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Instrucciones de uso para el SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD para sistemas DHPLC Página 0

Instrucciones de Uso para el SURVEYOR® Scan NRAS Kit

Exons 2, 3 & 4 CE IVD para Sistemas DHPLC

Lea detenidamente estas instrucciones de uso antes de utilizar este producto. Conserve estas instrucciones de uso para futura referencia.

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Índice 1 Fabricante ....................................................................................................................................... 3 2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD ................................................................... 3

2.1 Uso previsto .............................................................................................................................................. 3 2.2 Indicaciones de uso .................................................................................................................................. 3

3 Principios del ensayo SURVEYOR Scan para detección de mutaciones de NRAS ............... 4 3.1 KRAS y NRAS ............................................................................................................................................. 4 3.2 Análisis de muestras de pacientes usando kits SURVEYOR Scan .............................................................. 4 3.3 SURVEYOR Nuclease ................................................................................................................................. 5

4 Trazabilidad de los controles del kit ............................................................................................ 6 5 Componentes ................................................................................................................................. 7

5.1 Número de muestras que se pueden estudiar con un kit ........................................................................ 7 5.2 Secuenciación del ADN ............................................................................................................................. 8

6. Equipo y reactivos necesarios adicionales ............................................................................... 8 7 Preparación de reactivos .............................................................................................................. 8 8 Conservación y periodo de validez ............................................................................................. 9 9 Advertencias y precauciones ....................................................................................................... 9 10 Recogida, manipulación y conservación de las muestras primarias .................................... 9 11 Procedimiento del ensayo ........................................................................................................ 10

11.1 Detección de mutaciones somáticas con kits SURVEYOR Scan: descripción ........................................ 10 12 Instrucciones paso a paso ....................................................................................................... 11

12.1 Configuración/calibración inicial de DHPLC ......................................................................................... 11 12.2 Consideraciones antes del análisis de muestras NRAS ......................................................................... 11 12.3 Consideraciones sobre las plantillas ..................................................................................................... 11 12.4 Consideraciones sobre el flujo de trabajo ............................................................................................ 12 12.5 Protocolo de amplificación ................................................................................................................... 14 12,6 Programa del termociclador para el protocolo de amplificación ......................................................... 16 12,7 Control de calidad de los productos de la RCP ..................................................................................... 16 12.8 Digestión con SURVEYOR Nuclease ...................................................................................................... 17

13 Procedimientos de control ....................................................................................................... 18 13.1 Control de calidad del SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD .............................................. 18 13.2 Uso de ADN de plásmidos de control ................................................................................................... 19

14 Interpretación de resultados .................................................................................................... 19 14.1 Análisis de NRAS Exons 2, 3 & 4 usando SURVEYOR Nuclease ............................................................. 19 14.2 Revisión de datos de los resultados de SURVEYOR Scan ...................................................................... 19 14.3 Ejemplos de resultados ........................................................................................................................ 21

15 Características de rendimiento ................................................................................................ 24 15.1 Nivel de detección de mutaciones mediante kits SURVEYOR Scan ...................................................... 24 15.2 Confirmación de secuencia .................................................................................................................. 24 15.3 Limitaciones del procedimiento de ensayo .......................................................................................... 24

Apéndice A ...................................................................................................................................... 26 A.1 Plan de configuración de placas para kits SURVEYOR Scan ................................................................... 26 A.2 Marcas de ADN de control ..................................................................................................................... 26 A.3 Desnaturalización HPLC (DHPLC) requisitos del sistema ........................................................................ 27 A.4 Configuración del laboratorio para ensayos RCP ................................................................................... 28 A.5 Bibliografía ............................................................................................................................................. 29

Apéndice B ...................................................................................................................................... 30 Guía de Solución de Problemas .................................................................................................................... 30

Datos de pedido .............................................................................................................................. 37 Datos de contacto ........................................................................................................................... 37 Traducción Disclaimer ................................................................................................................... 37 Licencias marcas comerciales y copyright ................................................................................. 38

1 Fabricante


1 Fabricante

Fabricante M Transgenomic, Inc.

12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel 1-402-452-5400

Representante CE P

Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK

Tel +44-141-892-8800

2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD

2.1 Uso previsto

Solo para uso profesional. El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD de Transgenomic es un ensayo de diagnóstico in vitro que detecta mutaciones somáticas en los Exons 2, 3 y 4 del gen NRAS. Estas mutaciones se indican mediante picos de división de SURVEYOR Nuclease e incluyen las mutaciones con potencial conocido por su relevancia clínica. Este kit está diseñado para usar en un laboratorio de diagnóstico clínico por parte de personal debidamente formado que estudie ADN extraído de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina.

Este kit, con número de catálogo 710400, se suministra como una caja única que contiene los componentes indicados a continuación. Estas instrucciones de uso están disponibles para su descarga en http://world.Transgenomic.com/files/literature/482296-ES.pdf.

2.2 Indicaciones de uso

Los médicos pueden usar el SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD con sistemas DHPLC para que les ayude a decidir si los tumores de cáncer colorrectal de los pacientes pueden responder o no a un tratamiento contra el EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) como panitumumab.

El SURVEYOR Scan NRAS kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD va dirigido a su uso para el análisis de las muestras que determinadas como KRAS Exon 2 Wild-Type después del análisis mediante el SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD. Este también debe utilizarse en combinación con el SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD.

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD no debe usarse para el diagnóstico del cáncer colorrectal u otros cánceres.

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD es un ensayo que detecta la presencia de posibles mutaciones somáticas de los Exons 2, 3 & 4 del gen NRAS pero no confirma la identidad de la secuencia de la mutación. Para confirmar la mutación precisa detectada, se necesitarían más análisis, como secuenciación del ADN.

Aunque los resultados del análisis con este kit indicarán el estado de mutación del paciente, deben tenerse en cuenta otros factores clínicos, incluidas las mutaciones en NRAS Exons 2, 3 & 4. Los resultados obtenidos usando el SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD no deben ser el único método utilizado para tomar decisiones en relación con el tratamiento de los pacientes con cáncer colorrectal.

Es importante señalar que el uso de DHPLC para identificar muestras con resultado positivo para una mutación de NRAS con este kit solo debe utilizarse como orientación y todas las mutaciones deben confirmarse con otros análisis, como secuenciación del ADN.

http://world.transgenomic.com/files/literature/482296-ES.pdf

3 Principios del ensayo SURVEYOR Scan para detección de mutaciones de NRAS



3.1 KRAS y NRAS

Los agentes terapéuticos que tienen como objetivo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) han demostrado ser efectivos contra el cáncer colorrectal. Las investigaciones han indicado que alrededor del 40% de los tumores colorrectales presentan mutaciones somáticas del gen KRAS y los estudios clínicos han demostrado que las mutaciones del KRAS exon 2 (codones 12 y 13) predicen la falta de respuesta a los tratamientos contra el EGFR. Estudios recientes han demostrado que la población de pacientes puede refinarse más, ya que los pacientes cuyos tuyores mCRC albergan una mutación adicional de los KRAS exons 3 y 4, así como de los NRAS exons 2, 3 y 4, también tienden a no responder a los tratamientos contra el EGFR

1-7. Este kit está diseñado para su uso en el análisis diagnóstico de mutaciones somáticas

de NRAS Exons 2, 3 & 4.

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD es un ensayo para detectar todas las pequeñas alteraciones de inserción/eliminación y secuencia en los Exons 2, 3 & 4 del gen NRAS. Las mutaciones en los codones NRAS 12, 13, 59, 61 y 146 se han asociado con la falta de efectividad de panitumumab. En este kit se suministran Positive Controls para las mutaciones en los codones 12, 61 y 146.

Este kit utiliza la tecnología SURVEYOR Nuclease patentada por Transgenomic y, en combinación con DHPLC, ofrece una detección sencilla y sensible de posibles mutaciones. Es capaz de detectar una mezcla de mutante del 2-5% contra un fondo de ADN no mutante. Los estudios de validación han demostrado una concordancia muy alta con la secuenciación en muestras de cáncer colorrectal bien caracterizadas. El uso del SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD disminuirá la carga de secuenciación del usuario al tiempo que ayudará a la valoración de secuencias cuando un software de secuenciación automatizado no resuelva la presencia de una mutación de bajo nivel.

Debido a la alta sensibilidad de este ensayo en relación con la secuenciación Sanger, se recomienda optimizar la configuración del laboratorio para evitar la contaminación cruzada de controles o muestras. Para obtener un ejemplo de una configuración de laboratorio ideal, consulte el Apéndice A.4 Configuración de laboratorio para ensayos RCP.

3.2 Análisis de muestras de pacientes usando kits SURVEYOR Scan

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD solo debe usarse en el contexto de uno de los flujos de trabajo que se indican a continuación.

Figura 1 Flujos de trabajo del kit de detección de mutaciones SURVEYOR Scan para el ensayo de KRAS y NRAS

Muestra de paciente

Analizar KRAS Exons 2, 3 & 4 y NRAS Exons 2, 3 & 4

Notificar resultado

Flujo de Trabajo A Muestra de paciente

Analizar KRAS Exon 2

Notificar resultado

Analizar KRAS Exons 3 & 4 y NRAS Exons 2, 3 & 4

Resultado KRAS Codon 12 o 13 Wild-Type

Resultado Mutación en KRAS

Codon 12 o 13

Notificar resultado

Flujo de Trabajo B



Para una sugerencia sobre cómo configurar las placas de 96 pocillos para el análisis de todos los KRAS y NRAS Exons 2-4, consulte el Apéndice A.1 Plan de configuración de placas para kits SURVEYOR Scan.

3.3 SURVEYOR Nuclease

La SURVEYOR Nuclease de Transgenomic es una endonucleasa de ADN vegetal específica de discordancias, que puede estudiar mutaciones y polimorfismos tanto conocidos como desconocidos de ADN heteroduplex

8. La enzima divide el ADN con una elevada especificidad en

localizaciones de discordancia de sustitución de bases y otras distorsiones. Esta endonucleasa del ADN corta ambas cadenas de un heterodúplex de ADN en el lado 3 del lugar de la discordancia. Se reconocen todas las discordancias de inserción/eliminación y todas las discordancias de sustitución de bases, pero la eficiencia de la división varía con la secuencia de la discordancia.

La SURVEYOR Nuclease se ha usado en diversos contextos para detectar con exactitud diversas mutaciones y polimorfismos en los genes. Se ha usado especialmente la SURVEYOR Nuclease para verificar la presencia de mutaciones conocidas en diversos genes asociados al cáncer renal, el cáncer de pulmón, el cáncer de cabeza y cuello, la leucemia, el cáncer endometrial y en la predicción del resultado de al radioterapia

9,10,11.

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD se ha diseñado para cortar discordancias en los NRAS Exons 2, 3 & 4 para el análisis posterior mediante DHPLC.

Nota: si una muestra presenta ADN mutante 100%, no es posible formar heterodúplex y la muestra aparecerá como “Wild-Type”. Sin embargo, las muestras de la biopsia tumoral contendrá células Wild-Type debido a la heterogeneidad del tumor y/o la contaminación de tejido normal; tenga en cuenta que este kit detecta Wild-Type del 5% con trazas idénticas a ADN mutante 5%.

Nota: para este ensayo solo debe usarse la polimerasa del ADN suministrada con este kit.

Nota: tenga en cuenta las instrucciones específicas del manual de su sistema DHPLC.

Para usar este kit satisfactoriamente, recomendamos encarecidamente que lea a fondo este manual y siga cuidadosamente las instrucciones y directrices facilitadas. Las personas que lo usen por primera vez deben realizar los experimentos de control indicados en la sección "Uso del ADN de plásmidos de control".

Si tiene alguna pregunta o necesita ayuda, llame al (888) 233-9283 (solo en Norteamérica), +1 (402) 452-5400 o al +44 (0) 141 892 8800 (Europa) y solicite “soporte NRAS”. De forma alternativa, puede escribirnos un correo electrónico a:

[email protected]

Figure 2. Mode of action of SURVEYOR Nuclease. The endonuclease recognizes a mismatch and cleaves at the 3’ side of each base in the mismatch. This cleaves the DNA double strand, leaving a single base 3’ overhang.

mailto:[email protected]

4 Trazabilidad de los controles del kit


4 Trazabilidad de los controles del kit

Los controles suministrados con este kit son clones plásmidos de secuencias de los NRAS Exons 2, 3 & 4. Todos los clones se han secuenciado para comprobar la fidelidad de la secuencia por comparación con la NCBI Reference Sequence: NG_007572.

Los controles tienen una “marca” genética. Consulte el Apéndice A.2 Marcas de ADN de Control; esta variación de la secuencia NRAS Wild-Type, en una región donde no se espera que existan mutaciones, pueden usarse también para diagnosticar la contaminación de la muestra mediante Positive Controls. Consulte el Apéndice B – Guía de Solución de Problemas, problema 8, para obtener un ejemplo de una traza SURVEYOR Scan de dicha contaminación.

El “NRAS Control Wild-Type” se ha desarrollado mediante síntesis y clonación del NRAS Exons 2, 3 & 4 usando la secuencia de referencia NCBI mencionada anteriormente.

El “NRAS Positive Control Exon 2” se ha desarrollado mediante síntesis del NRAS Exon 2 usando la secuencia de referencia anterior pero conteniendo mutación del G12D. La secuenciación del ADN confirmó que el único cambio en la secuencia está en el codon 12 con una alteración G12D, GGT>GAT. Después, este clon se combina con el ADN de NRAS Control Wild-Type para crear una mezcla heterozigótica.

El “NRAS Positive Control Exon 3” se ha desarrollado mediante síntesis del NRAS Exon 3 usando la secuencia de referencia anterior pero conteniendo mutación del Q61K. La secuenciación del ADN confirmó que el único cambio en la secuencia está en el codon 61 con una alteración Q61K, CAA>AAA. Después, este clon se combina con el ADN de NRAS Control Wild-Type para crear una mezcla heterozigótica.

El “NRAS Positive Control Exon 4” se ha desarrollado mediante síntesis del NRAS Exon 4 usando la secuencia de referencia anterior pero conteniendo mutación del A146T. La secuenciación del ADN confirmó que el único cambio en la secuencia está en el codon 146 con una alteración A146T, GCC>ACC. Después, este clon se combina con el ADN de NRAS Control Wild-Type para crear una mezcla heterozigótica.

5 Componentes


5 Componentes

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD se compone de (1) un paquete de componentes de digestión SURVEYOR con 10 tubos de reactivo sin orificios vacíos y (2) un portatubos de controles y componentes RCP que contiene 13 tubos de reactivo y 7 orificios vacíos.

Número de

catálogo Componente

Color del tapón del

tubo

Volumen de kit de 100 reacciones

incluido

Envase de componentes de digestión SURVEYOR

710160 SURVEYOR Nuclease W Morado 2 x 105 µL

710161 SURVEYOR Enhancer W2 Negro 105 µL

708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 105 µL

708027 0.15 M MgCl2 Solution Marrón 105 µL

708030 SURVEYOR Stop Solution Rojo 250 µL

710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µM) Naranja 2 x 125 µL 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µM) Naranja 2 x 125 µL

Envase de controles y componentes RCP

703310 DNA Polymerase Rojo 100 µL 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Transparente 1 mL 703065 dNTPs (10 mM) Transparente 500 µL

710452F NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µM) Azul 90 µL

710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µM) Azul 90 µL





710441 NRAS Control Wild-Type Mix Amarillo 120 µL

710442 NRAS Positive Control Exon 2 Verde 40 µL



482296 Instrucciones de uso Descarga desde el sitio web*

http://world.Transgenomic.com/files/literature/482296-ES.pdf

5.1 Número de muestras que se pueden estudiar con un kit

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD está diseñado para permitir realizar la prueba en 100 reacciones. El número total de muestras que pueden estudiarse con el kit depende del promedio del tamaño del lote estudiado en cada momento, porque debe incluirse un juego de reacciones de control (Wild-Type Controls, Positive Controls y No Template Controls) en cada placa de reacción. La tabla siguiente muestra el número de muestras que se pueden analizar con el kit NRAS dependiendo del promedio del tamaño del lote de muestras, lo que tiene en cuenta (a) los 9 controles (3x Wild-Type, 3x Positive Controls, 3x Controles sin plantilla) necesarios por cada determinación y (b) el límite de 100 reacciones por kit.

Nota: Si se analizan varias placas, debe incluirse un juego de los nueve controles anteriores en cada placa. Por lo tanto, se necesitará un total de 18 reacciones de control para dos placas, 27 reacciones de control para tres placas, etc.

Cuando aumenta el tamaño del lote de muestras, se aumenta el número de muestras que se pueden estudiar con un kit, reduciendo el coste promedio de reactivos por muestra. La siguiente tabla ofrece una guía sobre el número de muestras que pueden analizarse con un solo kit.


5 Componentes


Tamaño

de lote de

muestras

N.º reacciones control

+ n.º amplicones

de muestra

N.º de reacciones

necesarias por

determinación

N.º total de

análisis de

lotes de

muestra por kit

Total de

muestras

analizadas

por kit

1 9 + 3 12 8 8

2 9 + 6 15 6 12

3 9 + 9 18 5 15

4 9 + 12 21 4 16

5 9 + 15 24 4 20

5.2 Secuenciación del ADN

Se suministran Universal Sequencing Primers (PN 710153F y 710153R) para su uso en la secuenciación del DNA de todas las muestras analizadas. Los amplicones RCP creados antes de la digestión con SURVEYOR Nuclease deben usarse para la secuenciación.

6. Equipo y reactivos necesarios adicionales

Otros componentes y equipo necesarios para utilizar el SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD para sistemas DHPLC son los siguientes:

Sistema DHPLC, columna, tampones, tamaño ADN estándar - en el Apéndice A.3.1 Especificaciones DHPLC para aplicaciones SURVEYOR Scan podrá consultar las características de un sistema DHPLC apropiado para su uso con este kit

Agua de calidad de biología molecular

Tubos RCP de 0,2 mL, tiras o placa de 96 pocillos

Micropipeteadores

Puntas de pipeta

Baño de hielo

Mezclador vorticial

Microcentrífuga

Termociclador

Equipo de electroforesis en gel de agarosa y geles de agarosa

Lejía 10% o agente limpiador similar

7 Preparación de reactivos

Todos los reactivos suministrados con este kit están listos para su uso. Algunos componentes tienen que descongelarse, agitarse vorticialmente o centrifugarse en una microcentrifugadora antes de su uso; compruebe los detalles en el Procedimiento del Ensayo, más adelante. No es necesario combinar los reactivos para producir mezclas maestras y mezclas de reacción; se ofrecen detalles completos en el Procedimiento del Ensayo más adelante.

8 Conservación y periodo de validez


8 Conservación y periodo de validez

El equipo debe conservarse a una temperatura entre -18 ºC y -25 ºC en un congelador de temperatura constante hasta su uso. Observe la fecha de caducidad de cada kit recibido. No utilice el kit después de que haya pasado la fecha de caducidad.

La mezcla de SURVEYOR Nuclease elaborada en el paso 7 de la Digestión con SURVEYOR Nuclease debe utilizarse inmediatamente, porque la SURVEYOR Nuclease W se inactiva con el tiempo cuando está en presencia de los otros componentes de la mezcla de reacción de SURVEYOR Nuclease.

9 Advertencias y precauciones

Ninguno de los reactivos de este kit presenta un riesgo para la salud en las cantidades en que se suministra. El número de documento MSD-710400 de Transgenomic puede descargarse de

http://world.Transgenomic.com/files/literature/710400-ES.pdf

En este kit no hay sustancias de origen animal o humano que presenten un riesgo de infección.

Este kit debe ser utilizado exclusivamente por personas que hayan sido formadas en las técnicas de laboratorio adecuadas. Cuando trabaje con los componentes de este kit, lleve siempre una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y protección ocular. Después del uso, los componentes del kit deben eliminarse como residuos clínicos y de acuerdo con las normas y reglamentos locales.

Las alícuotas de reactivos pipeteadas de los tubos de este kit están pensadas para un uso único. Se ha validado que los componentes de este kit siguen siendo estables después de 25 ciclos de congelación-descongelación. No utilice este kit si se supera este número de ciclos de congelación-descongelación.

10 Recogida, manipulación y conservación de las muestras primarias

El SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD para sistema DHPLC se ha validado para su uso con ADN extraído de muestras de biopsias tumorales de cáncer colorrectal fijadas en formol e incluidas en parafina. Para una extracción óptima del ADN, el tejido debe fijarse en formol durante 14-24 horas antes de ser incluido en parafina.

Las biopsias tumorales son una mezcla heterogénea de células tumorales y no tumorales. Además, el propio tumor es una mezcla heterogénea de células tumorales con mutaciones y células tumorales sin mutaciones. Debido a que estas mutaciones somáticas pueden no estar distribuidas de manera uniforme en todo el tumor, el análisis de mutaciones resultante de distintas secciones del mismo tumor puede ser diferente. Para aumentar la probabilidad de detectar una mutación, el ADN de la región tumoral del tejido debe aislarse raspando solo la zona del tumor del portamuestras de vidrio usando un nuevo bisturí estéril para cada nuevo portamuestras.

Para un uso con éxito de este kit, el ADN extraído debe cumplir los criterios indicados en Consideraciones sobre las plantillas.

NOTA: Las muestras de ADN extraídas no pensadas para el análisis inmediato con este kit deben conservarse congeladas entre -20 ºC y -80 ºC.


11 Procedimiento del ensayo


11 Procedimiento del ensayo

11.1 Detección de mutaciones somáticas con kits SURVEYOR Scan: descripción

La detección y la confirmación de mutaciones con la SURVEYOR Nuclease conlleva tres pasos:

Paso 1: preparar los amplicones RCP de ADN mutante (prueba) y normal (referencia), continuando a partir del ciclo final de amplificación por RCP para fundir todas las dobles cadenas y luego se enfría lentamente para la formación óptima de heterodúplex y homodúplex (los heterodúplex se producen cuando una cadena de una secuencia Wild-Type se hibrida con una cadena de secuencia mutante).

Paso 2: tratar una porción de la mezcla hibridada de heterodúplex/homodúplex con SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease cortará ambas cadenas de ADN heterodúplex dando lugar a fragmentos de ADN. El ADN Control Wild-Type, tratado de forma similar, sirve como control de fondo.

Paso 3: analizar los fragmentos de ADN en un sistema DHPLC. La formación de nuevos productos de rotura, debida a la presencia de una o más discordancias, se ve indicada por la presencia de picos cromatográficos adicionales. Los tiempos de migración de los productos de la rotura indican el tamaño de los fragmentos y, por tanto, la localización aproximada de la discordancia o discordancias.

13 Procedimientos de control


12 Instrucciones paso a paso

12.1 Configuración/calibración inicial de DHPLC

Al configurar la placa de SURVEYOR Nuclease para su análisis por DHPLC, consulte el Apéndice A.3 Desnaturalización HPLC (DHPLC) requisitos del sistema.

12.2 Consideraciones antes del análisis de muestras NRAS

Antes de analizar las muestras en un sistema DHPLC, debe determinarse un tamaño de ADN estándar apropiado para garantizar que el sistema funciona correctamente. El personal de laboratorio que utilice el instrumento debe comprobar la calidad de la resolución del tamaño de ADN estándar antes de proceder al análisis.

12.3 Consideraciones sobre las plantillas

1. Para ADN de plantillas aisladas de material FFIP, utilice procedimientos de laboratorio normales para evaluar la calidad y cantidad de ADN extraído para asegurar que hay una plantilla suficiente para RCP.

2. El cociente de absorbancia 260/280 debe mayor de 1,80.

3. Para acelerar la configuración de la RCP, ajuste la concentración de plantilla de trabajo en aproximadamente 12,5 ng/µL. Diluya el ADN de la plantilla en agua de calidad de biología molecular cuando sea necesario.



12.4 Consideraciones sobre el flujo de trabajo

El kit está diseñado para permitir el análisis de 100 reacciones. Pueden estudiarse lotes más pequeños de muestras, pero deben incluirse con cada lote de muestras los controles del kit y un “control sin plantilla”. Hay suficientes materiales de control en el kit para que se puedan usar 100 reacciones de todas las combinaciones de tamaños de lotes de muestras.

En general, el procesamiento de las muestras debe realizarse desde el comienzo hasta el final, como se describe en estas instrucciones de uso. Si debe interrumpirse el procesamiento de una muestra antes de que finalicen todos los pasos, el ADN deberá almacenarse a -20 °C en los puntos indicados. Sin embargo, debe evitarse la exposición de cualquier muestra congelada a ciclos repetidos de congelación-descongelación y debe evitarse la conservación congelada (de -18 °C a -25 °C) de ADN amplificado por RCP o productos de la digestión con SURVEYOR Nuclease durante períodos largos (>1 semana).

El análisis de muestras debe seguir el flujo de trabajo que se ilustra a continuación:

Aislación

de ADN y

RCPElectroforesis por Gel

Análisis SURVEYOR

Nuclease y DHPLC

SURVEYOR Scan

PositivoSURVEYOR Scan

Negativo

Evaluación RCP Robusto/Leve

NVD

Tejido

Raspado

Calidad de Secuencia

Superada

Calidad de

Secuencia

no Superada

SURVEYOR

Scan Fallido

Confirmación

de Secuencia

Mutaciones en los

codones G12, G13, A59,

Q61, K117 o A149

5

4

7 6

3

21

9

8

NVD

Figura 3 Flujo de trabajo de análisis con kit SURVEYOR Scan NRAS



Notas a la Figura 3

1. Aislar el ADN de FFIP usando procedimientos de laboratorio estándares.

2. Realizar RCP y comprobar la calidad del ADN mediante electroforesis por gel.

3. Registrar si la banda RCP es robusta (≥20 ng) o leve (<20 ng).

Si hay varias bandas RCP, preparar ADN genómico nuevo desde FFIP.

4. Con muestras evaluadas como RCP robusto o RCP leve después de la amplificación por RCP, proceder al tratamiento de SURVEYOR Nuclease y el análisis del sistema DHPLC.

Tenga en cuenta que con una valoración RCP leve, puede no haber ADN suficiente para obtener resultados significativos mediante DHPLC, pero puede haber ADN suficiente para la secuenciación.

5. Consulte el Apéndice B Guía de Resolución de Problemas para obtener ejemplos de resultados de SURVEYOR Scan fallidos. Todas las muestras con un resultado de SURVEYOR Scan fallido deben volver a procesarse:

a. repetir la RCP si queda suficiente ADN genómico

b. volver a extraer ADN desde FFIP; debe ser la segunda opción, ya que normalmente no se desea cortar otro bloque FFIP.

c. si va a utilizarse otra sección o bloque, debe repetirse todo el ensayo, ya que las discrepancias en las digestiones pueden deberse a la heterogeneidad del tumor.

6. Si no hay picos de división visibles, registrar un resultado SURVEYOR Scan negativo, como NVD = no se detecta variante.

7. Si una muestra presenta productos de división de SURVEYOR Nuclease (no coincide con el Wild-Type Control relevante), debe enviarse para confirmación mediante secuenciación.

8. Si el análisis de confirmación de secuencia es inaceptable, deberá:

a. repetir la RCP si queda suficiente ADN genómico

b. volver a extraer ADN desde FFIP; esta debe ser la segunda opción, ya que normalmente no se desean cortar preparaciones adicionales de un bloque FFIP.

9. Si el análisis de confirmación de secuencia es aceptable, los resultados deberán indicar:

a. Secuencia Wild-Type, es decir, no se detecta variante (NVD); o

b. Se detecta variante Si la confirmación de secuencia indica cualquier cambio base que produzca en un cambio de aminoácidos en:

i. codon 12

ii. codon 13

iii. codon 59

iv. codon 61

v. codon 117; o

vi. codon 146

determinar como mutación NRAS positiva.

Nota: es posible tener una valoración SURVEYOR Scan positiva que también da lugar a “No se detecta variante” en una prueba de confirmación de secuenciación. El nivel de detección (LOD) de SURVEYOR Nuclease en un sistema DHPLC es de hasta ADN mutante 2% en ADN Wild-Type 98% para algunas mutaciones, mientras que el LOD de la secuenciación es de aproximadamente ADN mutante 10-25% en ADN Wild-Type 90-75%.

Nota: si una muestra presenta ADN mutante 100%, no es posible formar heterodúplex y la muestra aparecerá como “Wild-Type”. Sin embargo, las muestras de la biopsia tumoral contendrá



células Wild-Type debido a la heterogeneidad del tumor y/o la contaminación de tejido normal; este kit detecta Wild-Type 5% con trazas idénticas a ADN mutante 5%.

Nota: los resultados SURVEYOR Scan positivos pueden deberse a cambios base distintos de los que se ha observado que son activadores de NRAS. Aunque estas mutaciones son raras, la confirmación por otros métodos, como la secuenciación del ADN, será necesaria para determinar si un resultado SURVEYOR Scan positivo es o no una mutación activadora de NRAS.

Nota: el proceso de fijación en formol usado para preparar las muestras de biopsia tumoral FFIP puede dar lugar a la desaminación de citosinas. Esta desaminación convierte la citosina en uracilo. La polimerasa “leerá” este uracilo como una timina e incorporará una adenina en las cadenas copiadas. Entonces, esto parecerá ser una mutación donde la G normal se sustituye por una A, lo que provoca una mutación G/C a A/T, una mutación de artefacto producida por el proceso de fijación que no es una auténtica mutación somática. Son sucesos poco frecuentes pero, si se copian al principio del ciclo RCP, “parecerán” mutaciones. No se reproducen al repetir el análisis.

Un ejemplo de una posible mutación por desaminación de citosina que debe tenerse en cuenta para determinar el tratamiento del paciente es NRAS A146T.

- Codon 146: GCC>ACC (A146T)

Por lo tanto, se recomienda confirmar cualquiera de estas mutaciones mediante un análisis doble del mismo ADN genómico o que todas las muestras se sometan a análisis doble desde el inicio del análisis.

12.5 Protocolo de amplificación

1. La solución de dNTP premezclada de Transgenomic (PN 703065) se suministra a una concentración de trabajo de 10mM de desoxinucleótido total (2,5 mM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos).

2. Los cebadores RCP NRAS Exon 2, Exon 3 y Exon 4 Forward y Reverse (PN 710452F/R, 710453F/R y 710454F/R) se suministran a 10 µM.

3. Extraiga los cebadores 10 µM, la solución de dNTP 10 mM y el DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) del congelador y descongele en hielo.

4. Una vez descongelados, agitar todos los componentes del kit (~10 segundos) hasta mezclar bien, centrifugar brevemente (~10 segundos) para comprobar que no queden restos de líquido en las tapas de los tubos y colocar en hielo.

5. Prepare las mezclas maestras sobre hielo.

6. Use la tabla siguiente como orientación para preparar una mezcla maestra para cada una de las reacciones NRAS Exon 2, KRAS Exon 3 y KRAS Exon 4:

Número de reacciones: 10

Cálculo del volumen:

Volumen de agua (µL) 330**

DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µL) 50

dNTPs (µL) 40

NRAS Primer Exon 2, 3 o 4 Forward (µL) 25

NRAS Primer Exon 2, 3 o 4 Reverse (µL) 25

DNA Polymerase (µL) 10

Volumen total de mezcla maestra 48.0

**Nota: El usuario debe intentar tener un mínimo de 25 ng de ADN por 50 µL de reacción. Cuando las concentraciones de ADN extraídas son inferiores al 12,5 ng/µL, aumente el volumen de ADN extraído de forma proporcional para obtener 25 ng por reacción. Reduzca también el volumen de agua en las mezclas maestras en la misma cantidad para obtener 50 µL por reacción. Todas las muestras elaboradas con estas mezclas maestras tendrán que tener ADN extraído por dilución hasta aproximadamente el



mismo nivel de concentración más bajo. No se recomienda usar concentraciones de ADN extraído inferiores a 5 ng/µL.

7. Calcule los volúmenes necesarios para cualquier mezcla maestra determinada en referencia al gráfico anterior y tenga en cuenta que:

(a) Para la mezcla maestra 1, NRAS Exon 2, se necesitan tres reacciones adicionales para el NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 y el control sin plantilla NRAS Exon 2 (NTC1).

(b) Para la mezcla maestra 2, NRAS Exon 3, se necesitan tres reacciones adicionales para el NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 3 y el control sin plantilla NRAS Exon 3 (NTC2).

(c) Para la mezcla maestra 3, NRAS Exon 4, se necesitan tres reacciones adicionales para el NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 4 y el control sin plantilla NRAS Exon 4 (NTC3).

Nota: tenga en cuenta que se necesitará un volumen de mezcla maestra ligeramente superior a este cálculo para permitir pérdidas durante el pipeteado.

8. Marque tubos de RCP de 0,2 mL o pocillos de una placa de 96 pocillos con la información adecuada de la muestra.

9. Marque tubos de centrifugadora de 20 mL para la elaboración de la mezcla maestra.

10. Añada el volumen necesario de agua de calidad de biología molecular a los tubos de centrifugadora de 2,0 mL marcados como “mezcla maestra”.

11. Añada la cantidad necesaria de DNA Polymerase 10X PCR Buffer a los tubos de mezcla maestra.

12. Añada el volumen necesario de solución dNTP de 10 mM a los tubos de mezcla maestra.

13. Añada el volumen necesario de NRAS Forward Primers a los tubos de mezcla maestra correspondientes.

14. Añada el volumen necesario de KRAS Reverse Primers a los tubos de mezcla maestra correspondientes.

15. Saque la DNA Polymerase (PN 703310) del congelador.

16. Centrifugue la DNA Polymerase durante ~10 segundos.

17. Agite la DNA Polymerase durante ~10 segundos.

18. Añada el volumen necesario de solución DNA Polymerase a los tubos de mezcla maestra.

19. Ponga el tapón a los tubos de mezcla maestra.

20. Antes de usar, agite los tubos de mezcla maestra durante ~30 segundos y, después, centrifúguelos brevemente durante ~10 segundos.

21. Conserve en hielo hasta el uso.

22. Pipetee 48.0 µL (ver la nota anterior en el punto 6) de mezcla maestra en los pocillos adecuados, cambiando las puntas de las pipetas entre medias si utiliza un pipeteador de canal única. Si usa un pipeteador de repetición, compruebe que no hay vertidos ni salpicaduras de un pocillo a otro. Mantenga la placa sobre hielo.

23. Añada 2,0 µL (ver nota anterior en el paso 6) de cada ADN de plantilla de muestra o agua (control sin plantilla, NTC) en los pocillos adecuados. Utilice puntas de pipetas separadas para cada muestra y evite la contaminación cruzada de las muestras por salpicadura. Tape los pocillos que contienen los ADN de muestra y el NTC con las tiras de 8 tapas (si utiliza una placa de 96 pocillos) o tape los tubos de RCP de 0,2 mL. Compruebe que las tapas se cierran de forma segura.

24. Solo entonces, abra los tubos de ADN de plantilla de control del kit (PN 710131, 710136, 710137, 710138) uno cada vez. Pipetee 2,0 µL de cada una de las plantillas de control al final para reducir la posibilidad de contaminar cualquier ADN de muestra. De nuevo, tape



cada pocillo con las tiras de 8 tapas (si usa una placa de 96 pocillos) o tape los tubos de RCP de 0,2 mL. Compruebe que las tapas se cierran de forma segura.

NOTA: la práctica recomendada es colocar los controles sin plantilla (NTC) en pocillos que no sean adyacentes a Positive Controls o muestras.

NOTA: Para una sugerencia sobre cómo configurar las placas de 96 pocillos para el análisis de todos los KRAS y NRAS exons 2-4, consulte el Apéndice A.1 Plan de configuración de placas para kits SURVEYOR Scan.

25. Agite vorticialmente (~1/2 velocidad) durante 10 segundos.

26. Centrifugue durante 1-2 minutos para asegurarse de recoger todas las soluciones en el fondo de los pocillos o tubos. Compruebe que las soluciones estén en el fondo de cada pocillo o tubo. En caso contrario, repita la centrifugación.

12,6 Programa del termociclador para el protocolo de amplificación

1. Utilice el siguiente protocolo del termociclador para la amplificación por RCP y la formación de heterodúplex:

Desnaturalización inicial

95 C 5 minutos

Amplificación por parada

15 ciclos 95 C 30 segundos

62 C, -0.5 ºC/cycle 30 segundos 72 C 25 segundos

Amplificación

30 ciclos 95 C 30 segundos 55 C 30 segundos 72 C 25 segundos

Extensión final

1 ciclo 72 C 2 minutos Formación de heterodúplex

95 ºC 2 minutos ≤12 C Detener

12,7 Control de calidad de los productos de la RCP

1. Se recomienda comprobar la calidad y cantidad del amplicon mediante electroforesis en gel (o método equivalente) antes de proceder a la digestión con SURVEYOR Nuclease.

2. Analice una alícuota del producto de la RCP junto con varias cantidades diferentes de una escalera de masa de ADN de 100 pb.

3. Utilice la escalera para estimar la concentración de ADN amplificado.

4. Solo debe observarse una banda única mayor de 20 ng/µL correspondiente al producto RCP principal.

5. Si hay múltiples bandas presentes, compruebe que la calidad del ADN de la plantilla de entrada era suficiente (véase Apéndice B, Guía de Solución de Problemas).

6. Si no se observa producto, compruebe que la calidad del ADN de plantilla de entrada era suficiente (véase Apéndice B, Guía de Solución de Problemas. Si la calidad cumple las especificaciones, aumente el volumen de plantilla a 4,0 µL por 50 µL de reacción (reduzca el agua por reacción a 31,0 µL).

7. No debe haber productos de RCP visibles en la muestra de control sin plantilla. Si son visibles productos del ADN, con este control, es probable la contaminación; véase el Apéndice B, Guía de Solución de Problemas.



8. Evalúe la RCP como RCP robusta o RCP leve.

a. La RCP robusta debe tener una sola banda superior o igual a 20 ng/µL.

b. La RCP leve debe tener una sola banda de menos de 20 ng/µL.

c. Proceda a la digestión con SURVEYOR Nuclease con evaluaciones de RCP tanto robusta como leve.

CONSEJO: en este punto, los productos RCP pueden almacenarse a una temperatura de -20 ºC o inferior durante un máximo de una semana.

12.8 Digestión con SURVEYOR Nuclease

1. Una vez que la RCP de la muestra se considere de calidad y cantidad suficientes, realice la reacción de digestión con SURVEYOR Nuclease como se describe a continuación.

2. Descongele los tubos que contienen la 0.15 M MgCl2 Solution y el SURVEYOR Enhancer Cofactor en hielo.

3. Añada 10,0 µL de cada muestra amplificada por RCP anterior a un nuevo tubo de RCP de 0,2 mL o a un pocillo de una placa de 96 pocillos.

4. Prepare una mezcla nueva de 0.15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 y SURVEYOR Nuclease W (mezcla de SURVEYOR Nuclease).

Utilice la tabla siguiente como guía para preparar una mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease para analizar varias muestras. El ejemplo siguiente incluye los volúmenes para una mezcla maestra de 10 muestras.

Tenga en cuenta que se necesitará un volumen de mezcla maestra ligeramente superior a este cálculo para permitir pérdidas durante el pipeteado.

Número de reacciones de digestión con SURVEYOR Nuclease:

10

Cálculo del volumen:

0.15 M MgCl2 Solution (µL) 10.0

SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL) 10.0

SURVEYOR Enhancer W2 (µL) 10.0

SURVEYOR Nuclease W (µL) 20.0

Volumen total de mezcla maestra: 50.0

Añada 5 µL de mezcla maestra SURVEYOR Nuclease a cada

Muestra amplificada por RCP (µL) 10.0

Volumen total de la reacción de digestión con SURVEYOR Nuclease:

15.0

a. Centrifugue cada reactivo antes del uso.

b. Agite con suavidad cada reactivo antes de pipetear; centrifugue brevemente durante ~10 segundos después de cada paso de agitado.

c. Para cada digestión, añada los componentes siguientes a un tubo de microcentrífuga de RCP de 0,2 mL (o mayor).

1.0 µL de 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027) 1.0 µL de SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1.0 µL de SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2.0 µL de SURVEYOR Nuclease W (PN 710160)

O añada 5 µL de muestra maestra preparada según la tabla anterior.

5. Agite suavemente la mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease durante 10 segundos a baja velocidad.



6. Centrifugue la mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease durante 10 segundos a baja velocidad.

7. Ponga en hielo la mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease hasta su uso.

Nota: La mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease elaborada en el paso 7 debe utilizarse inmediatamente, porque la SURVEYOR Nuclease W se inactiva con el tiempo cuando está en presencia de los otros componentes de la mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease.

8. Pipetee una alícuota de 5,0 µL de la mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease en cada tubo o pocillo con una alícuota de 10,0 µL de producto amplificado por RCP (ver el paso 3 anterior).

9. Una vez terminado el pipeteado, centrifugue los tubos de RCP de 0,2 mL o la placa de 96 pocillos durante 10 segundos.

10. Someta a agitación vorticial suave los tubos de RCP de 0,2 mL de muestra o la placa de 96 pocillos durante 10 segundos.

11. Centrifugue durante 10 segundos a baja velocidad (este paso es especialmente importante si se realiza la digestión en un instrumento sin tapa calefactada).

12. Incube a 42 °C durante 30 minutos.

13. Añada 1,0 µL de SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) a cada tubo o pocillo y someta a agitación vorticial suave (el volumen total de la reacción de SURVEYOR Nuclease es de 16,0 µL).

CONSEJO: los productos de digestión con SURVEYOR pueden almacenarse a ≤ -20 ºC durante un máximo de una semana.

14. Cargue los productos digeridos de las muestras en un sistema DHPLC.

Nota: Para los ajustes de gradiente del sistema DHPLC sugeridos para analizar productos de digestión con SURVEYOR Nuclease, visite http://world.Transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/DHPLCsystemsettings.


13.1 Control de calidad del SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD

Se incluyen ADN de plásmidos de control en el kit para aportar comprobaciones de control de calidad en pasos específicos del procedimiento de ensayo. Para el Protocolo de amplificación, estos controles suponen un medio de asegurar que las mezclas maestras se preparan correctamente y la amplificación está funcionando adecuadamente. Se necesitan también controles sin plantilla (en los que se añade agua en lugar del ADN plantilla) para comprobar la posible contaminación de los componentes del kit con cualquier plantilla de ADN extraña.

En la etapa de digestión por SURVEYOR Nuclease, los amplicones del ADN de plásmido de control aportan una comprobación eficaz de que las condiciones de la reacción de rotura (preparación de la mezcla maestra para digestión con SURVEYOR Nuclease y condiciones de incubación) fueron satisfactorias. En la etapa de análisis, las cromatografías del sistema DHPLC de los amplicones de control de productos digeridos con SURVEYOR Nuclease ofrecen orientación sobre dónde eluyen los picos de productos de rotura correspondientes a dichas mutaciones en los NRAS Exons 2, 3 y 4, incluso a bajos niveles (ver Figuras 4-6). Los picos de productos de rotura correspondientes a otras mutaciones de los NRAS Exons 2, 3 y 4 pueden eluir en posiciones ligeramente diferentes.

Si los amplicones de RCP no coinciden con los resultados descritos en Control de calidad de productos de RCP, consulte el Apéndice B, Guía de Solución de Problemas o póngase en contacto con el servicio técnico de Transgenomic antes de proceder con los siguientes pasos en el análisis de las muestras.

http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings




13.2 Uso de ADN de plásmidos de control

El kit se suministra con cuatro ADN de control:

NRAS Control Wild-Type; PN 710441

NRAS Positive Control Exon 2; PN 710442



Estos ADN de control son plásmidos con inserciones. Los Positive Controls contienen cada uno dos plásmidos: una mezcla del NRAS Control Wild-Type y un clon de mutación diferente del Wild-Type en un único par de bases. Los controles se facilitan en viales separados, cada uno a una concentración de 10

5 copias/µL.

Los cebadores RCP NRAS Exons 2, 3 y 4 Forward y Reverse necesarios para la amplificación por RCP se suministran de forma separada en el kit. Siga las instrucciones que encontrará en Protocolo de amplificación, Digestión con SURVEYOR Nuclease y Análisis de NRAS Exons 2, 3 & 4 usando SURVEYOR Nuclease para su uso en estos controles.

RECOMENDAMOS ENCARECIDAMIENTE QUE LAS PERSONAS QUE USEN EL EQUIPO POR PRIMERA VEZ REALICEN EXPERIMENTOS CON LOS CONTROLES

SOLOS ANTES DE ESTUDIAR MUESTRAS GENÓMICAS

14 Interpretación de resultados

14.1 Análisis de NRAS Exons 2, 3 & 4 usando SURVEYOR Nuclease

Para fines de comparación y control, realice SIEMPRE la digestión con SURVEYOR Nuclease en cada uno de los controles (Wild-Type y Positive Controls), un control sin plantilla, además de los ADN de muestra, y realice la determinación en la misma placa de muestra del sistema DHPLC.

En la etapa de digestión con SURVEYOR Nuclease, los amplicones de estos 3 ADN de plásmido de control aportan una comprobación eficaz de que las condiciones de la reacción de rotura (preparación de la mezcla de SURVEYOR Nuclease y condiciones de incubación) fueron satisfactorias. En la etapa de análisis, las trazas del sistema DHPLC de los amplicones de control de productos digeridos con SURVEYOR Nuclease ofrecen orientación sobre los fragmentos de ADN resultantes de la rotura en las localizaciones de discordancia de estas mutaciones específicas, incluso a bajos niveles (ver las Figuras 4-6).

Si alguno de los amplicones RCP o los fragmentos de rotura de SURVEYOR Nuclease derivados de los ADN de control no coinciden con los resultados descritos, consulte el Apéndice B, Guía de Solución de Problemas o póngase en contacto con la asistencia técnica de Transgenomic antes de continuar con los siguientes pasos en el análisis de las muestras.

Los ejemplos que se ofrecen a continuación son exclusivamente con fines de ilustración y NO deben usarse para determinar la identidad de una mutación determinada. Es necesario confirmar la identidad de una mutación para determinar de forma inequívoca la presencia de un cambio de base específico en los Exons 2, 3 o 4 del gen NRAS.

SURVEYOR Nuclease divide todas las discordancias resultantes de la formación de heterodúplex entre ADN Wild-Type y mutante, no solo las mutaciones de los Exons 2, 3 o 4. SURVEYOR Nuclease confirma que existe una discordancia. Es necesario identificar el cambio base específico de la mutación para determinar el estado de activación de NRAS y debe confirmarse mediante otro método, como la secuenciación.

14.2 Revisión de datos de los resultados de SURVEYOR Scan

Inspeccione los cromatogramas y compare los de los controles Wild-Type y Positive Controls con los de la muestra. Determine si el cromatograma de la muestra es similar o diferente del patrón de Wild-Type. Si es diferente, la muestra debe considerarse “positivas a SURVEYOR Scan” y debe enviarse para el análisis de secuencia de ADN. Consulte las Figuras 4-6 para obtener ejemplos y el Apéndice B, Guía de Solución de Problemas, Problemas 7 y 8 para obtener ejemplos de dichas muestras.



Cualquier muestra con un patrón de SURVEYOR Nuclease diferente del de Wild-Type debe enviarse para confirmación de secuencia incluso si no es idéntica al Positive Control. Consulte el Apéndice B, Guía de Solución de Problemas, Problema 7 para obtener un ejemplo de dicha muestra.

Cuando sea necesario, haga zoom en la región de interés y superponga el cromatograma de la muestra con el Wild-Type Control para dicho amplicon.

Observe cualquier diferencia entre el Wild-Type Control y la muestra analizada.

¡Importante! Después de una detenida revisión de cada muestra, el revisor de los datos debe examinar si las muestras adyacentes en la placa de análisis tienen resultados positivos idénticos en SURVEYOR Scan. Si se producen resultados positivos idénticos, pueden deberse a la contaminación cruzada de la muestra o el control y debe repetirse el análisis.



14.3 Ejemplos de resultados

Se muestran ejemplos de resultados obtenidos usando el SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD para DHPLC en las Figuras 4-6 siguientes. En estos ejemplos, usando WAVE

® 4500

Systems con detectores UVA y de fluorescencia, se siguió rigurosamente el proceso descrito en la sección Instrucciones paso a paso. Para obtener orientación sobre los ajustes de gradiente del sistema DHPLC sugeridos para analizar productos de digestión con SURVEYOR Nuclease, visite http://world.Transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/DHPLCsystemsettings.

Figuras 4A y 4B: Análisis WAVE DHPLC con deteción UVA (Figura 4A) y fluorescencia (Figura 4B) de productos de digestión con SURVEYOR Nuclease de NRAS Positive Control Exon 3 y Wild-Type Controls y ADN CRC aislado desde secciones FFIP. Al revisar visualmente los cromatogramas, las muestras digeridas deben compararse con el NRAS Control Wild-Type (línea azul). El NRAS Positive Control Exon 2 (línea verde) es una mezcla de Wild-Type y plásmidos G12D mutantes que dan como resultado picos de digestión de 88 y 148 bp; este control indica que el paso de digestión de SURVEYOR Nuclease funciona y muestra la región del cromatograma que debe inspeccionarse visualmente para determinar si debe enviarse una muestra para análisis de secuencia de ADN. Al comparar los patrones de digestión para las muestras 1 y 2 con el electroferograma digerido Wild-Type, es evidente que la muestra 1 (línea roja) tiene una mutación probable y debe secuenciarse para confirmar la ausencia o presencia de una mutación en el codon relevante. La muestra 2 (línea negra) tiene un cromatograma similar al observado para el NRAS Control Wild-Type y no es necesario enviarlo para análisis de secuencia

Flujo DHPLC

Lavado

DHPLC

Amplicon 236 bp

sin dividir

G12D ofrece fragmentos

88 & 148 bp

Figura 4B

Figura 4A

Uncleaved 200-bp

amplicon

NRAS Control Wild-Type NRAS Positive Control Exon 2 Muestra 1, NRAS Exon 2 Muestra 2, NRAS Exon 2 Tamaño ADN estándar

Uncleaved 200-bp

amplicon


Amplicon 236 bp

sin dividir G12D ofrece fragmentos

88 & 148 bp





de ADN. Tenga en cuenta que el resultado de la secuenciación es el resultado definitivo, ya que puede haber otras mutaciones irrelevantes que pueden dar como resultado fragmentos del mismo tamaño.

Figuras 5A y 5B: Análisis WAVE DHPLC con deteción UVA (Figura 5A) y fluorescencia (Figura 5B) de productos de digestión con SURVEYOR Nuclease de NRAS Positive Control Exon 3 y Wild-Type Controls y ADN CRC aislado desde secciones FFIP. Al revisar visualmente los cromatogramas, las muestras digeridas deben compararse con el NRAS Control Wild-Type (línea verde). El NRAS Positive Control Exon 3 (línea azul) es una mezcla de Wild-Type y plásmidos Q61K mutantes que dan como resultado picos de digestión de 78 y 125 bp; este control indica que el paso de digestión de SURVEYOR Nuclease funciona y muestra la región del cromatograma que debe inspeccionarse visualmente para determinar si debe enviarse una muestra para análisis de secuencia de ADN. Al comparar los patrones de digestión para las muestras 1 y 2 con el electroferograma digerido Wild-Type, es evidente que la muestra 1 (línea roja) tiene una mutación probable y debe secuenciarse para confirmar la ausencia o presencia de una mutación en el codon relevante. La muestra 2 (línea negra) tiene un cromatograma similar al observado para el NRAS Control Wild-Type y no es necesario enviarlo para análisis de secuencia de ADN. Tenga en cuenta que el resultado de la secuenciación es el resultado definitivo, ya que puede haber otras mutaciones irrelevantes que pueden dar como resultado fragmentos del mismo tamaño.

Figura 5A

Figure 5B

Uncleaved 200-bp

amplicon


Flujo DHPLC

Lavado

DHPLC

Amplicon 203 bp

sin dividir

Amplicon 203 bp

sin dividir

Q61K ofrece fragmentos

78 & 125 bp

Q61K ofrece fragmentos

78 & 125 bp

Uncleaved 200-bp

amplicon




Figuras 6A y 6B: Análisis WAVE DHPLC con deteción UVA (Figura 6A) y fluorescencia (Figura 6B) de productos de digestión con SURVEYOR Nuclease de NRAS Positive Control Exon 4 y Wild-Type Controls y ADN CRC aislado desde secciones FFIP. Al revisar visualmente los cromatogramas, las muestras digeridas deben compararse con el NRAS Control Wild-Type (línea verde). El NRAS Positive Control Exon 4 (línea azul) es una mezcla de Wild-Type y plásmidos A146T mutantes que dan como resultado picos de digestión de 68 y 165 bp; este control indica que el paso de digestión de SURVEYOR Nuclease funciona y muestra la región del cromatograma que debe inspeccionarse visualmente para determinar si debe enviarse una muestra para análisis de secuencia de ADN. Al comparar los patrones de digestión para las muestras 1 y 2 con el electroferama digerido Wild-Type, es evidente que las muestras 1 y 2 (líneas roja y negra) tienen cromatogramas similares a los observados para el NRAS Control Wild-Type y no necesitan enviarse para su análisis de secuencia de ADN. Tenga en cuenta que para resultados SURVEYOR Scan positivos, el resultado de la secuenciación es el resultado definitivo, ya que puede haber otras mutaciones irrelevantes que pueden dar como resultado fragmentos del mismo tamaño.

Figura 6A

Figura 6B

Uncleaved 200-bp

amplicon


Flujo

DHPLC

Lavado

DHPLC

Amplicon 233 bp

sin dividir

Amplicon 233 bp

sin dividir

A146T ofrece fragmentos

68 & 165 bp

A146T ofrece fragmentos

68 & 165 bp

Uncleaved 200-bp

amplicon


15 Características de rendimiento


15 Características de rendimiento

15.1 Nivel de detección de mutaciones mediante kits SURVEYOR Scan

La validación de los kits SURVEYOR Scan para plataformas DHPLC usando clones de plásmidos de todas las mutaciones indicadas ha mostrado que los picos de SURVEYOR Nuclease puede detectarse en una mezcla de mutante 2-5% en un fondo de Wild-Type.

La evaluación de secuenciación automatizada de cadenas tanto hacia adelante como hacia atrás a menudo no detecta mutaciones a niveles por debajo del 10% con ADN Wild-Type. Junto con los resultados de la SURVEYOR Nuclease, es posible interpretar con más confianza los electroferogramas de secuenciación de mutantes del 5-10%.

Si el análisis de una muestra presenta un resultado positivo en SURVEYOR Scan, pero no hay mutación de KRAS o NRAS detectable usando secuenciación de ADN, recomendamos registrar un resultado “No se detecta variante”. Consulte Consideraciones sobre el flujo de trabajo para obtener más detalles.

15.2 Confirmación de secuencia

Proceda a la confirmación de secuencia para todos los resultados positivos de SURVEYOR Scan para determinar la identidad de secuencia de las mutaciones del NRAS Exon 2, 3 o 4.

No proceda a la confirmación de secuencia si el SURVEYOR Scan ha tenido un resultado negativo. La muestra puede registrarse como Wild-Type o no se detecta variante.

Los Universal Sequencing Primers incluidos en este kit van dirigidos a su uso para confirmación de secuencia. El cebador hacia delante es PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) y el cebador hacia atrás es PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2).

15.3 Limitaciones del procedimiento de ensayo

Las sustancias contaminantes traídas de la extracción de las muestras fijadas en formol e incluidas en parafina podrían interferir con los procedimientos de amplificación por RCP y digestión por SURVEYOR Nuclease. Los procedimientos de control de calidad indicados en Control de Calidad de los Productos de la RCP asegurarán que el ADN extraído es adecuado para uso en este kit.

Este kit se ha validado para el análisis de muestras de tumores de cáncer colorrectal fijadas en formol e incluidas en parafina. No se ha validado para su uso diagnóstico de otros tipos de cáncer o con muestras de biopsia frescas o congeladas.

Para la resolución de problemas acerca de resultados no estándar y detalles de factores que puedan afectar a este ensayo, véase el Apéndice B, Guía de Solución de Problemas siguiente.

Es necesario tener cuidado para evitar la contaminación y la contaminación cruzada con este kit. La sensibilidad extrema del método de ensayo exige tomar precauciones en los puntos siguientes:

Compruebe que todas las muestras se manipulan de modo que no se pueda producir la contaminación cruzada entre las muestras.

Trabaje en una estación de trabajo de RCP u otro espacio apropiado donde el área de trabajo pueda exponerse a la luz UVA antes de establecer las reacciones de amplificación por RCP.

Utilice una habitación o estación de trabajo de RCP para abrir las muestras después de la amplificación por RCP para control de calidad mediante electroforesis en gel.

La configuración de la digestión con SURVEYOR Nuclease debe realizarse en una habitación separada o una estación de trabajo de RCP diferente de donde se realizó la configuración RCP inicial.

15 Performance Characteristics


Compruebe que los controles de plásmidos del kit se manipulan de forma separada a las muestras en todas las etapas del ensayo.

o Asegúrese de que todos los pocillos de soluciones, controles sin plantilla y ADN de muestra estén tapados antes de abrir los tubos que contienen el ADN de plásmido de control.

o MANEJE LOS CONTROLES AL FINAL. Añada el ADN de plásmido de control en los tubos apropiados solo DESPUÉS de haber tapado todos los pocillos de control sin plantilla y muestras.

o Después de tapar los tubos de ADN de control, limpie TODOS los tubos y tapones con un agente destructor de ADN (como lejía 10%) antes de transferirlos a otro lugar.

Compruebe que al pipetear las muestras en placas de 96 pocillos no permite la contaminación de los pocillos adyacentes debido a la salpicadura durante el mezclado o por no cambiar las puntas de las pipetas.

Apéndice A


Apéndice A

A.1 Plan de configuración de placas para kits SURVEYOR Scan

El plan de configuración de placas sugerido a continuación es para realizar análisis SURVEYOR Scan de los siete KRAS y NRAS Exons simultáneamente en 10 muestras.

Leyenda: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutación; NTC = Control sin plantilla.

A.2 Marcas de ADN de control

A continuación se indican las secuencias con una “marca”.

Leyenda: Las regiones de mutación más frecuentes están destacadas en Violeta. La secuencia en MAYÚSCULAS son bases codificadoras; la secuencia en minúsculas son bases no codificadoras.

Los controles tienen la “marca” genética resaltada en Amarillo; estas variaciones de la secuencia NRAS Wild-Type, en una región donde no se espera que existan mutaciones, pueden usarse también para diagnosticar la contaminación de la muestra mediante Positive Controls. Consulte el Apéndice B – Guía de Solución de Problemas, Problema 8, para obtener un ejemplo de una traza SURVEYOR Scan de dicha contaminación.

“Marca” de NRAS Exon 2

Tamaño del amplicon: 236 bp. Para la creación del plásmido de control del NRAS Exon 2 la

marca genética aca se cambia a tgt. Los codones 12 y 13 se destacan también a

continuación.

ccatgtggttcttgctggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAGGTGGTGTT



marca genética GAC se cambia a CTG. Los codones 59 y 61 se destacan también a

continuación.

ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA

Apéndice A




marca genética CAA se cambia a GTT. Los codones 117 y 146 se destacan también a

continuación.

AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG

ATTCCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG

A.3 Desnaturalización HPLC (DHPLC) requisitos del sistema

A.3.1 Especificaciones DHPLC para aplicaciones SURVEYOR Scan

Las especificaciones siguientes son los requisitos mínimos para las especificaciones del sistema DHPLC para realizar los ensayos con el kit SURVEYOR Scan KRAS y NRAS.

Sistema de administración de solvente de gradiente de alto rendimiento

Capacidad de gradiente binario; alta presión o baja presión

Control de caudal, rango mínimo: 0,7 mL/min

Precisión del caudal: ± 2% (H2O a 20 ºC)

Desgasificador de solvente

Tomador automático de muestras

Control de temperatura para enfriar las placas, ajustable: de 4 a 14 ºC

Volumen de inyección: 5–50 µL

Cartucho de separación

Diseñado para separación de tamaño de fragmento dsDNA, tamaños de fragmento de 50 bp a 250 bp

Horno con control de temperatura de alta precisión

Rango de temperatura: de 40 a 70 ºC

Precisión de temperatura: ± 0.2 ºC

Reproducibilidad de temperatura: ± 0.2 ºC

Linearidad en todo el rango de temperatura: ± 2.0 ºC

Alternativa de detección 1

Detector UV/VIS

Rango de longitud de onda: 190 – 700 nm

Fuente UVA: lámpara de deuterio

Alternativa de detección 2

Detector de fluorescencia

Rango de longitud de onda: excitación: 200 – 850 nm; emisión: 250 – 900 nm

Fuente de fluorescencia: lámpara de xenón de 150 W

Bomba de tinte fluorescente

Caudal fijo a 0,1 mL/minuto – 20%/+50%

Bajo flujo de pulsaciones

A.3.2 Manejo del sistema

Para la configuración y manejo del sistema DHPLC, consulte y siga las recomendaciones del fabricante para el análisis de fragmentos de dsDNA incluidos en el intervalo de tamaño de 50 bp a 250 bp, discriminación de tamaño objetivo de 10 bp o superior. Este es el tamaño de rango para fragmentos después de la digestión con SURVEYOR Nuclease usando este kit.

Para obtener orientación sobre los ajustes de gradiente del sistema DHPLC sugeridos para analizar productos de digestión con SURVEYOR Nuclease, visite http://world.Transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/DHPLCsystemsettings.



Apéndice A


A.3.3 Mantenimiento de cartuchos DHPLC

Para el mantenimiento de los cartuchos DHPLC, siga las recomendaciones del fabricante.

Nota: el análisis de las reacciones con SURVEYOR Nuclease exigirá protocolos de limpieza más frecuentes y estrictos que los empleados para análisis de muestras por RCP estándar. Consulte las instrucciones de su sistema DHPLC para obtener más información.

A.4 Configuración del laboratorio para ensayos RCP

Para producir resultados de RCP fiables y libres de contaminación, deben seguirse las buenas prácticas de laboratorio al diseñar la configuración del laboratorio RCP.

Al planificar la disposición del laboratorio, tenga en cuenta la necesidad de separación espacial de la configuración de amplificación RCP y las actividades post amplificación. Es importante separar (i) el aislamiento de ADN; (ii) la amplificación RCP; y (iii) las actividades post RCP, como abrir los tubos que contienen las muestras amplificadas en preparación para la ejecución de geles y la configuración de otros ensayos, como digestiones con SURVEYOR Nuclease y secuenciación de ADN.

También es importante tener equipos y suministros de laboratorio exclusivos para cada área y solo para ser usados en dicha área. Limpiar las superficies con lejía 10% (v/v), renovada cada semana, ayudará a eliminar los fragmentos de ADN ≤ 500 bp como plantillas para RCP. Además, puede ser útil tratar los objetos de plástico y las soluciones con una exposición de 7-10 minutos de luz UV de onda corta usando un reticulador UVA.

Nota: las enzimas y el ADN que desean amplificarse no deben tratarse con luz UVA.

Usar prendas protectoras adecuadas, cambiarse de guantes con frecuencia y lavarse las manos con guantes con la solución de lejía 10% (v/v) antes de pasar a la estación de trabajo ayudará considerablemente a reducir la contaminación.

Como mínimo, debe existir una configuración similar a la disposición con dos habitaciones del siguiente diagrama, diseñada específicamente para RCP y análisis mediante SURVEYOR Nuclease.

Apéndice A


A.5 Bibliografía

1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix®

(panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer. http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728

2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 1902-12

3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304 1812-20

4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65

5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9

6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101 715-21

7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62

8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702-707

9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6

10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9

11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706

Also see http://world.Transgenomic.com/files/literature/482146.pdf for references about SURVEYOR Nuclease and its applications.

http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728

http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf

Apéndice B


Apéndice B

Guía de Solución de Problemas

El uso eficaz de los kits SURVEYOR Scan para DHPLC depende de que se lleven a cabo una serie de pasos con éxito. Uno de los más críticos es la amplificación por RCP, que debe conducir a la producción de ADN específico, de tamaño uniforme, en cantidad suficiente para detectarse después de la hibridación y la rotura. Esto, a su vez, depende de la calidad de la muestra inicial. No se recomienda la realización del ensayo con ADN que no cumpla los criterios de calidad y cantidad.

Nota: Si utiliza por primera vez la SURVEYOR Nuclease, realice los experimentos de la sección Uso de los ADN de plásmidos de control después de leer y entender la sección Instrucciones paso a paso. Tenga a mano los resultados de los ADN de plásmidos control antes de ponerse en contacto con el servicio técnico de Transgenomic.

Esta guía de resolución de problemas cubre una lista de problemas que puede encontrar al usar los kits SURVEYOR Scan para DHPLC y sugerencias sobre cómo resolverlos.

Consulte el manual del instrumento del sistema DHPLC para obtener información detallada en relación con el manejo y mantenimiento del instrumento. El manual incluye procedimientos específicos para comprobar y mantener el rendimiento de la columna e incluye detalles sobre resolución de problemas.

Problema 1 – Bajo rendimiento de RCP o sin producto RCP al analizar en gel de agarosa

BAJO REND. RCP POSIBLE CAUSA SOLUCIÓN

Mala calidad de la plantilla de ADN

Repita la purificación del ADN; revise el método de purificación empleado. Si el ADN extraído mediante FFIP está demasiado fragmentado, pueden ser necesarios bloques FFIP adicionales.

Demasiado ADR en la muestra que provoca la sobrevaloración de la concentración de ADN

Repetir el tratamiento RNase de la muestra de ADN y volver a purificar el ADN.

Termociclador no calibrado

Realizar la calibración del termociclador.

Nota: Debe usarse ADN de alta calidad de material FFIP. El ADN debe tener una concentración de 25 ng/µL, determinada por la absorbancia a 260 nm, tener un cociente de absorbancia a 260/280 nm de más de 1,8 y tener más del 90% de ADN (esto es, libre de la mayor parte de contaminación de ARNt y ARNr, juzgado por el aspecto en un gel de agarosa). Conserve las muestras de ADN entre -20 °C y -80 °C.

El análisis de la plantilla de ADN extraída de tejido incluido en parafina exige adoptar varias precauciones. El ADN extraído se puede tratar con ADN uracilo glicosilasa para impedir la amplificación de los fragmentos de ADN que contienen residuos de C desaminados. A menudo, un porcentaje elevado del material de adsorción de A260 extraído del tejido incluido en parafina no se amplifica bien durante la RCP. Usar una cantidad mayor de ADN de inicio a menudo ayudará a producir un producto de amplificación idóneo. Otra consideración sería elegir secciones FFPI del tumor con un alto porcentaje de células tumorales. También puede utilizarse microdisección, pero se trata de una opción que requiere tiempo y no se recomienda en pruebas generales de laboratorio.

Buen Rendi-mento RCP

Bajo Rendi-mento RCP

Banda de

ARN

Apéndice B


Problema 2 – Varios productos RCP al analizar con gel de agarosa

VARIOS PRODUCTOS RCP POSIBLE CAUSA SOLUCIÓN

La temperatura de hibridación es demasiado baja

Comprobar la calibración del termociclador.

Nota: La RCP debe dar un rendimiento suficientemente alto (mayor de 20 ng/µL) de una ÚNICA molécula amplificada del tamaño correcto. Para la RCP deben usarse la DNA Polymerase y el DNA Polymerase 10X PCR Buffer suministrados con este kit. Los amplicones de los controles deben digerirse con la SURVEYOR Nuclease y estudiarse para excluir ruido de fondo espurio mediante comparación visual con los perfiles del electroferograma (véase Ejemplos de resultados, Figuras 4-6). Examine cada producto de ADN amplificado antes de la digestión mediante electroforesis en gel (o mediante análisis del sistema DHPLC) para estar seguro de que es una única molécula del tamaño esperado.

Buen Rendi-mento RCP

RCP con

Varias Bandas

Apéndice B


Problema 3 – No se observan productos de rotura en el análisis después del tratamiento de los heterodúplex con SURVEYOR Nuclease

SIN PRODUCTOS DE DIVISIÓN POSIBLE CAUSA

SOLUCIÓN

Proporción de la discordancia diana demasiado baja

Compruebe el ensayo usando los controles.

Formación ineficiente de heterodúplex

Siga el procedimiento de hibridación y RCP correcto. Utilice ADN recién hibridado en las digestiones de la SURVEYOR Nuclease.

Realice una nueva amplificación por RCP usando (1) la misma cantidad de plantilla ADN; (2) aumentando la cantidad de ADN inicial; o (3) aislar ADN nuevo de la misma sección FFPI u otra diferente.

SURVEYOR Nuclease inactiva

Realice la reacción de control para comprobar el rendimiento de la enzima. Utilice solo mezclas maestras de SURVEYOR Nuclease recién preparadas.

Nota: la SURVEYOR Nuclease corta predominantemente en las discordancias en los heterodúplex. La proporción de heterodúplex a homodúplex en la muestra hibridada determinará el tamaño de la señal de digestión de la SURVEYOR Nuclease. Si la mutación de NRAS está presente a una concentración muy baja en la muestra de ADN genómico, la señal podría ser demasiado baja para dar un resultado positivo.

Es importante asegurar que el paso de hibridación se incluye en el programa del termociclador (véase Protocolo de amplificación) para aumentar al máximo la eficiencia de la formación de heterodúplex. Los heterodúplex se forma de manera muy ineficiente durante las reacciones estándar de RCP.

Nota: el cociente de señal a ruido generalmente es suficientemente alto para detectar mutaciones presentes en un bajo porcentaje de la plantilla total de ADN; es posible detectar hasta un 2% de ADN mutante. Las Figuras 4-6 muestra los productos de la digestión generados con ADN NRAS Positive Control homodúplex y heterodúplex (incluidos en este kit) y muestras FFIP en un sistema WAVE DHPLC 4500. Los productos de rotura se ven claramente como dos nuevos picos que eluyen con los tamaños esperados que pueden estimarse en relación con el marcador de tamaño de ADN.

Advertencia: los tampones de RCP disponibles comercialmente varían espectacularmente en su contenido y las formulaciones a menudo no están definidas por los proveedores. Varios tampones

Pico de homoduplex

sin cortar

Posición de los heteroduplex

que faltan

Apéndice B


NO son compatibles con la SURVEYOR Nuclease debido al pH o a la presencia de aditivos surfactantes u otros ingredientes patentados. NO utilice ninguna otra polimerasa o tampones de polimerasa 10X que los proporcionados en el kit.

Problema 4 – Alto fondo después del tratamiento con SURVEYOR Nuclease

ALTO FONDO POSIBLE CAUSA SOLUCIÓN

Paso de hibridación subóptimo

Haga lo siguiente:

1. Compruebe que la concentración de ADN está en el rango de >25 ng/µL.

2. Repita el paso de formación de heterodúplex, teniendo cuidado de seguir el procedimiento recomendado; véase 12.7.1.

Cantidad de ADN demasiado baja

Compruebe el rendimiento y la calidad del ADN de la plantilla

Productos de RCP no específicos

Compruebe el rendimiento y la calidad del ADN de la plantilla

El SURVEYOR Enhancer W2 y/o SURVEYOR Enhancer Cofactor han perdido actividad

Compruebe la fecha de caducidad del kit

Nota: La SURVEYOR Nuclease ocasionalmente marca ADN de doble cadena en lugares de concordancia aleatorios, lo que produce fondo después de la digestión. Esta actividad se ve suprimida por el SURVEYOR Enhancer W2 y su Cofactor, sin que por otro lado afecte negativamente a la región de corte de discordancia. El SURVEYOR Enhancer W2 y el SURVEYOR Enhancer Cofactor están incluidos en este kit y deben emplearse siempre.

Cuando se sigan produciendo estos cortes, generan picos menores en el sistema DHPLC. La comparación de los productos control digeridos de homodúplex con los productos digeridos de las muestras permitirá reconocerlos.

Flujo DHPLC

Lavado DHPLC

Muestra con línea basal

ruidosa

Apéndice B


Problema 5 – Picos de digestión de la SURVEYOR Nuclease en controles negativos

PICOS DE DIGESTIÓN EN CONTROLES NEGATIVOS

POSIBLE CAUSA SOLUCIÓN

Contaminación del contenido del kit con amplicones KRAS o controles de plásmidos.

Deseche todos los componentes del kit y utilice un kit nuevo.

Póngase en contacto con el Servicio Técnico de Transgenomic para comentar posibles causas y fuentes de contaminación.

Problema 6 – Resultados de SURVEYOR Nuclease fallidos

LA DIGESTIÓN CON SURVEYOR NUCLEASE DE CONTROLES POSITIVOS HA FALLADO

POSIBLE CAUSA

SOLUCIÓN

No se ha añadido SURVEYOR Nuclease

Realice la digestión de una nueva muestra

La digestión con SURVEYOR Nuclease se ha realizado a la temperatura incorrecta

Realice la digestión de una nueva muestra

Flujo DHPLC

Lavado DHPLC

Picos de digestión de señal débiles

en Wild-Type Control

Pico de homoduplex

sin cortar

Sin picos de digestión

claros

Pico de homoduplex

sin cortar

Apéndice B


Problema 7 – Picos inesperados en la traza de digestión con SURVEYOR Nuclease

LA DIGESTIÓN CON SURVEYOR NUCLEASE DE POSITIVE HA FALLADO

POSIBLE CAUSA

SOLUCIÓN

Mutación en un lugar poco común

Secuenciar la muestra para verificar la mutación

Pico de digestión

inesperado

Pico de homoduplex

sin cortar

Lavado DHPLC

Flujo DHPLC

Picos de digestión

esperados

Apéndice B


Problema 8 – Contaminación de muestras con Positive Controls

Patrones de digestión consistentes con la presencia de región con marca de los controles positivos mezclados y heterodúplex Wild-Type

POSIBLE CAUSA

SOLUCIÓN

Región de los codones Región de la marca de 12 y 13 control

Técnica de pipeteado incorrecta

Debe tener cuidado al pipetear las muestras para evitar la contaminación cruzada.

Comprobar que las regiones de secuencia de marca de control no presenten contaminación por Positive Control.

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Sample 1 NVD en codones 12 & 13 Marca

detectada

Sample 2 c.34G>T

p.G12C, 30% No se detecta

marca

Sample 3 NVD en codones 12 & 13

No se detecta marca

Datos de pedido


Datos de pedido

Número de producto

Nombre de producto Tamaño

710104 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 100 reacciones

710106 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD 100 reacciones

710400 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD 100 reacciones

710077 CRC RAScan Combination Kit for KRAS and NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD

230 reacciones

Datos de contacto

Sede Corporativa Europa Transgenomic, Inc. Transgenomic Limited

12325 Emmet Street 40 Watt Road

Omaha Hillington Park, Hillington Nebraska 68164 Glasgow G52 4RY United States of America United Kingdom

Teléfono: (888) 233-9283* o +1 (402) 452-5400 Teléfono: +44 141 892 8800 Fax: +1 (402) 452-5401 Fax: +44 141 883 5967 Correo electrónico: [email protected] Correo electrónico: [email protected]

*Sólo en Norteamérica

www.Transgenomic.com

Traducción Disclaimer

Transgenomic, Inc. ha hecho todo lo posible para garantizar la exactitud de esta traducción. Si usted tiene preguntas con respecto a cualquier información en esta versión traducida del manual, consulte la versión Inglés Instructions for Use for the SURVEYOR® Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD for DHPLC Systems – 482296(EN) http://world.Transgenomic.com/files/literature/482296-EN.pdf y / o Transgenomic contacto en support @transgenomic.com.



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Datos de pedido


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DNA Polymerase: El uso de este producto está cubierto por una o más de las siguientes patentes de EEUU y las reivindicaciones de patentes correspondientes fuera de EE. UU.: 5.789.224; 5.618.711, 6.127.155 y revindicaciones fuera de EE. UU. correspondientes a la patente de EE. UU. n.º 4.889.818. La compra de este producto incluye una inmunidad limitada, no transferible, a las demandas bajo las anteriores reivindicaciones de patentes para usar sólo esta cantidad de producto para la propia investigación interna del comprador. No se transmite expresamente, implícitamente o por "estoppel" ningún derecho bajo ninguna otra reivindicación de patente (como las reivindicaciones del proceso de la 5' nucleasa patentado en las patentes de EE. UU. n.º 5.210.015 y 5.487.972), ningún derecho a realizar ningún método patentado y ningún derecho a realizar servicios comerciales de ningún tipo, incluidos, sin límites, la notificación de los resultados de las actividades del comprador por una cuota o cualquier otra consideración comercial. Este producto es exclusivamente para uso en investigación. Los usos diagnósticos bajo las patentes de Roche exigen una licencia separada de Roche. Puede obtener más información sobre la compra de licencias poniéndose en contacto con el Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

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Documento n.º 482296-ES rev-02

instrucciones de uso para el surveyor scan kit exons 2, 3 ... de los nras exons 2, 3 y 4, también...

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