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ndice0 Introduccin1 Objeto2 Formas moleculares3 Significacin clnica4 Mtodos de identificacin5 Recomendaciones6 Anexo A7 Bibliografa

0 INTRODUCCINLa medida de la concentracin cataltica de -amilasa (EC3.2.1.1) en el suero y en la orina es el examen de laboratorioms usado para el diagnstico y seguimiento de la pancreatitisaguda. La medicin de la concentracin de su isoenzima pan-cretica tiene mayor especificidad diagnstica que la de la -amilasa total, pero no est disponible en muchos laboratorios(1). La presencia en el suero de formas macromoleculares de la-amilasa o macroamilasas reduce la especificidad y porconsiguiente su eficiencia diagnstica al producir una eleva-cin artificial de su concentracin con los procedimientos demedida habituales.

La existencia de la macroamilasa fue demostrada inicial-mente por Wilding en 1964 (2) y el trmino se acept univer-salmente en 1967 a partir del estudio de Berk (3), quien la des-cribi como el resultado de la unin no covalente de la-amilasa plasmtica circulante con otros constituyentes, fun-damentalmente protenas, formando un complejo de alta masamolar, enzimticamente activo, que no puede ser filtrado porlos glomrulos renales.

1 OBJETO

El objeto de este documento es describir las formas molecula-res de -amilasa denominadas macroamilasas, valorar su posi-ble significado clnico, describir los mtodos de identificaciny recomendar los procedimientos para su deteccin y estudio.

2 FORMAS MOLECULARES

Las diferentes formas de macroamilasa han sido descritas con-siderando su coeficiente de sedimentacin, su composicin ylos criterios analticos.

Levitt y colaboradores describieron dos formas en 1968(4,5). La primera de ellas tiene un coeficiente de sedimenta-cin de 11s, se asocia a malabsorcin y est formada por launin de la -amilasa y la inmunoglobulina A. La otra forma,con un coeficiente de sedimentacin de 7s, no se asocia a ma-labsorcin y no se debe a la unin de la enzima con una inmu-noglobulina.

Berggren y Levitt propusieron en 1974 la existencia de unatercera forma (6), pero no describieron sus caractersticas, po-siblemente por aparecer de forma transitoria. Una posible ex-plicacin de su presencia en el plasma sera que en algunas en-fermedades se produce una sntesis de protenas anormales concapacidad potencial de unirse a la -amilasa y producir uncomplejo con actividad enzimtica, que desaparecera al resol-verse la disproteinemia asociada al cuadro clnico.

La masa molar de la -amilasa es de 54000 g/mol, mientrasque la de la macroamilasa puede variar entre 150000 y2000000 g/mol (6,7), dependiendo de su composicin. Se dis-tinguen tres posibles tipos de complejos (8):

a) Complejos formados por polmeros de -amilasa.b) Complejos de -amilasa e inmunoglobulinas (IgA y con

menor frecuencia IgG) que se unen en la regin Fab de la in-munoglobulina formando complejos antgeno-anticuerpo, obien unin de la enzima con otras protenas plasmticas (4,8).

c) Complejos de -amilasa con sustancias no proteicascomo polisacridos (9) o con sustitutos del plasma como el hi-droxietilalmidn (10,11).

Considerando criterios analticos, Fridhandler y Berk (12)definieron tres tipos de macroamilasa:

Tipo 1. Es la primera que se describi y la ms frecuente. Secaracteriza por dar lugar a una concentracin cataltica de -amilasa en el plasma persistentemente elevada y a una concen-tracin cataltica de -amilasa en la orina dentro de los lmitesde referencia. El cociente entre la concentracin cataltica demacroamilasa y de -amilasa en el plasma (M/A) es alto.

Tipo 2. La concentracin cataltica de -amilasa en el plas-ma es elevada, pero en la orina no se encuentra siempre dismi-nuda. El cociente M/A es menor que en el tipo 1.

Tipo 3. Las concentraciones catalticas de -amilasa en elplasma y en la orina se hallan dentro de los intervalos de refe-

Documento QUMICA CLNICA 2002; 21 (2) 74-79

Recomendaciones para la deteccin y estudio de las interferencias pormacroamilasas en la determinacion de -amilasaSociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa MolecularComit CientficoComisin de Interferencias y Efectos de los Medicamentos en Bioqumica Clnica1

Documento L, Fase 3, Versin 2Documento preparado por Mara del Patrocinio Chueca Rodrguez y Jos Luis Castao VidrialesCon la colaboracin de Ana Grijalba Uche, Sergio Garca Merlo y Mercedes Palacios Sarrasqueta

1Composicin de la Comisin: F. Antoja Rib, M.T. Casamaj Dalmau, J.L.Castao Vidriales, M.P. Chueca Rodrguez (presidenta) , M.V. Domenech Clar ,H. Douezi Lecha, M.D. Fernndez Delclos, R. Galimany Sol , N. Gascn Roche,J.M. Gelabert Orench , R. Gell Mir , I. Rojo Vizcano y S. Ventura Pedret

rencia, con valores bajos del cociente M/A.La isoenzima presente en el complejo puede ser de origen

salival, pancretico o coincidir ambas, siendo ms frecuente laprimera de ellas (13). Las sustancias que se unen a las isoenzi-mas para formar las macroamilasas son las que determinan larelacin entre ambas isoenzimas en el complejo, teniendo laisoenzima salival una mayor afinidad de unin a dichas sustan-cias. En la tabla I se presenta un esquema de la clasificacin deFridhandler y Berk con algunas modificaciones de los autoresde este documento (12,14).

3. SIGNIFICACIN CLNICALa presencia de una macroamilasa no est claramente asociadaa una enfermedad orgnica especfica, adems los escasos es-tudios sobre su prevalencia dificultan el establecimiento deconclusiones claras (15).

Una limitacin importante para el conocimiento de su preva-lencia real es que los diferentes autores realizan los estudios enpoblaciones de pacientes hospitalizados o ambulatorios, queno pueden ser comparadas entre s ni con la poblacin sana.

La prevalencia de macroamilasas en pacientes hiperamilas-micos oscila entre un 1% y un 10% (16,17,18), mientras queen los normoamilasmicos se estima entre un 1% y un 2%(19,20,21).

No se observa una distribucin geogrfica o racial especfi-ca, pero s es ms habitual en personas cuya edad se encuentraentre 50 y 70 aos. Respecto al sexo existen discrepancias,desde la presencia de diferencias menores o nulas (14,22,23)hasta una frecuencia doble en el sexo masculino (24).

Se ha establecido una asociacin entre la presencia de ma-croamilasas y el dolor abdominal, pero se debe tener en cuentaque la medicin de la concentracin cataltica de -amilasaest indicada en el diagnstico diferencial de las enfermedadespancreticas, frecuentemente asociadas a este sntoma, por loque esta asociacin presenta un cierto sesgo (6,13,25).

Las primeras descripciones de macroamilasas se realizaronen pacientes con alteraciones del ritmo intestinal, bien con es-treimiento (3) o bien con atrofia de vellosidades intestinales ymalabsorcin (2,4). Posteriormente se ha observado la existen-cia de la macroenzima en pacientes con enfermedad celaca enlos que la dieta exenta en gluten produjo no slo la desapari-cin de los sntomas clnicos sino tambin la de la macroami-lasa (26).

Se describen macroamilasas en sujetos aparentemente sanospero tambin en un nmero variado de alteraciones pancreti-cas endocrinas (24,27,28) y exocrinas (25), en presencia de en-fermedades hepticas (24) y hepatobiliares (13,16,29), en tu-mores de diversas localizaciones (8,16), en linfomas(30,31,32) y en el alcoholismo crnico (16,25,33).

Es frecuente su asociacin con enfermedades autoinmunescomo la artritis reumatoide (34,35), la glomerulonefritis crni-ca (16), el lupus eritematoso sistmico (18,36), la espondilitis

anquilopoytica (37) o la polimialgia reumtica (38), aunqueno existe evidencia del mecanismo inmunolgico que podradar lugar a la macroenzima. Existen tambin pacientes asinto-mticos VIH positivos (39), con sida (40) o con crioglobuline-mia (41), en los que se han descrito macroamilasas.

Si coexisten macroamilasa y macrolipasa el diagnstico di-ferencial del paciente puede resultar ms complejo (42,43).

El principal inters de la deteccin de la macroamilasa,mientras no se encuentre una relacin clnica de causa-efecto,es la necesidad de diferenciarla de la verdadera elevacin pato-lgica de la concentracin de -amilasa que requiere un trata-miento especfico, fundamentalmente en la pancreatitis aguda.Sin embargo, es aconsejable registrar en la historia clnica laexistencia de la macroenzima para evitar exploraciones diag-nsticas innecesarias.

4 MTODOS DE IDENTIFICACINActualmente no hay procedimientos especficos para la medi-cin de la concentracin de las macroamilasas, pero su exis-tencia puede sospecharse cuando se obtienen valores de laconcentracin cataltica de -amilasa en el plasma elevadosrespecto a los de otras enzimas pancreticas o a los de -ami-lasa en la orina, que pueden estar dentro de los lmites de refe-rencia (44).

Tambin podemos considerar indicativo de sospecha la ob-tencin de una excrecin fraccional de -amilasa respecto alcreatininio menor del 1%, debido a que la elevada masa molarde la macroenzima impide su filtracin glomerular (45). La ex-crecin fraccional se obtiene multiplicando por 100 el cocienteentre la excrecin de -amilasa y de creatininio. Este criterioposee limitaciones porque la excrecin de la isoenzima pan-cretica es superior a la de la salival, por lo que una hiperami-lasemia de predominio salival podra confundirse con la pre-sencia de una macroamilasa (46). Hay que considerar laposibilidad de encontrar valores elevados de la excrecin frac-cional en pacientes con macroamilasemia y neoplasia renal(47).

Desde un punto de vista clnico hay ciertas caractersticasgenerales que orientan hacia la existencia de una macroenzima(15,22,25,48):

1) Discordancia entre una concentracin cataltica elevadade la enzima en el suero y la ausencia de datos clnicos relacio-nados.

2) Persistencia de la elevacin de la concentracin catalticade la enzima en el suero, cuyos valores no descienden segncorresponderan a su semivida, debido a que la macroenzimatiene una semivida mayor.

Los mtodos de identificacin de la macroenzima son:

ElectroforesisSe puede realizar en agarosa o en acetato de celulosa. La acti-vidad del complejo se detecta como una banda nica con me-nor movilidad electrofortica que la -amilasa, debido a sumayor masa molar y no por una menor carga elctrica. La ban-da migra hacia el nodo. La inmunoelectroforesis permitir sa-ber si la sustancia unida a la enzima es una inmunoglobulina(49,50).

Este mtodo aislado no parece permitir la correcta identifi-cacin de las macroamilasas (25,51), aunque algunos autoreslo consideran tcnica de eleccin realizando un tratamiento

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Tabla I. Clasificacin de Fridhandler y Berk.

TIPO -Amilasa (plasma) -Amilasa (orina) M/A

1 Lmites referencia ALTO2 NO BAJO3 Lmites referencia Lmites referencia BAJO

previo de las muestras con ficina que permite separar las iso-enzimas de sus formas macromoleculares (52,53).

La tcnica es sencilla y semicuantitativa, precisando un rigu-roso control del procedimiento para que los resultados sean re-producibles. No es apropiada para ser utilizada de urgencia yse deben tener precauciones con la conservacin del suerocuya estabilidad es de 1 semana a 4 C y de 6 a 12 meses a20 C. Para conservaciones prolongadas se recomienda ha-cerlo a 70 C (44).

CromatografaLa cromatografa de filtracin sobre gel en columna es el pro-cedimiento ms utilizado para la deteccin y estudio de lasmacroamilasas. Se puede usar gel de dextrano (9,54), poliacri-lamida (6,7) o agarosa, encontrando la macroamilasa en el vo-lumen muerto de la columna y la -amilasa en el volumen pos-terior.

La modificacin del mtodo de Fridhandler (54) es uno delos ms utilizados (21,55). Su fundamento es la separacinmediante filtracin en gel de dextrano de la -amilasa unida yde la -amilasa libre.

En la grfica se representa en ordenadas la concentracin ca-taltica de la enzima y en abscisas el nmero de la fraccin co-rrespondiente. El rea sombreada representa la curva de -amilasa y la no sombreada es la de las protenas (Figura 1).

En los sueros de la poblacin de referencia se observa unpico correspondiente a la -amilasa no unida en las fracciones20-40.

En sueros con macroamilasa se observa un primer pico in-mediatamente despus del espacio muerto entre las fracciones10-20 que pertenece a la macroenzima y un segundo pico para

la -amilasa en las fracciones 20-40.Si representamos en orde-nadas la absorbancia a 280 nm y en abscisas el nmero de lafraccin se encuentran los picos correspondientes a las inmu-noglobulinas que se unen a la enzima (Figura 1).

Algunos autores consideran que la combinacin de la tcni-ca electrofortica con la cromatogrfica proporciona buenosresultados para la identificacin de la macroenzima (25).

Una variante es la cromatografa lquida de alta resolucinque proporciona una rpida cuantificacin de la macroamilasa,pero el equipamiento necesario no est al alcance de todos loslaboratorios (56).

PrecipitacinEl mtodo utilizado es el de Levitt y Ellis (57) que se basa enla capacidad del polietilenglicol 6000 para la precipitacin di-ferencial de macromolculas.

Un porcentaje de precipitacin igual o mayor al 73 % supo-ne la existencia de macroamilasa, mientras que en la poblacinde referencia no supera el 52 % (17,57,58). Otros autores esta-blecen los porcentajes en 71% y 61% respectivamente (59),existiendo variacin en las recomendaciones (18,21,32,55).

El mtodo de Isham (17) vara la concentracin de polieti-lenglicol 6000 a la mitad, pero Gillet (60) recomienda la de240 g/L de Levitt (57) ya que obtiene mejores resultados.

Es un procedimiento rpido y sencillo que no es adecuadopara la deteccin de la macroamilasa de tipo III. Se puede utili-zar combinado con el mtodo cromatogrfico.

5 RECOMENDACIONES

1. Se puede sospechar la presencia de una macroamilasacuando se observan elevaciones de la concentracin catalticade -amilasa en el plasma con valores de las restantes enzimaspancreticas dentro de los lmites de referencia o con una con-centracin cataltica de -amilasa en la orina dentro de los l-mites de referencia.

2. Un dato complementario orientativo sera la presencia deuna excrecin fraccional de -amilasa respecto a creatininiomenor del 1 %.

3. La interferencia producida por las macroamilasas en lamedida de la concentracin cataltica de la -amilasa se puedeevitar con la utilizacin de la medida de la concentracin cata-ltica de la -amilasa pancretica.

4. La correcta identificacin de una macroamilasa se realiza-r mediante el procedimiento del Anexo A.

5. Se elige un valor discriminante de 73% para el mtodo deprecipitacin con polietilenglicol 6000, aunque es recomenda-ble que cada laboratorio establezca su propio valor discrimi-nante.

6. La utilizacin del procedimiento cromatogrfico es mscompleja, por lo que la identificacin de la composicin de lamacroamilasa puede no estar al alcance de todos los laborato-rios.

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Fracciones

Abs

orba

ncia

(28

0nm

)

-A

mila

sa (k

at/L

)

Figura 1. Perfil de elucin cromatogrfica de un suero macroamilasmicorealizado en columna de filtracin sobre gel de Sephadex G200. Las protenas sedeterminaron a 280 nm tras su elucin en una solucin tamponada de Tris 50mmol/L pH 7,2; se recogieron fracciones de 400 l. (Grfica cedida por la Dra.Ana Grijalba)

6 ANEXO A

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Normal

(-)

73%

(-)

Concentracin cataltica de-amilasa pancretica

Precipitacincon polietilenglicol

Concentracin cataltica elevada de -amilasa en el plasma

Concentracin cataltica detriacilglicerol-lipasa en el plasma

y -amilasa en orina

Aumentadas Normal

(-) Cromatografa

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