempo en que debe

estar la muestra en el fijador para que quede

fijada es de 6 horas. Ahora si eventualmente

nosotros quisiramos apurar un poco ese

proceso, para que baje a 4 horas podemos

someter esa muestra a calor. Alrededor de 37C

por 30-60 minutos. Ese es el sentido del calor

como fijador.

Los mtodos fsicos no son tan empleados en

histologa como los mtodos qumicos

-Mtodos Qumicos

De acuerdo a cmo interaccionan con las protenas

presentes en las clulas, nosotros los separamos por

mtodos coagulantes de las protenas y mtodos no

coagulantes de las protenas.

Mtodos coagulantes:

Dentro de los estos tenemos una serie de alcoholes,

como el etanol y el metanol. El etanol se usa

principalmente para fijar muestras citolgicas, no

tejidos, sino que clulas. Son buenos fijadores, pero

tienen muy mal poder de penetracin en la muestra;

por lo tanto si nosotros pensamos en un tejido que es

mucho ms compacto, lo ms probable es que si lo

dejamos en alcohol vamos a fijar, pero slo la parte

externa, porque va a ser difcil que ingrese a la muestra,

y si ingresa va a generar alteraciones en la muestra de

tejido, y lo que nosotros queremos es que se mantenga

la morfologa. Muchas veces estos agentes, alcoholes y

cetonas, son agentes deshidratantes, retiran el agua de

la muestra, lo hacen muy rpidamente, es muy invasivo

con la muestra, entonces al ser un proceso muy rpido

genera una alteracin morfolgica. Es por esto que lo

dejamos para fijar solamente clulas aisladas y no

tejidos.

Mtodos no coagulantes:

Aqu encontramos la formalina, y tambin tenemos

otros como glutaraldehdo que se utiliza para

microscopa electrnica. La formalina proviene de un

gas que es el formaldehdo, que para que lo podamos

manipular es dejado en agua, la concentracin mxima

que alcanza el formaldehdo en agua es de un 37% a un

40%. Por ejemplo, si tengo 100 ml de agua y le agrego

formaldehdo en gas y lo dejo no voy a lograr que ms

de un 37%-40% de este formaldehdo gaseoso se mezcle

con la porcin de agua. Esto se conoce como formalina

absoluta. Para fijar los tejidos la concentracin

adecuada es del 10%, por lo que vamos a tomar una

porcin de esta formalina absoluta y la vamos a mezclar

con 9 partes de una solucin amortiguadora que est a

pH fisiolgico (7-7,2), como el tampn fosfato de sodio,

eso es lo que conocemos como formalina tamponada.

Que sea una solucin amortiguadora quiere decir que si

yo coloco algo que eventualmente pueda cambiar

mucho el pH en esta solucin amortiguadora la solucin

en general no va a modificar su pH; por ejemplo, si

tengo un pH 7 y agrego algo a pH 12 lo ms probable es

que vare el pH pero va a tratar de mantenerse en el

rango de pH 7.

La formalina absoluta no se diluye en agua, pues el

resultado sera una formalina con un pH demasiado



cido, aproximadamente de 2-3, y lo que nosotros

queremos es estudiar un tejido y tratar de mantener las

condiciones de cuando estaba vivo. Lo que ocurre es

que si colocamos un tejido en una formalina diluida en

agua se va a alterar la morfologa del tejido, y ms que

la morfologa del tejido se van a alterar muchas

protenas que seguramente sern necesarias para

posteriormente hacer un adecuado prediagnstico.

Cules son las cualidades de la formalina?

Fijacin, mantiene la condicin de la clula y el tejido. Es

un bactericida y fungicida, entonces tenemos una

muestra que no tiene mucho riesgo biolgico para

nosotros.

Cunto dura el efecto de la formalina?

La formalina en tejido se dice que debe estar un mnimo

de 6 horas, incluso de acuerdo a las caractersticas de la

muestra hay algunas que se fijan a las 12 horas, porque

depende mucho del espesor y de la consistencia de la

muestra. Por ejemplo una mucosa oral tendr la

misma consistencia que un hueso desmineralizado?

Pensando que tambin el hueso es un tejido conectivo

que est mineralizado, si nosotros a ese hueso le

quitamos la sangre, probablemente ese hueso demorar

ms en fijarse que la mucosa oral, pues es ms denso.

El proceso de fijacin en general, es un proceso

progresivo, es decir, si yo dejo una muestra en fijacin

durante un ao, no le va a pasar mucho y podr realizar

algunos tipos de tinciones convencionales, pero si quiero

realizar algn tipo de anlisis de protenas o de cidos

nucleicos, lo ms probable es que no pueda, ya que la

sobrefijacin altera a la muestra.

Volviendo a la formalina, tiene la capacidad de bloquear

la autlisis, tiene un efecto microbicida, induce

cambios en la composicin tisular, tiene un

consistencia que le permite entrar fcilmente entre los

tejidos, tambin precipita protenas, es un mtodo

coagulante y forma lo que se llaman puentes de

metileno, formados por los grupos amino, de los

aminocidos que componen la protenas de los tejidos.

Tambin para fijar se pueden utilizar mezclas de

formalina con otros fijadores, ya que tienen una rpida

penetracin en los tejidos; a diferencia de los alcoholes,

es un proceso de fijacin reversible, es decir, cmo se

forman esos puentes cruzados, lo que es muy til, para

lograr realizar tinciones, rompiendo principalmente

estos puentes con el aumento de calor.

Relacin de la muestra con el volumen del fijador:

estos tiene que ser una relacin de 10 a 20 veces ms el

volumen del fijador que el de la muestra. Si nosotros

fijamos la muestra en un volumen apropiado, por un

tiempo apropiado, nosotros podemos incluso hacer

PCR, lo que es una reaccin en cadena de la polimerasa,

lo que tiene como propsito lograr amplificar algn gen

que codificar a la protena de inters.

Qu pasa cuando el tejido est fijado por otros

medios?

Tejido fijado por congelacin: si nosotros quisiramos

hacer una muestra de ADN de una muestra que estaba

congelada, lo resultados sern excelente, porque la

muestra estar intacta y se podr realizar la accin de

la polimerasa en cadena sin problemas.

Tejido fijado con formalina tamponada: el ADN ser

modificado, pero no es tanto el dao si quisiramos

hacer un PCR igual resultara.

Tejido con formalina tamponada por dos aos: lo ms

probable es que si yo quisiera hacer una extraccin de

ADN, va a estar fuertemente fragmentada y por lo tanto

no ser posible hacer un PCR. Con todo lo

anteriormente dicho la formalina es muy buena, pero

siempre y cuando la muestra tenga un periodo mnimo

de fijacin de 6,8 o 12 horas, pero que tampoco se

exceda de las 36 horas, porque as se podr obtener una

correcta muestra, para luego empezar con el

procesamiento histolgico.



La muestra despus de ser enviada al laboratorio es

recibida por el patlogo, donde hace una descripcin

macroscpica del tejido, donde se considera la forma

(cua, regular o irregular), el color (blanquecino,

oscuro), consistencia, por ejemplo un tercer molar la

consistencia ser dura o firme?, es una consistencia

dura, pero si es mucosa ser una consistencia firme.

Ahora, si es una lesin que se siente que hay contenido

dentro, como una glndula que no se rompi en el

momento que la extrajeron, que tiene un tapn en el

conducto de salida, lo ms probable es que cuando

llegue al laboratorio y uno la toque se sienta como con

residuos, y esto da las caractersticas fsicas, la

superficie tambin, si es lisa o rugosa y las dimensiones:

ancho, alto y largo.

Entonces el tejido para iniciar el procesamiento del

prototipo nosotros lo queremos primero es recibir el

tejido en un vaso plstico de boca ancha.

Tenemos que llegar a hacer un taco de parafina.

Posteriormente llegar a la lmina histolgica que es lo

que se requiere para ser observada al microscopio.

Tejidos blandos y tejidos duros

El procedimiento para trabajar en tejido duro no es el

mismo que si yo quiero trabajar en una mucosa por

ejemplo. Cuando trabajo en un tejido duro tengo que

realizar la descalcificacin, que consiste en retirar las

sales presentes en la muestra.

Aqu tenemos una foto de una radiografa y podemos

observar que an hay partes mineralizadas, tiene que

quedar completamente sin minerales.



Como vamos a ver, cuando uno inicia un estudio

histolgico lo primero que hace es la tincin

hematoxilina-eosina. En algunos casos, sobre todo para

el diagnstico clnico, no le permite al patlogo decir

frente a qu tejido se encuentra, sobre todo cuando

estamos frente a tumores y ah requiere otro tipo de

tinciones, que vayan directamente a protenas

especificas dentro de la muestra, ahora cuando

nosotros tenemos que llegar a ese punto, la verdad es

que es importante, si es un tejido mineralizado, saber si

tenemos cidos porque lo ms probable es que las

protenas que estn presentes estn muy deterioradas

y no las podamos teir.

Una vez que la muestra ya est desmineralizada

tenemos que confeccionar el bloque de parafina que

nos permita cortarla despus, para ello debemos

considerar que la parafina es un hidrocarburo. Para ello

debemos seguir un procedimiento que es largo pero

que nos permite tomar la muestra en condiciones

adecuadas. La parafina es solo para cortar la muestra.

Recordemos que nosotros somos un organismo que

tenemos gran porcentaje de agua y la parafina es

insoluble en el agua. Si sacamos un tejido ese tejido

tambin va a tener mucha agua, lo vamos a colocar en

un fijador que es acuoso y por lo tanto si nosotros

queremos que este tejido quede repleto de parafina

debemos retirar esa agua y generar una instancia para

que luego en esos sitios donde haba agua queden

llenos del medio de soporte que es la parafina, para

esto vamos a hacer un proceso de deshidratacin.

Procesamiento histolgico.

El procesamiento histolgico es muy largo y consta de

seis etapas: deshidratacin, aclaramiento, inclusin,

corte, tincin y montaje. Nosotros lo podemos hacer de

forma manual en un frasquito similar al de conserva.

Ponemos la muestra y vamos cambiando de solvente, o

si no se puede hacer a travs de un equipo similar al

que tenemos en el laboratorio.

Primero vamos a deshidratar la muestra para ello, esto

ser de forma paulatina, no podemos de buenas a

primeras porque puede cambiar la morfologa y la

sometemos a concentraciones crecientes de alcohol,

primero a un bao de alcohol al 70% lo dejamos 1 hora

1 hora y media aproximadamente en el recipiente y

cambiamos posteriormente la muestra a otro que tiene

mayor concentracin de alcohol y menos concentracin

de agua, luego de nuevo a otro que tenga ms alcohol y

menos agua para finalmente llegar a uno que tenga

solamente alcohol.

En este tejido en el que inicialmente haba agua quedo

inmerso en alcohol pero el alcohol no es 100% afn con

el medio de soporte que es la parafina, entonces

tenemos que ponerlo en un medio que sea amigable

con el alcohol y con la parafina y luego empieza el

procesamiento que es el aclaramiento.

El aclaramiento consiste en colocar el tejido en otro

solvente orgnico que sea afn tanto con el alcohol

como con la parafina, generalmente se utiliza el xilol o

xileno. Existen otros medios aclarantes, como el



benceno, cloroformo, tolueno, pero son demasiados

txicos. (El xileno es el menos txico de todos).

Luego viene la etapa de inclusin, en esta se somete la

muestra a baos de parafina, que es el medio de

soporte para el tejido en estudio.

La parafina es un

hidrocarburo, o sea un

derivado del petrleo,

que tiene la

caracterstica de ser

slido a temperatura

ambiente, este

hidrocarburo se funde

aproximadamente a

56C.

La parafina debe estar fundida para incorporarse al

tejido. El tejido internamente esta relleno de parafina, y

adems se necesita hacer un cubo/bloque para ser

colocado en el micrtomo.

Para hacer el bloque de parafina se ocupan las barras

Leuckart, en este espacio se coloca la muestra orientada

hacia abajo, de forma que abajo quedar plano (donde

se encuentra la muestra) y arriba se formar una

concavidad.

Posterior a esto, se realiza el corte con el micrtomo.

Hay dos tipos de Micrtomo: deslizante y rotatorio.

Se coloca la muestra y van saliendo rebanas de la

muestra de 4-5 m. Una vez que se realiza un corte,

aparece el otro adosado, a causa de su delgado grosor,

formndose una cinta, en donde vamos a tener hartos

cortes de la muestra.

Ahora la muestra se debe colocar en el porta objetos,

por lo que se debe realizar un proceso antes. La cinta se

deposita en un bao de Flotacin, el cual es

termorregulado, tiene una temperatura aprox. de

40C, lo que permite obtener cortes bien estirados.

Imagen: Extendido de las muestras

Teniendo la muestra en el portaobjetos se realizan

una serie de pasos antes de la tincin, debido a que

los colorantes son acuosos, y la parafina no es afn

al agua. Por esto, se realiza un proceso de

desparafinacin en el que se calienta la muestra en

una estufa, de forma de derretir la parafina, luego

se somete a baos sucesivos de Xileno. Ahora se

somete a eliminar el xileno y se comienza a

hidratar la muestra paulatinamente, desde alcohol

100, 95, 90, 70. Ahora la muestra se encuentra

preparada para ser teida.



Las muestras en parafina se pueden guardar por

aos, y se conservan tal cual.

No se va a modificar ni mover la muestra, porque ya

est hecho el proceso de fijacin. En la muestra

citolgica va a existir el frotis de tipo convencional, que

es el que vamos a ver en el laboratorio, donde se extrae

muestra con una esptula en el caso que sea ms slida

y si es lquida se realiza un proceso diferente (por ej.

Puncin con aguja fina). Entonces, la fijacin citolgica

se realiza con etanol al 95%, tambin se utiliza el cito

spray que es hecho a base de alcohol. Pero, qu pasa

cuando tenemos un contenido lquido (queratina),

aplicamos el fijador etanol en la proporcin es 1/3 de

fijador de acuerdo a la cantidad de volumen de agua.

Por ejemplo, si tomamos 6 mL de contenido lquido le

vamos a agregar 2 mL de fijador. Este fijador puede ser

formalina tamponada al 10% o con alcohol al 95% y

llevamos el frotis al laboratorio.

Las tinciones son muchas y variadas, se pueden realizar

siempre y cuando se haya tomado bien la muestra (que

se haya aplicado el fijador apropiado y esperado el

tiempo suficiente de fijacin). Se utilizan con un fin

explicativo y para identificar elementos. Los colorantes

son sustancias qumicas que poseen, de acuerdo a sus

caractersticas, si precipitan en colorantes bsicos o

cidos o colorantes catinicos o aninicos.

Generalmente estos colorantes cuando los aplicamos en

solucin una parte de ellas se disocia en sus iones

correspondientes y, de acuerdo al in que tenga la

capacidad de colorear (citocromforo) es lo que se va a

precipitar. Si la solucin est cargada positivamente le

vamos a llamar colorante catinico o bsico. Que est

cargado en solucin acuosa significa que va a poder

interactuar con molculas que tengan en solucin su

carga opuesta. Llamaremos basfilas a las sustancias

que pueden captar en negatividad, por ejemplo, la

hematoxilina. Por su parte hay colorantes que son

cidos, es decir, que estn cargados negativamente, que

la parte negativa en solucin es la capaz de colorear,

son colorantes aninicos y se van a unir a aquellos que

tenga su carga opuesta. Estas estructuras se van a

denominar acidfilas como la eosina.

En general, los colorantes son sustancias qumicas

complejas. La hematoxilina es un colorante que

proviene de una leguminosa, este colorante natural por

s solo no tiene la capacidad de teir y debe ser

modificado qumicamente para que pueda teir. Debe

ser oxidado a un compuesto llamada hematena y la

hematena es quien tiene la capacidad de teir tejidos.

La hematena asociada con una solucin mordiente (la

que firma el colorante) forma lo que se llama hemates,

que est cargada positivamente en solucin y tiene

actividad por los grupos fosfatos que estn en el ADN,

por eso la hematoxilina tie. Y por su parte tenemos

tambin la eosina, que es un colorante complejo en

solucin est cargada negativamente y finalmente es

eso lo que da la cualidad de poder unirse a estructuras

con su carga opuesto, como protenas que hay en el

citoplasma.

Imagen: Tincin con tcnica de Hematoxilina-Eosina.



Por ejemplo, ac tenemos la tincin llamada PAS

(tincin del cido peridico-de Schiff). Esta es especial

para poner en evidencia mucosustancias, o sea,

sustancias con hidratos de carbono, como por ejemplo

un citolgico de una paciente en donde el cido

peridico-de Schiff se une a las mucosustancias

presentes en las paredes de la levadura.

En muchas ocasiones, sobre todo en la parte

histopatolgica, las lesiones no son fcilmente

distinguibles y tampoco cul es el tejido presente,

entonces nos ayudamos de otro tipo de coloraciones

que nos tien de manera diferencial distintos tipos de

tejidos.

Por ejemplo, tenemos cortes de hgados sometido a un

experimento donde se vea qu capa fibrosa le causaba

heridas, donde se ve un aumento en las clulas

colgenas (estas se coloreaban de azul).

Otro ejemplo son las glndulas de la lengua, teidas con

hematoxilina- eosina, donde se distinguen glndulas

serosas de las mucosas, las glndulas mucosas como

son mucosustancias por lo tanto no se tien con HM,

para teirlas usamos el cido peridico-de Schiff.

Ahora qu pasa si estoy en un caso real con un paciente

que presenta una neoplasia, tomamos una muestra de

clulas y en ellas no aparece nada. Teimos con todas

los mtodos que tenemos, pero Cmo diferenciamos

un linfocito de otro? No lo podemos hacer. Entonces lo

que podemos decir es que es un tumor

morfolgicamente indiferenciado de clulas epiteliales.

Este diagnstico es muy ambiguo para dictarle el

tratamiento al paciente.

Cortes sacados del mismo tejido no son iguales,

slo pueden ser representativos del otro.



INMUNOHISTOQUMICA

La inmunohistoqumica es lo que nos permite estudiar

protenas dentro del tejido, las que estudiamos con la

utilizacin de anticuerpos. Entonces en el laboratorio, lo

que se hace es crear un anticuerpo para obtener

protenas especficas de la muestra, luego realizamos

reacciones antgenoanticuerpo, este anticuerpo tiene

que estar marcado con un colorante para su

identificacin en un microscopio.

El cmo va a estar coloreado este anticuerpo, va a

depender de la cantidad de protena que yo ponga, si la

cantidad que pongo en tejido es baja, yo puedo ocupar

directamente un anticuerpo que ya este marcado, ahora

si la protena esta en baja concentracin, lo ms

probable, es que esta unin sea baja, sea tengo la

protena en el tejido y tengo el anticuerpo, pero

necesito algo que me amplifique mucho ms la seal,

algo que tenga harto color para que lo pueda ver,

entonces ocupo un sistema el cual me amplifique la

seal. Esto va a ser lo que me va a dar el color de la

reaccin.

Por ejemplo, ac si tengo un anticuerpo, con esta

ampolleta voy a ver menos que si tengo esta misma

unin pero con hartas ampolletas, entonces de eso va a

depender el sistema que voy a ocupar. La imagen

corresponde a un anticuerpo policlonal y uno

monoclonal, respectivamente.

Siempre creando anticuerpos especficos para la

protena.

Finalmente al hacer un estudio citolgico, este

determin que esas muestras eran melanomas y ambas

se vean aparentemente diferentes, descubrieron que

eran melanomas, pero lo descubrieron mucho tiempo

despus. Lo bueno de mantener las muestras en

formalina, es que se puede guardar la muestra durante

muchos aos, recoger la muestra nuevamente y

revisarla.

Ahora, cul es la caracterstica o qu es lo que tienen

de particular los tumores morfolgicamente

indiferenciados, cuando hay una lesin maligna, porque

todo el ciclo celular tiene un ritmo, que permite que la

clula nazca, se desarrolle, se diferencie y realice su

funcin? Cuando hay una proliferacin maligna, este

proceso est alterado y adems de estar alterado es

muy rpido, entonces la clula nace, no alcanza a

desarrollarse ni a realizar su funcin y solamente son

clulas inmaduras las que empiezan aumentar en

cantidad en la lesin, entonces como no alcanzan a

diferenciarse, yo las voy a ver siempre inmaduras, como

las veo tan inmaduras, no alcanc a ver si tena

caractersticas de epitelio, de tejido conectivo, de tejido

nervioso, porque al final son siempre clulas inmaduras

las que se van a estar reproduciendo, esa es la

caracterstica de una neoplasia maligna o de un cncer,

que las clulas que se reproducen son indiferenciadas,

son inmaduras.

Cuando el patlogo se encuentra con algo que no puede

diferenciar morfolgicamente, no puede decir qu es,

quiere decir que esas lesiones que son indiferenciadas.

Cuando las clulas estn muy inmaduras y a pesar de

que no presentan caractersticas de su condicin final,

mantienen total o parcialmente protenas del lugar

donde pertenecen; por ejemplo, los epitelios tienen

citoqueratinas, a diferencia del tejido conectivo, que

posee otras protenas que se llaman vimentina.

Entonces cuando tengo una clula indiferenciada, le

busco citoqueratinas y no tiene, quiere decir que no

tiene origen epitelial; pero si yo le busco vimentina y si



tiene, confirmo que era una clula para formar tejido

conectivo. As puedo verificar qu tipo de clula es, a

pesar de que morfolgicamente no lo tenga claro; con

el hecho de encontrar ciertas protenas, yo puedo decir

qu tipo de tejido es.

En el caso de una neoplasia, donde no existe una

estructura morfolgica clara, por lo que no se puede

establecer una clasificacin histolgica, el clnico no

tiene las herramientas para decir qu es.

En resumen: las clulas normales, podemos

diferenciarlas rpidamente segn el tejido al cual

pertenecen, debido a que presentan caractersticas

especficas, pero cuando nos encontramos frente a una

clula cancergena o maligna, debemos recurrir a otro

mtodo de bsqueda para saber a qu tipo de tejido

pertenece, esto lo hacemos mediante la bsqueda de

ciertas protenas caractersticas de cada tejido.

Los calcinomas, sarcomas, miosarcomas y tubos

neurales, todos tienen caractersticas especiales de

diferenciacin, hay filamentos intermedios

caractersticos en cada uno de ellos, por ejemplo:

Calcinoma: proviene del tejido epitelial y lo que

lo caracteriza, es la presencia de filamentos de

queratina.

Sarcoma: proviene del tejido mesenquimtico y

lo que lo caracteriza, es la presencia de

filamentos de vimentina.

Algo similar ocurre para los tumores musculares y

neurales.

Hay una protena caracterstica que est presente en el

sitio celular y que es la Ki 67, ahora si en la amgdala

humana sabemos que en condiciones normales se

encuentra una alta proliferacin celular en los tejidos,

en los centro germinativos, nosotros podemos poner en

evidencia estos centros germinativos ocupando este

marcador para saber dnde hay un centro germinativo y

as saber que est ocurriendo una alta proliferacin

celular, debido a que se encuentra teido de caf.

Lo mismo ac, nosotros podemos usar cloroformo para

pesquisar irregularidades dentro de la muestra y

diferenciar una patologa.

En esta imagen por ejemplo hay epitelio, queratinocitos

y aqu tambin hay epitelio, entonces en los penfigoides

lo caracterstico que se altera son autoanticuerpos para

desmosomas, que marcan el lmite entre el tejido

epitelial y el tejido conectivo en la capa basal. Nosotros

al poner en evidencia los anticuerpos presentes ac,

ponemos en evidencia patrones.

Por ejemplo cuando tenemos alterado un anticuerpo

unido a desmosomas, nosotros decimos que tenemos

un patrn. Ahora una vez que la muestra est teida,



nosotros le colocamos un medio de montaje a la

muestra y lo tapamos con un cubreobjetos, eso tiene

como propsito mejorar el ndice de refraccin de la

muestra. Solo como manera de resumen comentar que

cuando ustedes tomen biopsias el proceso va a ser

largo, ustedes van a tomar la biopsia la van a fijar, se va

a hacer la macroscpia, el procesamiento histolgico, el

montaje y la observacin, mientras que cuando tienen

muestras citodiagnsticos, van a realizar el frotis, lo van

a fijar y lo van a observar, sea es un proceso mucho

ms corto.

introducción a la histopatología ii

Documents