7. Ligamiento y recombinacinLigamiento y recombinacin. Acoplamiento y repulsin. Frecuencia de sobrecruzamiento y fraccin de recombinacin. Estimacin del ligamiento y de la fraccin de recombinacin. Problema de tres puntos. Nmero de grupos de ligamiento. Ligamiento al sexo (segmento apareante). Parasexualidad en virus y bacterias.

7. Ligamiento y recombinacinAcoplamiento y repulsin. A principios del siglo 20 Bateson y Punnet encontraron desviaciones significativas de la segregacin 9:3:3:1, para ciertos caracteres en guisante dulceP PPLL x ppllColor de las flores: P (prpura) > p (rojo)Forma del polen: L (alargado) > l (redondo)

[PL][Pl][pL][pl]TotalObservado284212155381Esperado(9:3:3:1)215717124381

7. Ligamiento y recombinacinAcoplamiento y repulsin. Para comprender el fenmeno es mejor utilizar cruzamientos ms simples. Morgan utilizo cruzamientos prueba en DrosophilaColor de ojos: pr+ (rojo) > pr (prpura)Desarrollo de alas: vg+ (normales) > vg (vestigiales) P pr+pr+vg+vg+ x prprvgvgF1 pr+prvg+vgX prprvgvg[pr+vg+] = 1339[prvg] = 1195[pr+vg] = 151[prvg+] = 154

7. Ligamiento y recombinacinAcoplamiento y repulsin. En otro cruzamiento con los mismos caracteres: P pr+pr+vgvg x prprvg+vg+F1 pr+prvg+vgX prprvgvg[pr+vg+] = 157[prvg] = 146[pr+vg] = 965[prvg+] = 1067

7. Ligamiento y recombinacinFrecuencia de sobrecruzamiento y fraccin de recombinacin. Estimacin del ligamiento y de la fraccin de recombinacin.Para explicar estos resultados Morgan supuso que los dos genes en estudio estaban sobre un mismo cromosoma:Atencin, se muestran cromosomas sin replicar

7. Ligamiento y recombinacinFrecuencia de sobrecruzamiento y fraccin de recombinacin. Estimacin del ligamiento y de la fraccin de recombinacin.Morgan supuso que en algunas meiosis se da el fenmeno de sobrecruzamiento entre los loci en estudio:Atencin, se muestran cromosomas sin replicarExisten pruebas visibles del sobrecruzamiento, los quiasmas observados en meiosis

7. Ligamiento y recombinacinFrecuencia de sobrecruzamiento y fraccin de recombinacin. Estimacin del ligamiento y de la fraccin de recombinacin.Dos genes situados, relativamente cerca, en el mismo cromosoma no segregan independientemente, incumpliendo as la segunda ley de Mendel. El dihbrido tiende a producir mas gametos de dos de las clases y menos de las otras dos.Este fenmeno se denomina LIGAMIENTO y los genes que lo presentan GENES LIGADOSUna vez comprobado el ligamiento, podemos escribir el genotipo de un di-hbrido pr+prvg+vg como pr+vg+/prvg, en el caso de acoplamiento, o pr+vg/prvg+, en el caso de repulsin

7. Ligamiento y recombinacinFrecuencia de sobrecruzamiento y fraccin de recombinacin. Estimacin del ligamiento y de la fraccin de recombinacin.Cuando los genes no estn ligados, la recombinacin inter-cromosmica en meiosis explica la aparicin de gametos parentales y recombinantes en frecuencias igualesCuando los genes estn ligados, la recombinacin intra-cromosmica en meiosis es el nico fenmeno que permite la aparicin de gametos recombinantes

7. Ligamiento y recombinacinFrecuencia de sobrecruzamiento y fraccin de recombinacin. Estimacin del ligamiento y de la fraccin de recombinacin.Considerando todas las meiosis posibles en un caso de ligamiento:1-x meiosis sin sobrecruzamiento entre Aa y Bbx meiosis con sobrecruzamiento entre Aa y Bbx/2 es la proporcin de gametos recombinantesTodos los gametos producidos son de tipo parentalFrecuencia de sobrecruzamiento

7. Ligamiento y recombinacinLlamaremos p (lgicamente = x/2) a la fraccin de recombinacinEl clculo de p es sencillo. p= n de gametos recombinantes/total de gametos.La fraccin de gametos parentales es 1-pLo que no es sencillo es contar gametos, salvo en un cruzamiento pruebaEn caso de no ligamiento, caso Mendeliano, p vale 0.5, hay de cada tipo de gameto, los genes no estn ligados (sea cual sea su posicin cromosmica)En el extremo contrario, si dos genes estan en el mismo cromosoma y nunca se produce sobrecruzamiento entre ellos no apareceran gametos recombinantes. p=0, es el ligamiento absoluto

1 ab (1-p) Ab (1-p) [Ab] (1-p) aB (1-p) [aB] p AB p [AB] p ab p [ab]

7. Ligamiento y recombinacinEl ligamiento absoluto fue descubierto por Bridges en Drosophila[pr+vg+] = 519[prvg] = 552[pr+vg] = 0[prvg+] = 0Luego se ha comprobado que el macho de Drosophila es aquiasmtico. Produce gametos recombinates?

7. Ligamiento y recombinacinSe ha podido comprobar que p es un valor propio de cada par de genesLa probabilidad de sobrecruzamiento determina la distancia gentica ( de distancia fsica), se mide en unidades de recombinacin o cM (= px100)La probabilidad de que se produzca un sobrecruzamiento es aproximadamente homognea a lo largo de los cromosomasLas distancias genticas son aproximadamente aditivas, es posible construir mapas genticos (Sturtevant construy el primero en 1911)

7. Ligamiento y recombinacinEn ocasiones es difcil determinar si dos genes estn ligados o no, siempre es posible calcular p, pero este clculo no tiene sentido cuando dos genes no estn ligadosLa desviacin observada entre 0.45 y 0.5 (caso de no ligamiento), es estadsticamente significativa?

7. Ligamiento y recombinacinLa prueba estadstica de 2 tiene en cuenta el nmero de individuos que hemos contado y el nmero de clases en las que se distribuyen, a continuacin nos indica el nivel de confianza con el que podemos afirmar que una distribucin observada refleja una distribucin terica Test de 2 :Determinar cual es la distribucin terica a la que queremos ver si se ajusta la distribucin observada (hipteis nula). En el problema que estamos tratando aqu h0= 1/4:1/4:1/4:1/4Determinar el nmero de grados de libertad del problema (= nmero de clases -1). en nuestro problema 4 -1=3Calcular el valor de 2 con la frmula

7. Ligamiento y recombinacinEstimar el valor P, probabilidad de obtener una desviacin igual o superior a la observada suponiendo que la hiptesis nula es ciertaEn nuestro problemaCon este valor buscamos en la tabla de X2 la probabilidad de obtener un resultado experimental como el obtenido asumiendo que la hiptesis nula es correcta

7. Ligamiento y recombinacin5.2La probabilidad de obtener una desviacin igual o mayor que la observada en este experimento, asumiendo que la hiptesis nula es cierta, se sita entre 0.2 y 0.1, por tanto >0.05. La hiptesis nula debe ser aceptada

7. Ligamiento y recombinacinProblema n 9 del cuadernillo de Ligamiento y Recombinacin:Bridges y Morgan realizaron numerosos cruzamientos en Drosophila melanogaster entre ellos y en cierto experimento cruzaron machos de patas dachs por hembras de cuerpo black. En la F2 obtuvieron 186 individuos salvajes, 73 dachs, 93 black y ninguno con ambos caracteres. Qu se deduce de los resultados obtenidos?. Razona la respuesta.

7. Ligamiento y recombinacin

7. Ligamiento y recombinacinEn este caso el nmero de grados de libertad es 4-1=3La hiptesis nula es 9:3:3:1La prueba de X2, que llamaremos total, ser;La probabilidad de obtener una desviacin igual o mayor que la observada en este experimento, asumiendo que la hiptesis nula es cierta, es P

7. Ligamiento y recombinacinHasta este momento hemos demostrado que la segregacin observada no es un caso de segregacin 9:3:3:1Significa esto que estamos ante un caso de ligamiento?La segregacin fenotpica observada en F2 es el resultado de la combinacin de dos segregaciones 3:1, combinacin independiente en el caso de no ligamiento y no independiente en el caso de ligamientoPero, y si una de las segregaciones, o las dos, no fuera 3:1?Podemos comprobar esto utilizando de nuevo el test de X2. Son las pruebas de X2 parciales.1. Gen dasch, la hiptesis nula ser 3:1 y el n de grados de libertad 2-1=1P>0.05. Desviacin no significativa. La hiptesis nula debe ser aceptada

7. Ligamiento y recombinacin2. Gen black, la hiptesis nula ser 3:1 y el n de grados de libertad 2-1=1P>0.05. Desviacin no significativa. La hiptesis nula debe ser aceptadaPor tanto tenemos que dos segregaciones 3:1 no se han combinado independientemente para dar lugar a una segregacin 9:3:3:1. Todo parece indicar que debido al ligamiento.Podemos obtener apoyo estadstico para esta afirmacin?Las pruebas de X2 son aditivas, una prueba de 3 grados de libertad se puede descomponer en a suma de tres de un grado de libertad cada una.La desviacin detectada por la X2 total se debe a la desviacin de cada parcial y a la desviacin de la combinacin de ambas. Esta desviacin en la combinacin es la que finalmente mide el ligamiento

7. Ligamiento y recombinacinDefinimos la X2 de ligamiento como:X2L= X2T - X2gen1 - X2gen2En nuestro caso: X2L=34.47-3.4-0.38=30.69 Para 1 grado de libertad esto equivale a P

7. Ligamiento y recombinacinProblema de tres puntosEn el estudio del ligamiento, conviene introducir una complicacin adicional y considerar el caso de tres genes ligados.La resolucin de este problema ilustra una dificultad importante en el clculo de distancias genticasConsideremos el siguiente cruzamiento en Drosophila:

P v+v+cvcvctct X vvcv+cv+ct+ct+

7. Ligamiento y recombinacinProblema de tres puntosPara analizar el ligamiento realizamos un cruzamiento prueba v+cvct /vcv+ct+ X vcvct /vcvct La segregacin esperada, caso de no ligamiento, sera 1/8:1/8: 1/8:1/8Parece un caso claro de ligamiento, podemos construir un mapa gentico calculando las distancias entre los genes tomados de dos en dos

7. Ligamiento y recombinacin[v+cvct]592 [vcv+ct+]580[vcvct+]45[v+cv+ct]40[vcvct]89[v+cv+ct+]94[vcv+ct]3[v+cvct+]5

pv-cv=45+40+89+94/1448=0.185

pv-ct=89+94+3+5/1448=0.132

pcv-ct=45+40+3+5=0.064Con esta informacin podemos construir el siguiente mapa:

7. Ligamiento y recombinacin[v+cvct]592 [vcv+ct+]580[vcvct+]45[v+cv+ct]40[vcvct]89[v+cv+ct+]94[vcv+ct]3[v+cvct+]5

El orden de los genes no es el dado en el problemaEl mapa podra dibujarse invertido13.2+6.4=19.618.5, por qu se ha subestimado la distancia?Explicar de que tipo de meiosis ha salido cada gameto parental o recombinante (usar smbolos a, b, c)Es evidente que la clase de los dobles recombinantes no se ha contado al calcular la distancia v-cv. Y debera haberse contado dos veces!

7. Ligamiento y recombinacinEn ese caso, podramos recalcular pv-cv:pv-cv=45+40+89+94+(2x3)+(2x5)/1448=0.196Y el mapa quedara:Las distancias genticas que estimamos no son precisas cuando la probabilidad de ocurrencia de dobles sobrecruzamientos, que no podemos detectar, es significativaEn otras palabras, la precisin del mapa es mayor cuando los genes que se estn analizando estn ms prximosLos mejores mapas son aquellos que tienen muchos marcadores muy prximos entre si.

7. Ligamiento y recombinacinDos consecuencias adicionales de lo anterior:En un problema de tres puntos es posible, an antes de realizar ningn clculo, determinar cual es el gen que ocupa el locus central. Basta comparar los gametos parentales con los menos frecuentes (que necesariamente provienen de doble sobrecruzamiento).El fenmeno de la subestimacin de las distancias genticas NO esta relacionado con el fenmeno de interferencia, interesante desde un punto de vista terico pero sin relacin con lo que nos ocupa aqu.

7. Ligamiento y recombinacinMapas genticos:Una de las aplicaciones ms importantes del anlisis gentico es la construccin de mapas en los que los genes (y en general cualquier tipo de marcador) aparecen ordenados y separados por distancias genticas. El proceso de construccin de un mapa implica:Establecimiento de lneas puras y produccin de una poblacin de mapa (F2)Anotacin del genotipo de cada individuo para cada uno de los marcadores que se van a emplear en el mapa

7. Ligamiento y recombinacinAnlisis del ligamiento de dos en dos y luego de tres en tres (va ordenador)Integracin en un mapa

IndividuocarcterF21F22F23F24F25............F299F21000A,aAAAaAaAB,bBBBbBbBbbbBBbb....Enfermedad/no En.No EENo ENo EENo ENo ED,dDdDdDDDdddDdDd

7. Ligamiento y recombinacinLa unin secuencial de marcadores al mapa va produciendo grupos de ligamientoEn un mapa saturado (un gran nmero de marcadores separados entre si por pocos cM, cubriendo todo el genoma) el nmero de grupos de ligamiento es igual al nmero de cromosomas de la especie.Para qu un mapa si hay un proyecto genoma?

7. Ligamiento y recombinacinLigamiento al sexo (segmento apareante).El estudio de este fenmeno se realizar mediante la resolucin de uno de los problemas del cuaderno de ligamiento y recombinacin.Parasexualidad en virus y bacterias. El anlisis gentico no se limita a organismos con meiosis (diploides) como los estudiados a lo largo de este curso. Es posible realizar anlisis gentico en organismos como virus o bacterias. De hecho, en los comienzos de la biologa molecular algunos conceptos clave sobre la funcin del gen fueron descubiertos mediante estudios genticos en E. coli y sus bacterifagos.En general estos estudios pasan por la obtencin de algn tipo de cigoto y el anlisis de los productos resultantes de esta estructura transitoria.

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. Bacterifagos:El ciclo de infeccin de un bacterifago (T4) Periodo latente, el genoma viral toma el control y el metabolismo bacteriano se desva hacia la elaboracin de componentes virales

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. El manejo de bacterifagos requiere trabajar con calvas de lisis en tapices bacterianos.Enseguida se observo que era posible identificar fenotipos asociados a distintas estirpes de bacterifagos, como la morfologa de las calvas y la especificidad del hospedadorSi dos bacterifagos infectan la misma bacteria es posible que se produzca recombinacin entre los genomas virales. Hershey y Rotman realizaron el siguiente experimento en el fago T2 (1949):h+ (especfico de E. coli cepa B), h (infecta tambin E. coli cepa B-2)r+ (lisis lenta), r (lisis rpida)

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. hr+ X h+rfr = 24/100 = 0.24Hacia 1950, Benzer utilizo el tremendo poder de resolucin del anlisis gentico en fagos (poda medir fr de 10-8) para detectar recombinacin intragnica en T4 (locus rII)

7. Ligamiento y recombinacinEn la recombinacin intragnica, es posible la complementacin entre dos alelos mutantes de un gen:Segn el test de alelismo es imposible que el cruzamiento de dos individuos mutantes a1a1 X a2a2 de lugar a un individuo de fenotipo silvestre (a1a2 = mutante).Lo que Benzer observo es recombinacin entre dos versiones mutantes de un gen, para dar lugar a un gen funcional.Los experimentos de Benzer permitieron interpretar los resultados del anlisis gentico a la luz de los conocimientos sobre la naturaleza molecular del gen

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. En bacterias, el anlisis gentico implica la obtencin de un merocigoto, un individuo portador del genoma bacteriano (circular) y un fragmento lineal de un genoma donanteLa informacin contenida en el fragmento lineal se pierde si no se integra por recombinacin en el genoma huspedEl tipo de caracteres analizados incluye resistencias a antibiticos y auxotrofas.

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. Estudiaremos dos de los mtodos de obtencin de merocigotos, transformacin gentica y conjugacin.El descubrimiento de la transformacin bacteriana est en el origen del descubrimiento del DNA como material hereditario. El mtodo consiste en tratar las bacterias con DNA, stas tienen la propiedad (facilitada por tratamientos qumicos, electroporacin...) de captar DNA del ambiente e incorporarlo al genoma por recombinacin.El DNA transformante puede ser un plsmido con capacidad replicativa, en ese caso no es necesaria la integracin en el genoma. Esto no permite realizar anlisis gentico pero resulta de gran utilidad en ingeniera gentica

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. La conjugacin, el factor F.La conjugacin es un mecanismo comn de transferencia gnica en bacterias.En E. coli, se descubri un plsmido, el factor F (de fertilidad) capaz de replicarse y pasar a clulas F-, transformndolas en F+.Ocasionalmente, el factor F puede integrarse en el genoma bacteriano, dando lugar a una cepa Hfr (alta frecuencia de recombinacin).La transferencia de F desde cepas Hfr a cepas F- implica transferencia de DNA bacteriano (distinto al factor F), de hecho F es el ltimo DNA que entrara en la cepa receptora

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. El proceso de transferencia completo (unos 4400 genes) llevara unos 100 minutos, normalmente se interrumpe antes de completarse.La presencia de marcadores en las cepas Hfr y F- permite monitorizar el proceso de entrada de genes.Es necesario que se de recombinacin para que los genes que han entrado se incorporen de forma estable en el genoma receptor, es posible medir la frecuencia de sobrecruzamiento y estimar as distancias genticas.La cepa receptora continuar siendo F- salvo que se haya completado la transferencia del cromosoma bacteriano.

7. Ligamiento y recombinacinParasexualidad en virus y bacterias. La insercin de F en el genoma bacteriano, para dar una cepa Hfr, se produce al azar.Cada cepa Hfr transmite los genes bacterianos en un orden determinado (que depende de la posicin de F en el genoma).Cuando se examinan los resultantes de la conjugacin con una cepa determinada Hfr, se observa un gradiente en la frecuencia de transferencia de los genes, que refleja su distancia relativa respecto del origen de transferencia en esa cepa particular.La conjugacin puede ser interrumpida experimentalmente (con una batidora) para monitorizar que genes han entrado en el receptor en un tiempo determinado, a partir de una Hfr concreta. En este caso no es necesario preocuparse de los eventos de sobrecruzamiento que, necesariamente, se han producido para dar lugar a la integracin de cada marcador.Los experimentos de conjugacin interrumpida permitieron construir el primer mapa gentico de E.coli, un mapa en el que los genes no estan separados por unidades de recombinacin sino por minutos.